Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут фармакології та токсикології
Бибик Олена Юріївна
УДК 615.2:616.831-005.4-092.4
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ КОМБІНОВАНОГО ЗАСТОСУВАННЯ АЦЕЛІЗИНУ ТА ТІОТРИАЗОЛІНУ В УМОВАХ ГОСТРОЇ ІШЕМІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ
14.03.05. – фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ЛУК'ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук СОЛОВЙОВ Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії.
доктор медичних наук, професор СТЕПАНЮК Георгій Іванович, Вінницький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології
Провідна установа: Київський національний медичний університет ім. О.О.Богомольця
Захист дисертації відбудеться 19.06.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.
Автореферат розісланий 17.05.2002 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01. кандидат біологічних наук Данова І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Одним із пріоритетних напрямків сучасної фармакологічної науки є пошук та розробка високоефективних нейропротекторних засобів з метою попередження фатальних наслідків невропатологічних станів, основу патогенезу яких складає гостре порушення церебрального кровообігу.
Суттєве медико-соціальне значення проблеми судинних захворювань головного мозку, у тому числі й гострої цереброваскулярної недостатності, визначається їх значною кількістю в структурі захворюваності та смертності населення (друге місце після серцево-судинної патології) (М.Б.Маньковский, 1996; О.Ф.Возіанов, 1998; А.В.Покровский, 1999). В спектрі патологічних станів, зумовлених гострим порушенням мозкового кровообігу, домінуюча роль належить ішемічним ураженням, які складають до 85% усіх випадків мозкових інсультів (Б.А.Булеца, 1998).
Згідно з даними Міністерства охорони здоров'я України, кількість хворих, які мали в анамнезі мозковий інсульт у співвідношенні з загальною кількістю населення, за останні 5 років непохитно збільшується. Більш того, середньорічна поширеність та захворюваність на ішемічний інсульт у південно-східному регіоні країни вища, ніж у західному (В.М.Пашковский, 1997). Проблема ішемічного інсульту набуває особливої актуальності, бо протягом останніх років відзначається значне збільшення кількості хворих з гострими порушеннями мозкового кровообігу за типом ішемії серед осіб працездатного віку.
Рівень смертності від мозкового інсульту в Україні за останні 5 років збільшився на 23,2% і є одним з найвищих у світі (О.Ф.Возіанов, 1996). Крім того, переважаюча більшість хворих, що перенесли інсульт, залишається інвалідами, а 25-30% мають важкі наслідки у вигляді вираженого неврологічного дефіциту, психічних розладів тощо (J.M.Ferro, 1994; K.R.Evenson, 2001).
У теперішній час існує багаточисельний арсенал нейротропних засобів, які застосовуються для корекції порушень мозкового кровообігу. Разом з цим, це не забезпечує в повному обсязі бажаної ефективності та безпечності фармакотерапії. Більш того, у рекомендаціях експертів ВООЗ 1995 року повідомляється про повну неефективність монотерапії ішемічного інсульту, що, вірогідно, зумовлене неспроможністю одним препаратом одночасно впливати на різні ланки патогенезу цього екстремального стану.
В цьому аспекті вивчення питань патогенетично обгрунтованої комбінованої фармакокорекції гострої цереброваскулярної недостатності ішемічного генезу є вельми актуальним. Доцільність одночасного застосування цереброактивних препаратів з різних фармакологічних груп при гострих мозкових судинних порушеннях ішемічної етіології лежить, з одного боку, в одночасній регуляції окремих ланок патогенезу цих екстремальних патологічних станів, а з іншого – у зменшенні доз, а відповідно, і побічних ефектів лікарських засобів, що комбінуються.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в плані основних напрямків наукових досліджень кафедри фармакології ЛДМУ за темою “Експериментальна розробка засобів фармакокорекції екстремальних станів” (№ держ. реєстрації 0198U4009100, 1999-2003 рр.). Дисертант була співвиконувачем вказаної теми.
Мета та завдання дослідження. Мета роботи – встановити ефективність та з'ясувати можливі механізми церебропротекторної дії ацелізину та тіотриазоліну в умовах експериментальної гострої ішемії головного мозку.
Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:
1. Серед препаратів з можливими церебропротекторними властивостями провести пошук лікарських засобів з профілактичною захисною дією при моделюванні гострої ішемії головного мозку.
2. Розробити оптимальний режим дозування найбільш ефективних комбінацій препаратів на моделі цереброваскулярної патології, що вивчається.
3. Вивчити вплив комбінованого застосування найактивніших церебропротекторних засобів на стан прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму в умовах ішемічного інсульту.
4. Оцінити ступінь впливу комбінації препаратів, що вивчається, на рівень центрального компонента аденілатциклазного месенджерного каскаду – цАМФ в крові та мозку щурів з формою ішемічного інсульту, яка моделюється.
5. Визначити кількісні параметри зв'язуючої спроможності сироваткових білків в умовах гострої церебральної ішемії на тлі застосування тіотриазоліну в комбінації з ацелізином.
6. Вивчити вплив засобів комбінованої лікарської профілактики на патоморфологічну картину різних утворень головного мозку при його ішемії.
