Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лабораторна робота №8
Тема: Загальні уявлення про обмін речовин. Біологічне окиснення. Кількісне визначення креатиніну в біологічних рідинах за колірною реакцією Яффе (метод Поппера).
Мета: Ознайомитись із загальними властивостями метаболізму, функціями макроергічних сполук в організмі, кінцевими продуктами біологічного окиснення. Розглянути методику кількісного визначення креатиніну в біологіч них рідинах колориметричним методом.
Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (w=10%), пікринової кислоти (насичений), дихромату калію K2Cr2O7 (w=1%); дистильована вода, профільтрована сеча, сироватка крові.
Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.
Питання для підготовки
Теоретичні відомості
Кінцевим продуктом метаболізму фосфокреатину є ангідрид кре атинін, який утворюється з фосфокреатину чи безпосередньо з креатину.
Концентрація креатиніну в сечі майже в 70 разів більша, ніж у плазмі крові. В організмі людини креатинін екскретується при клубочковій фільтрації в нирках і в невеликій кількості за ра хунок активності канальцевої секреції.
Виділення креатиніну з сечею підтримується щоденно для кожної людини на одному рівні. Вміст креатиніну в сечі безпо середньо пов'язаний з м'язовою масою людини. Це виражається у вигляді креатинінового коефіцієнту — масою (в мг) креатиніну, що виділився за 24 години, на 1 кг маси тіла. Цей коефіцієнт становить 18-32 у чоловіків і 10-20 у жінок; він невеликий у товстунів і астенічних осіб та великий в осіб середнього зросту з розвиненою мускулатурою.
При зменшенні маси м'язів унаслідок тривалого від'ємного азотистого балансу виділення креатину зростає, а креатиніну знижується, але сумарне виділення цих двох речовин залишається в цілому постійним. Така картина спостерігається, наприклад, при голодуванні, діабеті, гіпертиреозі, лихоманці.
При атрофії м'язів також відбувається підвищене виділення кре атину і зниження виділення креатиніну. Введення великих доз креатину лише незначною мірою призводить до збільшення ви ділення креатиніну з сечею, а основна частина введеного креати ну виводиться у незмінному вигляді. Введений креатинін кіль кісно виводиться з сечею. Щоденно людина виділяє з сечею таку кількість креатиніну, яка значно перевищує суму споживаного креатину і креатиніну. Рівень креатиніну, що виділяється з се чею, залежить від інтенсивності розпаду білків тканин організ му і від вмісту креатиніну в продуктах харчування.
Норма концентрації креатиніну в сироватці крові – 0,044-0,115 ммоль/л, у сечі 4,4-17,6 ммоль/л.
Хід роботи:
1. Принцип методу. При взаємодії креатиніну в лужному середовищі з пікриновою кислотою утворюється про дукт, що має жовтогаряче забарвлення. За інтенсивністю забарв лення колориметричним методом можна визначити вміст кре атиніну в досліджуваному матеріалі.
2. Виконання роботи.
У пробірку вносять з добового об'єму 1 см3 профільтрованої сечі, 5 см3 дистильованої води, 0,5 см3 10%-ного розчину натрій гідроксиду і 1 см3 насиченого розчи ну пікринової кислоти. Після ретельного перемішування суміш набуває жовтогарячого забарвлення.
Через 10 хвилин колориметрують у кюветі з l = 10 мм і λ = 530 нм (зелений світлофільтр) проти контролю. У контрольну пробу замість сечі вносять 1 см3 води. Оптичну густину досліджуваного розчину порівнюють з оптичною густиною стандартного розчину. За стандартний роз чин креатиніну править розчин К2Сг2О7 (w = 1 %). Оптична гус тина цього розчину відповідає вмісту 0,01 мг креатиніну в 1 см3 досліджуваної проби.
До 2 мл сироватки додають 6 мл насиченого розчину пікринової кислоти. Через 5 хв пробірку ставлять на 15-20 с на киплячу водяну баня. Вміст пробірки фільтрують або центрифугують, після чого відбирають 4 мл надосадової рідини і виливають в іншу пробірку. Додають 0,2 мл 10% розчину гідроксиду натрію і добре перемішують. Якщо осад мутніє, його необхідно відцентрифугувати. Загальний об’єм надосадової рідини доводять дистильованою водою до 10 мл і залишають на 10 хв. Екстинцію виміряють не пізніше ніж через 20 хв в кюветі товщиною 20 мл за довжини хвилі 530 нм. Для приготування контрольної проби до 3 мл насиченого розчину пікринової кислоти додають 0,2 мл розчину лугу, загальний об’єм доводять до 10 мл.
