Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
КЛІХ ЛАРИСА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 577.12:543.554.2:546.36/42:636.028
ОБМІННІ ПРОЦЕСИ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ПРИ ОТРУЄННІ ЦЕЗІЄМ І СТРОНЦІЄМ ТА ЗМІНІ КИСЛОТНО-ЛУЖНОГО СТАНУ
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інтенсивність обмінних процесів у клітинах залежить від багатьох факторів і, в тому числі, від екологічної ситуації, в якій перебуває організм. Відомо, що в цих процесах, які відповідають за енергозабезпечення організму, беруть участь системи, до складу яких входять велика кількість ферментів, їх інтермедіати, нікотинамідні і залізопорфіринові комплекси, флавопротеїди, убіхінони, інші структури, що є складними хімічними сполуками, чутливими до будь-яких зовнішніх змін. Саме тому активність функціонування обмінних процесів залежить від хімічного складу внутрішнього середовища, його кислотно-лужного стану, вмісту відповідних субстратів, активаторів, інгібіторів каталізу тощо.
Солі важких металів за своїми властивостями є хімічно активними речовинами. Токсичність їх визначається здатністю впливати на динамічну хімічну рівновагу в системі живих організмів, що зумовлено утворенням міцних зв’язків із хімічними компонентами клітини, головним чином з біологічними молекулами. Проникаючи в організм тварин і людини, вони діють на клітинні мембрани, впливають на структуру та інтенсивність функціонування внутрішньоклітинних органел і біологічних молекул, спричиняють пошкодження мітохондрій – структур, в яких активно протікають окисно-відновні процеси (Мудрий І.В., Короленко Т.К., 2002; Гудков І.М., Вінничук М.М., 2003). Результатом цього є підвищення проникності мітохондріальної мембрани, що призводить до втрати нікотинамідних коферментів, адже тільки окиснена форма нікотинамідаденіндинуклеотиду може проникати через пошкоджену мембрану, а відновлена - залишається фіксованою всередині мітохондрій (Ленінджер А., 1985). Це змінює співвідношення окиснених та відновлених форм нікотинамідних коферментів і впливає на стан обмінних процесів, гальмуючи реакції енергозабезпечення в організмі отруєних тварин.
Важкі метали цезій і стронцій у великій кількості потрапляють у навколишнє середовище в зв’язку з інтенсивним антропогенним забрудненням і, особливо, під час техногенних викидів підприємствами атомної, гірничо-видобувної, металургійної, хімічної, машинобудівної, паливно-енергетичної промисловості і комунального господарства. Накопичення цих металів призводить до розвитку ряду біохімічних змін в організмі, а період їх виведення є досить тривалим (Єршов Ю.О., Плетньова Т.В., 1989; Власик Л.І., 2000).
Дослідження механізмів токсичної дії важких металів на різні сторони обміну речовин та перетворення енергії багато років проводяться на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету під керівництвом академіка Д.О. Мельничука. Вони спрямовані на вивчення порушень метаболізму, що виникають під впливом важких металів, з метою їх корекції і створення на цій основі методів лікування, а також орієнтовані на пошук ефективних способів прискореного виведення їх сполук з організму тварин (Мельничук Д.О., 1989; Мельникова Н.М. та ін., 2005).
У сучасній науковій літературі недостатньо вивчені питання впливу цезію та стронцію на стан обмінних процесів в організмі отруєних тварин. Не досліджено вплив цезієвої і стронцієвої інтоксикації на показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну та способи корекції метаболічних порушень шляхом зміни параметрів кислотно-лужного стану організму. Цим зумовлена пріоритетність досліджень стану обмінних процесів в організмі щурів при введенні солей цезію і стронцію та виявлення впливу змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність їх накопичення, а також на пошук способів прискореного виведення цих металів з організму тварин.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідної роботи кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету: «Вивчити біохімічну характеристику тканин організму тварин, токсикованих важкими металами та розробити способи їх елімінації» (номер державної реєстрації 0106U003874) (2006 - 2010 рр.).
Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити обмінні процеси в тканинах і органах щурів при отруєнні цезієм і стронцієм та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану організму на інтенсивність їх накопичення.
Для досягнення мети роботи необхідно було вирішити такі завдання:
- розробити біологічні моделі введення щурам цезію і стронцію хлоридів;
- визначити особливості розподілу і накопичення цезію та стронцію в тканинах та органах отруєних щурів;
- з’ясувати вплив солей цезію і стронцію на вміст натрію, калію, магнію, кальцію в тканинах та органах отруєних щурів;
- дослідити стан окисно-відновних систем гліколізу й циклу трикарбонових кислот у печінці щурів, отруєних цезію і стронцію хлоридами;
- провести дослідження показників азотного обміну в крові щурів за умов уведення солей стронцію і цезію;
- дослідити показники кислотно-лужного стану крові в щурів за умов уведення їм солей цезію і стронцію;
- дослідити вплив зміни параметрів кислотно-лужного стану крові на вміст цезію і стронцію в органах щурів за умов уведення їх солей.
Об’єкт дослідження – біохімічні механізми регуляції обмінних процесів в організмі щурів за умов уведення тваринам солей цезію і стронцію та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність накопичення цих важких металів.
Предмет дослідження - показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну і кислотно-лужного стану, кров, печінка, нирки, м’язи та кістки білих лабораторних щурів.
Методи дослідження - ферментативні (показники гліколізу та циклу трикарбонових кислот), спектрофотометричні (показники мінерального, азотного, вуглеводного обміну, активність ферментів), потенціометричні (показники кислотно-лужного стану) та статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Показані особливості розподілу та накопичення солей стронцію і цезію в серці, нирках, печінці, м’язах та кістках щурів при внутрішньочеревному їх введенні. Вперше встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів спричиняє зміни рівня основних інтермедіатів, які характеризують стан обмінних процесів. Виявлено зниження інтенсивності окисно-відновних процесів у їх організмі, що зумовлює виникнення явища субкомпенсованого метаболічного ацидозу. Введення щурам солей вказаних металів призводить до зниження активності лактатдегідрогенази і амінотрансфераз у печінці та крові. Виявлено, що в умовах in vitro стронцій та цезій знижують активність лактатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази і малатдегідрогенази. Встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів призводить до зниження в крові вмісту аміаку та глутаміну за одночасної активації процесів сечовиноутворення. Поряд з цим, в організмі таких тварин спостерігається порушення мінерального обміну. Показано, що експериментальні зміни параметрів кислотно-лужного стану крові в бік метаболічного ацидозу сприяють прискоренню перерозподілу та зменшенню накопичення цезію й стронцію в організмі піддослідних щурів.
