Будь умным!

У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

Тема- Загальні уявлення про обмін речовин

Работа добавлена на сайт samzan.net:


Лабораторна робота №8

Тема: Загальні уявлення про обмін речовин. Біологічне окиснення. Кількісне визначення креатиніну в біологічних рідинах за колірною реакцією Яффе (метод Поппера).

Мета: Ознайомитись із загальними властивостями метаболізму, функціями макроергічних сполук в організмі, кінцевими продуктами біологічного окиснення. Розглянути методику кількісного визначення креатиніну в біологічних рідинах колориметричним методом.

Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (w=10%), пікринової кислоти (насичений), дихромату калію  K2Cr2O7 (w=1%); дистильована вода, профільтрована сеча, сироватка крові.

Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.

Питання для підготовки

  1.  Обмін речовин та енергії: катаболізм, анаболізм.  Загальні закономірності обміну речовин.
  2.  Стадії катаболізму та анаболізму. Реакції внутрішньоклітинного метаболізму.  Метаболічні шляхи.
  3.  Джерела енергії в живій природі.
  4.  Основні макроергічні сполуки. АТФ – будова та принципи функціонування.
  5.  Історія розвитку уявлень про біологічне окислення.
  6.  Сучасні вчення про механізм біологічного окислення.
  7.  Окислювальне фосфорилювання.
  8.  Мітохондрії, їх будова та функції.

Теоретичні відомості

Кінцевим продуктом метаболізму фосфокреатину є ангідрид креатинін, який утворюється з фосфокреатину чи безпосередньо з креатину.

Концентрація креатиніну в сечі майже в 70 разів більша, ніж у плазмі крові. В організмі людини креатинін екскретується при клубочковій фільтрації в нирках і в невеликій кількості за рахунок активності канальцевої секреції.

Виділення креатиніну з сечею підтримується щоденно для кожної людини на одному рівні. Вміст креатиніну в сечі безпосередньо пов'язаний з м'язовою масою людини. Це виражається у вигляді креатинінового коефіцієнту — масою (в мг) креатиніну, що виділився за 24 години, на 1 кг маси тіла. Цей коефіцієнт становить 18-32 у чоловіків і 10-20 у жінок; він невеликий у товстунів і астенічних осіб та великий в осіб середнього зросту з розвиненою мускулатурою.

При зменшенні маси м'язів унаслідок тривалого від'ємного азотистого балансу виділення креатину зростає, а креатиніну знижується, але сумарне виділення цих двох речовин залишається в цілому постійним. Така картина спостерігається, наприклад, при голодуванні, діабеті, гіпертиреозі, лихоманці.

При атрофії м'язів також відбувається підвищене виділення креатину і зниження виділення креатиніну. Введення великих доз креатину лише незначною мірою призводить до збільшення виділення креатиніну з сечею, а основна частина введеного креатину виводиться у незмінному вигляді. Введений креатинін кількісно виводиться з сечею. Щоденно людина виділяє з сечею таку кількість креатиніну, яка значно перевищує суму споживаного креатину і креатиніну. Рівень креатиніну, що виділяється з сечею, залежить від інтенсивності розпаду білків тканин організму і від вмісту креатиніну в продуктах харчування.

Норма концентрації креатиніну в сироватці крові – 0,044-0,115 ммоль/л, у сечі 4,4-17,6 ммоль/л.

Хід роботи:

1. Принцип методу. При взаємодії креатиніну в лужному середовищі з пікриновою кислотою утворюється продукт, що має жовтогаряче забарвлення. За інтенсивністю забарвлення колориметричним методом можна визначити вміст креатиніну в досліджуваному матеріалі.

2. Виконання роботи.

У пробірку вносять з добового об'єму 1 см3 профільтрованої сечі, 5 см3 дистильованої води, 0,5 см3 10%-ного розчину натрій гідроксиду і 1 см3 насиченого розчину пікринової кислоти. Після ретельного перемішування суміш набуває жовтогарячого забарвлення.

Через 10 хвилин колориметрують у кюветі з l = 10 мм і   λ = 530 нм (зелений світлофільтр) проти контролю. У контрольну пробу замість сечі вносять 1 см3 води. Оптичну густину досліджуваного розчину порівнюють з оптичною густиною стандартного розчину. За стандартний розчин креатиніну править розчин К2Сг2О7 (w = 1 %). Оптична густина цього розчину відповідає вмісту 0,01 мг креатиніну в 1 см3 досліджуваної проби.

До 2 мл сироватки додають 6 мл насиченого розчину пікринової кислоти. Через 5 хв пробірку ставлять на 15-20 с на киплячу водяну баня. Вміст пробірки фільтрують або центрифугують, після чого відбирають 4 мл надосадової рідини і виливають в іншу пробірку. Додають 0,2 мл 10% розчину гідроксиду натрію і добре перемішують. Якщо осад мутніє, його необхідно відцентрифугувати. Загальний об’єм надосадової рідини доводять дистильованою водою до 10 мл і залишають на 10 хв. Екстинцію виміряють не пізніше ніж через 20 хв в кюветі товщиною 20 мл за довжини хвилі 530 нм. Для приготування контрольної проби до 3 мл насиченого розчину пікринової кислоти додають 0,2 мл розчину лугу, загальний об’єм доводять до 10 мл.

Концентрацію креатиніну в біологічних рідинах розраховують за формулою:

                     

           C = (D1* m * 1000)/ (D2 * V * mM)

де С – концентрація креатиніну, ммоль/дм3;

D1 – екстинкція досліджуваного розчину;

D2 – екстинкція стандартного розчину калій дихромату;

m – вміст креатиніну в 1 см3 стандартного розчину, мг/см3;

V – об'єм рідини, взятий для дослідження, см3;

mМ – мілімолярна маса креатиніну, мг/моль.

Якщо концентрація креатиніну більша ніж 0,352 ммоль/л, сироватку необхідно розвести в 2-4 рази ізотонічним розчином натрію хлориду і перемножити отримані дані на величину розведення.

3. Записати результати досліджень.

4. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.

