Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
ФАКУЛЬТЕТ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ
на элективном курсе
«Современные методы генетической диагностики»
для студентов 3 курсов медицинских факультетов
НА ТЕМУ:
"СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДНК-ДИАГНОСТИК НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ"
|
Утверждено на заседании кафедры «11» января 2012г. Харьков 2012 |
Заведующая кафедры, чл.-корр. НАМНУ, д.мед.н., профессор _________________ Е.Я. Гречанина |
Тема 12: "СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДНК-ДИАГНОСТИК НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ"
Актуальность темы.
Реализация Проекта человеческого генома (HGP) способствовала бурному развитию генетической диагностики заболеваний, в частности генного тестирования. В настоящее время насчитывают более 4 тыс. наследственных болезней, генетическая природа которых установлена. Они, как правило, относятся к редким и составляют около 3–5% от всех известных заболеваний. Однако среди определенных этнических групп некоторые наследственные болезни встречаются чаще. Известно также, что мутации генов играют роль и в патогенезе широко распространенных заболеваний. Применение новых технологий для определения генетических мутаций позволяет в некоторых случаях выявить не только уже имеющуюся болезнь, но и предсказать вероятность ее развития у человека в будущем. Выявление и картирование большого числа генов, ассоциированных с развитием заболеваний, изменило проведение традиционных эпидемиологических исследований, позволило уточнить и лучше понять этиологию многих генетических болезней, особенно хронических, разработать методы генетического прогнозирования заболеваний, которые развиваются у лиц среднего и пожилого возраста, расширить возможности медико-генетического консультирования в предупреждении наследования некоторых неизлечимых заболеваний детьми, родители которых являются носителями соответствующих рецессивных генов (например, синдром Тэя — Сакса, серповидно-клеточная анемия, b-талассемия).
Специфической особенностью наследственных болезней является то, что их причиной (и в большинстве случаев единственной) являются изменения ДНК. Вполне понятно, что ДНК-диагностика как технология, направленная на обнаружение причины заболевания, является наиболее адекватным, объективным и информативным подходом к диагностике наследственных болезней. Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы.
Хотя ДНК-диагностика основана на весьма сложных, трудоемких и относительно дорогостоящих исследованиях, она имеет важные преимущества перед традиционными методами диагностики.
Объект исследования - ДНК - остается практически неизменным на протяжении жизни организма, начиная со стадии оплодотворенной яйцеклетки, и это позволяет проводить исследования на любой стадии развития организма. Таким образом, с помощью ДНК-диагностики можно решать следующие задачи, которые часто не удается решить другими методами:
- подтверждение клинического диагноза или дифференциальная диагностика у пациента;
- пресимптоматическая диагностика - когда клинические признаки заболевания с поздним дебютом отсутствуют;
- пренатальная диагностика по ДНК плодного материала (ворсины хориона, клетки амниотической жидкости, кровь плода);
- преимплантационная диагностика по ДНК клеток дробящейся яйцеклетки, оплодотворенной in vitro.
Пресимптоматическая диагностика является принципиально новой возможностью, позволяющей в ряде случаев осуществлять эффективное превентивное лечение (например, в случае болезни Вильсона-Коновалова). Но даже в тех случаях, когда эффективное лечение заболевания отсутствует, получение информации о наличии или отсутствии патологического гена для членов семей со случаями наследственного заболевания имеет большое морально-психологическое значение и служит важнейшим фактором для принятия многих жизненно важных решений, связанных с планированием семьи и деторождения, выбора работы и т.д.
Наиболее важной является пренатальная диагностика, которая позволяет предотвратить рождение больных детей с тяжелыми наследственными болезнями, такими, как миодистрофия Дюшенна, муковисцидоз, миотоническая дистрофия, и позволяет семье, имеющей больного ребенка с наследственным заболеванием, родить здорового ребенка. По сути пренатальная диагностика является единственным эффективным средством профилактики для многих наследственных болезней.