Концентрацію креатиніну в біологічних рідинах розраховують за формулою:
C = (D1* m * 1000)/ (D2 * V * mM)
де С – концентрація креатиніну, ммоль/дм3;
D1 – екстинкція дослі джуваного розчину;
D2 – екстинкція стандартного розчину калій дихромату;
m – вміст креатиніну в 1 см3 стандартного розчину, мг/см3;
V – об'єм рідини, взятий для дослідження, см3;
mМ – мілімолярна маса креатиніну, мг/моль.
Якщо концентрація креатиніну більша ніж 0,352 ммоль/л, сироватку необхідно розвести в 2-4 рази ізотонічним розчином натрію хлориду і перемножити отримані дані на величину розведення.
3. Записати результати досліджень.
4. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №9
Тема: Метаболізм вуглеводів. Спиртове бродіння. Окиснення глюкози дріжджами.
Мета: одержати мікробіологічним способом етиловий спирт, виділити
його з бродильного середовища, очистити й ідентифікувати; зробити розрахунки процесу за виходом вуглекислого газу.
Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (W = 10%), йоду (1%), дихромату калію (1%); сахароза, натрій гідрофосфат або калій дигідрофосфат, дистильована вода, хлібопекарські дріжджі, олія.
Обладнання: колби, пробки, газовідвідні трубки, хімічні склянки, ваги, прилад для перегонки спирту, нагрівачі для колб.
Питання для підготовки
1. Травлення вуглеводів.
2. Анаеробний шлях обміну вуглеводів.
3. Бродіння: спиртове та молочно-кисле.
4. Гліколіз і глікогеноліз. Стадії гліколізу.
Теоретичні відомості
У 1860 році Луї Пастер встановив, що бродіння не спонтанний процес, а результат життя при відсутності повітря. Він помітив, що в анаеробних умовах дріжджі зброджують значно більше цукру, ніж в аеробних, і що анаеробне бродіння необхідне для життя дріжджових клітин. Існує багато типів бродіння. Як свід чать сучасні теорії розвитку, життя виникло в ті часи, коли ки сню на Землі було надзвичайно мало. Унаслідок цього найбільш примітивні організми повинні були існувати за рахунок бродін ня, яке являє собою найдавніший і найпростіший шлях одер жання енергії клітинами.
Бродіння має важливе значення і для організму людини. Хоча у звичайних умовах м'язи отримують необхідну кількість кис ню і відбувається аеробне окиснення субстратів з виділенням великої кількості енергії, все ж інколи буває, що забезпечення киснем м'язів виявляється недостатнім. При крайньому напру женні зусиль, коли вже весь запас кисню використаний, м'язові клітини утворюють лактат шляхом бродіння. Більш того, у бі лих м'язах риб або домашньої птиці аеробний метаболізм порів няно невеликий, і основним кінцевим продуктом є молочна кислота. В організмі людини теж є такі тканини, які слабко забезпечуються кров'ю, наприклад кришталик і рогівка ока. У клітинах цих тканин забезпечення енергією здійснюється пере важно шляхом зброджування глюкози в лактат.
Частина лактату, що утворюється в м'язах й інших ткани нах, надходить у кров і переноситься в печінку, де він знову окиснюється в піруват. Менша частина пірувату потім окиснюється в циклі трикарбонових і дикарбонових кислот (Кребса), але більша частина знову перетворюється в глюкозу, яка може надходити в кров і повертатися у м'язи. Весь цей процес назива ється циклом Корі.
Зброджування глюкози в етиловий спирт відбувається в ана еробних умовах дихотомічним шляхом за участі ферментної системи дріжджів.
Послідовність реакцій спиртового бродіння і гліколізу (шлях Ембдена – Мейергофа – Парнаса) однакова до стадії піровиног радної кислоти. При гліколізі піруват відновлюється за рахунок НАДН-Н4+ за участі лактатдегідрогенази до молочної кисло ти, а при спиртовому бродінні дріжджові клітини спочатку декарбоксилюють піруват в ацетальдегід, який потім відновлю ється в етанол за участі алкогольдегідрогенази, використовуючи НАДН-Н+, утворений при окиснювальному фосфорилгованні 3-фосфогліцеральдегіду. На відміну від оборотного синтезу лак тату в дріжджів піруват необоротно декарбоксилюється до ацетальдегіду під дією піруватдекарбоксилази, яка відсутня у тка нинах тварин.
Історична довідка. Парнас Яків Оскарович (1884-1949) – біо хімік, академік АН і АМН СРСР. Народився в селі Мокряни Львів ської області. Закінчив Вищу школу в Берліні, навчався у Страсбурзі у Ф. Гофмейстера й Цюріху у Р. Вільштеттера. Викладав у Страсбурзькому університеті, завідував кафедрою фізіологічної хі мії у Варшавському університеті, очолював Інститут медичної хі мії Львівського університету з 1920 по 1941 рік, був директором Інституту біохімії АН СРСР.