Завдання для самостійної підготовки

  1.  Деякі фармацевтичні засоби, які використовують для схуднення, за своєю дією є роз’єднувачами біологічного окиснення і фосфорилювання. Обґрунтуйте їх терапевтичну дію.
  2.  Здорова доросла людина повинна щоденно отримувати з їжею 6386 кДж (при масі 70 кг). Ефективність перетворення енергії харчових продуктів в енергію АТФ складає біля 50%. Обчисліть масу АТФ, необхідну для енергетичних потреб людини протягом доби. Яку частку від маси тіла вона складає? Які найбільш ефективні шляхи перетворення енергії їжі в енергію АТФ? (Молярна маса АТФ 507 г/моль).
  3.  У процесі гліколізу на 1 моль глюкози вивільняється 199080 Дж, при спиртовому бродінні на 1 моль глюкози, що розпалася, вивільняється 235 620 Дж. У кожному випадку 61 200 Дж вивільненої енергії запасається в макроергічних зв'язках 2 молів АТФ. Розрахуйте коефіцієнти корисної дії спиртового бродіння і гліколізу.
  4.  Гіперфункція щитоподібної залози призводить до підвищення основного обміну. Поясніть механізм даного ефекту.
  5.  У новонароджених, на відміну від дорослих, міститься деяка кількість бурого жиру. Поясніть таку особливість будови організмів різного віку, якщо відомо, що бурий жир містить велику кількість мітохондрій, а вихід АТФ в ньому на атом поглитуного кисню становить менше одиниці.
  6.  У разі потрапляння ціанідів в організм людини розвивається ядуха і через декілька хвилин може настати смерть. Поясніть причини та механізм даного явища.

Лабораторна робота №9

Тема: Метаболізм вуглеводів. Спиртове бродіння. Окиснення глюкози дріжджами.

Мета: одержати мікробіологічним способом етиловий спирт, виділити
його з бродильного середовища, очистити й ідентифікувати; зробити розрахунки процесу за виходом вуглекислого газу.

Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (W = 10%), йоду (1%), дихромату калію  (1%);  сахароза, натрій гідрофосфат або калій дигідрофосфат, дистильована вода, хлібопекарські дріжджі, олія.

Обладнання: колби, пробки, газовідвідні трубки, хімічні склянки, ваги, прилад для перегонки спирту, нагрівачі для колб.

Питання для підготовки

1. Травлення вуглеводів.

2. Анаеробний шлях обміну вуглеводів.

3. Бродіння: спиртове та молочно-кисле.

4. Гліколіз і глікогеноліз. Стадії гліколізу.

Теоретичні відомості

У 1860 році Луї Пастер встановив, що бродіння не спонтанний процес, а результат життя при відсутності повітря. Він помітив, що в анаеробних умовах дріжджі зброджують значно більше цукру, ніж в аеробних, і що анаеробне бродіння необхідне для життя дріжджових клітин. Існує багато типів бродіння. Як свідчать сучасні теорії розвитку, життя виникло в ті часи, коли кисню на Землі було надзвичайно мало. Унаслідок цього найбільш примітивні організми повинні були існувати за рахунок бродіння, яке являє собою найдавніший і найпростіший шлях одержання енергії клітинами.

Бродіння має важливе значення і для організму людини. Хоча у звичайних умовах м'язи отримують необхідну кількість кисню і відбувається аеробне окиснення субстратів з виділенням великої кількості енергії, все ж інколи буває, що забезпечення киснем м'язів виявляється недостатнім. При крайньому напруженні зусиль, коли вже весь запас кисню використаний, м'язові клітини утворюють лактат шляхом бродіння. Більш того, у білих м'язах риб або домашньої птиці аеробний метаболізм порівняно невеликий, і основним кінцевим продуктом є молочна кислота. В організмі людини теж є такі тканини, які слабко забезпечуються кров'ю, наприклад кришталик і рогівка ока. У клітинах цих тканин забезпечення енергією здійснюється переважно шляхом зброджування глюкози в лактат.

Частина лактату, що утворюється в м'язах й інших тканинах, надходить у кров і переноситься в печінку, де він знову окиснюється в піруват. Менша частина пірувату потім окиснюється в циклі трикарбонових і дикарбонових кислот (Кребса), але більша частина знову перетворюється в глюкозу, яка може надходити в кров і повертатися у м'язи. Весь цей процес називається циклом Корі.

Зброджування глюкози в етиловий спирт відбувається в анаеробних умовах дихотомічним шляхом за участі ферментної системи дріжджів.

Послідовність реакцій спиртового бродіння і гліколізу (шлях Ембдена – Мейергофа – Парнаса) однакова до стадії піровиноградної кислоти. При гліколізі піруват відновлюється за рахунок НАДН-Н4+ за участі лактатдегідрогенази до молочної кислоти, а при спиртовому бродінні дріжджові клітини спочатку декарбоксилюють піруват в ацетальдегід, який потім відновлюється в етанол за участі алкогольдегідрогенази, використовуючи НАДН-Н+, утворений при окиснювальному фосфорилгованні 3-фосфогліцеральдегіду. На відміну від оборотного синтезу лактату в дріжджів піруват необоротно декарбоксилюється до ацетальдегіду під дією піруватдекарбоксилази, яка відсутня у тканинах тварин.

Історична довідка. Парнас Яків Оскарович (1884-1949) – біохімік, академік АН і АМН СРСР. Народився в селі Мокряни Львівської області. Закінчив Вищу школу в Берліні, навчався у Страсбурзі у Ф. Гофмейстера й Цюріху у Р. Вільштеттера. Викладав у Страсбурзькому університеті, завідував кафедрою фізіологічної хімії у Варшавському університеті, очолював Інститут медичної хімії Львівського університету з 1920 по 1941 рік, був директором Інституту біохімії АН СРСР.

Основні наукові праці присвячені вивченню тканинного обміну вуглеводів і ферментативних процесів, що лежать в основі м'язового скорочення. Дав теоретичний аналіз механізмів гліколізу і спиртового бродіння, а також встановив зв'язок між гліколізом та іншими перетвореннями в м'язах.