Наукова новизна одержаних результатів дисертаційної роботи підтверджена чотирма патентами на корисні моделі.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень поглиблюють сучасні уявлення про механізм негативної дії стронцію та цезію на внутрішньоклітинний метаболізм. Встановлено закономірності перерозподілу і накопичення цих важких металів у внутрішніх органах тварин, а також характер змін показників мінерального, вуглеводного, азотного обміну та параметрів кислотно-лужного стану в організмі щурів. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Дніпропетровського державного аграрного університету, Білоцерківського державного аграрного університету, Київського національного університету імені Тараса Шевченка, використовуються в науковій роботі Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, Інституту медицини праці Академії медичних наук України.
Отримані результати можуть стати фундаментальним підґрунтям для розробки нових ефективних способів профілактики та лікування продуктивних тварин за умов отруєння солями цезію та стронцію.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором під керівництвом доктора біологічних наук, академіка НАН України та УААН, професора Д.О. Мельничука. Разом із керівником сформульовано завдання роботи, сплановано напрями досліджень та проаналізовано отримані результати.
Відповідно до поставленої мети та завдань дисертаційної роботи автором проведено аналіз даних наукової літератури, виконано експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів, написано і оформлено дисертаційну роботу.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на II і III Міжнародних наукових конференціях студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (2006 - 2007 р. р., м. Львів), наукових конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ (2006 - 2007 р. р., м. Київ), IX Українському біохімічному з’їзді (2006 р., м. Харків), V Державній науково-практичній конференції «Аграрна наука виробництву» (2006 р., м. Біла Церква), V Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (2007 р., м. Київ), II Міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (2007 р., м. Харків).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 18 робіт, з них - 6 статей у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 12 тез у наукових збірниках конференцій та 4 патенти на корисні моделі.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, 8 додатків та списку використаних джерел, що включає 258 найменувань, з яких 73 латиницею. Робота викладена на 145 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 32 таблицями та 10 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Дослідження виконували в науковій проблемній лабораторії кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого НАУ, в віварії факультету ветеринарної медицини, Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК, а також у відділі регуляції обміну речовин Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Для цього використали клінічно здорових самців білих лабораторних щурів 3-місячного віку, масою тіла 150 – 200 г, яких утримували в віварії на стандартному раціоні в клітках по 6 голів. Під час експерименту використано 240 тварин.
Отруєння щурів проводили впродовж 14 діб, шляхом щоденного внутрішньочеревного введення цезію та стронцію хлоридів у дозі 1/15 , із розрахунку 0,006 г стронцію хлориду або 0,01 г цезію хлориду на 0,1 кг маси тіла (Філов В.А., 2004). З метою моделювання стану метаболічного ацидозу і алкалозу щурам дослідних груп per os уводили 2%-ний розчин HCl - 4 мг на 0,01 кг маси тіла та NaHCO3 - 5 мг на 0,01 кг маси тіла (Мельничук Д.О. та ін., 1995).
Піддослідних тварин розділили на 9 груп по 8 особин у кожній. Досліди проводили згідно зі схемою: I - інтактні щури (контроль); II - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид; ІІІ - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням НСl; ІV - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням розчину NaHCO3; V - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид, після чого впродовж 20 діб вводили розчин НСl; VI - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид; VII - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину НСl; VIII - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину NaHCO3; IX - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид, після чого впродовж 20 діб - розчин НСl.
Для проведення біохімічних досліджень від щурів відбирали зразки печінки, нирок, серця, кісток, м’язів та крові.
Вміст цезію, стронцію, калію, натрію, магнію і кальцію в органах визначали спектрохімічним методом (Бруцке М.Е., 1982), використовуючи режим абсорбції в повітряно-ацетиленовому полум’ї на атомно-абсорбційному спектрофотометрі ААS–30, фірми «Карл Цейс» (Німеччина). Контролем слугували стандартні зразки розчинів металів, виготовлені в Інституті фізичної хімії НАН України (м. Одеса).
Показники кислотно-лужного стану рН, парціальний тиск вуглекислого газу (р СО2) і кисню (р О2), концентрацію бікарбонатів [НСО3-], загальну вуглекислоту (СО2 заг.) та зсув буферних основ (ЗБО) в крові визначали на мікроаналізаторі Blood Gas Analyzer фірми «Rоdelkis» (Угорщина) за методом Зіггард-Андерсена (1964).
Активність ферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (ІДГ, КФ 1.1.1.41) визначали в цитозольній фракції печінки та in vitro за рівнем поглинання НАД+ та НАДН (фірма «Merkck» та «Reanal»), на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм.
Визначення концентрації інтермедіатів гліколізу та ЦТК (ізоцитрату, малату, лактату, пірувату, б-кетоглутарату і оксалоацетату) та глутамату в екстракті печінки проводили з використанням відповідних ферментів ЛДГ (із м’язів свині, «Fluka» (Німеччина)), МДГ (із серця свині, «Sigma» (США)), ІДГ (із печінки великої рогатої худоби, «Sigma» (США)). Оптичну густину дослідної проби вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм (Комаров Ф.М. та ін., 2002).
Зміну величини співвідношення НАД+/НАДН та НАДФ+/НАДФН у цитозолі та мітохондріях клітин печінки з метою виявлення інтенсивності окисно-відновних процесів в отруєному організмі тварин розраховували за номограмним методом (Мельничук Д.О., 1987).
Рівень аміаку і глутаміну в крові визначали на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм (Силакова А.І., Корнюшенко Н.П., 1969).
Концентрацію глюкози, сечовини, активність аланінамінотрансферази (АлАТ, КФ 2.6.1.2) і аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) у крові визначали на біохімічному аналізаторі Microlab-200 фірми «AVL» (Німеччина), з використанням реактивів фірми «Human» (Німеччина).
Експерименти проводили відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в наукових цілях.
Результати досліджень обробляли статистично, з використанням комп’ютерної програми MS Excel (Кучеренко М.Є. та ін., 2001).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Результати проведених досліджень свідчать про значне накопичення цезію та стронцію в досліджуваних органах щурів (табл.1).