Основні наукові праці присвячені вивченню тканинного обміну вуглеводів і ферментативних процесів, що лежать в основі м'язово го скорочення. Дав теоретичний аналіз механізмів гліколізу і спир тового бродіння, а також встановив зв'язок між гліколізом та ін шими перетвореннями в м'язах.
Крім молочнокислого і спиртового бродіння, є інші види: оцто вокисле; змішане кисле бродіння, при якому утворюються мураши на кислота, оцтова кислота, етанол, молочна І бурштинова кислоти; пропіоновокисле; маслянокисле; бутанольне; метанове.
Хід роботи:
1. У конічну колбу на 250 см3 вносять 20 г сахарози, додають близько 150 см3 теплої дистильованої води, розчиняють цукор. Після розчинення цукру в колбу вно сять 10-15 г хлібопекарських дріжджів і енергійно перемішу ють до утворення гомогенату. Сюди ж додають близько 1 г на трій гідрофосфату або калій дигідрофосфату. Після розчинення всіх компонентів суміші колбу із вмістом зважують і записують масу. Колбу закривають пробкою із газовідвідною трубкою, кі нець якої занурюють у посудину з водою (гідравлічний замок).
У процесі бродіння сахарози виділяється вуглекислий газ, який по газовідвідній трубці через гідравлічний замок виходить в ат мосферу, і в бродильній колбі тиск не підвищується. Разом з тим кисень повітря не проникає в колбу, тобто в бродильному середо вищі умови анаеробні, що і є обов'язковим для цього процесу.
Після закінчення бродіння через декілька днів колбу із вмі стом знову зважують (без пробки). Маса буде меншою унаслідок виділення вуглекислого газу. За масою виділеного вуглеки слого газу розраховують коефіцієнт корисної дії процесу:
С12Н22О11+ Н2О → 4С2Н5ОН + 4СО2.
Не змішуючи шар дріжджів на дні колби, зливають надосадову рідину, у якій міститься етанол, переносять у колбу для перегон ки. Для уникнення піноутворення за рахунок білків дріжджів, що були розчинені в рідині, взятій для перегонки, у колбу дода ють декілька крапель олії. У противному разі піна дуже заважа тиме перегонці. Збирають фракцію, яка кипить при температурі 90-95°С. Отриманий дистилят переганяють ще декілька разів і при останній перегонці збирають фракцію з температурою кипін ня 82-85°С. В останньому дистиляті якісно визначають наявність етилового спирту, окиснюючи його К2Сг2О7 до оцтового альдегіду, який має характерний запах прілих яблук:
ЗСН3-СН2-ОН + К2Сг2О7 + 4Н2SО4 → ЗСН3СОН+ Сг2(SО4)3 + К2SО4 + 7Н2О,
або за реакцією одержання йодоформу з етилового спирту, йоду і натрій гідроксиду:
J2 + 2NaОН → NaJ + NaOJ + Н2O
СН3СН2ОН + NaOH → СН3СОН + Na + Н2O
СН3СОН + ЗNаОJ → СH3СОН + ЗNаОН
СH3СОН + NaOН → НСООNa + СН3J жовтий осад.
Йодоформна реакція дозволяє виявляти в розчині дуже не значну кількість етанолу.
2. Записати результати досліджень.
3. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №10
Тема: Метаболізм вуглеводів. Визначення вмісту глюкози в крові методом Хагедорна-Йенсена.
Мета: Освоїти методику визначення глюкози в сироватці крові непря мим способом із застосуванням зворотного йодометричного титрування; навчитися визначити фізіологічну величину вмісту глюкози в крові.
Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (0,1М), сульфату цинку (w=45%), оцтова кислота (w=3%), крохмалю (w=1%), K3[Fe(CN)6] (0,0017М), натрій тіосульфат (С(1/2)=0,0025 моль/дм3), реактив А; дистильована вода, сироватка крові.
Обладнання: водяна баня, мікро бюретки, фільтрувальний папір, пробірки, штативи.
Питання для підготовки
1. Аеробне окиснення вуглеводів.
2. Перетворення молочної кислоти.
3. Цикл три карбонових кислот (цикл Кребса).
4. Енергетичний баланс окиснення вуглеводів.
5. Біосинтез вуглеводів.
Теоретичні відомості
В організмі людини і тварини вуглеводи є головним джерелом хімічної енергії. Окремі органи задовольняють свої потреби в основному в результаті розщеплення глюкози: головний мозок – на 80%, серце – на 70-75%. Глюкоза може надходити у тваринний організм у готовому вигляді чи утворюватися при гідролізі олігосахаридів і полісахаридів за участі амілолітичних фермен тів – амілази, мальтази, сахарози, лактази, інвертази. Гексози всмок туються головним чином у тонкому кишечнику у вигляді гексозофосфатів. Після переходу крізь кишкову стінку моносахариди фруктоза, галактоза, маноза таутомеризуються в глюкозу. Транс портування моносахаридів у клітини епітелію здійснюється за допомогою спеціальних білків-переносників. Процес всмоктування активується йонами Nа+, які створюють натрієвий насос, що забезпечує активне транспорту вання моносахаридів крізь мембрани ентероцита.