Об'єкт дослідження – головний мозок та його утворення (кора, гіпокамп, стовбур) в умовах ішемії на тлі комбінованого застосування ацелізину з тіотриазоліном у білих щурів.
Предмет дослідження – фармакодинамічні ефекти комбінації ацелізину з тіотриазоліном при гострому церебральному інсульті ішемічного генезу.
Методи дослідження. Використовувався комплексний методичний підхід із залученням фармакологічних, біофізичних, біохімічних, фізико-хімічних, імуноферментних, морфологічних і математичних методів дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше теоретично обгрунтована та експериментально доведена доцільність та ефективність комбінованого застосування ацелізину з тіотриазоліном, а також розроблений оптимальний режим їх дозування в умовах гострої цереброваскулярної патології ішемічного генезу. Встановлені особливості кінетики різних етапів вільно-радикальних реакцій в утвореннях головного мозку тварин з ішемічним інсультом після попереднього введення ацелізину в комбінації з тіотриазоліном. В порівняльному аспекті виявлена найбільша чутливість до ішемічного пошкодження кори головного мозку, якій поступаються в даному відношенні гіпокамп та особливо стовбур мозку.
Розширені та поглиблені існуючі уявлення про стан центрального компонента аденілатциклазного месенджерного каскаду - цАМФ, а також вперше виявлена здатність досліджуваних засобів з церебропротекторною активністю збільшувати продукцію цього ендогенного антигіпоксанту в сироватці крові та головному мозку тварин з церебральним інсультом за типом ішемії.
Вперше в умовах гострої ішемії головного мозку доведена можливість фармакологічної регуляції захисно-адаптаційних механізмів організму на етапі біотранспорту шляхом підвищення афінітету комплексу “білок-ліганд” з одночасним збільшенням числа місць фіксації на молекулі протеїну сироватки крові. При цьому визначені шляхи цілеспрямованого застосування лікарських засобів в підсиленні природних механізмів захисту організму при екстремальних кисеньдефіцитних станах.
Практична значимість одержаних результатів. Результати окремих фрагментів дослідження впроваджені в практику охорони здоров'я та роботу наукових закладів України у формі:
- Методичних рекомендацій “Фармакология средств, регулирующих прооксидантно-антиоксидантное состояние организма” (Луганск,1999).
- Інформаційних листів про нововведення в системі охорони здоров'я: “Комбінована лікарська профілактика гострої ішемії головного мозку” (Луганський ЦНТЕІ.-2000р., № 16) та “Церебропротекторна ефективність тіотриазоліну в комбінації з ацелізином при ішемічному інсульті” (Луганський ЦНТЕІ.-2000р., № 35), які впроваджені в роботу неврологічних відділень Луганської обласної клінічної лікарні імені Ф.Е.Дзержинського, Луганської обласної лікарні №2, Станично-Луганського ТМО і відділення анестезіології та реаніматології міської клінічної лікарні №3 м. Луганська.
За матеріалами експериментальних досліджень отримано патент України №339673А від 15 червня 2001 р. “Спосіб комбінованої лікарської профілактики ішемічного інсульту”.
Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології та клінічної фармакології Вінницького та Одеського державних медичних університетів, Дніпропетровської та Буковинської державних медичних академій та Української медичної стоматологічної академії.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно визначена мета та поставлені завдання, обрані методичні підходи дослідження, здійснено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових сервірів Yandex, Rambler, AltaVista, Aport, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет. Самостійно виконані всі фрагменти експериментальних досліджень і написаний огляд літератури. Статистична обробка, узагальнення та аналіз отриманих даних, розробка основних положень роботи та її висновків зроблені дисертантом особисто.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на V національному з'їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків,1999); секції неврології місячника студентської науки “СНТ-1999” ЛДМУ (Луганськ,1999); міжвузівській НПК молодих вчених і студентів “Комп'ютерні технології, фізичні методи діагностики і лікування” (Луганськ,1999); науково-практичній конференції “Наукові проблеми медицини катастроф та екстреної медичної допомоги” (Київ,2000); науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження акад. В.П.Філатова (Одеса,2000); IY Конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль,2000); VIII Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств (Львів-Трускавець, 2000); науково-практичній конференції “Ліки-людині” (Харків, 14 березня 2001); науково-практичній конференції “Ліки-людині” (Харків, 14 червня 2001); міжнародній медичній конференції студентів та молодих вчених “Сучасні проблеми клінічної та теоретичної медицини”, присвяченій 85-річчю з дня заснування Дніпропетровської медичної академії (Дніпропетровськ,2001); II національному з'їзді фармакологів України “Фармакологія 2001-крок у майбутнє” (Дніпропетровськ, 2001); V Конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль,2001); IV Міжобласній науково-практичній конференції анестезіологів “Екстремальна медицина. Актуальні проблеми інтенсивної терапії” (Луганськ, 2001).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 22 наукові роботи, з них 7 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 методичні рекомендації, 2 інформаційні листи, а також 11 тез доповідей на наукових форумах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, 6 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел, що включає 279 вітчизняних і 167 іноземних джерел. Робота ілюстрована 15 рисунками та 21 таблицею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на 920 статевозрілих щурах лінії “Wistar” обох статей вагою 160-240 г з урахуванням “Правил доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)” (1992), а також “Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента” (Киев, 1986).
