Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
35
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
УДК 57.043:612.111:576.31:547.42
МЕХАНІЗМИ ТЕМПЕРАТУРНО-ОСМОТИЧНОЇ СТАБІЛІЗАЦІЇ ЕРИТРОЦИТІВ ПРИ ОХОЛОДЖЕННІ Й ЗАМОРОЖУВАННІ
У ПРИСУТНОСТІ НЕПРОНИКАЮЧОГО КРІОПРОТЕКТОРА
03.00.19 –кріобіологія
АВТОРЕФЕРАТ
доктора біологічних наук
Харків - 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України
Наукові консультанти: академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, директор;
член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Білоус Аполлон Максимович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник відділу кріобіології систем репродукції.
Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва УААН; головний науковий співробітник, лабораторія генетики;
доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії;
доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріоморфології.
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України, відділ імуноцитохімії
Захист відбудеться “26”листопада 2002 р. о “13” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23)
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23)
Автореферат розісланий “”жовтня 2002 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На сьогодні існує ціла система концепцій, які пояснюють причини руйнування клітин при низькотемпературному впливі (Lovelock J.E., Polge C., 1954; Mazur P., 1966; Meryman H.T., 1966, 1982, 1983). Однак механізми, за допомогою яких клітини здатні зберігати свої біологічні властивості при впливі низьких температур та інших екстремальних факторів, все ще залишаються неясними. Разом з тим, вирішення цих питань має велике як фундаментальне, так і прикладне значення, оскільки дозволить істотно змінити технологічні процеси кріоконсервування клітинних суспензій, використовуваних у медицині (Аграненко В.А. и др., 1983; Виноград-Финкель Ф.Р. и др., 1980; Терехов Н.Т., Петров М.М., 1983; Sumida S., Oshikawa K., 1999) й інших галузях народного господарства (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994; Пушкарь Н.С., Белоус А.М., 1977).
Загальним недоліком відомих гіпотез кріопошкоджень є однобічне тлумачення процесів кріодеструкції клітин, наприклад, ролі поза- і внутрішньоклітинної кристалізації і таких супутніх процесів, як зміна тонічності середовища і рН у рідких мікрофазах закристалізованої матриці. При цьому фізіологічні системи клітин, відповідальні за збереження їхньої структурно-функціональної повноцінності в умовах охолодження й заморожування, залишалися мало дослідженими. Більш того, вважалося, що охолодження клітин від фізіологічних температур до 0С не супроводжується істотною зміною властивостей їхніх мембран і цитозольних білків, що впливають на стабільність клітини в цілому. Разом з тим, відомий феномен холодового шоку, коли клітини гинуть при охолодженні в області позитивних температур (0-4С), свідчить про те, що зниження температури до 0С є одним із важливих факторів їхнього ушкодження.
Останнім часом молекулярні механізми температурно-осмотичного шоку клітин продовжують інтенсивно вивчатися (Белоус А.М. и др., 1985; Бондаренко В.А., 1988), визначається загальна закономірність і послідовність процесів, що протікають у мембранах і клітинах у зазначених вище температурних умовах.
У наших попередніх дослідженнях з вивчення механізмів температурного шоку еритроцитів (Бабийчук Л.А., 1985; Белоус А.М. и др., 1985; Бондаренко В.А., 1988) було встановлено, що інкубація клітин при 0С в гіпертонічних розчинах солей і неелектролітів може призводити до підвищення їхньої стійкості до наступної зміни температури. Було виявлено, що в умовах температурно-осмотичного впливу на клітини відбувається деформація плазматичної мембрани, що вказувало на участь у цих процесах ліпідного бішару і білків мембрани, а також цитоскелетної мережі, стан якої контролює форму й об’єм клітин [Белоус А.М. и др., 1978, 1985).
Разом з тим, детальні клітинні механізми участі компонентів мембрани і білків цитоскелету в процесах, що регулюють структурно-функціональний стан цілісної клітини, багато в чому залишаються не з'ясованими.
Зараз відомо (Вебер К., Осборн М., 1985; Фултон А., 1987), що агрегатний і структурний стан білків цитоскелету впливає на ступінь їхньої асоціації з “якірними” білками мембрани (Tomishige M., Kusumi A., 1999; Van Dort H.M. et al., 2001), і в такий спосіб підтримує в’язко-еластичні властивості мембрани і стійкість клітини до дії екстремальних факторів, у тому числі при низьких температурах (Белоус А.М. и др., 1987). Участь білків у температурно-осмотичній стабілізації (чи дестабілізації) клітини здійснюється за допомогою досить складних механізмів, викликаних частковою дегідратацією цитоплазми, перерозподілом іонів, особливо Са+, допоміжних білків цитозолю і, можливо, інших систем, що беруть участь у реалізації зовнішнього клітинного сигналу. Тому вивчення характеру модифікації білків плазматичної мембрани і цитоскелету має важливе значення для подальшої розробки теорії і практики холодової стабілізації і холодостійкості клітин у циклі кріоконсервування.
При цьому було важливо з'ясувати можливість перебудови зазначених вище мембранних структур у суворо визначених оптимальних умовах температуртно-осмотичного впливу з метою штучного переорієнтування їхньої структури і функції в напрямку підвищення стійкості клітин до впливу негативних температур. Подібного роду перебудова структур клітин з метою підвищення їхньої стійкості до циклу заморожування-відігрівання звичайно досягається шляхом використання відповідних швидкостей заморожування (Пушкарь Н.С., Белоус А.М., 1977) і кріопротекторів ендо- і екзоцелюлярного механізму дії (Белоус А.М. и др., 1979; Пушкарь Н.С. и др., 1978). Останнім часом заслуговують на особливу увагу екзоцелюлярні кріопротектори, які не проникають через плазматичні мембрани і не вимагають видалення з деконсервованих клітин перед їхньою трансфузією.
Незважаючи на широке застосування різних непроникаючих кріопротекторів (поліетиленоксиди, полівінілпіролідони (ПВП), гідроксиетилкрахмалі (ГЕК)) при кріоконсервуванні клітинних суспензій (Терехов Н.Т. и др., 1977,1983; Allen et al., 1978; Heschel et al., 1994;Lionetti F.J., Hunt S.M., 1975; Spiels G. et al., 1994; Sputtek A. et al., 1994), механізм дії цих хімічних сполук залишається багато в чому не ясним. Відомо, що при використанні непроникаючих кріопротекторів захист клітин обумовлений процесами помірної дегідратації і формуванням своєрідної “оболонки” навколо поверхні плазматичної мембрани (Пушкарь Н.С. и др., 1978). Однак неясно, чи спричиняють екзогенні хімічні кріопротектори лише колігативну і дегідратуючу (осмотичну) дію, або в процес утягуються системи внутрішньоклітинної сигналізації, що у свою чергу впливають на стан білків мембрани і цитоскелету клітини. Подібного роду перебудови можуть відбуватися в клітині під впливом осмотично активних непроникаючих кріопротекторів, охолодження і заморожування, що призведуть до порушення структури і функції мембрани клітин. Тому з'ясування ролі мембранних білків і білкового цитоскелету, які впливають на структурно-функціональний стан клітини, має велике значення у збереженні стійкості живих систем до дії осмотичнох і температурних факторів у процесі кріоконсервування.
У зв'язку з цим вивчення механізмів, що лежать в основі підвищення стійкості клітин до впливу факторів низькотемпературного консервування, є актуальною проблемою, вирішення якої дозволить обґрунтувати нові підходи для спрямованої модифікації стану клітин на ранніх етапах перед кріоконсервуванням і може стати основою для розробки ефективних методів кріоконсервування клітин.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Дисертація виконана згідно з планами науково-дослідної роботи Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планових тем: “Дослідження молекулярних механізмів холодової толерантності при природній і штучній адаптації клітин”(шифр теми: 2.2.6.50) і “Вивчення молекулярних механізмів холодової стабілізації клітин при дії непроникаючих кріопротекторів і низьких температур. Розробка безвідмивної технології кріоконсервування еритроцитів”(шифр теми: 2.2.6.85, Державна реєстрація № 0101ИО03471).
Мета і задачі дослідження.
Мета дослідження. З'ясування механізмів стабілізації плазматичної мембрани і білків цитоскелету в умовах впливу на еритроцити людини осмотично активних сполук, головним чином, непроникаючих кріопротекторів, охолодження й заморожування для експериментального обґрунтування нових технологічних процесів кріоконсервування еритроцитів.
Задачі дослідження:
Об'єкт дослідження. Механізми, що лежать в основі підвищення стійкості клітин до впливу факторів кріоконсервування. Спрямована модифікація структурно-функціонального стану еритроцитів.
Предмет дослідження. Температурно-осмотична стабілізація плазматичних мембран і білків цитоскелету еритроцитів на етапі перед кріоконсервуванням. Розробка безвідмивного способу кріоконсервування еритроцитів з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500.