Моносахариди крові використовуються для різних потреб організму – енергетичних, пластичних, захисних тощо. Так, у людини 3-5% глюкози крові використовуються для синтезу глікогену, 30-35% – для синтезу ліпідів, 60-70% – служать джерелом хімічної енергії. Глюкоза знаходиться у вільному і зв'язаному станах. У деяких випадках кількість зв'язаної глю кози сягає 40-50% загального її вмісту в крові. Артеріальна кров, що надходить у головний мозок по сонних артеріях, на 98-105 мг % містить більше глюкози, ніж венозна кров, яка від тікає від мозку по яремних венах.
Запас глікогену, що міститься у м'язах, має поповнюватися за рахунок глюкози крові. Якщо кількість глюкози, яка надходить з їжею або вилучається з глікогену печінки, виявляється недостатньою, то вона повинна синтезуватися з амінокислот.
Особливість метаболізму глюкози полягає також у тому, що певні тканини, у тому числі мозок, клітини крові, мозкова речо вина нирок, отримують практично всю необхідну для них енер гію за рахунок окиснення глюкози. Тому не можна допускати, щоб вміст глюкози в крові зменшувався значно нижче норми (3,9-6,2 ммоль/дм3).
Досить поширене метаболічне порушення у людини – цук ровий діабет. Чітким симптомом діабету є висока концентрація глюкози в крові, вміст якої може досягати 8-60 ммоль/дм3. На діабет хворіє більше 3% людей віком від 40 до 50 років, а серед осіб, старших 70 років, на це захворювання страждає більш як 7%. Схильність до діабету є спадковою. Унаслідок дефектно сті генів, відповідальних за біосинтез гормону білкової природи інсуліну, відбувається атрофія β-клітин підшлункової залози, де і синтезується цей гормон, який регулює вміст глюкози в крові і взагалі її метаболізм.
Хід роботи:
1. У пробірку вносять 0,1-0,2 см3 сиро ватки крові. Для видалення білків приливають 1 см3 розчину натрій гідроксиду (С = 0,1М) і 4 см3 розчину цинк суль фату (w = 0,45%). Пробірку нагрівають на киплячій водяній бані 3 хвилини, після чого суміш фільтрують в іншу пробірку. Промивають осад на фільтрі гаря чою водою 3 рази по 2 см3.
Одночасно ставлять контрольну пробу, яка замість сироват ки крові містить такий же об'єм води.
У всі проби додають по 2 см3 (точно!) розчину калій гексаціано-(Ш)-ферату (С = 0,0017М) і нагрівають у киплячій водяній бані 15 хвилин. У цей час відбувається окиснення глю кози (і можливих інших відновників). Слід мати на увазі, що така кількість окисника калій гексаціано-(Ш)-ферату може окиснити не більше 0,385 мг глюкози. Отже, сироватки крові треба взяти стільки, щоб у цій пробі глюкози не було більше зазначе ної кількості.
Після нагрівання всі проби охолоджують до кімнатної темпе ратури, додають у кожну 3 см3 реактиву А (10 г цинк сульфату і 50 г натрій хлориду розчиняють у воді і доводять водою до 200 см3; до 40 см3 цього розчину додають 1 г калій йодиду), 2 см3 розчину оцтової кислоти (w = 3%) і розчин крохмалю (w = 1%) до чіткого синього забарвлення. Титрують із мікробюретки розчином на трій тіосульфату (С(1/2) = 0,0025 моль/дм3) до знебарвлення. Додавати всі реактиви треба перед початком титрування.
Вміст глюкози розраховується за спеціальною таблицею. При титруванні визначається йод, що відповідає надлишку калій гексаціано-(ІП)-ферату, який залишився після окиснення глюкози у пробі сироватки крові. Оскільки кількість окисника, взятого для окиснення глюкози в пробі сироватки відома (2 мл, С = 0,0017 моль/дм3) і кількість окисника, що залишилася, визначена йодометрично, можна розрахувати кількість K3[Fe(CN)6], що пішла на окиснення глюкози. Чим менше витрачено тіосульфату, тим було більше глюкози в даній пробі. Таблицю складено так, що в ній певному об'єму розчину натрій тіосульфату, витраченому на титрування надлишку калій гексаціано-(ІІІ)-ферату, відповідає та маса глюкози (в мг), яка була окиснена.