Експериментальною моделлю був патологічний процес, який формується в піддослідних тварин з незворотньою одномоментною двобічною оклюзією загальних сонних артерій до місця її біфуркації на зовнішню та внутрішню гілки під натрій-тіопенталовим (70мг/кг) наркозом. У роботі використовували ацелізин ВАТ “Київмедпрепарат” та тіотриазолін, виробництва Запорізького НВО “Фарматрон”.
Первинний фармакологічний скринінг потенційних засобів з церебропротекторними властивостями проводили серед 11 препаратів з різними механізмами дії. Лікарські засоби, що вивчаються, вводили одноразово в ізоефективних дозах (запозичених з літератури) з профілактичною метою внутрішньошлунково або внутрішньоочеревинно, відповідно, за 90 та 30 хвилин до початку моделювання цереброваскулярної патології, яка моделюється. Ефективність препаратів оцінювали в динаміці за показниками летальності та середній тривалості життя тварин, а також за клінічними симптомами перебігу гострої цереброваскулярної недостатності у щурів.
При розробці дозового режиму застосування комбінації найефективніших, за результатами проведеного скринінгового дослідження, засобів, які володіють церебропротекторними властивостями, (ацелізин та тіотриазолін) вводили одноразово внутрішньоочеревинно в різних дозах (10; 95; 200 мг/кг) і в різний час відносно моменту двобічного перетину загальних каротидних судин. Ефективність препаратів оцінювали за виживанням щурів (через 24 години після перетину загальних сонних артерій). Математичну залежність ефекту від доз досліджуваних препаратів визначали методом двофакторного експерименту (Е.Е.Рафалес и др., 1971) за допомогою спеціально розробленої програми.
Аналіз отриманої залежності проводили графічним способом з використанням стандартної програми Mach Engine V 2.001.
Екстраполяцію доз ацелізину в комбінації з тіотриазоліном, отриманих в експерименті, на людину проводили за допомогою констант біологічної активності (Ю.Р.Риболовлєв, Р.С.Риболовлєв, 1979).
Біосубстратом для проведення біофізичних та біохімічних досліджень були сироватка крові та гомогенати кори, гіпокампу та стовбура головного мозку, які готували на охолодженому (4°С) ізотонічному розчині натрію хлориду.
Інтенсивність перебігу вільно-радикальних реакцій в мембранних структурах клітин нервової тканини оцінювали біохемілюмінесцентним методом за допомогою люменометра EMILITE –1105 виробництва фірми “Біо-Хім-Мак”. Спектральний діапазон хемілюмінометра складав 350-950 нм, а діапазон вимірювань – 103 –1010 фотон/с. Індукцію вільно-радикальних реакцій здійснювали за методом, описаним Є.П.Сидориком зі співавт. (1989р.) з використанням запропонованих співробітниками кафедри фармакології ЛДМУ удосконалень (В.Д.Лукьянчук и др., 1997). Аналізували наступні параметри хемілюмінесценції: амплітуду швидкого спалаху (I1), амплітуду повільного спалаху (I2) і константи швидкостей змін інтенсивності світіння (К1 і К2), які визначали за тангенсом кута нахилу кінетичної кривої. Стан прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму в умовах ішемічного інсульту та комбінованого застосування засобів, які вивчаються, оцінювали за вмістом продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та активністю і рівнем основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму в гомогенатах досліджуваних утворень головного мозку через 1, 6 та 24 години після двобічного перетину загальних сонних артерій.
Серед продуктів ліпідпереокислення досліджували концентрацію первинних – дієнові кон'югати (ДК) (И.Д.Стальная, 1977), проміжних – гідроперекиси ліпідів (ГП) (А.А.Романова та И.Д.Стальная, 1977) та кінцевих продуктів ПОЛ, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти) (И.Д.Стальная, Г.Г.Гаршвили, 1977).
При вивченні стану основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму визначали активність супероксиддисмутази (СОД) (В.А.Костюк зі співавт., 1990) і каталази (М.А.Королюк и др.., 1988), а також рівень відновленого глутатіону (Sedlack J., Lindsay H., 1968) та сульфгідрильних груп (G.L.Ellman, 1959).
Вплив ацелізину в комбінації з тіотриазоліном на передачу внутрішньоклітинного сигналу за аденілатциклазним шляхом при формі цереброваскулярної патології, що вивчається, оцінювали за динамікою змін рівня вторинного месенджеру – циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) за допомогою набору “Сamp enzymeiimmunoassay (EIA) system” виробництва фірми “Amersham pharmacia biotech” (Англія) на приборі для імуноферментного аналізу (АИФ?М/340 “Витязь”).
Один із центральних етапів фармакокінетики комбінації церебропротекторів – біотранспорт - досліджували за допомогою рівноважного діалізу (А.И.Луйк, В.Д.Лукьянчук, 1984). Параметри, які характеризують процес зворотнього зв'язування - константу асоціації (Кас) і число місць фіксації (N), розраховували за спеціально написаною комп'ютерною програмою (О.І.Луйк зі співавт., 1999). Патоморфологічне дослідження лімбічної кори, гіпокампа та стовбура проводили за загальновідомими методичними прийомами (І.В.Вікторова, 1969).