Таблиця 1. Вміст стронцію і цезію в тканинах та органах отруєних щурів, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи
Стронцій Цезійінтактні
щури
щури, отруєні SrCl2
інтактні
щури
щури, отруєні CsCl М’язи0,061 ±
0,005
0,102 ±
0,015*
0,011 ±
0,001
0,416 ±
0,030*
Печінка0,040 ±
0,005
0,061 ±
0,003 *
0,0012 ±
0,0001
0,2740 ±
0,0300*
Серце0,0045 ±
0,0003
0,0090 ±
0,0007 *
0,0010 ±
0,0001
0,0670 ±
0,0040*
Нирки0,010 ±
0,001
0,017 ±
0,002 *
0,0046 ±
0,0003
0,1350 ±
0,0100*
Кістки0,065 ±
0,004
0,332 ±
0,035 *
0,0093 ±
0,0005
0,3520 ±
0,0380*
Примітка. Тут і далі * - Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями в групі інтактних тварин.
Показано, що в м’язах щурів, отруєних цезієм, його вміст зростає в середньому в 37, у печінці – в 228, у серці – в 67, у нирках – у 29, у кістках – у 38 разів, а вміст стронцію у тварин, отруєних стронцію хлоридом, підвищується в середньому відповідно в 1,7; 1,5; 2; 1,7 і 5,1 рази.
Особливості перерозподілу цезію в організмі тварин визначаються тим, що він є хімічним аналогом калію і, потрапивши в організм, вступає в конкурентні відносини з останнім за включення в біохімічні процеси. Основна маса калію знаходиться в м’язах, що пояснює накопичення солей цезію в м’язовій тканині (Власик Л.І., 2000).
Відомо, що стронцій є природним аналогом кальцію і конкурує з ним за включення в остеобласти кісткової тканини організму отруєних тварин (Засєкін Д.А., 2004).
Встановлено, що надлишок важких металів змінює макроелементний склад внутрішніх органів піддослідних тварин (табл. 2).
Таблиця 2. Вміст натрію і калію у тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Натрій Калій інтактні отруєні інтактні отруєні М’язи 8,37 ± 0,80 4,83 ± 0,44* 41,10 ± 3,62 23,63 ± 2,51* Печінка 2,69 ± 0,19 4,08 ± 0,43 * 10,60 ± 0,91 16,54 ± 0,54 * Серце 1,42 ± 0,09 1,97 ± 0,16 * 3,00 ± 0,23 4,11 ± 0,15 * Нирки 5,55 ± 0,07 3,42 ± 0,35 * 7,46 ± 0,68 4,58 ± 0,26 * Кістки 21,10 ± 2,62 9,21 ± 0,97 * 31,00 ± 2,42 15,54 ± 1,61 *У м’язах, нирках та кістках щурів, отруєних цезію хлоридом, вміст натрію знижується в середньому відповідно в 1,7; 1,6 та 2,3 рази, а в печінці та серці - підвищується в 1,5 та 1,4 рази. Аналогічні зміни спостерігаються і в перерозподілі калію та магнію (табл. 3). Вміст кальцію знижується в кістках у 2,7 рази та збільшується в м’язах, печінці, серці і нирках відповідно у 2,2; 3,6; 1,4 та 1,3 рази.
Таблиця 3. Вміст магнію та кальцію в тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Магній Кальцій інтактні отруєні інтактні отруєні М’язи 5,10 ± 0,47 1,81 ± 0,14* 0,31 ± 0,01 0,67 ± 0,05* Печінка 0,40 ± 0,02 0,91 ± 0,07 * 0,031 ± 0,001 0,113 ± 0,008 * Серце 0,20 ± 0,02 0,30 ± 0,01 * 0,030 ± 0,002 0,042 ± 0,004 Нирки 0,50 ± 0,04 0,39 ± 0,02 * 0,066 ± 0,007 0,084 ± 0,004 * Кістки 9,80 ± 0,82 4,99 ± 0,34 * 294,69 ± 16,55 108,29 ± 11,27 *Інший розподіл елементів спостерігається в організмі щурів, отруєних стронцієм: у кістках підвищується вміст натрію, калію та магнію в 1,6 рази і знижується - кальцію в 1,7 рази (табл. 4,5).
Таблиця 4. Вміст натрію та калію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Натрій Калій інтактні отруєні інтактні отруєні М’язи 8,37 ± 0,80 6,43 ± 0,66 41,10 ± 3,62 32,87 ± 2,61* Печінка 2,69 ± 0,19 5,53 ± 0,27* 10,65 ± 0,91 11,14 ± 0,86 Серце 1,42 ± 0,09 2,66 ± 0,19 * 3,00 ± 0,23 5,28 ± 0,55 * Нирки 5,55 ± 0,17 3,92 ± 0,27 * 7,46 ± 0,68 7,77 ± 0,50 Кістки 21,11 ± 1,62 33,66 ± 3,07* 31,03 ± 3,42 50,88 ± 4,71 *В інших органах вміст цього елементу підвищується: в м’язах – у 2,0 рази, печінці – в 3,5, серці - в 1,8, нирках – у 1,5 рази. У м’язах вміст калію та магнію знижується відповідно в 1,3 та 1,7 рази, а натрію не змінюється.
Таблиця 5. Вміст магнію та кальцію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Магній Кальцій інтактні отруєні інтактні отруєні М’язи 5,14 ± 0,47 3,00 ± 0,29* 0,31 ± 0,01 0,64 ± 0,03* Печінка 0,42 ± 0,02 1,10 ± 0,05* 0,031 ± 0,001 0,107 ± 0,005 * Серце 0,21 ± 0,02 0,46 ± 0,03 * 0,030 ± 0,004 0,054 ± 0,004 * Нирки 0,59 ± 0,06 0,75 ± 0,08 0,066 ± 0,007 0,100 ± 0,010 * Кістки 9,82 ± 0,82 15,78 ± 1,54 * 294,69 ± 16,55 170,90 ± 11,98 *Вміст натрію, магнію та кальцію у серці і печінці підвищується, а калію не змінюється. В нирках вміст натрію знижується в 1,4 рази, а магнію та калію не змінюється. Отже, в результаті проведених досліджень можна стверджувати, що стронцій та цезій спричиняють перерозподіл макроелементів в організмі щурів.
Дослідження впливу важких металів на активність окремих ферментів гліколізу, циклу трикарбонових кислот та азотного обміну показали, що цезій і стронцій у печінці знижують активність ЛДГ (відповідно на 17 та 13%), НАДФН - залежної ІДГ (відповідно на 26,4 та 37,3%) (табл. 6).
Таблиця 6. Ферментативна активність у печінці та крові щурів, отруєних цезієм та стронцієм, мкмоль/хв/мг білка (М ± m, n = 8)
Фермент Група інтактні щурищури, отруєні
CsCl
інтактні щурищури, отруєні SrCl2
Лактатдегідрогеназа
(НАДН-залежна), печінка
0,430 ±
0,020
0,358 ±
0,015*
0,630 ±
0,010
0,550 ±
0,030*
Ізоцитратдегідрогеназа
(НАДФ+-залежна), печінка
0,015 ±
0,001
0,013 ±
0,001
0,024 ±
0,003
0,025 ±
0,002
Ізоцитратдегідрогеназа
(НАДФН-залежної), печінка
0,0053 ±
0,0004
0,0039 ±
0,0003*
0,0059 ±
0,0005
0,0037 ±
0,0002*
Малатдегідрогеназа
(НАД+-залежна), печінка
0,030 ±
0,003
0,029 ±
0,001
0,056 ±
0,002
0,052 ±
0,004
Малатдегідрогеназа
(НАДН-залежної), печінка
0,13 ±
0,01
0,12 ±
0,01
0,25 ±
0,01
0,28 ±
0,03
Аспартатамінотрансфе рази
(ммоль/мл), кров
4,51 ±
0,17
3,44 ±
0,30*
4,51 ±
0,17
3,07 ±
0,19*
Аланінамінотрансфе рази
(ммоль/мл), кров
2,51 ±
0,13
1,97 ±
0,07*
2,51 ±
0,13
2,05 ±
0,04*
Активність НАДФ-залежної ІДГ та МДГ (як НАД+-залежної, так і НАДН-залежної) не змінюється. Вплив важких металів на активність вищезгаданих ферментів підтверджується і результатами досліджень, проведеними in vitro (табл. 7).
Таблиця 7. Вплив цезію та стронцію на активність ферментів за умов in vitro, мкмоль/хв/мг білка (М ± m, n = 8)
Фермент КонтрольCsCl
(2мг/мл)
CsCl
(20мг/мл)
SrCl2
(2мг/мл)
SrCl2
(20мг/мл)
Лактатдегідрогеназа
(НАДН -залежна)
1,33 ±
0,04
1,49 ±
0,01*
0,91 ±
0,01*
1,59 ±
0,02*
1,10 ±
0,01*
Ізоцитратдегідрогеназа (НАДФ+-залежна)
0,110 ±
0,010
0,099 ±
0,006
0,075 ±
0,004*
0,085 ±
0,003
0,033 ±
0,003*
Ізоцитратдегідрогеназа (НАДФН-залежна)0,168 ±
0,010
0,114 ±
0,010*
0,086 ±
0,003*
0,138 ±
0,010*
0,054 ±
0,004*
Малатдегідрогеназа (НАД+-залежна)
0,64 ±
0,02
0,13 ±
0,02*
0,067 ±
0,001*
0,38 ±
0,03*
0,23 ±
0,02*
Малатдегідрогеназа (НАДН-залежна)14,46 ±
0,61
9,83 ±
0,10*
8,79 ±
0,15*
9,95 ±
0,14*
8,22 ±
0,43*
Активність досліджуваних ферментів залежить від концентрації важкого металу. Причому, введення як цезію, так і стронцію до складу інкубаційного середовища в концентрації 20 мг/мл знижує активність ЛДГ відповідно на 31,3 та 17,3%, ІДГ НАДФ-залежної - на 30,6 та 69,4%, ІДГ НАДФН+-залежної - на 48,8 та 67,9%, МДГ НАД-залежної - на 89,5 та 63,4%, МДГ НАДН+-залежної - на 39,2 та 43,1%.
Активність ЛДГ при введенні цезію та стронцію до складу інкубаційного середовища в концентрації 2 мг/мл має тенденцію до підвищення, а активність інших досліджуваних ферментів знижується.
Виявлений характер змін може бути зумовлений здатністю металів брати участь у процесах комплексоутворення з природними лігандами, що містять тіолові групи, адже, згідно з даними літератури (Володіна Т.Т., Гулий М.Ф., 1984), важкі метали мають здатність входити до складу металоферментних комплексів, що може спричинити активацію або інгібування таких сполук.
Аналіз даних наукової літератури (Голіков С.М. та ін., 1986; Дельва Ю.В., Нейко Е.М., 1990) свідчить, що важкі метали є інгібіторами ферментних систем, хоча в мінімальних концентраціях вони є ефективними активаторами перебігу багатьох біохімічних реакцій, а за умов суттєвого надлишку блокують або сповільнюють цей процес.
Зв’язування тіолових груп призводить до зміни структури молекул, в результаті чого ферменти, що їх містять, здатні втрачати свою активність (Діксон М., Уебб Е., 1982; Голіков С.М. та ін., 1986). Вплив металу, очевидно, може відбуватися на різних стадіях: в період синтезу відповідного ферменту, під час його активації, в момент приєднання ферменту до субстрату тощо.
Живий організм має ряд систем, які здатні зв’язувати іони важких металів (Забродський П.Ф., 1998; Засєкін Д.А., 2001), тим самим зменшуючи їх негативну дію на ферментні системи, чим може пояснюватись відмінність в одержаних результатах випробувань активності ферментів in vitro та in vivo. Одним із захисних механізмів організму є синтез металотіонеїнів – білків, що містять тіолові групи, які можуть зв’язувати важкі метали (Барабой В.А., Петрина Л.Г., 2003).
У результаті проведених досліджень встановлено, що стан отруєння важкими металами характеризується певними метаболічними особливостями, при яких рівень більшості досліджуваних метаболітів відрізняється від контрольного (табл. 8). У крові щурів, отруєних цезієм і стронцієм концентрація глюкози вища, ніж у інтактних тварин відповідно на 38,8 та 33,0%. В печінці отруєних щурів підвищується концентрація пірувату на 26 та 38% і знижується – лактату відповідно на 27,7 та 19,0%. Виявлені зміни можуть бути зумовлені зниженням інтенсивності гліколітичних процесів у печінці отруєних щурів, що підтверджується зменшенням активності ЛДГ.
Таблиця 8. Вміст інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот у печінці щурів, отруєних цезієм і стронцієм, мкмоль/г (М ± m, n = 8)
Показник Групаінтактні
щури
щури, отруєні
CsCl
щури, отруєні SrCl2
Глюкоза 3,30 ± 0,53 5,39 ± 0,31* 4,92 ± 0,26* Лактат 3,58 ± 0,18 2,59 ± 0,16* 2,91 ± 0,18* Піруват 0,165 ± 0,011 0,225 ± 0,012* 0,260 ± 0,010* Ізоцитрат 0,245 ± 0,018 0,219 ± 0,015 0,200 ± 0,020 б-Кетоглутарат 0,135 ± 0,009 0,222 ± 0,014* 0,280 ± 0,020* Малат 0,237 ± 0,013 0,237 ± 0,008 0,270 ± 0,020 Оксалоацетат 0,100 ± 0,010 0,230 ± 0,027* 0,210 ± 0,020*Підвищення концентрації глюкози в крові отруєних тварин при збільшенні концентрації іонів гідрогену також може вказувати на інтенсифікацію процесів глюконеогенезу, що узгоджується з даними Д.О. Мельничука (1989).
Одержані результати узгоджуються з підвищенням концентрації окремих субстратів ЦТК у печінці щурів, отруєних солями цезію та стронцію, а саме: оксалоацетату відповідно на 56 та 54%, б-кетоглутарату - на 39 та 53%, глутамату - на 37 та 18%. Концентрація малату та ізоцитрату в обох дослідних групах залишається без змін.
Багаторівневий контроль клітинного метаболізму, який забезпечує підтримку гомеостазу в змінних умовах зовнішнього середовища, включає, як один із основних факторів, регуляцію окисно-відновного стану в компартментах клітини, що виражається співвідношеннями вільних нікотинамідних коферментів НАД+/НАДН і НАДФ+/НАДФН. Розрахунки цих співвідношень вказують на те, що у тварин, яким вводили цезію і стронцію хлорид, збільшується величина співвідношення НАД+/ НАДН у цитоплазмі клітин відповідно на 45 та 48% (табл. 9).
Таблиця 9. Співвідношення НАД+/ НАДН та НАДФ+/ НАДФН у мітохондріях і цитоплазмі гепатоцитів щурів, отруєних цезієм і стронцієм (М ± m, n = 8)
Співвідношення
коферментів
Група інтактні щури щури, отруєні CsClщури, отруєні SrCl2
НАД+/ НАДН
в цитоплазмі
400 ± 30730 ± 52*
780 ± 51*
НАД+/ НАДН
в мітохондріях
11,00 ± 0,986,20 ± 0,54*
9,50 ± 0,72*
НАДФ+/НАДФН
в цитоплазмі
0,033 ± 0,001 0,033 ± 0,001 0,036 ± 0,002Величина співвідношень НАДФ+/НАДФН у цитоплазмі клітин печінки щурів інтактної та дослідних груп не змінюється. З іншого боку, величина співвідношення НАД+/НАДН у мітохондріях клітин печінки щурів, яким вводили цезію та стронцію хлориди, зменшується відповідно на 44 та 13%. Отже, надлишок солей цезію та стронцію в організмі щурів впливає на перебіг реакцій циклу трикарбонових кислот та гліколізу в печінці, змінюючи інтенсивність перебігу окисно-відновних процесів.
Дослідження вмісту продуктів азотного обміну (аміак, сечовина, глутамінова кислота та глутамін), які використовуються для діагностики фізіологічного стану організму за умов отруєння показало, що в крові щурів, яким вводили розчини цезію і стронцію, знижується концентрація глутаміну в середньому відповідно на 15,7 та 23,0% і аміаку - на 50,2 та 38,6%, а рівень сечовини і глутамату підвищується на 39,0 і 22,4% та 37 і 18% (табл. 10).
Таблиця 10. Вміст продуктів азотного обміну в крові щурів, отруєних цезієм і стронцієм, мкмоль/мл (М ± m, n = 8)
Показник Групаінтактні
щури
щури, отруєні
CsCl
щури отруєні
SrCl2
Аміак 19,96 ± 1,65 9,95 ± 0,89* 12,25 ± 0,95* Глутамін 18,9 ± 1,68 15,93 ± 1,46* 14,56 ± 1,41* Сечовина 11,53 ± 0,97 18,91 ± 0,87* 14,86 ± 0,94* Глутамінова кислота 0,679 ± 0,031 1,076 ± 0,062* 0,82 ± 0,04*Це може вказувати на те, що інтенсивність утилізації амонійного азоту переважає над процесами амонієгенезу, що й зумовлює зменшення концентрації аміаку в крові отруєних тварин порівняно з інтактними. Зазначене припущення підтверджується зниженням активності АсАТ та АлАТ у крові щурів, отруєних цезію хлоридом відповідно на 23,6 та 21,6%, а стронцію хлоридом – на 31,9 та 18,5% порівняно з інтактними тваринами.
Отримані результати дозволяють припустити, що іони важких металів зумовлюють зниження активності ферментів та уповільнення процесів переамінування амінокислот. Відомо (Корнілова С.В., 1986; Мацевич Л.Л., Лукаш Л.Л., 2001; Мудрий І.В., Короленко Т.К., 2002), що амінотрансферази, як і інші ферменти, містять у своєму складі певну кількість HS-груп і тому дуже чутливі до дії таких токсикантів.
Результати досліджень параметрів кислотно-лужного стану крові щурів, отруєних стронцію хлоридом, свідчать про те, що токсичні дози цього металу призводять до змін відповідних показників (табл. 11). При цьому величина рН крові зміщується в кислий бік: з 7,35 у інтактних щурів до 7,23 у отруєних. У цих тварин також знижуються рівень р СО2 - на 15,2%, величина [НСО3-] - на 18,1%, вміст СО2 заг. - на 30,2%, значення ЗБО - на 37,4%, рівень р О2 - на 36,4%. Такий характер змін свідчить про виникнення стану метаболічного ацидозу в організмі отруєних тварин.
Таблиця 11. Кислотно-лужний стан крові щурів, отруєних стронцію хлоридом (М ± m, n = 8)
Показник Група інтактні щурищури, отруєні SrCl2
щури, отруєні SrCl2 з HCl
щури, отруєні
SrCl2 з NaHCO3
рН7,34 ± 0,01
7,23 ± 0,01
7,12 ± 0,01
7,36 ± 0,01
р О2, мм.рт.ст.
53,41 ± 2,47 33,96 ± 2,27* 28,64 ± 2,54* 42,25 ± 3,01*р СО2, мм.рт.ст.