С помощью методов ДНК-диагностики можно также определить носительство поврежденного гена для женщин в случае Х-сцепленных заболеваний (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А и В и др.). Женщина-носительница, как правило, является клинически здоровой, однако ее сыновья с вероятностью 0,5 будут больны. Для женщин-носительниц необходимо рекомендовать пренатальную диагностику, в то время как женщины с генотипом, не отягощенным мутацией, не нуждаются в дальнейшем генетическом консультировании.
Таким образом, ДНК-диагностика позволяет решить ряд проблем для семей с наследственными болезнями, многие из которых просто неразрешимы другими методами. Это определяет значительную роль ДНК-диагностики не только для генетического консультирования, но и для медицины в целом.
Общая цель – знакомство с молекулярно- генетическими методами ДНК-диагностики наследственной патологии.
|
Конкретные цели |
Навыки |
|
|
1.знать область применения молекулярно – генетических методов исследования |
Цели конечного уровня |
|
|
2.знать принципы молекулярно – генетических методов исследования, методы прямой и непрямой ДНК-диагностики 3. знать показания к применению, возможности молекулярно – генетических методов исследования |
1.умение отбирать контингент больных для проведения ДНК-диагностики |
|
|
2.умение истолковывать результаты молекулярно – генетических методов исследования |
||
Задания для самоподготовки и самокоррекции исходного уровня знаний.
Для того, чтобы определить, соответствует ли исходный уровень знаний ожидаемому, решите следующие задачи; правильность решения сопоставьте с эталоном ответов.
Тестовые задания.
А. Осуществление непрямого метода молекулярной диагностики (ПДРФ) возможно, если:
1. искомый ген картирован
2. мутация не идентифицирована
3. ген не секвенирован
4. пробанд отсутствует
5. известны нуклеотидные последовательности, фланкирующие ген и к ним имеются ДНК-зонды или олигопраймеры
Б. Как векторные молекулы могут быть использованы:
1. плазмиды
2. дрожжи
3. фаги
4. хромосомы
5. липосомы
В. Методы работы с ДНК:
1. гибридизация соматических клеток
2. создание рекомбинантных молекул
3. Саузерн-блот гибридизация
4. создание библиотек ДНК-зондов
5. полимеразная цепная реакция
6. электрофорез белков плазмы
7. генеалогический анализ
Г. Как генетические маркеры могут быть использованы:
1. полиморфизм хромосом (морфологические перестройки)
2. сцепленные признаки в родословных
3. полиморфные сайты рестрикций (ДНК-маркеры)
4. группы крови
5. геномный ДНК- отпечаток
6. комплекс HLA
7. триплетность кода
Д. Методы молекулярной диагностики наследственных болезней:
1. прямое ДНК-зондирование
2. ПДРФ
3. геномная дактилоскопия
4. дерматоглифика
5. кариотипирование
6. определение полового хроматина
Информацию, необходимую для пополнения базисного уровня знаний, возможно найти в следующих источниках:
После усвоения указанных данных изучите следующий материал:
Основные теоретические вопросы темы.
Введение. Понятие мутации. Структура ДНК. Классификация мутаций.
Общая характеристика методов ДНК-диагностики. Метод блотгибридизации по Саузерну, секвенирование (по Сэнджеру), метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Современные методы идентификации мутации: метод ДНК-чипов.
Прямые методы ДНК-диагностики. Их преимущества. SSCP –анализ. Метод денатурирующего градиентного электрофореза –DGGE. Метод ферментативного или химического расщепления некомплементарных сайтов –CMC. Гетеродуплексный анализ.
Непрямые методы ДНК-диагностики. Преимущества и возможности. Применение ПДРФ- анализа на примере диагностики наследственного заболевания.