Отримані цифрові дані оброблені статистично за допомогою критерію t Ст'юдента (Ю.И.Иванов, 1990), а також непараметричного критерію статистики – точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (Е.В.Гублер, 1978).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
У скринінговій серії дослідів вивчалися препарати різних фармакологічних груп з потенційними можливостями різновекторного впливу на патогенез ішемічного інсульту. Серед 11 досліджуваних потенційних засобів з церебропротекторними властивостями найвищу і вірогідно значущу (Р<0,025) профілактичну активність за виживанням та термінами загибелі тварин в умовах цереброваскулярної патології, що моделюється, проявляють тіотриазолін та ацелізин і, особливо, їх комбіноване застосування (див. табл.1)
Комплексні фармакометричні дослідження з застосуванням методу двофакторного експерименту дозволили розробити оптимальний режим дозування ацелізину в комбінації з тіотриазоліном. Встановлено, що найбільш високу церебропротекторну активність тіотриазолін і ацелізин виявляють при їхньому введенні в дозах 67,9 і 43,5 мг/кг, відповідно, за 70 хвилин до моменту двобічної оклюзії загальних каротидних артерій.
При поглибленому вивченні ефективності та фармакодинаміки комбінації найактивніших препаратів виходили з даних літератури і результатів досліджень, отриманих у лабораторії кафедри фармакології ЛДМУ, про роль окислювально-антиоксидантної рівноваги при кисеньдефіцитних станах будь-якого генезу.
В дослідах in vitro методом біохемілюмінесценції встановлено, що внесення в систему ацелізину, тіотриазоліну та їхньої комбінації вірогідно знижує інтенсивність швидкого спалаху надслабкого світіння.
Порівняльний біохемілюмінесцентний аналіз церебропротекторної активності ацелізину в комбінації з тіотриазоліном in vitro в різних структурах ішемізованого мозку - корі, гіпокампі та стовбурі ще раз довів наявність у засобів, що вивчаються, антирадикальної активності з антиоксидантними властивостями. Це реалізується зменшенням інтенсивності швидкого спалаху надслабкого світіння, головним чином в стовбурі мозку, де цей показник наближається до величин, які реєструються у інтактних тварин і декілька в меншій мірі – у гіпокампі та корі.
Таблиця 1 Вплив досліджуваних препаратів на виживання (%) щурів з гострою ішемією головного мозку (n=6-8) Примітка: 1. В/о – внутрішньоочеревинно; 2. В/ш – внутрішньошлунково; 3. Р – розраховано в порівнянні з контролем (через 36 год) за допомогою критерію Фішера.
В подальшому була проведена серія досліджень по вивченню церебропротекторної активності тіотриазоліну в комбінації з ацелізином при ішемії головного мозку на рівні цілісного організму.
Доведено, що профілактичне застосування препаратів із церебропротекторою активністю, що комбінуються, в значній мірі попереджує в динаміці накопичення первинних продуктів ліпідпереокислення – ДК в середньому в 1,7-1,9 разів, проміжних компонентів - ГП у 2,5 рази і ТБК-активних речовин в середньому в 3,0-3,7 разів в усіх утвореннях мозку, що аналізуються.
Враховуючи, що збалансованість в організмі метаболічних процесів залежить не тільки від стану процесів ПОЛ, але і від активності та рівня компонентів антиоксидантної системи захисту організму, в подальшому з метою максимально коректної оцінки антирадикальних і антиоксидантних властивостей комбінації ацелізину з тіотриазоліном вивчали їхній вплив на стан основних компонентів антиоксидантної системи в умовах гострої церебральної ішемії.
Встановлено, що профілактичне введення комбінації препаратів, що вивчаються, істотно попереджує інактивацію таких компонентів ферментативної ланки антиоксидантної системи захисту організму тварин з ішемією головного мозку, як СОД і каталаза в усіх досліджуваних утвореннях головного мозку в різні терміни спостереження.
Про вплив ацелізину з тіотриазоліном на функціонування неферментативної ланки антиоксидантної системи робили висновок за рівнем відновленого глутатіону і вільних сульфгідрильних груп, вміст яких в значній мірі зростає (у порівнянні з контролем) в усіх церебральних утвореннях, що досліджуються, але здебільшого в стовбурі й дещо менше в гіпокампі та неокортексі.
Вплив потенційних нейропротекторів на забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами оцінювали за таким інтегральним показником, як перекисна резистентність еритроцитів. Встановлено, що введення досліджуваної комбінації препаратів вірогідно (Р<0,05) знижує відсоток гемолізу еритроцитів у тварин з циркуляторною церебральною ішемією, що ще раз експериментально доводить виявлені мембранопротекторні властивості ацелізину з тіотриазоліном.