32,13 ± 1,87 27,25 ± 1,34* 24,34 ± 1,27* 41,24 ± 2,49*СО2, заг., ммоль/л
21,45 ± 1,6717,28 ± 1,34*
13,11 ± 1,21* 28,12 ± 2,72*[НСО3-], ммоль/л
20,33 ± 1,58
16,65 ± 1,43*
12,34 ± 0,98* 27,25 ± 1,01* ЗБО, ммоль/л-5,76 ± 0,18
-9,20 ± 0,41*
-10,90 ± 0,54* -4,95 ± 0,41*Ці дані вказують також на те, що отруєні стронцію хлоридом тварини, яким уводили хлоридну кислоту, знаходяться в стані експериментального метаболічного ацидозу. Це супроводжується зниженням величини рН до 7,12, вмісту СО2 заг. - на 40,8%, рівня р СО2 - на 24,2%, величини [НСО3-] - на 39,3%, значення ЗБО - на 47,1% і рівня р О2 - на 46,4%.
В отруєних стронцієм щурів, які додатково отримували натрію гідрокарбонат нормалізуються показники кислотно-лужного стану, за винятком підвищення концентрації бікарбонатів на 25,4% та СО2 заг. - на 27,3%.
Аналогічний характер змін КЛС спостерігається і в щурів, отруєних цезієм (табл. 12). Про це свідчить зміщення показників КЛС в отруєних тварин у напрямі розвитку метаболічного ацидозу. Отруєні цезієм тварини, яким вводили хлоридну кислоту, перебувають у стані метаболічного ацидозу, а ті, що отримували натрію гідрокарбонат - у стані компенсованого алкалозу.
Таблиця 12. Кислотно-лужний стан крові щурів, отруєних цезію хлоридом (М ± m, n = 8)
Показник Групаінтактні
щури
щури, отруєні CsCl щури, отруєні CsCl з HClщури, отруєні CsCl з NaHCO3
рН 7,34 ± 0,01 7,22 ± 0,01 7,11 ± 0,03 7,37 ± 0,03р О2, мм.рт.ст.
53,41 ± 2,47 34,45 ± 2,51* 31,04 ± 1,34* 39,27 ± 2,10*р СО2, мм.рт.ст.
32,13 ± 1,87 26,21 ± 1,49* 23,98 ± 2,05* 39,75 ± 1,34*СО2 заг., ммоль/л
21,45 ± 1,67 16,58 ± 1,34* 14,21 ± 0,98* 27,69 ± 2,35*[НСО3-], ммоль/л
20,33 ± 1,58 15,08 ± 1,44* 13,14 ± 1,31* 26,59 ± 1,95* ЗБО, ммоль/л -5,76 ± 0,18 -9,83 ± 0,78* -11,01 ± 0,99* -4,98 ± 0,59*Показано, що зміна параметрів КЛС крові в бік ацидозу сприяє прискореній елімінації кадмію з організму щурів. Це зумовлюється підвищенням ступеня іонізації та розчинності важких металів за вказаних умов (Мельникова Н.М. та ін., 2007).
Нами було досліджено вплив метаболічного ацидозу й алкалозу на інтенсивність накопичення та виведення стронцію і цезію з органів отруєних щурів (табл. 13).
Таблиця 13. Вміст стронцію в органах отруєних щурів за умов зміни показників кислотно-лужного стану крові, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Групаінтактні
щури
щури, отруєні SrCl2
щури, отруєні SrCl2 з HCl
щури, отруєні SrCl2 з NaHCO3
М’язи 0,061 ± 0,005 0,102 ± 0,015* 0,065 ± 0,002** 0,091 ± 0,015* Печінка 0,040 ± 0,005 0,061 ± 0,003 * 0,042 ± 0,004** 0,051 ± 0,006* Серце 0,0045 ± 0,0003 0,0090 ± 0,0007 * 0,0080 ± 0,0008* 0,009 ± 0,001* Нирки 0,010 ± 0,001 0,017 ± 0,002 * 0,011 ± 0,001** 0,015 ± 0,001* Кістки 0,065 ± 0,004 0,332 ± 0,025 * 0,121 ± 0,012** 0,330 ± 0,040*Примітка. ** - Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями для отруєних тварин.
Показано, що отруєння щурів солями цезію та стронцію на фоні введення хлоридної кислоти призводить до зниження накопичення важких металів у м’язах відповідно в 2,1 та 1,6 рази, в печінці - в 2,3 та 1,5 рази, в нирках тварин обох дослідних груп - в 1,5 рази, в кістках - у 1,3 та 2,7 рази. В серці відмічено тенденцію до зниження накопичення досліджуваних металів.
Зменшення накопичення цезію та стронцію в органах піддослідних щурів на фоні виникнення стану метаболічного ацидозу можна пояснити підвищенням ступеня іонізації та рівня розчинності важких металів, що сприяє їх інтенсивнішій екскреції.
Підтвердженням зазначеного є результати досліджень, в яких уведення щурам цезію і стронцію хлориду поєднували з натрію гідрокарбонатом. За таких умов ступінь накопичення важких металів в органах є таким, як і при відсутності NaHCO3. При цьому відмічено подібні значення показників кислотно-лужного стану крові. Це узгоджується з результатами досліджень інтенсивності виведення важких металів з органів отруєних щурів за умов уведення їх у стан експериментального метаболічного ацидозу після отруєння важкими металами. Результати досліджень свідчать про виведення цезію та стронцію з органів отруєних щурів. Проте у тварин, які після отруєння важкими металами були введені в стан метаболічного ацидозу, процес виведення цезію та стронцію відбувається інтенсивніше. Це відмічено на 4 - 8-му добу дослідження. В цей період спостерігається вірогідна різниця щодо вмісту металів у досліджуваних органах. При цьому найбільш вагомі зміни відзначали у виведенні цезію, де між контрольною і дослідною групами на 20-ту добу різниця перевищувала в м’язах у середньому в 2,8; в нирках – у 5,1; в печінці – у 5,8; в кістках – у 2,8 рази порівняно з отруєними тваринами (табл. 14).
Таблиця 14. Інтенсивність виведення цезію з органів отруєних щурів за умов метаболічного ацидозу, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи Група тварин Доба 1 2 4 8 14 20 М’язи СsCl0,416 ±
0,031
0,457 ±
0,030
0,525 ±
0,045
0,403 ±
0,040
0,332 ±
0,031
0,311 ±
0,030
СsCl +
ацидоз
0,416 ±
0,031
0,449 ±
0,031
0,490 ±
0,040
0,279 ±
0,025*
0,169 ±
0,011*
0,111 ±
0,010*
Нирки СsCl0,135 ±
0,010
0,130 ±
0,011
0,119 ±
0,011
0,091 ±
0,008
0,076 ±
0,006
0,051 ±
0,004
СsCl +
ацидоз
0,135 ±
0,010
0,127 ±
0,011
0,094 ±
0,009*
0,056 ±
0,004*
0,026 ±
0,001*
0,010 ±
0,001*
Печінка СsCl0,274 ±
0,022
0,252 ±
0,021
0,209 ±
0,019
0,189 ±
0,016
0,141 ±
0,011
0,116 ±
0,010
СsCl +
ацидоз
0,274 ±
0,022
0,248 ±
0,020
0,182 ±
0,015*
0,129 ±
0,011*
0,057 ±
0,004*
0,020 ±
0,001*
Кістки СsCl0,352 ±
0,032
0,331 ±
0,029
0,312 ±
0,03
0,254 ±
0,024
0,202 ±
0,021
0,181 ±
0,017
СsCl +
ацидоз
0,352 ±
0,032
0,310 ±
0,028
0,249 ±
0,022*
0,194 ±
0,016*
0,111 ±
0,010*
0,065 ±
0,005*
Результати проведених досліджень свідчать, що цезій і стронцій, накопичуючись в організмі, змінюють інтенсивність окисно-відновних процесів, впливають на вуглеводний, азотний, мінеральний обмін та показники КЛС. Зміну параметрів КЛС у бік метаболічного ацидозу можна використати для прискорення процесу елімінації цезію і стронцію з організму тварин. Зниження вмісту важких металів в органах за умов зміни параметрів КЛС крові отруєних тварин до фізіологічно безпечних меж є важливим фактором при проведенні детоксикаційних та профілактичних заходів у біогеохімічних зонах України зі значним вмістом важких металів у довкіллі.
Одержані результати можуть стати необхідним підґрунтям для розробки ефективних способів профілактики і лікування продуктивних тварин за цезієвого та стронцієвого отруєння, з метою отримання екологічно чистої продукції.
ВИСНОВКИ
У дисертації представлене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється в дослідженні показників азотного, вуглеводного, мінерального обміну та кислотно-лужного стану в організмі щурів, за умов уведення їм цезію і стронцію хлориду, а також вивченні впливу зміни параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність накопичення цих важких металів у тканинах та органах тварин.
1. Встановлено, що в організмі щурів, яким вводили цезію і стронцію хлорид, підвищується вміст цезію в печінці, серці, кістках, скелетних м’язах, нирках відповідно у 228, 67, 38, 37 і 29 разів, а вміст стронцію – в 1,5; 2; 5,1; 1,7 і 1,7 рази порівняно з інтактними тваринами.
2. Введення щурам цезію хлориду призводить до зниження вмісту натрію, калію й магнію в кістках відповідно в 2,3; 2,0; 2,0 рази, нирках - у 1,6; 1,6; 1,5 рази, м’язах - в 1,7; 1,7; 2,8 рази і підвищення в печінці – в 1,5; 1,5; 2,2 рази та серці в 1,4; 1,4; 1,5 рази. Вміст кальцію в кістках знижується в 2,72 рази і підвищується в інших досліджуваних органах. Уведення щурам стронцію хлориду сприяє зменшенню вмісту натрію в нирках у 1,4 рази, калію і магнію в м’язах відповідно у 1,25 і 1,7 рази та кальцію в кістках – у 1,7 рази, що може бути пов'язано з конкурентними відносинами між зазначеними металами.
3. Виявлено, що при введенні щурам цезію хлориду знижується активність лактатдегідрогенази в цитозолі печінки на 17,1%, НАДФН-залежної ізоцитратдегідрогенази – на 26,4%, аспартатамінотрансферази в крові – на 23,6%, аланінамінотрансферази – на 21,6%, а отруєння стронцію хлоридом відповідно на 13,0; 37,3; 31,9 і 18,5%, що може призводити до гальмування реакцій гліколізу та переамінування.
4. Введення до інкубаційного середовища цезію і стронцію хлоридів в концентрації 20 мг/мл in vitro знижує активність всіх досліджуваних ферментів, у тому числі лактатдегідрогенази відповідно на 31,3 і 17,3%, ізоцитратдегідрогенази НАДФ+-залежної – на 30,6 і 69,4%, ізоцитрат-дегідрогенази НАДФН-залежної – на 48,8 і 67,9%, малатдегідрогенази НАД+-залежної – на 89,6 і 63,4%, малатдегідрогенази НАДН-залеж- ної – на 39,2 і 43,1%, що вказує на інгібувальну дію згаданих металів у високих концентраціях, при цьому додавання стронцію хлориду в дозі 2 мг/мл, підвищує активність лактатдегідрогенази на 16,7%.
5. Солі цезію і стронцію спричиняють підвищення концентрації глюкози в крові відповідно на 38,8 і 33,0% та пірувату – на 26,0 і 38,0%, оксалоацетату – на 56,0 і 54,0%, б-кетоглутарату – на 39,2 і 53,0%, глутамату – на 36,9 і 18,0% в печінці, при зниженні вмісту лактату на 27,7 і 19,0%. Величина співвідношення НАД+/НАДН у цитоплазмі гепатоцитів збільшується відповідно на 45,0 і 48,0%, а в мітохондріях, навпаки, зменшується на 43,6 і 13,0%, що можливо, зумовлюється гальмуванням використання гідрогену в обмінних процесах.
6. Виявлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів призводить до розвитку субкомпенсованого метаболічного ацидозу, більш вираженого в крові щурів, отруєних цезієм, про що свідчить зниження величини рН в середньому до 7,22; р О2 – на 35,5%; р СО2 – на 18,5%; [НСО3-] – на 25,8%; СО2 заг. – на 33,6%. Зниження вмісту глутаміну на 15,7 і 23,0%, аміаку – на 50,2 і 38,6% при підвищенні рівня сечовини відповідно на 39,0 і 22,4%, ймовірно, вказує на переважання процесів утилізації амонійного азоту над швидкістю амонієгенезу.
7. В умовах експериментального метаболічного ацидозу в організмі отруєних щурів виявлено зниження накопичення цезію і стронцію в печінці відповідно у 2,3 та 1,5 рази, нирках - у 1,6, м’язах - у 2,1 та 1,6, кістках – 1,3 та 2,7 рази, тоді як введення тварин у стан компенсованого алкалозу не спричиняє вірогідних змін вмісту важких металів у досліджуваних внутрішніх органах порівняно з інтактними щурами.