Решите несколько заданий-моделей, используя диагностические и лечебные алгоритмы:
А. Геномная библиотека представлена:
1. учебным руководством по генетике
2. набором ДНК-зондов в составе рекомбинантных молекул
3. набором олигопраймеров к фланкирующим участкам гена
4. ДНК-зондами к сайтам рестрикции
5. коллекцией клонов известных хромосом
6. ДНК-содержащими вирусами
Б. Этапы полимеразной цепной реакции:
1. Получение и очистка ДНК
2. Амплификация ДНК (увеличение количества)
3. Денатурация нагреванием (разделение на 2 цепочки)
4. Добавление в раствор ДНК-полимеразы
5. Отжиг (добавление искусственных специфических олигопраймеров)
В. Этапы геномной дактилоскопии:
1. Обработка ДНК специфическими рестриктазами
2. Электрофорез
3. Получение ДНК (напр. из биологических жидкостей)
4. Гибридизация с искусственными ДНК-зондами (радиоактивными маркерами)
5. Блоттинг (получение отпечатков на нитроцеллюлезном фильтре)
6. Анализ вариабельных полос (участков ДНК); расчет % совпадений
Г. Выберите оптимальный метод молекулярной диагностики, позволяющий выполнить генетическое тестирование эмбриона еще до переноса его в полость матки и наступления беременности:
Д. На приеме у врача-невропатолога у мальчика 7 лет клинически диагностирована миопатия Дюшенна. Какими должны быть дальнейшие действия врача? Кто из родственников должен быть обследован и с помощью каких методов?
Граф логичной структуры темы «Современные методы ДНК-диагностики»
Приложение.
Приложение №1
Прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.
Прямые методы основаны на поиске мутаций, приводящих к заболеванию. Как правило, они являются точными, могут быть использованы для подтверждения клинического диагноза и, в ряде случаев, для прогноза течения заболевания. Немаловажно также, что они могут быть информативны в семьях без пробанда, поскольку анализ мутаций возможен у родителей больного ребенка.
Недостатком данного подхода является сложность поиска патологических мутаций, особенно в больших (многоэкзонных) генах. В ряде случаев сложно определить, является ли обнаруженное изменение в структуре гена патологическим, и, таким образом, является ли оно причиной заболевания.
Косвенные методы основаны на анализе тесно сцепленных с патологическим геном полиморфных маркеров. Анализ наследования аллелей этих полиморфных маркеров и заболевания в семье позволяет определить, с какими аллелями в данной родословной сцеплен поврежденный ген, и, следовательно, проследить его наследование в данной семье по сцепленным с ним маркерным аллелям. Определенными условиями для проведения непрямой (косвенной) ДНК-диагностики являются уверенность в клиническом диагнозе, отсутствие генетической гетерогенности и доступность необходимых членов семьи - как правило, для исследования требуется генетический материал пробанда.
Обычный подход - по возможности использовать прямые методы ДНК-диагностики, а к косвенным методам прибегают либо как к дополнительным, либо в случае невозможности обнаружить мутации в исследуемой семье.
Для ДНК-диагностики в постнатальном периоде (у больных) обычно используются ядросодержащие клетки крови; для дородовой диагностики чаще всего используются клетки ворсин хориона, амниотической жидкости, кровь плода.
В любом случае необходимым условием проведения ДНК-диагностики является знание гена, ответственного за заболевание, или его примерного расположения относительно известных ДНК-маркеров (картирование гена). В настоящее время известны гены для подавляющего большинства распространенных тяжелых наследственных болезней, известны также гены для многих менее распространенных и редких заболеваний. Кроме того, гены, ответственные за большое количество наследственных заболеваний, картированы. Группа таких заболеваний, гены которых локализованы, но пока не идентифицированы, является наиболее динамичной: с одной стороны, идут интенсивные исследования, направленные на идентификацию картированных генов, а с другой - осуществляется картирование новых наследственных заболеваний. Всего в каталоге наследственных заболеваний Мак-Кьюсика (один из адресов электронной версии каталога в Интернете - http://www3.ncbi. nlm.nih.gov/Оmim/), включающем описания наследственных болезней, заболеваний с наследственной предрасположенностью и записи о генах, мутации в которых приводят к таким болезням, более 10 300 записей. В настоящее время трудно даже оценить, для какого количества наследственных болезней может быть проведена или уже проводится ДНК-диагностика. По-видимому, таких заболеваний более 1000.
Прямые методы ДНК- диагностики - это большая и разнообразная группа методов исследования молекулярной структуры ДНК, основные дифференциально-диагностические тесты, необходимость разработки которых обусловлена генетической природой наследственных заболеваний, их выраженным клиническим полиморфизмом, а также существованием генокопий и фенокопий.
Особое место в этой группе занимают методы ДНК-диагностики (зондовой). Они позволяют диагностировать заболевание на уровне первичного молекулярного дефекта - патологического гена. Ее точность в установлении причины наследственного дефекта абсолютна.
Среди основных методов ДНК-диагностики выделяются:
- дозовый блот-гибридизационный анализ;
- анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ);
- полимеразная цепная реакция (ПЦР);
- анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей.
Благодаря этим методам у врачей появились уникальные возможности эффективного применения в различных областях медицины самых совершенных технологий.
В настоящее время в ДНК-диагностике выделяют 4 подхода. Они применяются в зависимости от того: известен или не известен ген данного заболевания (1), клонирован или нет этот ген или ДНК-копия его тРНК или кодирующей ДНК (2), известна или нет природа мутации, вызывающей заболевание (3), насколько широко распространена данная мутация в различных случаях данного заболевания в данной популяции, данном географическом регионе (4).
Виды ДНК-диагностики: подтверждающая, пресимптоматическая, носительства, пренатальная. Прямые методы возможны лишь при условии, что ген заболевания клонирован, известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательностьполноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. Главным преимуществом прямых методов диагностики является почти 100% эффективность. Прямые методы основаны на технологии ПЦР.
Однако в большинстве случаев наследственных заболеваний ген не клонирован или заболевание является генетически гетерогенным, т.е. обусловлено повреждением в разных генах, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые гены. Эти трудности могут быть преодолены с помощью косвенных методов ДНК-диагностики, основанных на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров. В этом случае определяется гаплотип хромосомы, несущей мутантный ген в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших родственников. Такой подход возможен практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией гена. Основной недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженных родственников, «доступных» для обследования, проведение диагностики (за редким исключением) становится невозможным.
Приложение №2.
Полимеразная цепная реакция – ПЦР.
В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.
Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.
В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии (рис.2). Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно искусственно синтезированным праймером.
Рис. 1. ПЦР: Полимеразная Цепная Реакция
Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.
Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом элетрофореза в геле.
In Situ ПЦР
Метод In Situ (IS)- ПЦР стал активно развиваться в последнее время благодаря тому, что он, в отличие от ПЦР, проводимой в растворе, позволяет не только специфически амплифицировать какую-либо последовательность ДНК, но и локализовать ее внутри клетки.
|
Рисунок 1. Метод характеризуется такой же высокой чувствительностью, как и ПЦР, проводимая в растворе (возможность амплификации исходно одной копии ДНК-мишени). Способность локализовать специфическую последовательность делает IS-ПЦР неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне. |
|
Рисунок 2. |
Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР может осуществляться двумя способами: через опосредованную (непрямую) In Situ гибридизацию или прямую детекцию меченых нуклеотидов (например, дигоксигенин-11-дУТФ, флуоресцеин-дУТФ), которые включаются в состав амплифицируемого продукта в процессе ПЦР (прямая IS-ПЦР) (рис.1). В непрямом методе гибридизация меченой ДНК-пробы с амплифицированным продуктом обеспечивает максимальную специфичность при внутриклеточной детекции ПЦР-продуктов. Существует ряд некоторых особенностей проведения IS ПЦР. В первую очередь это касается протеолитической обработки гистологических срезов или клеточного монослоя. Высокая концентрация протеолитических ферментов (трипсин, пепсин или протеиназа К), или длительное время инкубации с ними часто приводят к искажению морфологической картины препарата, а низкие концентрации - к недостаточному протеолизу и, как следствие этого, к низкой проницаемости клеточной мембраны для ПЦР. При проведении IS-ПЦР также учитывается возможность получения как ложно-положительных, так и ложноотрицательных результатов. Первая группа артефактов включает в себя амплификацию неспецифической ДНК в результате ПЦР, неспецифическое включение меченого нуклеотида вследствие репаративных свойств ДНК-полимеразы клетки или используемой в реакции Taq-полимеразы, диффузию амплифицированных фрагментов ДНК из клеток. Вторая группа артефактов (ложноотрицательные результаты) особенно характерна для IS-ПЦР, выполненной на стекле. Их причина до конца не выяснена, но возможно уменьшение эффективности амплификации обусловлено физическими факторами, такими как недостаточно быстрое охлаждение и нагревание препарата, недостаточная конвекция реагентов под зажимами или возможная адсорбция ДНК-полимеразы и других компонентов на поверхности стекла, покрытой специальным агентом. Альтернативное объяснение ложно-отрицательных результатов - это потеря ПЦР-продуктов во время промывок препарата при детекции. Чтобы избежать ложноотрицательных и ложноположительных результатов обычно выполняют следующие контроли: обработка срезов или клеточного монослоя ДНК-азой (отрицательный контроль), проведение амплификации ДНК без ДНК-полимеразы; проведение амплификации ДНК без праймеров (контроль ДНК-полимеразной репарации), проведение процедуры выявления без использования антител, а также без использования щелочной фосфатазы - для регистрации содержания эндогенного биотина и эндогенной активности фермента (если в качестве меченого нуклеотида используется биотин -11-дУТФ).
Количественная ПЦР
|
Существует несколько приемов для количественной оценки продуктов амплификации, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Вначале необходимо получить представления о том, какие причины могут влиять на точность измерения ампликонов и что такое количественная ПЦР. Как и любая биохимическая реакция, протекающая in vitro, ПЦР имеет ряд существенных отклонений от теоретически предсказанной закономерности накопления продукта, происходящего не по закону геометрической прогрессии, а по сложному закону, обусловленному истощением реагирующих компонентов, присутствием ингибиторов, инактивацией фермента в ходе реакции и т.д. Принять во внимание все эти факторы при расчете калибровочных кривых практически невозможно, поэтому необходимо применение методик, позволяющих учитывать многочисленные параметры в ходе самой ПЦР. Исследователь не может быть до конца уверен в том, что все испытуемые образцы при изначально одинаковых условиях по реагентам и температуре в термоблоке дают одинаковый выход продукта. Из вышесказанного следует, что действенным способом борьбы с недостатками ПЦР как метода количественного определения мишеней амплификации являются методические приемы, позволяющие регистрировать протекание реакции или вносить поправки, выявляя возможные артефакты в каждой пробе. Для создания количественной ПЦР наиболее распространены подходы, использующие внутренние контроли- стандарты, которые, как и определяемая ДНК, участвуют в ПЦР. Используя контроли -стандарты с разным количеством копий на образец можно определить количество копий матрицы, участвующей в реакции. |
Внутренний контроль- стандарт выполняет несколько функций. Во-первых, он позволяет выявить возможное ингибирование реакции ингибиторами, содержащимися в выделенном клиническом образце. Во-вторых, использование контроля в ходе реакции в той же пробирке, где происходит определение испытуемой матрицы, позволяет учесть эффект неравномерности протекания реакции, так как условия амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК абсолютно идентичны. В третьих, использование контроля позволяет в значительной степени абстрагироваться от изучения закономерностей протекания реакции, так как основным алгоритмом определения является совпадение интенсивности сигнала от внутреннего контроля-стандарта и сигнала от определяемого ампликона. Кроме описанного выше метода количественного ПЦР с использованием внутреннего контроля на практике используется еще один прием, получивший название "метод конечных разведений". Суть подхода в том, что определяется конечное разведение образца ДНК или РНК, дающее положительный результат ПЦР. В каждом определении используется панель стандартов для выявления чувствительности работы тест-системы. Этот метод не дает реальной возможности контролировать процесс амплификации +со всеми его отклонениями от ожидаемого, вместе с тем, техника его наиболее проста в исполнении. Из-за методической простоты некоторые лаборатории до сих пор используют этот метод для так называемых внутрилабораторных (in house) технологий. Такой подход неприемлем для отечественной лабораторной службы, строго регламентирующей возможность работы только с сертифицированными наборами реагентов. На сегодняшний день известен способ решения проблемы количественного определения ампликона в ходе реакции (Real time PCR). Речь идет о регистрации накопления продуктов реакции в реальном времени и построении калибровочных кривых по реальным процессам, происходящим в каждой конкретной пробирке. "Taqman" - технология, предложенная специалистами Perkin Elmer совместно с Roche. В основе метода лежит способность Taq-полимеразы гидролизовать последовательность ДНК в направлении 5'-3'. Принцип работы подобной системы представлен на рис.3.