Враховуючи центральну роль цАМФ як вторинного месенджеру аденілатциклазної системи в передачі внутрішньоклітинного сигналу, а також надзвичайне значення цього посередника в якості ендогенного протектора при гіпоксичному синдромі будь-якого генеза, цікавим було вивчити рівень цАМФ в крові та мозку тварин в умовах церебральної ішемії.
В серії імуноферментних досліджень, результати яких наведені в таблиці 2, показано, що при даному екстремальному стані вміст цАМФ різко знижується (у порівнянні з вихідним рівнем) в біосередовищах, що аналізуються, досягаючи мінімальних значень до 6-годинної позначки. Ці дані свідчать про зниження адаптаційних властивостей організму, а також співпадають з динамікою перебігу кліничної картини та термінами загибелі щурів з формою інсульту, яка моделюється.
Разом з тим, введення ацелізину з тіотриазоліном реалізується протекторною активністю шляхом значного підвищення концентрації цАМФ як в крові, так і в мозку тварин з ішемічним інсультом. Отримані результати дають змогу робили висновок про спроможність комбінації препаратів, що вивчається, корегувати функціонування аденілатциклазного месенджерного каскаду за рахунок стабілізації запасів цАМФ, що, певно, досягається пригніченням активності фосфодіестерази і/або активацією аденілатциклази.
Можливість фармакологічного комбінованого регулювання природних захисно-адаптаційних механізмів організму стало основою для дослідження спроможності ацелізину та тіотриазоліну модифікувати процес зворотнього зв'язування лігандів з білками сироватки крові на етапі біотранспорту. Методом рівноважного діалізу доведено, що на тлі застосування досліджуваних препаратів з церебропротекторною активністю відбувається значне (у порівнянні з контролем) збільшення спорідненості сироваткових білків до лігандів особливо в інтервалі від 6 до 24 годин, коли Кас досягає і навіть переважає вихідний рівень (див. рис.). Поряд з цим, реєструється збільшення кількості фіксуючих центрів на молекулі білка.
Таблиця 2.
Вплив ацелізину в комбінації з тіотриазоліном на динаміку вмісту цАМФ (пмоль/мл) в сироватці крові та корі головного мозку тварин з церебральним ішемічним інсультом (n=6-8)
Група тварин Статис- тичний показник Термін дослідження (у годинах після оклюзії загальних сонних артерій)
1 6 24
Сироватка крові
Інтактні М ±m 15,69 0,39 - -
Контроль (без препаратів) М ±m Р1 12,01 0,17 <0,001 9,43 0,63 <0,001 -
Дослід (ацелізин в комбінації з тіотриазоліном) М ±m Р1 Р2 12,60 0,27 <0,05 >0,05 13,86 0,41 <0,05 <0,001 15,10 0,24 <0,1 -
Кора головного мозку
Інтактні М ±m 19,62 0,26 - -
Контроль (без препаратів) М ±m Р1 15,08 0,23 <0,05 6,39 0,24 <0,001 -
Дослід (ацелізин в комбінації з тіотриазоліном) М ±m Р1 Р2 16,71 0,24 <0,05 <0,05 14,33 0,30 <0,05 <0,001 19,50 0,30 >0,05 -
Примітка: Р1 – у порівнянні з інтактною групою;
Р2 – у порівнянні з контрольною групою.
Виходячи з загальновідомого положення про те, що біологічну активність виявляє вільна фракція, є підстави вважати, що інтенсивність ендотоксикозу, що розвивається при ішемії мозку, зворотньопропорційна комплексоутворювальній спроможності транспортних протеїнів.
Аналіз даних світломікроскопічного дослідження впливу комбінації ацелізину та тіотриазоліну на патоморфологічну картину утворень головного мозку, що вивчаються, при його ішемії показав значне зменшення гістопатологічних ознак змін в динаміці в тканині мозку, які відображають структурно-функціональний стан нервової тканини в умовах різко обмежених можливостей гемоциркуляції в ній. Ці дані є своєрідним інтегральним, демонстрантивним показником реалізації виявлених церебропротекторних властивостей ацелізину та тіотриазоліну в умовах експерименту, що вивчається.
Рисунок. Динаміка змін показників зворотнього комплексоутворення
сироваткових білків при гострій церебральній ішемії на тлі
застосування ацелізину в комбінації з тіотриазоліном
Примітка:*- вірогідно (P<0,05) у порівнянні з інтактною групою;
** - вірогідно (P<0,05) у порівнянні з контрольною групою;
Для контролю 24 години дані не подані, оскільки тварини не
доживають до цього терміну
Таким чином, в основі церебропротекторного ефекту ацелізину в комбінації з тіотриазоліном лежить їхня спроможність попереджати формування розповсюдженої мембранопатії нейронів різних утворень головного мозку і передусім його стовбурової частини. Мембраностабілізуюча дія препаратів реалізується шляхом регулювання прооксидантно-антиоксидантної рівноваги за рахунок встановленої антиоксидантної активності з антирадикальними властивостями, збереження фонду ендогенного антигіпоксанта – цАМФ в сироватці крові та мозку, а також підсилення функціонування одного з компонентів захисно-адаптаційного механізму організму на етапі біотранспорту низькомолекулярних речовин в результаті підвищення зв'язуючої спроможності транспортних протеїнів.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення й нове вирішення наукової задачі, що визначаєтья експериментальним обгрунтуванням доцільності та ефективності застосування з профілактичною метою ацелізину в комбінації з тіотриазоліном в умовах гострого порушення церебрального кровообігу ішемічного генезу.
2. На моделі гострої ішемії головного мозку білих щурів з 11 вивчених препаратів різних фармакологічних груп значну церебропротекторну активність проявили ацелізин, тіотриазолін і, особливо, їх комбінація, на що вказують значне збільшення середньої тривалості життя тварин (на 40,12 ч; Р<0,001) і більш сприятливий перебіг клінічної картини патології.
3. Найвищу церебропротекторну ефективність препарати спричиняють при їх внутрішньоочеревинному введенні в дозах 43,47 мг/кг (ацелізин) та 67,86 мг/кг (тіотриазолін) за 70 хвилин до початку двобічного лігування каротидних судин.
4. Біохемілюмінесцентний аналіз церебропротекторної дії комбінації ацелізину з тіотриазоліном в різних утвореннях мозку щурів з ішемічним інсультом в дослідах in vitro вказує на спроможність цих препаратів суттєво корегувати кінетику надслабкого світіння як на початкових етапах розвитку вільно-радикальних реакцій, так і в період розгалуження ланцюга в більшій мірі в стовбурі мозку та дещо менше – у гіпокампі та неокортексі.
5. Профілактичне застосування ацелізину в комбінації з тіотриазоліном при гострій церебральній ішемії спричиняє виражену мембранопротекторну дію за рахунок антиоксидантних властивостей препаратів, що проявляється попередженням значного зростання рівня первинних (дієнових кон'югатів), проміжних (гідроперекисів) та кінцевих (які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою) продуктів ліпідпереокислення з одночасним попередженням зниження активності і вмісту основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму (супероксиддисмутази, каталази, сульфгідрильних груп високо- та низькомолекулярних біосубстратів, у т.ч. і глутатіону відновленого) в утвореннях головного мозку – стовбурі, гіпокампі та корі.
6. Особливістю фармакодинаміки комбінації ацелізину з тіотриазоліном, які застосовуються з профілактичною метою в умовах моделювання цереброваскулярного кризу ішемічного генезу, є здатність корегувати аденілатциклазний месенджерний каскад за рахунок підвищення вмісту цАМФ в сироватці крові (P<0,001) і корі головного мозку (P<0,001) протягом 24 годин після оклюзії загальних сонних артерій.
7. Церебропротекторна активність ацелізину в комбінації з тіотриазоліном реалізується в їхній спроможності модифікувати в динаміці комплексоутворюючі властивості білків сироватки крові щурів з формою ішемічного інсульту, що моделюється, шляхом багатократного збільшення константи асоціації комплексу “білок-ліганд” (у 3,8 –4,0 рази), а також кількості зв'язувальних центрів на молекулі протеїну (у 2,5 – 4,0 рази).
8. Профілактичне введення щурам з гострою церебральною недостатністю ішемічного генезу ацелізину в комбінації з тіотриазоліном попереджує виникнення структурних порушень в стовбурі, гіпокампі та корі головного мозку, в першу чергу за рахунок поліпшення гемоциркуляції в цих утвореннях.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Бибик О.Ю. Пошук засобів медикаментозної профілактики гострої ішемії головного мозку // Ліки.-1999.-№2.-С.83-85.
2. Лысенко Е.А., Бибик Е.Ю., Кравец Д.С. Биохемилюминисцентный анализ действия ацелизина, тиотриазолина и их комбинации // Український медичний альманах.-2000.-№3.-С.98-101.
3. Лук'янчук В.Д., Бибик О.Ю. Розробка дозового режиму комбінованого застосування ацелізину та тіотриазоліну за умов гострої ішемії головного мозку // Одеський медичний журнал.-2000.-Т.61,№5.-С.13-15.
4. Лук'янчук В.Д., Міщенко К.М., Бибик О.Ю. Прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз в ранньому постішемічному періоді при профілактичному застосуванні ацелізину та тіотриазоліну //Ліки.-2000.-№6.-С.48-51.
5. Лук'янчук В.Д., Бибик О.Ю. Вплив комбінованого застосування тіотриазоліну з ацелізином на динаміку змін комплексоутворюючих властивостей сироваткових білків при церебральному ішемічному інсульті // Клінічна фармація.-2001.-№3.-С.75-77.
6. Лук'янчук В.Д., Савченкова Л.В., Бибик О.Ю. Окисний гомеостаз мозку при ішемії і досвід експериментальної фармакотерапії (огляд літератури та власних джерел) // Журнал АМН України.-2001.-Т.7, №4.-С.647-659.
7. Бибик Е.Ю. , Лысенко Е.А., Савченкова Л.В. Сравнительная оценка состояния процессов липидпереокисления в различных структурах мозга при острой церебральной ишемии на фоне комбинированного применения ацелизина и тиотриазолина // Буковинський медичний вісник.-2001.-№4.-С.143-147.
8. Фармакология средств, регулирующих прооксидантно-антиоксидантное состояние организма /В.Д.Лукьянчук., Е.А.Лысенко, Л.В.Савченкова, Е.Ю.Бибик /Метод. Рекомендации.- Под ред. проф. В.Д.Лукьянчука.- Луганск,1999.-40с.
9. Пат. 339673 А Україна, 61 К 5/0205. Спосіб комбінованої лікарської профілактики ішемічного інсульту/ В.Д.Лук'янчук, О.Ю.Бибик, О.М.Дзюба; Бюл.№1; Заявл. 12.12.1999; Опубл.15.06.2001.
10. Бибик Е.Ю. Скрининг средств с церебропротекторной активностью // Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті: Матеріали V нац. з'їзду фармацевтів України.- Харків,1999.-С.552.
11. Лысенко Е.А., Бибик О.Ю. Биохемилюминисцентный анализ фармакодинамики потенциальных церебропротекторных средств in vitro // Матеріали IY Конгресу студентів та молодих вчених.- Тернопіль,2000.-С.336-337.
12. Лисенко О.А., Бибик О.Ю. Вплив засобів з церебропротекторною активністю на перебіг вільнорадикальних реакцій в модельних дослідах //Тези доповідей YIII Конгресу Світової Федерації Українських лікарських товариств.-Львів,2000.-С.452-453.
13. Равновесный диализ как базовый метод на этапе биотранспорта /В.Д.Лукьянчук, Д.С.Кравец, Е.Ю.Бибик, Д.М.Болгов, А.А.Коробков //Тези доповідей наукової конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження акад. В.П.Філатова.-Одеса,2000.-396-397.
14. Белоусова И.П., Бибик Е.Ю. Фармакологическая регуляция окислительного гомеостаза // Проблеми військової охорони здоров'я: Збірник наукових праць Української військово-медичної академії. Випуск 7.-Київ,2000.-С.473-477.
15. Бибик Е.Ю. Комбинированная фармакокоррекция антиоксидантной недостаточности при острой церебральной ишемии //Материалы научно-практической конференции “Лекарства - человеку”.- Харьков, 2001.-С.9-10.
16. Бибик Е.Ю. Влияние ацелизина в комбинации с тиотриазолином на интенсивность липидпереокисления в различных структурах ишемизированного мозга // Матеріали V Конгресу студентів та молодих вчених.-Тернопіль, 2001.-С.195.
17. Бибик Е.Ю. Влияние средств комбинированной фармакокоррекции на комплексообразующие свойства сывороточных белков при церебральной ишемии // Матеріали міжнародної медичної конференції студентів та молодих вчених “Сучасні проблеми клінічної та теоретичної медицини”, присвяченої 85-річчю з дня заснування Дніпропетровської медичної академії.- Дніпропетровськ,2001.-С.178.
18. Лукьянчук В.Д., Бибик Е.Ю. Современные подходы к фармакотерапии ишемического инсульта //Материалы научно-практической конференции “Лекарства-человеку”.- Харьков, 2001.-Т.XV, №1-2-С.30-33.
19. Бибик Е.Ю., Мищенко Е.М. Антиоксидантная активность с антирадикальными свойствами нового цереброактивного препарата – тиотриазолина в комбинации с ацелизином / Тези доповідей II Національного з'їзду фармакологів України “Фармакологія 2001-крок у майбутнє”.- Дніпропетровськ, 2001.-С.22.
20. Лисенко Е.А., Бибик Е.Ю. Влияние ацелизина в комбинации с тиотриазолином на состояние липидпереокисления в условиях острой церебральной ишемии / Тези доповідей II Національного з'їзду фармакологів України “Фармакологія 2001-крок у майбутнє”.- Дніпропетровськ, 2001.-С.156.
21. Дзюба О.М., Бибик О.Ю. Комбінована лікарська профілактика гострої ішемії головного мозку /Інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я № 16.- Луганський центр науково-практичної та економічної інформації, 2000 -4с.
22. Дзюба О.М., Бибик О.Ю. Церебропротекторна ефективність тіотриазоліну в комбінації з ацелізином при ішемічному інсульті / Інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я №35.- Луганський центр науково-практичної та економічної інформації, 2000 -4с.
АНОТАЦІЇ
Бибик О.Ю. Експериментальне обгрунтування комбінованого застосування ацелізину та тіотриазоліну в умовах гострої ішемії головного мозку.- Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05.-фармакологія.- Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2002.
Дисертація присвячена експериментальному обгрунтуванню доцільності комбінованого застосування ацелізину та тіотриазоліну в умовах гострої церебральної недостатності ішемічного генезу.
В експерименті показано, що найвищу профілактичну активність ацелізин в комбінації з тіотриазоліном проявляють, відповідно, у дозах 43,5 мг/кг і 67,9 мг/кг за 70 хвилин до моменту двобічної оклюзії загальних каротидних артерій.