8. Моделювання експериментального метаболічного ацидозу після введення щурам солей цезію та стронцію сприяє зниженню їх вмісту у внутрішніх органах і більш виражене для цезію, вміст якого зменшується в м’язах, нирках, печінці та кістках відповідно у 2,8; 5,1; 5,8 та 2,8 рази, що можна пояснити посиленням процесів іонізації та підвищенням розчинності досліджуваних металів.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Кліх Л.В., Мельничук Д.О., Мельникова Н.М. Вплив стронцієвого отруєння на вміст субстратів гліколізу і циклу трикарбонових кислот в організмі щурів // Современные проблемы токсикологии. – 2006. – № 3. – С. 21 - 24. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір зразків, виконано біохімічні дослідження, обробку та узагальнення одержаних результатів.
2. Кліх Л.В., Мельничук Д.О., Мельникова Н.М. Вплив цезієвого отруєння на активність окремих ферментів печінки та крові щурів // Науковий вісник НАУ. – К.: НАУ, 2006. – № 102. – С. 49 - 53. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір зразків, виконано біохімічні дослідження.
3. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В. Вплив ізотопів стронцію на активність ферментів печінки отруєних щурів // Науковий вісник Львівської національної академії вет. медицини ім. С.З. Гжицького. – 2006. – Т. 8, № 4 (31), ч. 1. – С. 103 - 106. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір зразків, виконано біохімічні дослідження, обробку та узагальнення одержаних результатів.
4. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Кислотно-лужний стан крові щурів при отруєнні цезієм // Вісник аграрної науки. – 2007. – № 7. – С. 37 - 39. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір зразків, виконано біохімічні дослідження, обробку та узагальнення одержаних результатів.
5. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Накопичення та розподіл стабільного стронцію в організмі експериментальних тварин // Науковий вісник НАУ. – К.: НАУ, 2007. – № 105. – С. 223 - 226. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір зразків, виконано біохімічні дослідження, обробку та узагальнення одержаних результатів.
6. Кліх Л.В Кислотно-лужний стан крові та накопичення стронцію у тканинах щурів // Укр. біохім. журнал. – 2007. – № 4. – С. 62 - 66.
7. Пат. на корисну модель 25193 Україна, G 01 N 33/48. Спосіб створення біологічної моделі: Пат. на корисну модель 25193 Україна, G 01 N 33/48 Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В. (Україна). № u 200704010; Заявл. 11.04.2007; Опубл. 25.07.2007, Бюл. № 11. – 4 с.
8. Пат. на корисну модель 25194 Україна, G 01 N 33/48. Спосіб створення біологічної моделі: Пат. на корисну модель 25194 Україна, G 01 N 33/48 Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В. (Україна). № u 200704011; Заявл. 11.04.2007; Опубл. 25.07.2007, Бюл. № 11. – 4 с.
9. Пат. на корисну модель 25195 Україна, A23J 3/00 В08В 15/00. Спосіб виведення стронцію з організму тварин: Пат. на корисну модель 25195 Україна, A23J 3/00 В08В 15/00 Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В. (Україна). – № u 200704012; Заявл. 11.04.2007; Опубл. 25.07.2007, Бюл. № 11. – 4 с.
10. Пат. на корисну модель 25196 Україна, A23J 3/00 В08В 15/00. Спосіб виведення цезію з організму тварин: Пат. на корисну модель 25196 Україна, A23J 3/00 В08В 15/00 Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В. (Україна). – № u 200704013; Заявл. 11.04.2007; Опубл. 25.07.2007, Бюл. № 11. – 4 с.
11. Кліх Л.В., Мельничук Д.О. Вплив хлоридів цезію і стронцію на вміст метаболітів гліколізу у щурів // Матеріали IX Українського біохімічного зїзду. Харків, 24-27 жовт. 2006р. – Харків, 2006. - Т. 2. - С. 194 - 195.
12. Кліх Л.В., Мельничук Д.О., Мельникова Н.М. Вплив стронцію і цезію на активність деяких ферментів гліколізу та ЦТК в організмі щурів // II Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». Львів, 21-24 берез. 2006 р. – Львів, 2006 – С. 55.
13. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В., Сердюков Я.К. Вплив цезію та стронцію на вміст аміаку і глутаміну в організмі щурів // Конф. проф.-викл. складу, наук. співроб. і аспірантів Навчально-наукового інституту вет. медицини та якості і безпеки продукції тваринництва. Київ, 5 - 6 квіт. 2006 р. – К., 2006. - С. 78.
14. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Розподіл іонів магнію в організмі щурів в умовах підвищеного вмісту стронцію // V Державна науково-практична конференція. Біла Церква, 23 - 25 листоп. 2006 р. – Біла Церква, 2006. – С. 126.
15. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Вплив стронцію на розподіл іонів кальцію в організмі та органах експериментальних щурів // V Державна науково-практична конференція. Біла Церква, 23 - 25 листоп. 2006 р. – Біла Церква, 2006. – С. 111 - 112.
16. Загорська О.В., Кліх Л.В. Мінеральний склад кісткової тканини щурів, отруєних стронцію хлоридом // III Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». Львів, 23 - 27 квіт. 2007 р. – Львів, 2007. – С. 52.
17. Кліх Л.В., Мельничук Д.О. Кислотно-лужний стан крові експериментальних щурів, отруєних цезію хлоридом // III Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». Львів, 23 - 27 квіт. 2007 р. – Львів, 2007. – С. 61 - 62.
18. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В., Тупицька О.М. Отруєння щурів стронцієм та його вплив на мінеральний обмін // V Міжнародний конгрес спеціалістів ветеринарної медицини. Київ, 3 - 5 жовт. 2007 р. – К., 2007. – С. 140 - 141.
19. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Кліх Л.В., Тупицька О.М. Порівняння впливу стабільних цезію та стронцію на вміст кальцію в організмі отруєних щурів // Конф. проф.-викл. складу, наук. співроб. і аспірантів навчально-наукового інституту вет. медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ. Київ, 16 - 17 берез. 2007 р. – К., 2007. – С. 91.
20. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Розподіл йонів калію в організмі щурів в умовах підвищеного вмісту цезію // Конф. проф.-викл. складу, наук. співроб. і аспірантів навчально-наукового інституту вет. медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ. Київ, 16 - 17 берез. 2007 р. – К., 2007. – С. 92.
21. Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Тупицька О.М., Кліх Л.В. Вплив цезію на вміст Fe, Cu, та Zn в організмі щурів // Матеріали II Міжнародної конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери». Харків, 19 - 21 листоп. 2007 р. – Харків, 2007. – С. 40 - 41.
22. Кліх Л.В., Мельничук Д.О., Мельникова Н.М. Окисно-відновні процеси у щурів при отруєнні цезієм // Матеріали II Міжнародної конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери». Харків, 19 - 21 листоп. 2007. – Харків, 2006. – С. 43 - 44.