Крім молочнокислого і спиртового бродіння, є інші види: оцтовокисле; змішане кисле бродіння, при якому утворюються мурашина кислота, оцтова кислота, етанол, молочна І бурштинова кислоти; пропіоновокисле; маслянокисле; бутанольне; метанове.

Хід роботи:

1. У конічну колбу на 250 см3 вносять 20 г сахарози, додають близько 150 см3 теплої дистильованої води, розчиняють цукор. Після розчинення цукру в колбу вносять 10-15 г хлібопекарських дріжджів і енергійно перемішують до утворення гомогенату. Сюди ж додають близько 1 г натрій гідрофосфату або калій дигідрофосфату. Після розчинення всіх компонентів суміші колбу із вмістом зважують і записують масу. Колбу закривають пробкою із газовідвідною трубкою, кінець якої занурюють у посудину з водою (гідравлічний замок).

У процесі бродіння сахарози виділяється вуглекислий газ, який по газовідвідній трубці через гідравлічний замок виходить в атмосферу, і в бродильній колбі тиск не підвищується. Разом з тим кисень повітря не проникає в колбу, тобто в бродильному середовищі умови анаеробні, що і є обов'язковим для цього процесу.

Після закінчення бродіння через декілька днів колбу із вмістом знову зважують (без пробки). Маса буде меншою унаслідок виділення вуглекислого газу. За масою виділеного вуглекислого газу розраховують коефіцієнт корисної дії процесу:

С12Н22О11+ Н2О → 4С2Н5ОН + 4СО2.

Не змішуючи шар дріжджів на дні колби, зливають надосадову рідину, у якій міститься етанол, переносять у колбу для перегонки. Для уникнення піноутворення за рахунок білків дріжджів, що були розчинені в рідині, взятій для перегонки, у колбу додають декілька крапель олії. У противному разі піна дуже заважатиме перегонці. Збирають фракцію, яка кипить при температурі 90-95°С. Отриманий дистилят переганяють ще декілька разів і при останній перегонці збирають фракцію з температурою кипіння 82-85°С. В останньому дистиляті якісно визначають наявність етилового спирту, окиснюючи його К2Сг2О7 до оцтового альдегіду, який має характерний запах прілих яблук:

ЗСН3-СН2-ОН + К2Сг2О7 + 4Н2SО4  → ЗСН3СОН+ Сг2(SО4)3 + К2SО4 + 7Н2О,

або за реакцією одержання йодоформу з етилового спирту, йоду і натрій гідроксиду:

J2 + 2NaОН → NaJ + NaOJ + Н2O

СН3СН2ОН + NaOH  → СН3СОН + Na + Н2O

СН3СОН + ЗNаОJ → СH3СОН + ЗNаОН

СH3СОН + NaOН →  НСООNa + СН3J жовтий осад.

Йодоформна реакція дозволяє виявляти в розчині дуже незначну кількість етанолу.

2. Записати результати досліджень.

3. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.

Завдання для самостійної підготовки

  1.  У процесі гліколізу на 1 моль глюкози вивільняється 199080 Дж, при спиртовому бродінні на 1 моль глюкози, що розпалася, вивільняється 235 620 Дж. У кожному випадку 61 200 Дж вивільненої енергії запасається в макроергічних зв'язках 2 молів АТФ. Розрахуйте коефіцієнти корисної дії спиртового бродіння і гліколізу.
  2.  У спортсмена після змагань підвищився вміст молочної кислоти в крові. Чи можна вважати це патологією. Відповідь обґрунтуйте.
  3.  Опишіть методи, що використовуються для діагностики цукрового діабету.

Лабораторна робота №10

Тема: Метаболізм вуглеводів. Визначення вмісту глюкози в крові методом Хагедорна-Йенсена.

Мета: Освоїти методику визначення глюкози в сироватці крові непрямим способом із застосуванням зворотного йодометричного титрування; навчитися визначити фізіологічну величину вмісту глюкози в крові.

Реактиви: розчини: гідроксиду натрію NaOH (0,1М), сульфату цинку (w=45%), оцтова кислота (w=3%), крохмалю (w=1%),  K3[Fe(CN)6] (0,0017М), натрій тіосульфат (С(1/2)=0,0025 моль/дм3), реактив А; дистильована вода, сироватка крові.

Обладнання: водяна баня, мікро бюретки, фільтрувальний папір, пробірки, штативи.

Питання для підготовки

1. Аеробне окиснення вуглеводів.

2. Перетворення молочної кислоти.

3. Цикл три карбонових кислот (цикл Кребса).

4. Енергетичний баланс окиснення вуглеводів.

5. Біосинтез вуглеводів.

Теоретичні відомості

В організмі людини і тварини вуглеводи є головним джерелом хімічної енергії. Окремі органи задовольняють свої потреби в основному в результаті розщеплення глюкози: головний мозок – на 80%, серце – на 70-75%. Глюкоза може надходити у тваринний організм у готовому вигляді чи утворюватися при гідролізі олігосахаридів і полісахаридів за участі амілолітичних ферментів – амілази, мальтази, сахарози, лактази, інвертази. Гексози всмоктуються головним чином у тонкому кишечнику у вигляді гексозофосфатів. Після переходу крізь кишкову стінку моносахариди фруктоза, галактоза, маноза таутомеризуються в глюкозу. Транспортування моносахаридів у клітини епітелію здійснюється за допомогою спеціальних білків-переносників. Процес всмоктування активується йонами Nа+, які створюють натрієвий насос, що забезпечує активне транспортування моносахаридів крізь мембрани ентероцита.

Моносахариди крові використовуються для різних потреб організму – енергетичних, пластичних, захисних тощо. Так, у людини 3-5% глюкози крові використовуються для синтезу глікогену, 30-35% – для синтезу ліпідів, 60-70% – служать джерелом хімічної енергії. Глюкоза знаходиться у вільному і зв'язаному станах. У деяких випадках кількість зв'язаної глюкози сягає 40-50% загального її вмісту в крові. Артеріальна кров, що надходить у головний мозок по сонних артеріях, на 98-105 мг % містить більше глюкози, ніж венозна кров, яка відтікає від мозку по яремних венах.