Якщо, наприклад, на титрування надлишку окисника пішло 1,51 см3 тіосульфату, то за таблицею це відповідає 0,086 мг глю кози. Нехай на титрування холостої проби використано 1,97 см3 тіосульфату, що відповідало б 0,005 мг глюкози. Цю „масу глю кози” слід відняти від маси, знайденої у досліді.
m (дослідна) – m (холостої проби) = m (глюкози)
Концентрація глюкози в крові визначається за формулою:
С(глюкози) = m (глюкози)/ mМ(глюкози)*V,
де m (глюкози) – маса глюкози в крові, знайденої по таблиці, мг,
mМ(глюкози) – мілімолярна маса глюкози, мг/моль,
V – об’єм сироватки крові, дм3.
2. Записати результати спостережень та обчислити концентрацію глюкози в досліджуваній пробі.
3. Записати висновок щодо виконання лабораторної роботи.
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №11
Тема: Метаболізм ліпідів. Виявлення кетонових тіл.
Мета: Ознайомитись із метаболізмом ліпідів, розглянути методику якісного визначення кетонових тіл в біологіч них рідинах. Засвоїти методику оцінки фізіологічного стану організму за кількістю кетонових тіл в фізіологічних рідинах.
Реактиви: розчини: нітропрусиду натрію (w=10%), гідроксиду натрію (10%), сульфату амонію (50%), аміаку (25%); льодяна ацетатна кислота, дистильована вода, сеча хворого на цукровий діабет та сеча здорової людини.
Обладнання: пробірки, штативи, піпетки.
Питання для підготовки
1. Травлення жирів. Всмоктування ліпідів.
2. Внутрішньоклітинне окиснення продуктів гідролітичного розщеплення жирів.
3. Біосинтез тригліцеридів.
4. Обмін складних ліпідів.
Теоретичні відомості
У здорової людини в крові вміст кетонових тіл – 13-185 мкмоль/л (1,5-20 мг/л), із сечею виділяється 20-40 мг на добу. Це переважно ацетоацетатна і β-оксимасляна кисло ти. Ацетон з'являється в організмі за наявності патології. Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і сечі (кетонурія) спостеріга ють при цукровому діабеті, дефіциті вуглеводів у харчуванні, перепро дукції гормонів – антагоністів інсуліну (кортикостероїдів, тироксину, гормонів передньої долі гіпофіза тощо). В умовах відсутності необхідної терапії концентрація кетонових тіл зростає в десятки разів, що супро воджується порушенням кислотно-основного стану і розвитком мета болічного кетоацидозу, що є небезпечним, у першу чергу, для нормального функціонування клітин головного мозку. Зниження кількості кетонових тіл не має клінічного значення. У дітей тривалі розлади у травному тракті (токсикоз, шигельоз) можуть призвести до кетонемії в результаті хронічного голодування і виснаження.
Хід роботи:
1. Принцип методу. Ацетон і ацетоацетатна кислота з натрію нітропрусидом у лужному середовищі в разі нашарування аміаку утворюють фіолетове кільце. Швидкість утворення кільця залежить від концентрації ацетону. Вста новлено, що поява кільця протягом 3-4 хв. відповідає вмісту 0,0085 г/л (0,85 мг/100 мл) ацетону.
2. Виконання роботи.
Беруть 8 пробірок. У всі, крім першої, наливають по 1 мл дистильованої води. У першу та другу пробірки додають по 1 мл сечі хворого на цукровий діабет. Таким чином, у першій пробірці сеча не розведена, а в другій розведена в два рази. Після перемішування з другої пробірки відбирають 1 мл суміші і переносять у третю пробірку, з третьої – у четверту і т. д. З останньої пробірки 1 мл виливають для урівнювання об'єму з іншими пробірками. Таким чином, сеча в пробірках буде розведеною у 2, 4, 8 (і т. д.) разів. Потім у кожну пробірку дода ть по 8 крапель 50 % розчину амонію сульфату для збільшення густини розчинів, по 8 крапель ацетатної кислоти (концентрованої) та натрію нітропрусиду. Вміст пробірок перемішують і в кожну з них обережно по стінках, починаючи з останньої пробірки, нашаровують по 1 мл концентрованого аміаку (реактив відбирати обережно, лише за допомогою гумової груші, працюючи з ним під витяжною шафою). Спостерігаючи за пробірками, позначають ту з них, у якій за максимального розведення сечі протягом 3-4 хв ще помітне фіолетове кільце на межі рідин.
Розрахунок роблять за формулою:
Х = 0,85х А х 15,
де X – концентрація ацетону в сечі, мг/добу;
0,85 – емпіричне число; А – розведення сечі; 15 – перерахунок на добову сечу, 1 500 мл.
Після проведення розрахунків зробити висновок про отриманий ре зультат.
3. Записати результати досліджень.
4. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №12
Тема: Метаболізм білків. Кількісне визначення білка за методом Лоурі.
Мета: Ознайомитись із процесами метаболізму білків; методами кількісного визначен ня білків.
Реактиви: розчини: натрій карбонату (w=2%) в гідроксиді натрію NaOH (С=0,1 моль/дм3), купрум сульфату (w=0,5%) в натрій тартраті (w=3,33%), реактив Фоліна, дистильована вода.
Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.
Питання для підготовки
Теоретичні відомості
За методом Лоурі вимірюють інтенсивність забарвлення розчину, який з'являється в резуль таті протікання принаймні двох реакцій на білок: біуретової реакції і реакції Фоліна з залишками тирозину і цистеїну у складі білкових молекул. Реактив Фоліна являє собою суміш фосфорно-вольфрамової і фосфорно-молібденової кислот. За учас ті білка відбувається відновлення цих кислот. Відновлені фор ми мають інтенсивне синє забарвлення. Вважають, що в реакції відновлення беруть участь комплексні сполуки Купруму, які виникають при взаємодії білка в лужному середовищі з купрум гідроксидом. Метод Лоурі надзвичайно чутливий і дозволяє ви значати білок у сильно розбавленому розчині, де його вміст ста новить лише десятки мікрограмів, і, як правило, застосовується для визначення білків в елюатах із колонок при фракціонуван ні на йонообмінних смолах і сефадексах. За методом Лоурі у розчині визначається не сам білок, а результат його відновної дії на фосфорно-вольфрамову і фосфорно-молібденову кислоти.
Хід роботи
1. Готують розчин для проведення біуретової реакції. Для цього спочатку змішують 49 мл розчину А з 1 мл розчину В. Розчин А являє собою розчин натрій карбонату в розчині натрій гідроксиду. Розчин В являє собою розчин купрум сульфату в розчині натрій чи калій тартрату. До 1 см3 досліджуваного білкового розчину, що містить від 10 до 100 мкг білка, додають 4 см3 суміші розчинів А і В. Перемішують і залишають на 10 хвилин при кімнатній тем пературі. Потім швидко доливають з піпетки 0,4 см3 реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хвилин до появи забарвлення. При цьому жовте забарвлення реактиву Фоліна поступово переходить у синє. Оптичну густину розчину ви значають на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 750 нм у кюветі з l = 10 мм.
2. Вміст білка в досліджуваній пробі визначають за калібруваль ним графіком, який будують за розчином будь-якого чистого білка точно відомої концентрації. Краще використовувати роз чин того білка або суміші білків, які визначають за методом Лоурі. Для цього готують серію розчинів чистого білка, в 1 см3 якого міститься від 20 до 400 мкг білка. Стандартний білок для калібрувального графіка розчиняють у розчині натрій гідрокси ду (С=0,1 моль/дм3). Серію розчинів готують шляхом розве дення вихідного концентрованого розчину білка (400 мкг в 1 см3) до необхідних значень. З кожним із зазначених розчинів прово дять не менше трьох разів реакцію Лоурі, застосовуючи об'єми реагентів, вказані вище (5,4 см3). За отриманими даними буду ють графік – калібрувальну криву. На ординаті відкладають зна чення оптичної густини, на абсцисі – вміст білка в пробі.
3. Визначивши оптичну густину досліджуваного розчину білка після проведення реакції Лоурі, на калібрувальному графіку про водять від певного значення оптичної густини пряму, паралель ну осі абсцис до перетину з калібрувальною кривою, і опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Таким чином визначають вміст білка в пробі досліджуваного розчину. Роблять перерахунки вмісту білка на 100 см3 досліджуваного розчину.
Перевагами визначення білка за методом Лоурі є короткий час визначення порівняно з іншими методами і надзвичайно велика чутливість, що надає можливість визначати слідові кількості білка. Недоліками є те, що за цим методом можна визна чити лише водорозчинні білки, сине забарвлення розчину не до сить стійке, що зменшує точність вимірювання.
4. Записати результати досліджень.
5. Записати висновок щодо виконання лабораторного заняття.
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №13
Тема: Обмін нуклеїнових кислот. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові та сечі.
Мета: Ознайомитись із процесами метаболізму нуклеїнових кислот; методами кількісного визначен ня продуктів їх розпаду.
Реактиви: сироватка або плазма крові, сеча, розчини: натрій вольфрамату (10%), натрій карбонату (10.3 г/100мл), сульфатної кислоти (0,35 М), фосфатвольфрамовий реактив (реактив Фоліна), дистильована вода.
Обладнання: пробірки, піпетки, штативи, центрифуга.
Питання для підготовки
Теоретичні відомості
Елементарними одиницями будови нуклеїнових кислот є нуклеотиди, які складаються з гетероциклічних азотистих основ (пуринових та піримідинових), пентоз та фосфорної кислоти.