Методи дослідження. Для проведення досліджень щодо взаємодії ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями”еритроцитів, фосфорилювання мембранних білків еритроцитів, визначення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, вивчення транспорту катіонів та амінокислот, а також приживлюваності еритроцитів у руслі крові були використані радіоізотопні методи.
Морфологічні дослідження еритроцитів проводили методом електронної та растрової електронної мікроскопій. Просторову структуру цитоскелету визначали методом поляризаційної мікроскопії.
Зміни стану білків мембран еритроцитів вивчали методом електрофорезу в ПААГ.
Структурно-функціональну повноцінність еритроцитів після кріоконсервування оцінювали за рівнем гемолізу або виживаністю еритроцитів, осмотичній крихкості, рівнем АТФ, 2,3-ДФГ і кисень-зв’язувальною здатністю еритроцитів.
Наукова новизна отриманих результатів. У роботі уперше встановлено, що визначальна роль у механізмі температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів до факторів низькотемпературного консервування належить білкам цитоскелету клітин, модифікація яких призводить до підвищення стійкості еритроцитів до дії факторів заморожування за умови їхньої холодової експозиції при 0-4С в розчинах ПЕО-1500. Після теплової денатурації спектрину й інкубації клітин з інгібітором полімеризації колхіцином стійкість еритроцитів до дії факторів заморожування різко знижується. Використання методу електрофорезу в ПААГ із застосуванням зшивального агента, діаміду дозволило установити, що інкубація еритроцитів із кріопротектором ПЕО-1500 при 22С викликає порушення просторового розташування і перерозподіл білкових фракцій спектрин-актинового комплексу, що призводить до дестабілізації клітин. Навпроти, інкубація еритроцитів із кріопротектором при 0С сприяє стабілізації структури білків цитоскелету, зберігає їхніє просторове й орієнтаційне розташування в клітині і поліпшує тим самим результати кріоконсервування.
Уперше показано, що спрямованість структурної модифікації плазматичних мембран і білків цитоскелету клітин визначається впливом температури і рівнем дегідратації під дією непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 на системи, що регулюють їхній структурно-функціональний стан. Це пов'язано зі змінами концентрації внутрішньоклітинного Са+ і рівнем фосфорилювання білків. Новим є установлений факт, що стабілізація структурно-функціонального стану білків цитоскелету еритроцитів під впливом холодової інкубації клітин із кріопротектором пов'язана з підвищенням рівня фосфорилювання спектрину (у 2,5 рази) й концентрації внутрішньоклітинного Са+ –процесів, що підтримують білки в полімерному стані.
У роботі встановлено, що температура, при якій клітини вміщуються в гіпертонічні умови, впливає на макроскопічні параметри еритроцитів (об’єм і форму). Уперше показано, що інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 0С призводить до обмежання деформації форми і зворотньої трансформації перехідних форм дискоцитів у нормоцити, що дозволяє зберегти стабільність форми клітин у циклі заморожування-відігрівання. Отримано нові дані про взаємозв'язок між характером зв'язування ПЕО-1500 з мембранами еритроцитів на етапі інкубації, зміною їхнього об’єму і форми, модифікацією білків цитоскелету, станом бар'єрних властивостей мембран і стійкістю еритроцитів до заморожування-відігрівання. Новим є виявлений нами факт зниження зв'язування С-ПЕО-1500 з еритроцитами при інкубації їх при 0С. Зменшення кількості ПЕО-1500, який зв’язується з клітинами, сприяє обмеженню деформації форми і дегідратації клітин, що багато в чому забезпечує збереження бар'єрних властивостей мембрани і систем транспорту іонів і метаболітів, і в остаточному підсумку стійкість еритроцитів до кріоконсервування підвищується.
Уперше показана ефективність дозованого введення в середовище кріопротектора при низьких позитивних температурах як фактора, що підвищує стійкість еритроцитів до заморожування і зміни осмотичних умов середовища.
Практичне значення отриманих результатів. У результаті проведеного вивчення механізмів стабілізації еритроцитів до дії непроникаючого кріопротектора і низьких температур обґрунтовані нові підходи для спрямованої модифікації структурно-функціонального стану клітин на початкових етапах перед кріоконсервуванням з метою підвищення їхньої стійкості до заморожування-відігрівання. Ці підходи полягають у формуванні визначених температурно-осмотичних умов, при яких відбувається стабілізація плазматичних мембран і білків цитоскелету. Розроблено оптимальні умови для структурної стабілізації еритроцитів, що полягають у попередній інкубації клітин при 0-4С і дозованому введенні кріопротектора. На основі принципу “холодової стабілізації”розроблений і захищений патентом України (Патент № 30888 А) безвідмивний спосіб кріоконсервування еритроцитів під захистом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500, що дозволяє значною мірою підвищити їхню стійкість до заморожування-відігрівання і зберігати структурно-функціональні показники клітин на досить високому рівні. Даний метод є більш перспективним у порівнянні з існуючими на сьогодні методами кріоконсервування еритроцитів і може знайти широке застосування в практичній медицині.
Основні наукові положення роботи використовуються в курсах лекцій для студентів факультету фундаментальної медицини Харківського Національного університету ім. В.Н. Каразіна.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автору дисертаційної роботи належить вибір теми, визначення мети і задач дослідження, методологічних основ її виконання. Здобувачем особисто отримані експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведена їхня статистична обробка. Автором роботи самостійно проаналізовані отримані результати і зроблені висновки.
У спільних наукових публікаціях співавтори брали участь у постановці деяких методик і проведенні окремих експериментів.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи повідомлені й обговорені на II Всесоюзному з'їзді гематологів і трансфузіологів (Львів, 1985); II Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів України (Київ, 1986); Міжнародній конференції "Досягнення й перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини" (Харків, 1988); Всесоюзній конференції "Структурна динаміка біологічних мембран і її роль у регуляції фотобіологічних і рецепторних процесів" ( Мінськ, 1988); X-ій Всесоюзній конференції молодих учених "Синтез і дослідження біологічно активних сполук" (Рига, 1989); Всесоюзному симпозіумі "Реконструкція, стабілізація і репарація біологічних мембран" (Благовєщенськ, 1989); IV Міжнародній школі "Кріобіологія і заморожування-ліофілізація" (Софія, Болгарія, 1989); Міжнародній конференції "Низькі температури 90" (Чехословаччина, 1990); VII Міжнародному симпозіумі "Проблеми низькотемпературного консервування клітин, тканин і органів" (Берлін, ФРН, 1991); II Міжнародній конференції "Успіхи сучасної кріобіології" (Харків, 1992); VІ Українському біохімічному з'їзді (Київ , 1992);); III Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995); I з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995); VI Міжнароднійй конференції по тканинним банкам (Единбург, 1997); Міжнародному симпозіумі “Трансфузія 2000”(Фукуока, Японія, 1999); П з'їзді біофізиків Росії (Москва, Росія, 1999); 30-38 Міжнародних нарадах по кріобіології (Атланта, США, 1993; Кіото, Японія, 1994; Вісконсин, США, 1995; Барселона, Іспанія, 1997; Піттсбург, США, 1998; Марсель, Франція, 1999; Единбург, Великобританія, 2001), Усеукраїнська наукова конференція “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини”(Харків 2001).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 56 наукових праць, з них 24 статті у фахових наукових виданнях, 31 тези, отриманий 1 патент України на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 299 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, шести розділів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків і списку використовуваної літератури, що включає 459 джерел на 47 сторінках. Робота ілюстрована 44 рисунками і 12 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Матеріалом дослідження були еритроцити донорської крові людини, консервованої на середовищі "Глюгіцир". Перед заморожуванням еритроцити інкубували з кріопротектором ПЕО-1500. Використовували 30% розчин ПЕО-1500 на основі або 10 мМ трис-НСl, або 0,01 М фосфатному буфері рН 7,4, що містить 150 мМ NaCl. У роботі було застосовано два температурних режими: інкубація клітин при температурі 0 –С і 22-24С. Розчин ПЕО-1500 вводили в суспензію еритроцитів або одномоментно по краплях та інкубували протягом 40 хв., або шляхом додавання через кожні 4 хв. рівними порціями протягом 40 хв. При цьому співвідношення об’ємів еритромаси і розчинів кріопротектора при кожному зі способів додавання складало 1:1 за об’ємом. Заморожування здійснювали до –С шляхом занурення контейнера в рідкий азот. Відтаювання робили на водяній бані при температурі 42-44С при постійному похитуванні.
Взаємодію С-ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями”при різних режимах обробки визначали після видалення незв’язаного кріопротектора з клітинної суспензії шляхом триразового відмивання у фізіологічному розчині NaCl. Кількість зв’язаного з клітинами і “білими тінями”С-ПЕО-1500 визначали шляхом виміру осадку на сцинтиляційному лічильнику Beckman LS-7800 у сцинтиляторі ЖС-8.