Запас глікогену, що міститься у м'язах, має поповнюватися за рахунок глюкози крові. Якщо кількість глюкози, яка надходить з їжею або вилучається з глікогену печінки, виявляється недостатньою, то вона повинна синтезуватися з амінокислот.

Особливість метаболізму глюкози полягає також у тому, що певні тканини, у тому числі мозок, клітини крові, мозкова речовина нирок, отримують практично всю необхідну для них енергію за рахунок окиснення глюкози. Тому не можна допускати, щоб вміст глюкози в крові зменшувався значно нижче норми (3,9-6,2 ммоль/дм3).

Досить поширене метаболічне порушення у людини – цукровий діабет. Чітким симптомом діабету є висока концентрація глюкози в крові, вміст якої може досягати 8-60 ммоль/дм3. На діабет хворіє більше 3% людей віком від 40 до 50 років, а серед осіб, старших 70 років, на це захворювання страждає більш як 7%. Схильність до діабету є спадковою. Унаслідок дефектності генів, відповідальних за біосинтез гормону білкової природи інсуліну, відбувається атрофія β-клітин підшлункової залози, де і синтезується цей гормон, який регулює вміст глюкози в крові і взагалі її метаболізм.

Хід роботи:

1. У пробірку вносять 0,1-0,2 см3 сироватки крові. Для видалення білків приливають 1 см3 розчину натрій гідроксиду (С = 0,1М) і 4 см3 розчину цинк сульфату (w = 0,45%). Пробірку нагрівають на киплячій водяній бані 3 хвилини, після чого суміш фільтрують в іншу пробірку. Промивають осад на фільтрі гарячою водою 3 рази по 2 см3.

Одночасно ставлять контрольну пробу, яка замість сироватки крові містить такий же об'єм води.

У всі проби додають по 2 см3 (точно!) розчину калій гексаціано-(Ш)-ферату (С = 0,0017М) і нагрівають у киплячій водяній бані 15 хвилин. У цей час відбувається окиснення глюкози (і можливих інших відновників). Слід мати на увазі, що така кількість окисника калій гексаціано-(Ш)-ферату може окиснити не більше 0,385 мг глюкози. Отже, сироватки крові треба взяти стільки, щоб у цій пробі глюкози не було більше зазначеної кількості.

Після нагрівання всі проби охолоджують до кімнатної температури, додають у кожну 3 см3 реактиву А (10 г цинк сульфату і 50 г натрій хлориду розчиняють у воді і доводять водою до 200 см3; до 40 см3 цього розчину додають 1 г калій йодиду), 2 см3 розчину оцтової кислоти (w = 3%) і розчин крохмалю (w = 1%) до чіткого синього забарвлення. Титрують із мікробюретки розчином натрій тіосульфату (С(1/2) = 0,0025 моль/дм3) до знебарвлення. Додавати всі реактиви треба перед початком титрування.

Вміст глюкози розраховується за спеціальною таблицею. При титруванні визначається йод, що відповідає надлишку калій гексаціано-(ІП)-ферату, який залишився після окиснення глюкози у пробі сироватки крові. Оскільки кількість окисника, взятого для окиснення глюкози в пробі сироватки відома (2 мл, С = 0,0017 моль/дм3) і кількість окисника, що залишилася, визначена йодометрично, можна розрахувати кількість K3[Fe(CN)6], що пішла на окиснення глюкози. Чим менше витрачено тіосульфату, тим було більше глюкози в даній пробі. Таблицю складено так, що в ній певному об'єму розчину натрій тіосульфату, витраченому на титрування надлишку калій гексаціано-(ІІІ)-ферату, відповідає та маса глюкози (в мг), яка була окиснена.

Якщо, наприклад, на титрування надлишку окисника пішло 1,51 см3 тіосульфату, то за таблицею це відповідає 0,086 мг глюкози. Нехай на титрування холостої проби використано 1,97 см3 тіосульфату, що відповідало б 0,005 мг глюкози. Цю „масу глюкози” слід відняти від маси, знайденої у досліді.

m (дослідна) – m (холостої проби) = m (глюкози)

Концентрація глюкози в крові визначається за формулою:

С(глюкози) = m (глюкози)/ mМ(глюкози)*V,

де m (глюкози) – маса глюкози в крові, знайденої по таблиці, мг,

mМ(глюкози) – мілімолярна маса глюкози, мг/моль,

V – об’єм сироватки крові, дм3.

2. Записати результати спостережень та обчислити концентрацію глюкози в досліджуваній пробі.

3. Записати висновок щодо виконання лабораторної роботи.

Завдання для самостійної підготовки

  1.  Повне окиснення 1 моль ацетил-КоА в циклі трикарбонових кислот супроводжується вивільненням 903,84 кДж енергії. У разі сполучення процесу окиснення ацетил-КоА з фосфорилюванням звільняється вільна енергія 516,26 кДж/моль. Розрахуйте кількість енергії, яка акумульована в макроергічних зв’язках АТФ. Знайдіть кількість синтезованих молів АТФ. Визначте частку енергії, що акумулюється в АТФ, по відношенню до загальної кількості енергії, яка звільняється при повному окисненні ацетил-КоА.
  2.  У здорових людей після цукрового навантаження вміст глюкози в крові може зменшуватись. Поясніть, чому це відбувається?
  3.  Відомо, що глікоген, який становить енергетичний запас організму, відкладається в печінці та м’язах, але не створює резерву в такій важливій тканині, як нервова, яка у великих кількостях використовує глюкозу. Поясніть чому глікоген не накопичується у мозку?
  4.  У нормі співвідношення концентрації молочної і піровиноградної кислот у крові людини дорівнює 10. Розрахуйте концентрацію пірувату, якщо вміст лактату в 5 разів нижчий від середньої концентрації глюкози в крові. Яке клініко-діагностичне значення має визначення вмісту лактату в крові?