|
Рисунок 3. |
В ходе реакции к образцу добавляется специальный зонд, модифицированный двумя флуоресцентными красителями, имеющими близкие максимумы поглощения и флуоресценции. Расстояние между молекулами красителей на зонде подобрано таким образом, что происходит перенос энергии от одной молекулы - испускающей первичный квант флуоресценции (З), к другой, которая испускает квант света в более длинноволновой области спектра (Т). Амплификация происходит в специальном приборе, который оснащен устройством освещения возбуждающим светом каждой амплификационной ячейки и многоканальным флуоресцентным детектором со спектральным разрешением анализируемого сигнала. При наличии специфической матрицы в начале амплификации просходит смещение максимума флуоресценции из-за деградации олигонуклеотидного зонда (из-за 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы) и, вследствие этого, отменой переноса энергии от одного флуорофора к другому. Анализ кинетики флуоресценции в каждой амплификационной ячейке позволяет рассчитывать количество исходной матрицы, используемой в реакции амплификации. Кроме того, анализ в реальном времени позволяет регистрировать все артефакты, связанные с вышеперечисленными причинами, и вносить необходимые поправки.
Приложение № 3
Метод FISH-анализа (Fluorescence in situ hybridization).
Более 20 лет цитогенетические методы, базирующиеся на технике выявления продольной сегментации хромосом, оставались основными в пре- и постнатальной цитогенетике. Появление молекулярно-цитогенетических методов открыло в изучении хромосом человека и их нарушений новое измерение – субмикроскопический уровень. Метод FISH-анализа (Fluorescence in situ hybridization) позволяет объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на метафазных пластинках (хромосомы в состоянии максимальной конденсации и визуализации) или интерфазных ядрах (деконденсированные хромосомы, без четкой морфологической структуры) на основе особенностей их молекулярно-генетического строения. Объектом исследования в данном случае являются особенности нуклеотидного состава конкретной хромосомы или ее отдельного участка.
Классический метод FISH-анализа основан на гибридизации известной по нуклеотидному составу ДНК-пробы с участком тестируемой хромосомы и с последующим выявлением результата гибридизации по метке – флуоресцентному сигналу в ожидаемом месте. Метод FISH-анализа превратился в необходимую аналитическую процедуру в ходе цитогенетического исследования и стал востребованным сегодня в пре- и постнатальной диагностике, в мониторинге зигот после искусственного оплодотворения, в процедуре предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в ходе селекции эмбрионов с нормальным кариотипом и т.д.
Основные преимущества FISH-анализа:
• высокая разрешающая способность (на препаратах можно выявлять те хромосомные нарушения, которые не визуализируются в обычный световой микроскоп);
• точность диагностики (размер проб может варьировать от 90-100 тыс. до нескольких миллионов пар нуклеотидов, так что в качестве мишени могут быть не только отдельные гены или хромосомные участки, но и целая хромосома).
FISH-анализ позволяет выявить, к примеру, несколько аномальных клеток среди тысяч клеток с нормальным генотипом. Все эти преимущества очень важны в обследовании супружеских пар с проблемами репродукции, т.к. хромосомные изменения в такой группе пациентов, как правило, не имеют фенотипической клинической картины.
|
Дот-гибридизация, dot hybridization or d. blot - - метод количественного определения ДНК или РНК. Денатурированная ДНК или РНК накапывается на нитроцеллюлозный фильтр или др. матрицу в различной концентрации и затем гибридизуется с соответствующим радиоактивным зондом. После радиоавтографии оценивается интенсивность потемнения данных пятен по сравнению с контрольными. |
|
Нозерн-блот, н.-блоттинг, РНК-б. * Nothern blot or N. blotting or N. transfer or RNA b. - - метод, сходный с методом Саузерн-блоттинга. Используется для элюирования (извлечения) фрагмента РНК из гелей после электрофореза. Молекулы РНК, электрофоретически разделенные по размерам в агарозном или полиакриламидном геле, переносятся непосредственно на нитроцеллюлозный фильтр или матрицу с помощью электрических или капиллярных сил (Нозерн-перенос). Однонитчатые нуклеиновые кислоты фиксируются на нитроцеллюлозном фильтре методом спекания. Иммобилизованные таким образом на фильтре молекулы РНК гибридизуются с однонитчатыми зондами, предварительно помеченными радиоактивной или иной меткой. Метод позволяет выявлять индивидуальные РНК из сложной популяции этих молекул. |
|
Сауз-Вестерн блоттинг * South-Western blotting - - метод быстрой идентификации белка, связанного с ДНК, и определения места его связывания на геномной ДНК. Для этого белки отделяют на SDS-полиакриламидном геле, ренатурируют путем удаления SDS в присутствии мочевины, переносят на нитроцеллюлозу и иммобилизуют в их нативной конфигурации. Затем проводят рестрикцию геномной ДНК-мишени, фрагменты метят и осуществляют гибридизацию с иммобилизованными белками в присутствии неспецифической конкурентной ДНК. Связавшаяся с белком ДНК может быть элюирована из каждого индивидуального ДНК-белкового комплекса и проанализирована. |
|
Щелочной блоттинг * alkaline blotting - - модификация метода Саузерн-блоттинга , когда фрагменты ДНК в процессе электрофореза разделяют по размерам в агарозном геле, денатурируют in situ и переносят на нейлоновую мембрану с NaOH-содержащим буфером. Щелочь усиливает ковалентное связывание фрагментов ДНК. |
|
Электроблоттинг * electroblotting - - метод электрофоретического переноса ДНК, РНК или белковых молекул с разделительного геля на нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлозные мембраны для этих целей не используются, поскольку они эффективно связывают нуклеиновые кислоты только при высокой концентрации солей. |
Реакции транскрипционно опосредованной амплификации (NASBA, TAS, 3SR)
Принципы всех этих изотермических реакций амплификации схожи и могут быть ограничены рассмотрением широко применяемой в настоящее время технологии - NASBA. Первые сообщения об этом методе были сделаны группой авторов Kwoh et al. в 1989г. В ходе реакции транскрипционно опосредованной амплификации происходит увеличение количества РНК, транскрибируемой со специального промотора (используется промотор для Т7-полимеразы), входящего в состав специфического праймера, который отжигается в определенном месте РНК- (и или ДНК) мишени. Если в случае первичной мишени используется РНК-матрица, то первые стадии процесса формируют полноценную структуру промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 для инициирования транскрипции. Для достраивания второй цепи ДНК после первого этапа- обратной транскрипции (стадия 2) также используется фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) (стадии 4-6), обладающая также и активностью РНКазы Н. Эта активность удаляет матричную РНК после синтеза первой цепи ДНК (2) и, следовательно, делает процесс "денатурации" ДНК-РНК гибрида (за счет гидролиза РНК) автоматически воспроизводимым в каждом последующем цикле амплификации. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза транскрибирует за один цикл, время которого составляет 5-15 мин., 105копий фрагментов РНК (7). Таким образом в течение 40-50 мин изотермической транскрипционно опосредованной амплификации ДНК или РНК в растворе образуется 108-109 копий. В настоящее время принцип NASBA используется в диагностических наборах, производимых фирмой Organon Technika.
ДНК/РНК гибридный захват ( hibrid capture)
Принцип этого метода основан на иммунохимической детекции продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК моноклональными антителами, узнающими образующиеся дуплексы. Если происходит детекция бактерий или ДНК-содержащих вирусов, то используется рибоолигонуклеотидный зонд. В случае когда выявлению подвергаются инфекционные агенты, содержащие рибонуклеиновые кислоты, такие, например, как вирус гепатита С используют дезоксирибонуклеиновый зонд. В современных наборах реагентов применяется хемилюминесценция, в качестве процесса, обеспечивающего чувствительную детекцию результатов гибридизации. Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистки нуклеиновых кислот, что позволяет использовать иммунохимическую детекцию специфического РНК/ДНК гибрида для скрининга.
Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (bDNA)
Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов представляет собой пример амплификационных технологий, позволяющих усиливать в ходе определения сигнал. В результате многоступенчатого процесса гибридизации происходит присоединение многочисленных зондов, коньюгированных с молекулами фермента, окисляющего специальный субстрат и запускающий таким образом хемилюминесценцию.
Предимплантационная генетическая диагностика (ПГД)
Только благодаря появлению метода FISH-анализа стало возможным проведение ПГД, позволяющей выполнить генетическое тестирование эмбриона еще до переноса его в полость матки и наступления беременности. Впервые ПГД провели в 1988 г. в Лондоне, в госпитале «Хаммерсмит». С тех пор в рамках программы ЭКО уже проведено несколько тысяч таких процедур, наступили и уже благополучно закончились сотни беременностей.
В большинстве случаев биопсия эмбриона с целью ПГД проводится на так называемой стадии дробления
Обычно на третьи сутки жизни в лабораторных условиях от нескольких эмбрионов – 7-10 (это зависит от результатов стимуляции овуляции у женщин) микроманипулятором берут один из 6-8 бластомеров. Немедленно, в течение нескольких часов, проводят FISH-диагностику на заинтересованные, согласно анамнезу супружеской пары, хромосомы или диагностику ДНК одной клетки с помощью модификаций ПЦР-метода. После этого в полость матки переносят только 2-3 генетически «здоровых» эмбриона. Очень важно отметить, что биопсия эмбриона проводится на том этапе развития, когда все его клетки-бластомеры недифференцированны, тотипотентны (totypotency – способность клеток дифференцироваться в любую из клеток взрослого организма), и поэтому возможно безопасное замещение удаленной клетки при дальнейшем дроблении оставшихся клеток. Безопасность этого метода для эмбрионов и соответственно младенца, родившегося из этого эмбриона, давно доказана. Установлено также, что биопсия эмбриона никак не повышает вероятности пороков развития человека, родившегося из этого эмбриона. Выявление генетического заболевания у плода методами инвазивной пренатальной диагностики предполагает необходимость прерывания беременности; доимплантационная диагностика преследует цель наступления беременности изначально здоровым плодом. Степень риска беременности больным плодом определяется в каждом конкретном случае при медико-генетическом консультировании.
Проведение ПГД показано:
1. Носителям и больным хромосомными или генными заболеваниями с целью уменьшения риска рождения ребенка с генетической патологией:
• пациентам с мозаичными вариантами синдромов Клайнфельтера, Тернера и др.;
• носителям Робертсоновских транслокаций, маркерных хромосом, сбалансированных и др. перестроек в кариотипе;
• лицам с моногенными заболеваниями или носителям этих заболеваний (муковисцидоза, гемофилии, болезни Гентингтона, мышечной дистрофии Дюшена и др.).
2. Для увеличения эффективности программы ЭКО с помощью «отсева» эмбрионов с числовыми аномалиями в кариотипе, которые выявляются более чем у половины рутинно переносимых эмбрионов:
• женщинам в возрасте старше 35 лет;
• лицам с плохим прогнозом ЭКО (три и более спонтанных прерываний беременности на ранних сроках);
• пациентам с тремя и более неудачными попытками IVF/ICSI;
• мужчинам с тяжелыми нарушениями сперматогенеза.
Кроме того, с помощью метода ПГД стало возможным:
• выявление «эмбрионов-носителей» болезней с поздней манифестацией и генетической предрасположенностью к тяжелым заболеваниям (онкология, болезнь Альцгеймера и т.д.);
• проведение HLA (human leukocyte antigen) – типирование эмбрионов для подбора донора, идентичного по лейкоцитарному антигену больному ребенку – брату/сестре;
• определение пола эмбриона для предотвращения передачи заболевания, сцепленного с полом.
PAGE 2