“Білі тіні”еритроцитів одержували за допомогою гіпотонічного шоку за методом (Fairbanks G., at al., 1971).
Морфологічні дослідження еритроцитів проводили методом растрової електронної мікроскопії і сканували на електронному мікроскопі РЕМ-100У. Ультраструктуру еритроцитів вивчали відповідно до (Карулу, 1984) і досліджували в електронному мікроскопі ЕОМ-100АК. Об’єм еритроцитів визначали на приладі Пикаскель.
Денатурацію спектрину проводили, інкубуючи еритроцити при температурі 50 С протягом 15 хв (Coakley W.T. et al., 1981). Колхіцин додавали до проб із розрахунку 0,04 мг/мл клітинної суспензії й інкубували протягом 1,5 годин при 37С (Carlsson L., Blikstad I., 1981). Рівень гемолізу після розморожування визначали на спектрофотометрі "СФ-46 ЛОМО".
Зміну стану білків мембран еритроцитів вивчали методом електрофорезу в ПААГ. Електрофорез мембранних білків проводили за методом (Fairbanks G. at al., 1971) у гелі з концентрацією акриламіду 10%, а також у градієнтних гелях РАР 4/30 (Pharmacia, Швеція). Гелі сканували при 540 нм на денситометрі "Beckman CDS-200". Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери LMW (Pharmacia, Швеція). Обробку клітин діамідом здійснювали за методом (Haest C., at al., 1977), одержували потім “білі тіні”, що піддавалися електрофорезу.
Поляризаційно-мікроскопічні дослідження просторової структури цитоскелету еритроцитів проведені, як описано в роботі (Саакян Ш.С., 1988), на поляризаційному мікроскопі МІН-8.
Фосфорилювання мембранних білків еритроцитів здійснювали Р в -положенні молекули АТФ (пит. активність 1 мкКи/мл) (Fairbanks G., 1978), потім білки розділяли за допомогою електрофорезу в ПААГ. Для кількісної оцінки шматочки гелю з радіоактивно міченими білками розчиняли в 30% перекисі водню і прораховували на сцинтиляційному лічильнику.
Концентрацію внутрішньоклітинного кальцію визначали радіоізотопним методом (Покудин Н.И., Орлов С.Н., 1986) з невеликими модифікаціями (Покудин Н.И. и др., 1988), за допомогою СaCl.
Транспорт катіонів та амінокислот в еритроцитах досліджували за допомогою Rb і С-гліцину. Визначення концентрації катіонів здійснювали за допомогою полум'яної фотометрії на приладі ПАЖ-1.
Осмотичну крихкість еритроцитів визначали за рівнем виходу вільного гемоглобіну після переносу розмороженої суспензії еритроцитів у середовища з фізіологічною тонічністю (0,15 М NаCl, розведення 1:100 та інкубація при 37С 1 година). Вільний гемоглобін визначали за методом (Дервиз Г.В., Бялко Н.К., 1966), загальний гемоглобін –ціан мет-гемоглобіновим методом, вміст АТФ за методом (Атаулаханов Ф.И., Пичугин А.В., 1981), 2,3-ДФГ методом (Мешкова Н.Т., Алексахина Н.В., 1954), концентрацію гемоглобіну визначали на апараті Со-оксимер (США), кисневу ємність крові на апараті Zex-Про-Con (США), Р еритроцитарної маси визначали по кривих дисоціації оксигемоглобіну, що реєстрували на апараті Гем-О-Скан (США).
Реологічні властивості еритроцитів визначали за методом (Suda T. at al., 1980), їх здатність до деформації й агрегаційну активність –за методом (Шестаков В.А., Александрова Н.П., 1974).
Статистичну обробку даних проводили параметричним методом Фішера-Стьюдента (Бейли Н., 1963) з використанням t-критерію. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму “StatGraphics Plus 2.1” for Windows.
Взаємодія поліетиленоксиду м.м. 1500 з мембранами еритроцитів. Дія ПЕО-1500 як осмотично і поверхово активної речовини, поширюється на різні системи клітин і, насамперед, на плазматичні мембрани. Співвідношення захисної дії кріопротектора та його цитотоксичного ефекту залежить від багатьох факторів. У визначених умовах варіювання температури токсичний ефект кріопротектора можна звести до мінімуму, якщо врахувати, що токсичність пов'язана саме з первинним впливом кріопротектора на поверхневі властивості мембрани. Дослідження характеру взаємодії С-ПЕО-1500 з еритроцитами в залежності від температури і темпів уведення кріопротектора в клітинну суспензію показали (рис. 1), що кількість кріопротектора, що зв'язується з клітинами, визначається насамперед температурою, при якій клітини інкубують із кріопротектором. Так, при 0С з еритроцитами взаємодіє в 5 разів менше С-ПЕО-1500, ніж при 22С, тобто введення кріопротектора в клітинну суспензію при 22С збільшує його зв'язування з еритроцитами.
Механізм взаємодії ПЕО-1500 з еритроцитами представляється досить складним. Тому що ПЕО-1500 є непроникаючою у клітину речовиною, його взаємодія з мембраною супроводжується адсорбуванням його молекул на поверхні мембрани, що змінює її структурні і зарядові характеристики (Моисеев В.А., 1984). Разом з тим, маючи значну ліпофільність, ПЕО-1500 може вбудовуватися в гідрофобні ділянки плазматичної мембрани. Наявність у структурі ПЕО-1500 полярних груп створює можливість його взаємодії з гідрофільними ділянками макромолекул, зокрема, з полярними голівками фосфоліпідів.
e0 - 00d1; - ef 00d1; - 220d1; – 220d1
Рис. 1 Взаємодія С-ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями”.
Оскільки у використаному нами препараті ПЕО-1500 могли міститися домішки низькомолекулярних фракцій, здатних проникати в клітину, розходження у взаємодії цього кріопротектора з клітинами при 0 і 22С можуть бути обумовлені впливом температури на дифузію цих фракцій усередину клітини. Експерименти, проведені на незамкнутих “білих тінях”еритроцитів, що дозволяють виключити роль дифузії низькомолекулярних фракцій і оцінити тим самим особливості зв'язування ПЕО-1500 з мембранами еритроцитів при різних температурах, показали (рис. 1), що закономірності, установлені при взаємодії ПЕО-1500 з нативними еритроцитами при 0 і 22С, характерні також для незамкнутих “білих тіней”. Це свідчить, що розходження в кількості кріопротектора, зв’язаного з клітинами, при різних температурах, обумовлені неоднаковим характером його взаємодії з плазматичними мембранами, а дифузія низькомолекулярних домішок у клітину не відіграє визначальної ролі у виникненні цих розходжень.
При дослідженні взаємозв'язку між характером зв'язування кріопротектора з клітинами та їхньою стійкістю до заморожування-відігрівання виявлено, що існує кореляція між кількістю ПЕО-1500, що зв'язується з клітинами на етапі інкубації, та їх стійкістю до заморожування-відігрівання. Інкубація еритроцитів при 0С супроводжується незначним зв'язуванням поліетиленоксиду з поверхнею мембрани, що корелює з низьким рівнем гемолізу після розморожування клітин (рис. 2). Збільшення зв'язування з клітинами кріопротектора на етапі інкубації при 22С призводить до зниження стійкості еритроцитів до низькотемпературного впливу.
Очевидно, при збільшенні інтенсивності взаємодії кріопротектора з мембранами клітин починає виявлятися його цитотоксичний ефект, що збільшує імовірність утворення трансмембранних дефектів. В умовах заморожування-відігрівання під впливом різних фізико-хімічних факторів нестабільність клітин значно зростає.
e0 - 00d1; - ef 00d1; – 220d1; - 220d1.
Рис. 2 Рівень гемолізу еритроцитів, кріоконсервованих з ПЕО-1500.
Розходження в кількості ПЕО-1500, що взаємодіє з еритроцитами при 0 і 22С можуть бути обумовлені, насамперед, термодинамічними причинами, в силу яких при зниженні температури відбувається обмеження хімічних і просторових взаємодій. Максимальна збереженість еритроцитів у процесі кріоконсервування в наших експериментах спостерігається при дозованому введенні кріопротектора в клітинну суспензію на етапі інкубації при 0С. Отже, можна припустити, що в цьому випадку для забезпечення кріозахисної дії ПЕО-1500 досягаються оптимальні умови для збереження цілісності еритроцитів у циклі кріоконсервування. Таким чином, зниження температури інкубації клітин із кріопротектором до 0С призводить до зменшення кількості ПЕО-1500, який зв’язується з клітинами, що є важливим чинником у механізмі підвищення стійкості клітин до низькотемпературного впливу.