Лабораторна робота №11

Тема: Метаболізм ліпідів. Виявлення кетонових тіл.

Мета: Ознайомитись із метаболізмом ліпідів, розглянути методику якісного визначення кетонових тіл в біологічних рідинах. Засвоїти методику оцінки фізіологічного стану організму за кількістю кетонових тіл в фізіологічних рідинах.

Реактиви: розчини: нітропрусиду натрію (w=10%), гідроксиду натрію (10%), сульфату амонію (50%), аміаку (25%); льодяна  ацетатна  кислота, дистильована вода, сеча хворого на цукровий діабет та сеча здорової людини.

Обладнання: пробірки, штативи, піпетки.

Питання для підготовки

1. Травлення жирів. Всмоктування ліпідів.

2. Внутрішньоклітинне окиснення продуктів гідролітичного розщеплення жирів.

3. Біосинтез тригліцеридів.

4. Обмін складних ліпідів.

Теоретичні відомості

У здорової людини в крові вміст кетонових тіл – 13-185 мкмоль/л (1,5-20 мг/л), із сечею виділяється 20-40 мг на добу. Це переважно ацетоацетатна і β-оксимасляна кислоти. Ацетон з'являється в організмі за наявності патології. Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і сечі (кетонурія) спостерігають при цукровому діабеті, дефіциті вуглеводів у харчуванні, перепродукції гормонів – антагоністів інсуліну (кортикостероїдів, тироксину, гормонів передньої долі гіпофіза тощо). В умовах відсутності необхідної терапії концентрація кетонових тіл зростає в десятки разів, що супроводжується порушенням кислотно-основного стану і розвитком метаболічного кетоацидозу, що є небезпечним, у першу чергу, для нормального функціонування клітин головного мозку. Зниження кількості кетонових тіл не має клінічного значення. У дітей тривалі розлади у травному тракті (токсикоз, шигельоз) можуть призвести до кетонемії в результаті хронічного голодування і виснаження.

Хід роботи:

1. Принцип методу. Ацетон і ацетоацетатна кислота з натрію нітропрусидом у лужному середовищі в разі нашарування аміаку утворюють фіолетове кільце. Швидкість утворення кільця залежить від концентрації ацетону. Встановлено, що поява кільця протягом 3-4 хв. відповідає вмісту 0,0085 г/л (0,85 мг/100 мл) ацетону.

2. Виконання роботи.

Беруть 8 пробірок. У всі, крім першої, наливають по 1 мл дистильованої води. У першу та другу пробірки додають по 1 мл сечі хворого на цукровий діабет. Таким чином,  у першій пробірці сеча не розведена, а в другій розведена в два рази. Після перемішування з другої пробірки відбирають 1  мл суміші і переносять у третю пробірку, з третьої – у четверту і т. д. З останньої пробірки 1 мл виливають для урівнювання об'єму з іншими пробірками. Таким чином, сеча в пробірках буде розведеною у 2, 4, 8 (і т. д.) разів. Потім у кожну пробірку додать по 8 крапель  50 % розчину амонію сульфату для збільшення густини розчинів, по 8 крапель ацетатної кислоти (концентрованої) та натрію нітропрусиду. Вміст пробірок перемішують і в кожну з них обережно по стінках, починаючи з останньої пробірки, нашаровують по 1 мл концентрованого аміаку (реактив відбирати обережно, лише за допомогою гумової груші, працюючи з ним під витяжною шафою). Спостерігаючи за пробірками, позначають ту з них, у якій за максимального розведення сечі протягом 3-4 хв ще помітне фіолетове кільце на межі рідин.

Розрахунок роблять за формулою:

Х = 0,85х А х 15,

де X – концентрація ацетону в сечі, мг/добу;

0,85 – емпіричне число; А – розведення сечі; 15 – перерахунок на добову сечу, 1 500 мл.

Після проведення розрахунків зробити висновок про отриманий результат.

3. Записати результати досліджень.

4. Записати висновок щодо виконання лабораторно-практичного заняття.

Завдання для самостійної підготовки

  1.   У хворого закупорка загальної жовчної протоки. Які порушення в перетравлюванні ліпідів це може спричинити?
  2.   У раціоні спостерігається недостача рибофлавіну, нікотинової кислоти, біотину, піридоксину, ціанокобаламіну, вітаміну В10. Як це вплине на обмін жирів?
  3.   Аналіз добової сечі показав, що концентрація кетонових тіл становить 100 мг. Оцінити даний показник, вказати можливі причини та наслідки метаболічних порушень.
  4.   Людина зазнала сильного стресу. Як це вплине на її ліпідний обмін?
  5.   У хворого виявлено активація процесів перекисного окиснення ліпідів. Чи змінюються при цьому процеси окисного фосфорилювання?
  6.   Чому тригліцериди є більш ефективним запасом енергії, ніж глікоген?

Лабораторна робота №12

Тема: Метаболізм білків. Кількісне визначення білка за методом Лоурі.

Мета: Ознайомитись із процесами метаболізму білків; методами кількісного визначення білків.

Реактиви: розчини: натрій карбонату (w=2%) в гідроксиді натрію NaOH (С=0,1 моль/дм3), купрум сульфату (w=0,5%) в натрій тартраті (w=3,33%), реактив Фоліна,  дистильована вода.

Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.

Питання для підготовки

  1.  Перетворення білків в процесі травлення.
  2.  Шляхи перетворення амінокислот у тканинах.
  3.  Трансамінування: амінотрансферазні реакції, продукти перетворень, регуляція.
  4.  Дезамінування амінокислот.
  5.  Декарбоксилування.
  6.  Обмін аміаку. Біосинтез сечовини.
  7.  Біосинтез білка.