У результаті катаболізму нуклеотидів утворюються вище вказані сполуки, які підлягають подальшому розпаду або включення в певні синтетичні процеси. Залишки фосфорної кислоти та пентози використовуються у клітинному метаболізмі. Піримідинові основи розпадаються до β-аланіну, оксиду карбону (IV) та аміаку. Β-аланін використовується для синтезу дипептидів м’язової системи – карнозину та ансерину – або виділяється із сечею. Основна кількість аміаку знешкоджується в орнітиновому циклі.
Кінцевим продуктом обміну пуринових основ є сечова кислота – 2,6,8-триоксипурин. Дана сполука не підлягає подальшому окисненню і виділяється як кінцевий продукт обміну за участю нирок. У нормі концентрація сечової кислоти у цільній крові становить 3-4 мг/л, у сироватці близько 5 мг/л. З сечею у нормі виділяється 1,60-3,54 ммоль/добу (270-700 мг/добу).
У чоловіків вміст сечової кислоти при визначення її за допомогою фосфатвольфрамового фотометричного методу у сироватці крові становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.
Хід роботи
Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти в сироватці крові.
Хід виконання роботи. У центрифужнуі пробірки вміщують по 0,5 мл сироватки крові або сечі, розведеної у 10 раз, та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірок перемішують і додають 0,25 мл розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл розчину натрій вольфрамату. Вміст пробірок перемішують і через 5 хв центрифугують протягом 10 хв із швидкістю 3000 об/хв. Проводять визначення вмісту сечової кислоти за Табл.:
Табл. Визначення вмісту сечової кислоти в сироватці крові
|
Реактиви |
Контрольна проба, мл |
Стандартна проба, мл |
Дослідна проба, мл |
|
Надосадова рідина |
– |
– |
2 |
|
Стандартний розчин сечової кислоти |
– |
2 |
– |
|
Вода дистильована |
2 |
– |
– |
|
Розчин натрій карбонату |
1 |
1 |
1 |
|
Фосфатвольфрамовий реактив |
0.5 |
0,5 |
0,5 |
Вміст пробірок переміщують, через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідної проб за довжини хвилі 640 нм (590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм. Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.
Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:
С = (Dд×30×А) / Dс,
де С – вміст сечової кислоти у дослідній пробі, кмоль/л;
Dд – оптична густина дослідної проби;
Dс – оптична густина стандартної проби;
30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині. Кмоль/л;
А – величина розведення (А=10 для сироватки крові або 100 для сечі).
Завдання для самостійної підготовки
Лабораторна робота №14
Тема: Обмін води і мінеральних солей. Кількісне визначення Кальцію в сироватці крові.
Мета: Ознайомитись із методиками кількісного визначення мінеральних речовин у біологічному матеріалі, з’ясувати роль макро- і мікроелементів в живих організмах.
Реактиви: розчини: натрій карбонату (2%) в гідроксиді натрію NaOH (С=0,1 моль/дм3), купрум сульфату (0,5%) в натрій тартраті (3,33%), реактив Фоліна, дистильована вода.
Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.
Контрольні запитання
1. Вміст і розподіл води в організмі.
2. Обмін води і регуляція водного обміну.
3. Значення мінеральних речовин в організмі людини.
4. Біохімічна роль окремих макро- і мікроелементів та особливості їх обміну.
Теоретичні відомості
Кальцій є одним із найбільш важливих макроелементів органі зму. Його частка складає майже третину всіх мінеральних речо вин організму. 97% Кальцію зосереджено в скелеті у вигляді фосфатів і карбонатів. До 1% Кальцію знаходиться у вигляді йонів Са2+.
Всмоктується Кальцій переважно в тонкому кишечнику тва рин. Інтенсивність всмоктування залежить від вмісту Кальцію у харчових продуктах, потребі в ньому тварин, наявності вітаміну D. При пухлинах головного мозку різко зменшується вміст мі неральних речовин в кістковій і м'язовій тканинах. При нестачі вітамінів групи D зменшується ступінь засвоєння організмом Кальцію. Вітамін D є складовою частиною білкового переносни ка – кальцій-зв'язуючого протеїну, який при всмоктуванні ви конує функції стимулятора дифузії, носія і концентратора Каль цію. 40% Кальцію зв'язано з альбумінами крові, які транспор тують Кальцій до тканин і клітин.
Кальцій бере участь у регуляції порозності ендотелію судин, у створенні структури кісткової тканини, у процесах коагуляції крові, знижує збудливість нервової системи, стимулює скорочен ня серцевого м'язу, знижує проникність клітинних мембран, змен шує здатність колоїдів зв'язувати воду, бере участь у регуляції діяльності багатьох ферментів. Так, Кальцій є інгібітором енолази і дипептидази, активатором лецитинази і актоміозин-АТФ-ази. Йони Кальцію активують кіназу фосфорилази, блокують натрієві канали, активують аденілатциклазу. При нестачі у їжі Кальцію виникає гіпокальцемія. Вона супроводжується гіперфосфатемією, підвищенням проникності клітинних мембран, остеопорозом, крихкістю і викривленням кісток, остеомаляцією, рахітом, судомами.