Модифікація морфологічної структури й об'ємні зміни еритроцитів під впливом кріопротектора ПЕО-1500 і заморожування-відігрівання. Теоретичний та експериментальний аналізи механізмів ушкодження клітин при охолодженні й заморожуванні-відігріванні показує, що однією з важливих цитоплазматичних структур, які забезпечують стабільність (чи нестабільність) клітини, є система мембранних цитоскелетних білків (Белоус А.М. и др., 1985, Бондаренко В.А., 1988). При додаванні до еритроцитів осмотично активних речовин і, зокрема, непроникаючих кріопротекторів, реакція білків цитоскелету проявиться, насамперед, у зміні об’єму й форми клітин. При цьому важливим є те, що поряд з осмотичними факторами температура також впливає на формотвірні процеси, утягуючи в реакцію клітин білки цитоскелету і мембрану в цілому (Glazer H., 1976). Оскільки при дослідженні стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання було виявлено, що найбільш оптимальним режи-мом при 0С є дозоване додавання кріопротектора до суспензії еритроцитів протягом 40 хв., а при 22С одномоментне (по краплях), то при вивченні впливу ПЕО-1500 на морфологію еритроцитів були використані саме ці режими.
При дослідженні змін форми еритроцитів нами була використана класифікація, запропонована (Козинец Г., 1984). Дана класифікація дозволяє систематизувати послідовність змін поверхневої архітектоніки клітин у процесі їхньої трансформації.
Додавання кріопротектора ПЕО-1500 до еритроцитів при 22С супроводжується значною деформацією і дегідратацією клітин. Зміна популяційного складу клітин (табл. 1) супроводжується достовірним зменшенням числа перехідних форм дискоцитів типу "шовковична ягода" і з відростками. Паралельно значно збільшується число передгемолітичних форм клітин типу сфероцитів та інших дегенеративно змінених видів еритроцитів. Виходячи з отриманих даних, можна зробити висновок, що додавання кріопротектора ПЕО-1500 до еритроцитів при 22С сприяє прискоренню процесу диск-сфера трансформації перехідних форм дискоцитів у передгемолітичні.
Таблиця 1
Морфологічна характеристика еритроцитів крові людини в умовах дії кріопротектора ПЕО-1500 і заморожування-відігріву
|
Умови досліду |
Типы еритроцитів, % |
|
Нормоцити |
Дискоцити |
Сфероцити |
Інші форми еритроцитів |
|
з гребнем |
із зубчастим краєм |
з відростками |
“шовковична ягода” |
гладкі |
з відростками |
|||
|
Контроль |
33,2 6,8 |
1,6 0,1 |
24,0 + 2,8 |
32,6 8,0 |
3,1 0,1 |
1,5 0,05 |
2,0 0,6 |
2,0 0,04 |
|
ПЕО при 0 С |
61,7 5,8* |
1,8 0,7 |
,3 2,7 |
6,8 1,6* |
,2 0,08* |
,4 1,2* |
,2 0,07* |
6,6 0,5 |
|
ПЕО-при 22 С |
39,38,1 |
33,30,5* |
21,33,7 |
,53,6* |
,90,03* |
,10,6* |
,00,05 |
,61,6* |
|
Заморожування-відігрів після інкубації з ПЕО при 0С. |
51,7 3,9** |
1,7 0,8 |
14,9 1,7 |
7,6 0,6** |
1,5 0,4** |
11,5 2,9 |
1,3 0,37** |
9,8 1,7** |
|
Заморожування-відігрів після інкубації з ПЕО при 22С. |
228,81,4** |
2,9 1,2 |
,9 6,4 |
,1 2,4** |
0,4 0,01** |
14,7 4,2 |
0,5 0,01** |
14,7 1,9** |
Примітка: * –відмінності достовірні (Р<0,05) порівняно з контролем, ** – відмінності достовірні (Р<0,05) при порівнянні морфологічних характеристик після заморожування-відігріву еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при 0С і 22С.
Отримані дані свідчать, що краще збереження форми клітин у процесі кріоконсервування досягається після інкубації їх із кріопротектором ПЕО-1500 при 0С. Це підтверджується також даними електронно-мікроскопічних досліджень ультраструктури і конформаційних змін еритроцитів, де було виявлено, що температура інкубації клітин із кріопротектором впливає на ультраструктуру і деформованість еритроцитів після заморожування-відігрівання. Так, після розморожування клітин, інкубованих із ПЕО-1500 при 0С спостерігається висока збереженість ультраструктури й помірна деформація цих клітин. Інкубація клітин при 22С й наступне заморожування-відігрівання призводить до значного росту в популяції кількості сфероцитів, збільшення числа "рожевих", ушкоджених еритроцитів.
Таким чином, узагальнюючи отримані дані, можна зробити висновок, що в клітинах, інкубованих із кріопротектором ПЕО-1500 при 22С, ушкодження і необоротна трансформація перехідних форм дискоцитів у передгемолітичні відбуваються під час інкубації клітин із кріопротектором, а наступне заморожування-відігрівання підсилюють ушкодження. Інкубація еритроцитів із кріопротектором при 0С сприяє збереженню нативної форми клітин, що може бути пов'язане з тим, що низька температура "фіксує" об’єм і форму білкового цитоскелету і набута стабільність форми зберігається й у циклі кріоконсервування.
Гіпертонічні розчини різних непроникаючих осмотично-активних речовин викликають у тому чи іншому ступені стиск клітини, обумовлений частковою об'ємною дегідратацією цитоплазми. Це означає, що вміст клітини перейшов в іншу, більш конденсовану форму, при якій динамічна структура білків цитоскелету і цитозолю зазнавала фазових і конформаційних перетворень. Тому процес дегідратації є дуже важливим фактором у структурній модифікації стану клітини в аспекті її стабільності (чи нестабільності) (Bolen W., 2000). Аналіз змін об’єму еритроцитів у залежності від температури інкубації їх із кріопротектором показує, що дозоване додавання ПЕО-1500 при 0С призводить до часткової дегідратації клітин, про що свідчить зміна їхнього об’єму на 28,9%. Інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 22С супроводжується більш значною дегідратацією - зменшення об’єму досягає 44,7%. Зіставляючи ці дані з результатами, отриманими при дослідженні форми клітин, можна зробити висновок, що в еритроцитах спостерігається тісний взаємозв'язок між процесами дегідратації й деформації цих клітин. Чим менше об’єм еритроцитів, тим більше вони деформовані.
Модифікація структури білкового цитоскелету при підвищенні концентрації внутрішньоклітинних електролітів в осмотично стиснутих клітинах може служити початковим етапом появи холодової чутливості еритроцитів. При зменшенні об’єму концентрація усіх внутрішньоклітинних компонентів збільшується, що саме по собі може сприяти зміні молекулярної структури цитоскелету. Тому можна припустити, що після інкубації еритроцитів із кріопротектором ПЕО-1500 при 0С, коли зменшення об’єму клітин менш виражено, відбувається, очевидно, така модифікація структури цитоскелету, що призводить до різкого обмеження деформації форми і формуванню стійкого до низькотемпературного впливу стану.
Фізико-хімічна модифікація білків цитоскелету при температурно-осмотичному впливі на клітини і після заморожування-відігрівання. Той факт, що стійкість еритроцитів до заморожування після інкубації з ПЕО-1500 при 0С пов'язана, насамперед, з модифікацією білків цитоскелету, доводять експерименти, у яких блокується (чи обмежується) можливість структурних змін цих білків. Як видно з даних, представлених на рис. 3, теплова денатурація спектрину при 50С (Coakley W.T. et al., 1981), що передує інкубації еритроцитів у розчині кріопротектора й обмежуюча його участь у структурно-функціональній модифікації клітин, призводять до зниження їхньої стійкості до заморожування-відігрівання, що виявляється в підвищенні рівня гемолізу як у випадку інкубації при 0С (рис. 3 в), так й у випадку інкубації з кріопротектором при 22С (рис. 3 г) у порівнянні з аналогічними варіантами інкубації нативних клітин (рис. 3 а, б).
Отже, зниження стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання після термоденатурації спектрину обумовлено змінами властивостей цього білка і його здатності до взаємодії з іншими компонентами мембрани (Coakley W.T. et al., 1981, Lee J.C., 1999). Разом з тим, після розморожування еритроцитів з денатурованим спектрином, інкубованих із кріопротектором при 22С, рівень їхнього гемолізу вище (рис. 3 г), ніж у передінкубованих з ПЕО-1500 при 0С (рис. 3 в). Це може бути пов'язане з особливостями взаємодії поліетиленоксиду з мембранами еритроцитів при різних температурах, коли при 0С взаємодія даного кріопротектора з клітинами слабшає і локальні деформації плазматичної мембрани менш виражені, тобто не відбувається перебудова білків цитоскелету, що веде до дестабілізації клітин. Можливо також, що розходження, які зберігаються, у стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання в залежності від температурного режиму інкубації з кріопротектором пов'язані зі здатністю інших білків цитоскелету адекватно реагувати на температурно-осмотичний вплив і додавати клітинам підвищеної стійкості.
e0 - , 00d1; - , 220d1; - e2 , 00d1; - , 22 0d1.