Теоретичні відомості

За методом Лоурі вимірюють інтенсивність забарвлення розчину, який з'являється в результаті протікання принаймні двох реакцій на білок: біуретової реакції і реакції Фоліна з залишками тирозину і цистеїну у складі білкових молекул. Реактив Фоліна являє собою суміш фосфорно-вольфрамової і фосфорно-молібденової кислот. За участі білка відбувається відновлення цих кислот. Відновлені форми мають інтенсивне синє забарвлення. Вважають, що в реакції відновлення беруть участь комплексні сполуки Купруму, які виникають при взаємодії білка в лужному середовищі з купрум гідроксидом. Метод Лоурі надзвичайно чутливий і дозволяє визначати білок у сильно розбавленому розчині, де його вміст становить лише десятки мікрограмів, і, як правило, застосовується для визначення білків в елюатах із колонок при фракціонуванні на йонообмінних смолах і сефадексах. За методом Лоурі у розчині визначається не сам білок, а результат його відновної дії на фосфорно-вольфрамову і фосфорно-молібденову кислоти.

Хід роботи

1. Готують розчин для проведення біуретової реакції. Для цього спочатку змішують 49 мл розчину А з 1 мл розчину В. Розчин А являє собою розчин натрій карбонату в розчині натрій гідроксиду. Розчин В являє собою розчин купрум сульфату  в розчині натрій чи калій тартрату. До 1 см3 досліджуваного білкового розчину, що містить від 10 до 100 мкг білка, додають 4 см3 суміші розчинів А і В. Перемішують і залишають на 10 хвилин при кімнатній температурі. Потім швидко доливають з піпетки 0,4 см3 реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хвилин до появи забарвлення. При цьому жовте забарвлення реактиву Фоліна поступово переходить у синє. Оптичну густину розчину визначають на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 750 нм у кюветі з l = 10 мм.

2. Вміст білка в досліджуваній пробі визначають за калібрувальним графіком, який будують за розчином будь-якого чистого білка точно відомої концентрації. Краще використовувати розчин того білка або суміші білків, які визначають за методом Лоурі. Для цього готують серію розчинів чистого білка, в 1 см3 якого міститься від 20 до 400 мкг білка. Стандартний білок для калібрувального графіка розчиняють у розчині натрій гідроксиду (С=0,1 моль/дм3). Серію розчинів готують шляхом розведення вихідного концентрованого розчину білка (400 мкг в 1 см3) до необхідних значень. З кожним із зазначених розчинів проводять не менше трьох разів реакцію Лоурі, застосовуючи об'єми реагентів, вказані вище (5,4 см3). За отриманими даними будують графік – калібрувальну криву. На ординаті відкладають значення оптичної густини, на абсцисі –  вміст білка в пробі.

3. Визначивши оптичну густину досліджуваного розчину білка після проведення реакції Лоурі, на калібрувальному графіку проводять від певного значення оптичної густини пряму, паралельну осі абсцис до перетину з калібрувальною кривою, і опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Таким чином визначають вміст білка в пробі досліджуваного розчину. Роблять перерахунки вмісту білка на 100 см3 досліджуваного розчину.

Перевагами визначення білка за методом Лоурі є короткий час визначення порівняно з іншими методами і надзвичайно велика чутливість, що надає можливість визначати слідові кількості білка. Недоліками є те, що за цим методом можна визначити лише водорозчинні білки, сине забарвлення розчину не досить стійке, що зменшує точність вимірювання.

4. Записати результати досліджень.

5. Записати висновок щодо виконання лабораторного заняття.

Завдання для самостійної підготовки

  1.  Загальний вміст білків у крові людини становить 100 г/л. Чи відповідає це нормі? Як називають такий стан? Назвіть причини його виникнення.
  2.  Загальний вміст білків у крові людини становить 45 г/л. Чи відповідає це нормі? Як називають такий стан? Назвіть причини його виникнення.
  3.  У результаті реакцій трансамінування утворилося 30 г глютамінової кислоти (молекулярна маса – 147). Розрахуйте кількість метіоніну (молекулярна маса – 149), яка брала участь у даній реакції.
  4.  У людини із сечею виділяється 12 г сечовини на добу. Дайте оцінку отриманому показнику. Вкажіть можливі причини його зміни.
  5.  З їжею в організм людини за добу надійшло 80 г білка. Із сечею за цей час виділилося  16 г азоту. Який азотистий баланс у людини, про що він свідчить?
  6.  Глутамінова кислота, яка транспортується кров’ю до тканин мозку, перетворюється там на глутамін, концентрація якого в крові, що йде від мозку, підвищена. Назвіть джерело додаткової кількості глютаміну. Яке біохімічне значення мають ці перетворення і як вони відбуваються?

Лабораторна робота №13

Тема: Обмін нуклеїнових кислот. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові та сечі.

Мета: Ознайомитись із процесами метаболізму нуклеїнових кислот; методами кількісного визначення продуктів їх розпаду.

Реактиви: сироватка або плазма крові, сеча, розчини: натрій вольфрамату (10%), натрій карбонату (10.3 г/100мл), сульфатної кислоти (0,35 М), фосфатвольфрамовий реактив (реактив Фоліна), дистильована вода.

Обладнання: пробірки, піпетки, штативи, центрифуга.

Питання для підготовки

  1.  Обмін нуклеїнових кислот. Шляхи біосинтезу нуклеотидів.
  2.  Катаболізм нуклеотидів.
  3.  Біологічне значення реплікації ДНК. Напівконсервативний механізм реплікації. Молекулярні механізми самоподвоєння ДНК.
  4.  Ферменти та механізм транскрипції РНК.
  5.  Генетичний код та його властивості.
  6.  Рибосомальна білоксинтезуюча система.
  7.  Етапи та механізм трансляції. Регуляція транскрипції.

Теоретичні відомості

Елементарними одиницями будови нуклеїнових кислот є нуклеотиди, які складаються з гетероциклічних азотистих основ (пуринових та піримідинових), пентоз та фосфорної кислоти.

У результаті катаболізму нуклеотидів утворюються вище вказані сполуки, які підлягають подальшому розпаду або включення в певні синтетичні процеси. Залишки фосфорної кислоти та пентози використовуються у клітинному метаболізмі. Піримідинові основи розпадаються до β-аланіну, оксиду карбону (IV) та аміаку. Β-аланін використовується для синтезу дипептидів м’язової системи – карнозину та ансерину – або виділяється із сечею. Основна кількість аміаку знешкоджується в орнітиновому циклі.