Обмін Кальцію в організмі регулюється паратгормоном і кальцитоніном. Гіпофункція паращитовидної залози призводить до виникнення тетанії – захворювання, яке супроводжується зменшенням вмісту Кальцію в крові. У нормі вміст Кальцію в сироватці крові знаходиться в межах 9-11 мг%.
Щоденне виділення із сечею Са2+ складає 100-300 мг. Низь ка розчинність солей Кальцію призводить до того, що вони випа дають в осад у вигляді агрегатів або каменів. Близько третини цих каменів складається з Са3(РО4)2, СаСО3, МgNН4РО4 або їх су міші. Утворення цих каменів часто відбувається в результаті хронічного залуження сечі в сечовому міхурі і ниркових чашках, яке є наслідком бактеріальної інфекції. Ферменти бактерій гідролізують сечовину з утворенням амоніаку. Утворенню ка менів спричинює надлишкове виділення Са2+, наприклад, при гіперпаратиреоїдозі, остеопорозі, який викликаний нерухомістю, а також надвисоким вмістом Са2+ у їжі. Близько половини нир кових каменів складається або з кальцій оксалату в чистому вигляді, або із суміші його з Са3(РО4)2, СаСО3. Такі камені вияв ляються у людей, які вживають велику кількість рослинної їжі, що містить багато щавлевої кислоти (щавель, шпинат, ревінь, редиска). Крім того, камені, що складаються з кальцій оксалату, є наслідком оксалурії – спадкового порушення метаболізму глі цину, при якому практично весь синтезований гліцин окиснюється через гліоксилову кислоту до щавлевої кислоти.
Хід роботи
Принцип методу. Кальцій, що міститься у вигляді солей у сироватці крові, переводять в оксалат. При розчиненні каль цій оксалату в сульфатній кислоті вивільнюється еквівалент на кількість щавлевої кислоти, яку відтитровують розчином КМnО4.
1. В одну центрифужну пробірку вносять 1 мл негемолізованої сироватки крові, а в іншу – 1 мл бідистильованої води (контроль). В обидві пробірки додають по 1 мл насиченого розчину амоній оксалату і залишають стояти на 1 го дину. Потім проби центрифугують при 3000 g протягом 10 хви лин. Зливають рідину, перевертаючи пробірки. Вносять у пробір ки по 2 мл розчину амоніаку (w=2%), збовтують осад і знову центрифугують. Осад кальцій оксалату легко розчиняється в мінеральних кислотах і нерозчинний у слабколужному середовищі. Тому надлишок амоній оксалату видаляють багаторазо вою промивкою (не менше 3 разів) розчином амоніаку (w= 2%). Потім додають у кожну пробірку по 1 мл розчину сульфатної кислоти (w=5%). Осад перемішують для повного його розчинення. Кількісно переносять вміст пробірок у колби на 25 мл, додають близько 3-4 мл гарячого розчину сульфатної кислоти (w= 5%) і гарячий розчин титрують з мікробюретки розчином КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3) до появи слабко-рожевого забарвлення, що не зникає протягом 1 хвилини.
Контроль служить для встановлення вмісту Кальцію у реак тивах.
Вміст Кальцію в біологічному об'єкті визначають за формулою:
С = (V1-V2) × T × 1000 /V3 × mM (ммоль/дм3),
де С – вміст Са2+ у сироватці крові, ммоль/дм3;
V1 – об'єм розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), що пішов на титрування дослідної проби, см3;
V2 – об'єм розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), витра чений на титрування контрольної проби, см3;
V3 – об'єм сироватки крові, взятий для аналізу, см3;
Т – титр робочого розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), за Кальцієм (0,2 мг/см3);
mM – мілімоль йонів Кальцію, мг/моль.
2.Обрахувати результати досліду та записати висновки по лабораторній роботі.
Завдання для самостійної підготовки
1. Користуючись довідником з біохімії, скласти перелік ферментів, для яких Са2+ є активаторами чи інгібіторами.
2. Заповнити таблицю:
Табл. Біохімічна роль макро- і мікроелементів.
|
№ п/п |
Хімічний елемент |
Локалізація |
Біологічна роль |
Порушення обміну |
|
Макроелементи |
||||
|
Мікроелементи |
||||
3.Скільки ендогенної води утвориться в організмі людини внаслідок вживання їжі з енергетичною цінністю 4000 ккал?
4. Концентрація кальцію в крові хворого становить 7,8 ммоль/л (норма – 2,4 ммоль/л), а кількість неорганічних фосфатів зменшена приблизно вдвічі. Яке захворювання можна передбачити? Описати основні ознаки цієї хвороби.