В основі церебропротекторного ефекту препаратів лежить спроможність попереджати формування розповсюдженої мембранопатії нейронів різних утворень головного мозку і передусім його стовбурової частини шляхом регулювання прооксидантно-антиоксидантної рівноваги за рахунок виявленої антиоксидантної активності з антирадикальними властивостями, збереження фонду ендогенного антигіпоксанту – цАМФ в сироватці крові і мозку, а також протекторний ефект щодо захисно-адаптаційних механізмів, реалізованих на етапі біотранспорту за рахунок підвищення ємностей та афінітету сироваткових білків до ліганду.
Ключові слова: ацелізин, тіотриазолін, комбіноване застосування, головний мозок, ішемія.
Бибик Е.Ю. Экспериментальное обоснование комбинированного применения ацелизина и тиотриазолина в условиях острой ишемии головного мозга.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05.-фармакология.- Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2002.
Диссертация посвящена экспериментальному обоснованию целесообразности комбинированного применения ацелизина и тиотриазолина в условиях острой церебральной недостаточности ишемического генеза.
Проведенные скрининговые исследования показали, что среди 11 изученных потенциальных средств с церебропротекторной активностью из различных фармакологических групп в условиях моделируемой формы ишемического инсульта наиболее высокую и достоверно значимую (Р<0,025) профилактическую эффективность по выживанию и срокам гибели животных проявляют тиотриазолин и ацелизин, и в особенности их комбинированное применение.
В серии комплексных фармакометрических исследований по разработке оптимального режима дозирования комбинации изучаемых средств с церебропротекторными свойствами было установлено, что наиболее высокую активность препараты оказывают при их совместном внутрибрюшинном применении в дозах 43,47 мг/кг ацелизин и 67,86 мг/кг тиотриазолин за 70 минут до начала моделирования острой цереброваскулярной патологии ишемического генеза.
Исследованиями инициированной биохемилюминисценции в модельных опытах показано, что наиболее высокой антирадикальной и антиокислительной активностью ацелизин и тиотриазолин обладают в количестве 0,03 и 0,06 моль в системе, соответственно.
Комбинированное профилактическое использование ацелизина с тиотриазолином при острой церебральной ишемии приводит к предупреждению образования и накопления во все исследуемые сроки продуктов всех этапов деградации фосфолипидов мембран нейронов (диеновых коньюгатов, гидроперекисей липидов и ТБК-активных веществ) в коре, гиппокампе и стволе головного мозга.
Установлено, что предварительное введение изучаемой комбинации препаратов у животных с моделируемой формой цереброваскулярной патологии предупреждает инактивацию таких компонентов ферментативного звена эндогенной антиоксидантной системы, как каталаза и супероксиддисмутаза, а также в существенной мере увеличивает содержание восстановленного глутатиона и свободных сульфгидрильных групп. Кроме того, у животных, получавших с профилактической целью ацелизин и тиотриазолин выявлено снижение процента гемолизированных эритроцитов, что еще раз подтверждает выраженные мембранопротекторные свойства изучаемой комбинации препаратов.
В серии иммуноферментных исследований установлено, что особенностью фармакодинамики комбинации ацелизина и тиотриазолина в условиях острой церебральной ишемии является способность модифицировать аденилатциклазный мессенджерный каскад за счет повышения содержания эндогенного протектора гипоксии - цАМФ в сыворотке крови и коре головного мозга.
Церебропротекторная активность комбинации изучаемых препаратов реализуется также способностью модифицировать в динамике свойства обратимого комплексообразования белков сыворотки крови путем существенного увеличения константы ассоциации “белок-лиганд”, а также количества связывающих центров на молекуле протеина в изучаемых условиях эксперимента.
Светомикроскопическими исследованиями влияния ацелизина в комбинации с тиотриазолином на патоморфологическую картину различных образований головного мозга при его ишемии установлена положительная динамика развития обратимых гистопатологических признаков, отражающих структурно-функциональное состояние нервной ткани в условиях резко ограниченных возможностей гемоциркуляции в ней.
Ключевые слова: ацелизин, тиотриазолин, комбинированное применение, головной мозг, ишемия.
Bibik O.U. Experimental substantiation combine using of acelizine and tiotriazoline in conditions of acute brain's ischemia.- Manuscript.
This dissertation is designed for obtaining a scientific degree: “Candidate in Medical Sciences”, speciality – Pharmacology (14.03.05).- Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences, Kyiv, Ukraine, 2002.
The dissertation is dedicated to experimental substantiation expediency using of acelizine in conbination with tiotriazoline in conditions of acute cerebrovascular deficiency of ischemic genesis.
In experimant shown, that the greatest cerebroprotective activity a combination acelizine with tiotriazoline have in dosage 43,5 mg/kg acelizine and 67,9 mg/kg tiotriazoline, accordingly, for 70 minutes prior to moment of bilateral occlussion of common carotid arteries.
As complex researches have shown, ability to prevent of the formation of widespread membranopathy of neurons of different brain's structures, especially its trunk part by regulation of the prooxidative-antyoxydative balance due to clarified antyradical characteristics, preserving of the fund of endogenic antyhypoxante – cAMP in the serum of blood and brain and also intensification of function to one of components protective-adaptive mechanism of organism on the stage of biotransport of the lawmolecular substances lying in the base of cerebroprotections by acelizine with tiotriazoline.
Key words: acelizine, tiotriazoline, combinative use, brain, ischemia.