Кінцевим продуктом обміну пуринових основ є сечова кислота – 2,6,8-триоксипурин. Дана сполука не підлягає подальшому окисненню і виділяється як кінцевий продукт обміну за участю нирок. У нормі концентрація сечової кислоти у цільній крові становить 3-4 мг/л, у сироватці близько 5 мг/л. З сечею у нормі виділяється 1,60-3,54 ммоль/добу (270-700 мг/добу).

У чоловіків вміст сечової кислоти при визначення її за допомогою фосфатвольфрамового фотометричного методу у сироватці крові становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.  

Хід роботи

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти в сироватці крові.

Хід виконання роботи. У центрифужнуі пробірки вміщують по 0,5 мл сироватки крові або сечі, розведеної у 10 раз, та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірок перемішують і додають 0,25 мл розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл розчину натрій вольфрамату. Вміст пробірок перемішують і через 5 хв центрифугують протягом 10 хв із швидкістю 3000 об/хв. Проводять визначення вмісту сечової кислоти за Табл.:

Табл. Визначення вмісту сечової кислоти в сироватці крові

Реактиви

Контрольна проба, мл

Стандартна проба, мл

Дослідна проба, мл

Надосадова рідина

–

–

2

Стандартний розчин сечової кислоти

–

2

–

Вода дистильована

2

–

–

Розчин натрій карбонату

1

1

1

Фосфатвольфрамовий реактив

0.5

0,5

0,5

 

Вміст пробірок переміщують, через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідної проб за довжини хвилі 640 нм (590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм. Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:

С = (Dд×30×А) / Dс,

 де С – вміст сечової кислоти у дослідній пробі, кмоль/л;

 Dд – оптична густина дослідної проби;

 Dс – оптична густина стандартної проби;

30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині. Кмоль/л;

А – величина розведення (А=10 для сироватки крові або 100 для сечі).

Завдання для самостійної підготовки

  1.  Жінка звернулася до лікаря зі скаргами на біль у суглобах кисті й стопи. Суглоби збільшенні, мають вигляд потовщених вузлів. У сироватці крові пацієнтки виявлено збільшений вміст уратів – солей сечової кислоти. Які біохімічні зміни є причиною виникнення даної патології? Як вона називається?
  2.  Вміст сечової кислоти у добовій сечі людини становить 3,2 г. Які можливі причини цього стану і як він називається?
  3.  Новонароджені в період вигодовування не отримують нуклеїнових кислот з молоком, але вони інтенсивно ростуть, в їхньому організмі збільшується кількість клітин, синтез білків, що потребують іРНК, тРНК, рРНК, ДНК. За рахунок яких сполук синтезуються нуклеїнові ткислоти новонароджених?
  4.  У двох препаратах ДНК вміст аденіну становить відповідно 25 і 12% від загального вмісту азотистих основ. Обчисліть відносний вміст тиміну, цитозину і гуаніну в цих препаратах ДНК.
  5.  Тетрацикліни, антибіотики широкого спектра дії, є інгібіторами синтезу білків на 70S-рибосомах прокаріотів, не впливаючи  на 80S-рибосоми еукаріотів. Рибосоми мітохондрій евкаріотів за структурою подібні до рибосом прокаріотів (70S). Використовуючи ці дані, поясніть токсичний ефект дії тетрациклінів на організми еукаріотів.

Лабораторна робота №14

Тема: Обмін води і мінеральних солей. Кількісне визначення Кальцію в сироватці крові.

Мета: Ознайомитись із методиками кількісного визначення мінеральних речовин у біологічному матеріалі, з’ясувати роль макро- і мікроелементів в живих організмах.

Реактиви: розчини: натрій карбонату (2%) в гідроксиді натрію NaOH (С=0,1 моль/дм3), купрум сульфату (0,5%) в натрій тартраті (3,33%), реактив Фоліна,  дистильована вода.

Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.

Контрольні запитання

1. Вміст і розподіл води в організмі.

2. Обмін води і регуляція водного обміну.

3. Значення мінеральних речовин в організмі людини.

4. Біохімічна роль окремих макро- і мікроелементів та особливості їх обміну.

Теоретичні відомості

Кальцій є одним із найбільш важливих макроелементів організму. Його частка складає майже третину всіх мінеральних речовин організму. 97% Кальцію зосереджено в скелеті у вигляді фосфатів і карбонатів. До 1% Кальцію знаходиться у вигляді йонів Са2+.

Всмоктується Кальцій переважно в тонкому кишечнику тварин. Інтенсивність всмоктування залежить від вмісту Кальцію у харчових продуктах, потребі в ньому тварин, наявності вітаміну D. При пухлинах головного мозку різко зменшується вміст мінеральних речовин в кістковій і м'язовій тканинах. При нестачі вітамінів групи D зменшується ступінь засвоєння організмом Кальцію. Вітамін D є складовою частиною білкового переносника – кальцій-зв'язуючого протеїну, який при всмоктуванні виконує функції стимулятора дифузії, носія і концентратора Кальцію. 40% Кальцію зв'язано з альбумінами крові, які транспортують Кальцій до тканин і клітин.

Кальцій бере участь у регуляції порозності ендотелію судин, у створенні структури кісткової тканини, у процесах коагуляції крові, знижує збудливість нервової системи, стимулює скорочення серцевого м'язу, знижує проникність клітинних мембран, зменшує здатність колоїдів зв'язувати воду, бере участь у регуляції діяльності багатьох ферментів. Так, Кальцій є інгібітором енолази і дипептидази, активатором лецитинази і актоміозин-АТФ-ази. Йони Кальцію активують кіназу фосфорилази, блокують натрієві канали, активують аденілатциклазу. При нестачі у їжі Кальцію виникає гіпокальцемія. Вона супроводжується гіперфосфатемією, підвищенням проникності клітинних мембран, остеопорозом, крихкістю і викривленням кісток, остеомаляцією, рахітом, судомами.