Рис. 3 Вплив теплової денатурації спектрину на стійкість до заморожування еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при різних температурах.
Аналогічні закономірності встановлені й в експериментах, у яких інкубації еритроцитів у розчині кріопротектора передувала інкубація з колхіцином, що інгібує процеси полімеризації актину (Carlsson L., Beckstad I., 1981) і, зв'язуючи зі спектрином (Fuller G.M. et al., 1973), може впливати на утворення його олігомерних форм. Передінкубація еритроцитів з колхіцином також призводить до зниження стійкості еритроцитів, інкубованих у розчині ПЕО-1500 як при 00С, так і при 220С, до дії заморожування-відігрівання. Ці дані підтверджують визначальну роль спектрину й актину в підвищенні стійкості клітин до заморожування-відігрівання, і свідчать, що в механізмі підвищення холодової стабільності еритроцитів важливим є така структурна модифікація цитоскелету, при якій зберігається полімеризована форма актину й формуються олігомери спектрину.
Характер модифікації білків цитоскелету еритроцитів під впливом кріопротектора і заморожування-відігрівання можна адекватно оцінити методом електрофорезу в ПААГ, використовуючи білок-зшиваючий реагент, - діамід, що має здатність утворювати містки між SH-групами білків, що знаходяться на певній один від одного відстані (Haest C.W.H. et al., 1977). У результаті цього при окислюванні SH-груп білків виникають агрегатні білкові комплекси, що виявляються на електрофореграмах у вигляді фракцій високомолекулярних білків на старті гелю.
Інкубація еритроцитів у розчині ПЕО-1500 при 22 0С призводить до деяких порушень просторового упакування частини білків цитоскелету, про що свідчить поява білкових агрегатів на старті гелю, хоча кількість їх незначна і складає 2,4% від усіх мембранних білків (рис. 4).
а - нативні еритроцити; б - еритроцити після заморожування-відігрівання без кріопротектора; в - інкубація клітин з ПЕО-1500 при 220С; г - заморожування після інкубації з ПЕО-1500 при 220С; д - інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С; е - заморожування після інкубації клітин при 00С. М - маркерні білки.
|
Білки |
Вміст, % |
|
Умови експерименту |
|
а |
б |
в |
г |
д |
е |
|
|
Білкові Агрегати |
- |
14,5 |
2,4 |
14,0 |
0,5 |
3,8 |
|
Спектрин |
17,7 |
14,0 |
16,6 |
12,4 |
17,6 |
17,8 |
|
Полоса 2.1 |
12,5 |
13,9 |
10,9 |
9,5 |
10,8 |
12,9 |
|
Полоса 3 |
25,1 |
17,1 |
26,5 |
20,8 |
28,3 |
26,3 |
|
Полоса 4.1 |
9,6 |
7,7 |
6,9 |
4,2 |
5,3 |
7,8 |
|
Актин |
11,3 |
7,8 |
9,7 |
4,3 |
10,0 |
7,5 |
Рис. 4 Електрофорез білків мембран еритроцитів, оброблених діамідом, після їхньої інкубації з кріопротектором при різних температурах і наступного заморожування-відігрівання.
Особливо чітко ці порушення в структурі білків цитоскелету виявляються після розморожування клітин, інкубованих при 220С в розчині ПЕО-1500, де на електрофореграмі з'являються білкові агрегати на старті гелю. Рівень агрегації білків складає біля 14% від усіх мембранних білків. При цьому змінюється і вміст білків в окремих фракціях: знижується вміст спектрину (білок смуги 1 і 2), актину (білок смуги 5), аніонного переносника (білок смуги 3) і смуги 4.1. Утворення білкових агрегатів може бути пов'язане з тим, що в процесі заморожування-відігрівання відбувається порушення просторової структури частини білків мембрани й цитоскелету, у результаті чого з'являються доступні для діаміда SH-групи, що і призводить до утворення зшивок між білками. Зниження вмісту окремих фракцій білків пов'язано, насамперед, із залученням частини цих білків у процес агрегації, про що свідчить гетероморфний характер білкових агрегатів, тобто білки на старті гелю представлені у вигляді окремих смуг, що мають різну молекулярну масу.
При дозованому додаванні кріопротектора ПЕО-1500 до еритроцитів при 00С структура цитоскелету, що виявляється за допомогою гельелектрофорезу, практично не змінюється. У даному випадку на старті гелю не відбувається утворення білкових агрегатів (рис. 4), а розподіл білків по фракціях мало відрізняється від нативних еритроцитів. Після заморожування-відігрівання клітин, інкубованих із кріопротектором при 00С, спектр мембранних білків не так значно відрізняється від нативних клітин, як після розморожування еритроцитів, інкубованих при 220С. У даному випадку агрегація білків під дією діаміду складає в середньому 3,8% від усіх мембранних білків, а розподіл їх по фракціях є більш близьким до контролю.
Це свідчить про те, що інкубація клітин при 00С в присутності екзогенного полімеру дозволяє краще зберегти властивості білків цитоскелету в близькому до нативного стані. Таким чином, попередня інкубація еритроцитів з поліетиленоксидом м.м. 1500 при 0 і 220С супроводжується різним характером модифікації білків спектрин-актинового комплексу. Ці розходження можуть бути обумовлені особливостями структурного стану білків при 0 і 220С, тому що відомо, що при зниженні температури енергетично більш вигідною стає тетрамерна й олігомерна асоціація спектрина (Morrow L.S., Marchest V.T., 1981) і полімерна форма актину (Hoffmeister K.M. et. al., 2001). Додаткові зв'язки між білками цитоскелету, що виникають при формуванні олігомерних форм спектрина й актину при 00С можуть, очевидно, у якомусь ступені визначати реакцію клітини на дію поліетиленоксиду і сприяти підвищенню стійкості клітини до екстремальних впливів. Так, було виявлено, що ізольовані цитоскелети еритроцитів є більш стійкими до дисоціюючої дії гіпертонічних розчинів NaCl при 00С, ніж при 370С (Бондаренко В.А., 1988).
При дослідженні просторової структури цитоскелету в клітинах методом поляризаційної мікроскопії (Саакян Ш.С., 1988), яка подає істотну інформацію про орієнтацію молекул у системі показано, що орієнтаційний порядок молекул у цитоскелеті еритроцитів, інкубованих з поліетиленоксидом м.м. 1500 при 00С, а також після їхнього заморожування-відігрівання, зберігається, що свідчить про збереження просторової структури цитоскелету в нативному стані. Заморожування клітин, інкубованих при 220С, призводить до втрати орієнтаційної впорядкованості молекул у цитоскелеті, тобто відбувається порушення просторової структури цитоскелету, що вказує на структурно-функціональні зміни цих білків.
Таким чином, при інкубації клітин з поліетиленоксидом відбуваються структурні зміни, що охоплюють мембрану в цілому і білки цитоскелету зокрема. Останні в залежності від умов можуть індукувати розвиток у клітині або зниженої, або підвищеної чутливості до наступного заморожування-відігрівання. Повільна оборотність конформаційних змін білків (Белоус А.М., Бондаренко В.А., 1982; Гулевский А.В. и др., 1988), індукованих температурно-осмотичном впливом, означає, що клітини можуть тривалий час зберігати стійкість структури, тобто білки визначають стійкість як вихідного, так і модифікованого стану клітини, обумовлюючи її реакцію на зміну температурних і осмотичних умов середовища. Очевидно, подібного роду перебудови білків цитоскелету при температурах, близьких до 00С, призводять до пригнічення процесів, спрямованих на ініціацію формування трансмембранних дефектів, що служать каналами витоку іонів, метаболітів і білків (Белоус А.М. и др., 1987). Усе це обумовлює низьку дефектність мембрани і тим самим підвищує стабільність клітин у процесі кріоконсервування.
Фосфорилювання мембранних білків і зміна концентрації Са2+ в еритроцитах при температурно-осмотичному впливі. Генералізовані зміни плазматичної мембрани при частковій дегідратації клітин в умовах дії непроникаючого кріопротектора можуть супроводжуватися змінами процесів фосфорилювання-дефосфорилювання мембранних білків, що істотно впливає на характер білок-білкових взаємодій (Филатов В.Л. и др., 1999; Гусев Н.Б., 2001; Mische et al., 1985; Mische S.M., Morrоw J.S., 1988) і, отже на міцність асоціативних зв'язків із плазматичною мембраною.
Проведені нами дослідження з вивчення фосфорилювання білків цитоскелету еритроцитів у присутності -32Р-АТФ (Fairbanks et al., 1978) після інкубації клітин з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500 при різних температурах з наступним заморожуванням-відігріванням свідчать, що в процес холодової стабілізації еритроцитів втягнені структурні зміни цитоскелету, що залежать від ступеня фосфорилювання спектрина. Як видно з даних, представлених на рис. 5, після інкубації еритроцитів із кріопротектором при 00С включення 32Р в спектрин зростає в 2,5 рази, причому після заморожування-відігрівання фосфорилювання спектрина зберігається на більш високому рівні, ніж у нативних еритроцитах. Подібний ефект інтенсифікації включення 32Р в спектрин не спостерігається в клітинах, інкубованих перед заморожуванням з ПЕО-1500 при 220С.
Збільшення рівня фосфорилювання спектрина під впливом інкубації еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С може відображати як особливості структурної модифікації спектрина, так і зміну активності ц-АМФ-незалежної протеїнкінази в цих умовах. Оскільки при 00С енергетично більш вигідною стає олігомерна форма спектрина (Morrow J.S., Mchesi V.T., 1981), а рівень фосфорилювання гексамерних і великих олігомерних форм спектрина більш ніж у двічі перевищує рівень фосфорилювання димерів і тетрамерів (Mische S.M., Morrow J.S., 1985, 1988), то однією з можливих причин підвищення рівня фосфорилювання спектрина в процесі інкубації еритроцитів із кріопротектором при 00С може бути посилення асоціативних зв'язків у спектрин-спектриновому взаємозв’язку й утворення олігомерів спектрина, що може призводити до підвищення стабільності клітин до дії заморожування-відігрівання.
e0 - ; - ee; - 220d1 e6- (); - 0 0d1 - ().
Рис. 5 Фосфорилювання спектрина еритроцитів при різних режимах інкубації з кріопротектором ПЕО-1500 і наступному заморожуванні-відігріванні.
Зростання включення 32Р в спектрин може призвести до зміцнення зв'язків спектринових димерів з білком смуги 4.1 (Eder P.S. et al., 1986), що впливає на ступінь полімеризації актину в цитоскелеті еритроцитів (Pinder J.C. et al., 1979, 1995). Можливо, що інкубація еритроцитів у розчинах ПЕО-1500 при 00С супроводжується посиленням процесів полімеризації актину внаслідок підвищення спорідненості спектрина при його фосфорилюванні до білка смуги 4.1. У роботі (Pinder J.C. et al., 1978) показано, що підвищення процесу фосфорилювання сприяє посиленню взаємодії між спектрином і мономерними молекулами актину, при цьому білки цитоскелету переходять у стан гелю. Виходячи з цього, можна допустити, що посилення взаємодій у комплексі спектрин-білок смуги 4.1-актин є однією з причин генералізованого підвищення механічної стійкості еритроцитів, що сприяє збереженню їхньої форми (Mohandas N., 1988; Manno S. et al., 1995). Така спрямованість у зміні властивостей білків мембранного скелету поряд з іншими факторами може визначати збереження в процесі кріоконсервування фіксованої форми клітин при інкубації еритроцитів у розчині непроникаючого кріопротектора при низькій позитивній температурі. У результаті таких змін білків цитоскелету клітина набуває підвищеної стійкості до заморожування-відігрівання.
Підвищення рівня фосфорилювання спектрина при 00С в умовах часткової дегідратації клітин може бути пов'язане зі зміною активності протеїнкінази. Зміна активності мембранної ц-АМФ-незалежної протеїнкінази, що здійснює фосфорилювання спектрина, може модулюватися Са2+, кальмодуліном, діацилгліцеридами.
Серед різноманітних систем, що контролюють конформаційний та агрегатний стан білків цитоскелету і цитозолю, важливу роль відіграють іони Са2+, що є універсальним вторинним месенджером (Крутецкая З.И., Лебедева О.Е., 2000) і впливає на структуру і стабільність мембран.
У наших експериментах збільшення концентрації внутрішньоклітинного Са2+ у порівнянні з контролем спостерігається після інкубації клітин як при 220С, так і при 00С в гіпертонічних розчинах ПЕО-1500, сахарози і NaCl, що не відрізняються значно своєю осмолярністю і, отже, спричиняють на клітини аналогічний осмотичной ефект. Однак, інкубація еритроцитів при 00С викликає більш високе збільшення внутрішньоклітинного Са2+ (на 40%) як при дії на клітини осмотично активних речовин, так і в ізотонічних умовах, у порівнянні з інкубацією при 220С. Основною причиною підвищення концентрації внутрішньоклітинного Са2+ при інкубації при 00С є, очевидно, гальмування при цій температурі функцій Са2+-АТФ-ази плазматичної мембрани (Winokur C.H., Hartwing J., 1995), що забезпечує вихід Са2+ із клітини проти його електрохімічного градієнта (Айрапетян С.Н., 1990). Виявлене нами підвищення рівня внутрішньоклітинного Са2+ при 00С може сприяти полімеризації мембранних білків (Hoffmeister K.M. et al., 2001) і підвищенню кріостійкості клітин. Оскільки структурно-функціональний стан клітини багато в чому залежить від внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+, виявлені нами розходження в стійкості еритроцитів до факторів низькотемпературного консервування в залежності від температури їхньої інкубації з кріопротектором, можуть бути пов'язані з особливостями стану клітини, викликаного впливом температури і гіпертонії на Са2+-регулюючі системи.
Бар’єрно-транспортні властивості мембран еритроцитів, модифікованих кріопротектором ПЕО-1500 і температурою. Важливим показником глибини перебудови біологічних мембран у присутності кріозахисних агентів можуть бути стан бар'єрної функції мембран і систем транспорту іонів і метаболітів. Оскільки модифікація об’єму і форми клітин, так само як і зміна структури білків цитоскелету, може викликати зміну бар'єрних властивостей мембрани, були досліджені зміни проникності клітинної мембрани для іонів калію під впливом різних режимів інкубації еритроцитів з ПЕО-1500 і заморожування-відігрівання. Як видно з даних, представлених у табл. 2, інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 22 0С збільшує концентрацію К+ у середовищі інкубації, чого не відбувається при дозованому додаванні кріопротектора при 00С. Після розморожування еритроцитів, інкубованих при 220С, вихід К+ із клітин значно зростає (у 1,5 рази) у порівнянні з клітинами, інкубованими при 00С і підданими заморожуванню-відігріванню. Ці факти вказують, що початковий стан мембрани багато в чому визначає результат заморожування-відігрівання клітин. Незначні по величині трансмембранні дефекти, що виявляються у втраті еритроцитами К+ на етапі інкубації з ПЕО-1500 при 220С, значно збільшуються в процесі заморожування-відігрівання. Виникнення й еволюція дефектів у мембрані, проникної для іонів, відображають порушення як у структурі мембрани, так і білках цитоскелету, виявлені нами методом електрофорезу білків мембран еритроцитів. Отже, при порушенні просторового упакування білків цитоскелету відбувається порушення бар'єрних властивостей мембрани. Інкубування еритроцитів у розчині ПЕО-1500 при 00С в значному ступені усуває структурно-функціональні порушення білків цитоскелету, що багато в чому забезпечує краще збереження бар'єрних властивостей плазматичної мембрани.
Таблиця 2
Вихід іонів К + при різних режимах інкубації еритроцитів
з кріопротектором ПЕО-1500 і після заморожування-відігрівання.
|
Умови експерименту |
Концентрація К+, мМ/л |
|
Контроль |
4,2 0,6 |
|
Інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С |
3,8 0,4* |
|
Інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 220С |
5,7 0,7* |
|
Заморожування-відігрівання еритроцитів після інкубації з ПЕО-1500 при 00С |
23,3 2,2* |
|
Заморожування-відігрівання еритроцитів після інкубації з ПЕО-1500 при 220С |
37,2 0,9** |
Примітка: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,001
Це є дуже важливим моментом, оскільки початковий стан підвищеної проникності може бути істотним фактором у механізмі підвищення чутливості клітин до наступного охолодження і заморожування-відігрівання, тому що є передумовою до розвитку колоїдно-осмотичного набрякання і лізису еритроцитів.
Температурно-осмотичний вплив на клітини може супроводжуватися зміною стану систем транспорту катіонів і метаболітів. Дослідження особливостей транспорту катіонів за допомогою 86Rb показали, що в еритроцитах, інкубованих з ПЕО-1500 при 00С, спостерігається краща збереженість систем транспорту катіонів у процесі кріоконсервування, ніж у клітин, інкубованих із кріопротектором при 220С, де відбувається різке інгібування Na-насоса, а після заморожування-відігрівання таких клітин спостерігаються значні порушення транспорту катіонів, що особливо яскраво виявляється у відсутності активності Na-насоса.
Порушення транспорту катіонів у клітину при інкубації їх із кріопротектором і наступне заморожування-відігрівання може супроводжуватися порушенням транспорту метаболітів (Ellory, 1983,1984; Гулевский А.К., 1986). У наших експериментах інкубація еритроцитів із кріопротектором ПЕО-1500 при 220С і наступне заморожування-відігрівання призводить до істотного (у 2 рази) зниження накопичення 14С-гліцину як у порівнянні з контролем, так і з клітинами, інкубованими при 00С. Відсутність значних порушень транспортної системи гліцину при інкубації еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С і після заморожування-відігрівання може свідчити про збереженість структурно-функціональних властивостей білків мембран еритроцитів.
Механізм гальмування транспорту катіонів і метаболітів, за даними роботи (Гулевский А.К. и др., 1988), значною мірою пов'язаний із взаємодією молекул кріопротектора з мембраною. Виявлене нами значне посилення взаємодії ПЕО-1500 із клітинами при 220С є, очевидно, важливим чинником порушення транспорту іонів і метаболітів у клітинах за даних умов інкубації. Зменшення кількості ПЕО-1500, що зв’язався з мембранами при 00С, сприяє кращому збереженню системи транспорту іонів і метаболітів.
Таким чином, просліджується взаємозв'язок між кількістю кріопротектора ПЕО-1500, що зв'язується з мембранами еритроцитів, змінами їхнього об’єму і форми, структурно-функціональною перебудовою білків цитоскелету, станом бар'єрної функції мембран, систем активного і пасивного транспорту іонів і метаболітів та стійкістю клітин до заморожування-відігрівання. В умовах інкубації еритроцитів при 00С, коли зменшується зв'язування кріопротектора з клітинами, відбуваються такі функціональні перебудови білків цитоскелету, які призводять до фіксації об’єму й форми еритроцитів, і багато в чому забезпечують збереження бар'єрних властивостей мембрани і систем активного і пасивного транспорту іонів і метаболітів, що в остаточному підсумку сприяє підвищенню стійкості еритроцитів до кріоконсервування.
Кріоконсервування еритроцитів у великих об’ємах під захистом поліетиленоксиду з попередньою "холодовою стабілізацією" клітин. Проведені нами дослідження показують, що стійкість еритроцитів до заморожування до – 1960С в присутності поліетиленоксиду м.м. 1500 зростає, якщо температуру інкубації клітин у розчинах кріопротекторів перед заморожуванням знизити до 0-40С, а захисну речовину вводити дозовано, тобто створити умови для "холодової стабілізації" компонентів плазматичної мембрани і білків цитоскелету до дії молекул ПЕО-1500. У такому варіанті, розвиваються фізико-хімічні процеси перебудови мембран і цитоскелету, що сприяють стабілізації клітин при їхньому заморожуванні.
Виходячи з цього, нами розроблений спосіб кріоконсервування еритроцитів у великих об’ємах (від 200 до 600 мл) під захистом кріопротектора ПЕО-1500, який не потребує видалення його після розморожування клітин. Принцип цього методу полягає в тому, що після видалення плазми до еритроцитів при 0-40С додають 30% розчин ПЕО-1500, приготовлений на фізіологічному розчині NaCl і 0,01 М фосфатному буфері. Кріопротектор додають протягом 40 хв 10 рівними порціями 1:1 за об’ємом. Такий режим підготовки сприяє розвитку підвищеної стійкості еритроцитів до наступного заморожування-відігрівання, що виявляється в значному зниженні рівня гемолізу відразу після розморожування клітин і, особливо, у зменшенні осмотичної крихкості після переносу їх у середовища з фізіологічною тонічністю, у порівнянні з клітинами, інкубованими перед заморожуванням при 220С (рис.6).
Дослідження основних функціональних показників – АТФ і 2,3 ДФГ показує, що в еритроцитах, кріоконсервованих по розробленому методу, вони зберігаються на рівні контрольних величин (рис. 6), що свідчить про структурно-функціональну повноцінність клітин. Це підтверджується також дослідженням іонного гомеостазу. Як видно з табл.3, елімінація іонів К+ із клітин після заморожування-відігрівання в умовах попередньої "холодової стабілізації", невелика і іонний баланс еритроцитів змінюється незначно, що свідчить про збереження функції транспортної системи плазматичної мембрани клітин після кріоконсервування.
а) б) в) г)
Рис. 6 Рівень гемолізу (а), АТФ (в), 2,3 ДФГ (г) і осмотична крихкість (б) еритроцитів, кріоконсервованих з ПЕО-1500.
А - еритроцити, інкубовані з ПЕО-1500 при 220С; Б, В – еритроцити, інкубовані з ПЕО-1500 при 00С; Г- нативні еритроцити.
Таблиця 3
Перерозподіл іонів в еритроцитах, кріоконсервованих
згідно з розробленим методом.
|
Умови експерименту |
Позаклітин. К+, мМ/л |
Внутрішньокл. К+, мМ/л |
Позакліт. Na+, мМ/л |
Внутрішньокл. Na+, мМ/л |
|
Контроль |
4,1 + 0,4 |
76,1 + 1,6 |
147 + 5 |
18,4 + 4,0 |
|
Розроблений метод |
17,8 + 3,0 |
67,0 + 3,3 |
143 + 4 |
21,2 + 3,0 |
|
P < 0,01 |
P < 0,02 |
P < 0,1 |
P < 0,1 |
Дослідження кисневотранспортної функції еритроцитів після кріоконсервування показує, що вона зберігається на рівні контрольних величин. При оцінці властивостей деконсервованих еритроцитів важливим показником є їхня приживлюваність у руслі крові реципієнта. Проведені дослідження з визначення життєздатності розморожених еритроцитів, інкубованих із кріопротектором при 00С, за допомогою 51Cr, показують, що в середньому виживаність еритроцитів складає 82,5 2,9%, а час циркуляції в кровоносному руслі варіює в широкому діапазоні: Т1/2 від 9 до 40 днів, що свідчить про досить високу життєздатність клітин, кріоконсервованих згідно із розробленим методом.
Оскільки в даний час для кріоконсервування еритроцитів донорської крові найбільш широко застосовується гліцериновий метод (Аграненко В.А. и др., 1980; Sumida S., Oshikawa K., 1999), що є досить трудомістким у зв'язку з триразовим відмиванням еритроцитів перед трансфузією, а також ведуться роботи зі створення безвідмивного способу кріоконсервування еритроцитів (Sputtek A. et al., 1994, 2001) на основі непроникаючого кріопротектора гідроксиетилкрахмалю (ГЕК) з м.м. 20000, що використовується в 25%-й концентрації, було проведене порівняння розробленого нами безвідмивного методу кріоконсервування з цими методами. Проведені експерименти показують (табл. 4), що найбільш висока виживаність клітин після розморожування спостерігається в еритроцитах, заморожених згідно із розробленим методом з ПЕО-1500, і вона практично в 2 рази вище, ніж у клітин, кріоконсервованих з ГЕК.
Таблиця 4
Виживаність еритроцитів після розморожування, кріоконсервованих за різними методами
|
Донори |
Виживаність еритроцитів, % |
|
30% ПЕО-1500 |
30% гліцерин |
25% ГЕК |
|
|
1 |
98,0 |
91,2 |
46,0 |
|
2 |
98,8 |
92,0 |
56,8 |
|
3 |
98,9 |
94,2 |
54,9 |
|
4 |
95,8 |
89,8 |
40,1 |
|
5 |
97,9 |
91,8 |
49,5 |
Отримані дані свідчать, що розроблений метод кріоконсервування еритроцитів з ПЕО-1500 дозволяє в значній мірі підвищити виживаність клітин після розморожування в порівнянні з існуючими методами кріоконсервування еритроцитів з непроникаючими кріопротекторами, а також значно спрощує й робить дешевшою процедуру одержання якісних деконсервованих клітин у порівнянні з методами кріоконсервування еритроцитів із проникаючими кріопротекторами.
Тому розроблений нами безвідмивний метод кріоконсервування еритроцитів є більш перспективним у порівнянні з існуючими і може знайти широке застосування в практичній медицині.
Таким чином, результати, отримані при вивченні механізмів температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів до дії факторів низькотемпературного консервування свідчать, що в основі цього явища лежить структурно-функціональна модифікація плазматичних мембран і білків цитоскелету клітин, характер і спрямованість якої визначається впливом температури і рівнем дегідратації на системи, що регулюють стан зазначених вище компонентів клітини.
ВИСНОВКИ
Список робіт, опублікованих за темою дисертації
АНОТАЦІЯ
Бабійчук Л.А. Механізми температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів при охолодженні і заморожуванні в присутності непроникаючого кріопротектора.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2002.
В дисертації представлено теоретичне обґрунтування і нове вирішення наукової проблеми температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів до дії непроникаючих кріопротекторів і низьких температур.
Установлено, що основна роль у механізмах температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів належить білкам цитоскелету клітин, модифікація яких призводить до підвищення стійкості еритроцитів до дії факторів кріоконсервування за умов їх холодової експозиції при 0-4С у розчинах поліетилеоксиду м.м. 1500.
Уперше показано, що спрямованість структурної модифікації плазматичних мембран і білків цитоскелету визначається впливом температури і рівнем дегідратації на системи, що регулюють їхній структурно-функціональний стан. Це пов’язано зі змінами концентрації внутрішньоклітинного кальцію і рівнем фосфорилювання білків. Стабілізація структурно-функціонального стану білків цитоскелету еритроцитів під впливом холодової інкубації клітин із кріопротектором супроводжується підвищенням рівня фосфорилювання спектрину (у 2.5 рази) і концентрації внутрішньоклітинного Са2+ (на 40%) - процесів, що підтримують білки у полімерному стані.
В результаті проведеного вивчення механізмів температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів до дії кріоконсервування обґрунтовані нові підходи для спрямованої модифікації структурно-функціонального стану клітин на етапах перед кріоконсервуванням з метою підвищення їхньої стійкості до заморожування-відігріву. Це дало можливість розробити новий безвідмивний спосіб кріоконсервування еритроцитів із непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500, який може знайти широке застосування в практичній медицині.
Ключові слова: еритроцити, плазматична мембрана, білки цитоскелету, фосфорилювання, температурно-осмотична стабілізація, непроникаючий кріопротектор ПЕО-1500, кріоконсервування, заморожування-відігрів, безвідмивний спосіб кріоконсервування.
Аннотация
Бабийчук Л.А. Механизмы температурно-осмотической стабилизации эритроцитов при охлаждении и замораживании в присутствии непроникающего криопротектора. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2002.
В работе проведено изучение механизмов температурно-осмотической стабилизации эритроцитов человека при охлаждении и замораживании в присутствии непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 (ПЭО-1500) с целью обоснования новых подходов к проблеме криоконсервирования эритроцитов.
Радиоизотопными, электонно-микроскопическими, поляризационно-микроскопическими, биохимическими и биофизическими методами установлено, что определяющая роль в механизме температурно-осмотической стабилизации эритроцитов к факторам низкотемпературного консервирования принадлежит белкам цитоскелета клеток, модификация которых приводит к повышению устойчивости эритроцитов к действию факторов замораживания при условии их холодовой экспозиции при 0-40С в растворах ПЭО-1500. После тепловой денатурации спектрина и инкубации клеток с ингибитором полимеризации колхицином устойчивость эритроцитов к действию факторов замораживания резко снижается. Использование метода электрофореза в ПААГ с применением сшивающего агента диамида позволило установить, что инкубация эритроцитов с криопротектором ПЭО-1500 при 220С вызывает нарушение пространственного расположения и перераспределения белковых фракций спектрин-актинового комплекса, приводящее к дестабилизации клеток. Напротив, инкубация эритроцитов с криопротектором при 00С способствует стабилизации структуры белков цитоскелета, сохраняет их пространственное и ориентационное расположение в клетке и улучшает тем самым исходы криоконсервирования.
Впервые показано, что направленность структурной модификации плазматических мембран и белков цитоскелета клеток определяется влиянием температуры и уровнем дегидратации под действием непроникающего криопротектора ПЭО-1500 на системы, регулирующие их структурно-функциональное состояние. Это связано с изменениями концентрации внутриклеточного Са2+ и уровнем фосфорилирования белков. Стабилизация структурно-функционального состояния белков цитоскелета эритроцитов под влиянием холодовой инкубации клеток с криопротектором сопровождается повышением уровня фосфорилирования спектрина (в 2,5 раза) и концентрации внутриклеточного Са2+ (на 40%) – процессов, которые поддерживают белки в полимерном состоянии.
В работе установлено, что температура, при которой клетки помещаются в гипертонические условия, оказывает существенное влияние на макроскопические параметры эритроцитов (объем и форму). Инкубация эритроцитов с ПЭО-1500 при 00С приводит к ограничению деформации формы и обратной трансформации переходных форм дискоцитов в нормоциты, что позволяет сохранить стабильность формы клеток в цикле замораживания-отогрева. Обнаружена взаимосвязь между характером связывания ПЭО-1500 с мембранами эритроцитов на этапе инкубации, изменением их объема и формы, модификацией белков цитоскелета, состоянием барьерных свойств мембран и устойчивостью эритроцитов к замораживанию-отогреву. В условиях инкубации клеток при при 00С, когда наблюдается уменьшение связывания криопротектора с клетками, происходят структурно-функциональные перестройки плазматических мембран и белков цитоскелета, которые приводят к “фиксации” объема и формы эритроцитов, и во многом обеспечивают сохранение барьерных свойств мембраны, что в конечном итоге способствует повышению устойчивости эритроцитов к криоконсервированию.
В результате проведенного изучения механизмов стабилизации клеток к действию непроникающего криопротектора и низких температур обоснованы новые подходы для направленной модификации структурно-функционального состояния клеток на начальных этапах перед криоконсервированием с целью повышения их устойчивости к замораживанию-отогреву. Эти подходы заключаются в формировании определенных температурно-осмотических условий, при которых происходит стабилизация плазматических мембран и белков цитоскелета. Разработаны оптимальные условия для структурной стабилизации эритроцитов, заключающиеся в предварительной инкубации эритроцитов при 0-40С и дозированном введении криопротектора. На основе принципа “холодовой стабилизации” разработан и защищен патентом Украины способ криоконсервирования эритроцитов под защитой непроникающего криопротектора ПЭО-1500, который позволяет в значительной мере повысить их устойчивость к замораживанию-отогреву и сохранять структурно-функциональные показатели клеток на достаточно высоком уровне. Данный метод является более перспективным по сравнению с существующими в настоящее время методами криоконсервирования эритроцитов и может найти широкое применение в практической медицине.
Ключевые слова: эритроциты, плазматическая мембрана, белки цитоскелета, фосфорилирование, температурно-осмотическая стабилизация, непроникающий криопротектор ПЭО-1500, криоконсервирование, замораживание-отогрев, безотмывочный способ криоконсервирования.
SUMMARY
Babijchuk L.A. Mechanisms for Temperature-Osmotic Erythrocytes’ Stabilization when Cooling and Freezing in the Presence of Non-Penetrating Cryoprotectant.- Manuscript.
Thesis for the Doctor’s degree (biology) obtaining on the specialty 03.00.19: cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Science of Ukraine, Kharkov, 2002.
In the thesis we have presented the theoretical generalization and new solving for a scientific problem of temperature-osmotic erythrocytes stabilization to the effect of non-penetrating cryoprotectants and low temperatures.
It has been established that the main role in the mechanisms for low temperature erythrocytes stabilization belongs to the proteins of cell cytoskeleton, modification of those has resulted in an increase of erythrocytes stability to the effect of cryopreservation factors under the conditions of their cold exposure at 0-40C in PEO-1500 solutions.
It has been shown for the first time that the direction of structural modification of plasmatic membranes and cytoskeleton proteins is determined by the temperature effect and dehydration level on the systems, regulating their structural and functional state. This fact is related to the changes in concentration of intracellular calcium and the level of proteins phosphorylation. Stabilization of structural and functional protein state of the erythrocytes cytoskeleton under the effect of cells cold incubation with the cryoproetctant is accompanied with the increase in the level of spectrine phosphorylation (by 2.5 times) and concentration of intracellular Ca2+ (by 40%) - the processes, maintaining the proteins in a polymeric state.
As a result of carried-out investigation of the mechanisms for temperature-osmotic erythrocytes stabilization to cryopreservation effect we have substantiated new approaches for the directed modification of cell structural and functional state at the stages before cryopreservation with the aim of increasing their stability to freeze-warming. This fact has given the possibility to elaborate the new washing-out method for erythrocytes cryopreservation with non-penetrating cryoprotectant PEO-1500, which can be widely applied in practical medicine.
Key words: erythrocytes, plasmatic membrane, cytoskeleton proteins, phosphorylation, temperature-osmotic stabilization, PEO-1500 non-penetrating cryoprotectant, cryopreservation, freeze-thawing, washing-out method for cryopreservation.
Відповідальний за випуск Б.П. Сандомирський
________________________________________________________
Підписано до друку 1.10.2002 р. Формат 60х90 1/16
Тираж 100 прим. авт. арк. 1,9
Надруковано в ТОВ "Рейтинг", вул. Сумська, 37,
Тел.: 470123, 143426