Обмін Кальцію в організмі регулюється паратгормоном і кальцитоніном. Гіпофункція паращитовидної залози призводить до виникнення тетанії – захворювання, яке супроводжується зменшенням вмісту Кальцію в крові. У нормі вміст Кальцію в сироватці крові знаходиться в межах 9-11 мг%.

Щоденне виділення із сечею Са2+ складає 100-300 мг. Низька розчинність солей Кальцію призводить до того, що вони випадають в осад у вигляді агрегатів або каменів. Близько третини цих каменів складається з Са3(РО4)2, СаСО3, МgNН4РО4 або їх суміші. Утворення цих каменів часто відбувається в результаті хронічного залуження сечі в сечовому міхурі і ниркових чашках, яке є наслідком бактеріальної інфекції. Ферменти бактерій гідролізують сечовину з утворенням амоніаку. Утворенню каменів спричинює надлишкове виділення Са2+, наприклад, при гіперпаратиреоїдозі, остеопорозі, який викликаний нерухомістю, а також надвисоким вмістом Са2+ у їжі. Близько половини ниркових каменів складається або з кальцій оксалату в чистому вигляді, або із суміші його з Са3(РО4)2, СаСО3. Такі камені виявляються у людей, які вживають велику кількість рослинної їжі, що містить багато щавлевої кислоти (щавель, шпинат, ревінь, редиска). Крім того, камені, що складаються з кальцій оксалату, є наслідком оксалурії – спадкового порушення метаболізму гліцину, при якому практично весь синтезований гліцин окиснюється через гліоксилову кислоту до щавлевої кислоти.

Хід роботи

Принцип методу. Кальцій, що міститься у вигляді солей у сироватці крові, переводять в оксалат. При розчиненні кальцій оксалату в сульфатній кислоті вивільнюється еквівалентна кількість щавлевої кислоти, яку відтитровують розчином КМnО4.

1. В одну центрифужну пробірку вносять 1 мл негемолізованої сироватки крові, а в іншу – 1 мл бідистильованої води (контроль). В обидві пробірки додають по 1 мл насиченого розчину амоній оксалату і залишають стояти на 1 годину. Потім проби центрифугують при 3000 g протягом 10 хвилин. Зливають рідину, перевертаючи пробірки. Вносять у пробірки по 2 мл розчину амоніаку (w=2%), збовтують осад і знову центрифугують. Осад кальцій оксалату легко розчиняється в мінеральних кислотах і нерозчинний у слабколужному середовищі. Тому надлишок амоній оксалату видаляють багаторазовою промивкою (не менше 3 разів) розчином амоніаку (w= 2%). Потім додають у кожну пробірку по 1 мл розчину сульфатної кислоти (w=5%). Осад перемішують для повного його розчинення. Кількісно переносять вміст пробірок у колби на 25 мл, додають близько 3-4 мл гарячого розчину сульфатної кислоти (w= 5%) і гарячий розчин титрують з мікробюретки розчином КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3) до появи слабко-рожевого забарвлення, що не зникає протягом 1 хвилини.

Контроль служить для встановлення вмісту Кальцію у реактивах.

Вміст Кальцію в біологічному об'єкті визначають за формулою:

С = (V1-V2) × T × 1000 /V3 × mM  (ммоль/дм3),

де   С – вміст Са2+ у сироватці крові, ммоль/дм3;

V1 – об'єм розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), що пішов на титрування дослідної проби, см3;

V2 – об'єм розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), витрачений на титрування контрольної проби, см3;

V3 – об'єм сироватки крові, взятий для аналізу, см3;

Т – титр робочого розчину КМnО4 (С(1/5) = 0,01 моль/дм3), за Кальцієм (0,2 мг/см3);

mM – мілімоль йонів Кальцію, мг/моль.

2.Обрахувати результати досліду та записати висновки по лабораторній роботі.

Завдання для самостійної підготовки

1. Користуючись довідником з біохімії, скласти перелік ферментів, для яких Са2+ є активаторами чи інгібіторами.

2. Заповнити таблицю:

Табл. Біохімічна роль макро- і мікроелементів.

№

п/п

Хімічний елемент

Локалізація

Біологічна роль

Порушення обміну

Макроелементи

Мікроелементи

3.Скільки ендогенної води утвориться в організмі людини внаслідок вживання їжі з енергетичною цінністю 4000 ккал?

4. Концентрація кальцію в крові хворого становить 7,8 ммоль/л (норма – 2,4 ммоль/л), а кількість неорганічних фосфатів зменшена приблизно вдвічі. Яке захворювання можна передбачити? Описати основні ознаки цієї хвороби.




1. Организация и порядок финансирования выборов в России
2. Communist politicl movement tht endorses violence nd dicttorship is clled fscism serious problem in internl ffirs during the Ming dynsty in Chin ws corruption nd txtion socil system tht se
3. общие методы исследования политических объектов
4. О государственной поддержке молодежных и детских общественных объединений
5. Тема 10. Електронна пошта і система міжбанківських електронних платежів
6. Битва при Азенкуре 25 октября 1415 года
7. Автомобили и автомобильное хозяйство направления подготовки Эксплуатация наземного транспорта и трансп
8. Импульс от 4 декабря 20г
9. Андрей Дмитриевич Сахаров (глазами физика)
10. тема мер по надзору за сост ОС2
11. Основные задачи гимнастики
12. ФИНАНСОВЫЙ ПЛАН
13. Политическая власть в России- проблема легитимности
14. сприйняття розуміння дія кожний елемент котрого соціально політично та культурно опосередкуван
15. 15 пен 16 жаста~ы ~ызметкерлерге белгіленген ~ыс~артыл~ан ж~мыс аптасыны~ ~закты~ы-24 са~ат; 16 жастан 18 жас.html
16. Статья 1. Сфера применения настоящего Федерального закона 1
17. из варяг в греки соединявшего Балтийское море с Чёрным системой рек озёр и волоков водораздельных учас
18. Гимназическое образование- прошлое и настоящее
19.  Таможенное законодательство
20. Тема героизма в русской литературе Изображение подвига человека на войне является традиционным еще со вр.html

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе