Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция 11
Сегодня мы рассмотрим две группы РНК-содержащих вирусов: пикорнавирусы и альфавирусы.
Пикорнавирусы.
Мелкие вирусы Ø 20 нм, без оболочки, капсид икосаэдрический. Геном представлен одноцепочечной (+) РНК длиной 7,5 – 8.0 т.п.н.
Пикорнавирусы известны как модельные системы, на которых сделано много открытий. Например, впервые сформулировано положение о моноцистронности эукариотических РНК; открыта внутренняя инициация трансляции; обнаружен РНК-зависимый синтез РНК и фермент его катализирующий; обнаружена двуспиральная РНК; показано участие нуклеотид-белковой затравки в синтезе нуклеиновых кислот; обнаружена РНК рекомбинация; сделано первое картирование генома, причем по продуктам трансляции.
In vitro был осуществлен синтез полиовируса. Искусственно синтезированные фрагменты ДНК лигировали и на этой матрице синтезировали РНК. Правда, для этого потребовалось очень много времени. Недавно таким же образом была синтезирована ДНК фага φХ174, но для этого понадобилось всего две недели.
Представители: полиовирус, вирус гепатита А, вирус ящура, риновирусы (возбудители ОРЗ и ОРВ), вирус энцефаломиокардита.
Структура генома.
К 5’-концу ковалентно (через тирозин – урацил) пришит белок, а на 3’-конце имеется полиА последовательность, синтезируемая матричным способом.
В 5’-НТО размером 600-1000 нт. находится IRES, а также последовательность polyС, функции которой не ясны, но известно, что ее удаление вызывает изменение фенотипа. Продуктом трансляции является единый полибелок, который далее нарезается на отдельные белки.
В 5’ и 3’-НТО находятся также цис-регуляторные элементы репликации (они не консервативны) oriL и oriR соответственно. У энтеровирусов и риновирусов в 5’-НТО находятся консервативные элементы, организованные в структуру типа клеверного листа.
Имеются также внутренние репликативные элементы – CRE (Cis-acting replicating element) иначе ori I.
Геном можно условно разделить на три части. В первой части закодированы структурные белки капсида, в третьей части, в гене 3D, закодирована РНК-зависимая РНК-полимераза.
Механизм репликации.
Схемы репликации постоянно меняются и ниже излагаемая видимо не последняя. Причина заключается в методологической сложности создания системы, позволяющей изучать процесс in vitro. В случае фага Qβ создание системы in vitro возможно, а, например, у полиовирусов репликация идет только в грубо очищенных экстрактах (фракция 10000g), выяснилось, что процесс связан с мембранами. В пораженной клетке развивается система мембранных пузырьков вытянутой формы, называемых репликативными комплексами. Можно показать, что в таких пузырьках сосредоточены все неструктурные белки и идет репликация. В трансформации мембранной системы задействованы белки 2В, 2С и полибелок 2ВС. Соответственно реагенты, ингибирующие образование мембранных пузырьков, подавляют и репликацию вируса.
Инициация синтеза (-) цепи РНК.
Необходимо наличие мембран, происходит на циркуляризованной нековалентными взаимодействиями (+) цепи. Циркуляризация (+) РНК осуществляется посредством образования рибонуклеопротеидных комплексов. В 5’ и 3’-НТО находятся элементы узнаваемые белками, в 5’-НТО – с PolyC связывается PCBP (PolyC-Binding Protein) с 3’-НТО связывается PABP (PolyA-Binding Protein). После связывания с элементами РНК эти белки приобретают сродство друг к другу, и посредством такого белкового мостика, РНК циркуляризуется. Клеточный фактор инициации трансляции – eIF4G (входит в состав фактора eIF4F), связывается с IRES в 5’-области и также имеет сродство к РАВР.
Вирусные белки 3CD и 3AB взаимодействуют с одной из шпилек в 5’-концевой структуры. 3СD может также связываться с мембраной, закрепляя всю структуру.
Образование кольцевой молекулы РНК можно рассматривать как контроль качества, потому что только целая молекула может свернуться в кольцо.
В одной из работ был показано, что синтез (-) цепи можно осуществить in vitro и в отсутствии мембран с помощью очищенной полимеразы на искусственной матрице полиА, при этом также как и in vivo происходит ковалентное присоединение VPg. Однако, следует учитывать чувствительность метода, в малых количествах (-) цепь образуется и в отсутствии мембран, но выход реакции очень мал по сравнению с системами in vivo.
Структура ori R.
Этот участок длиной 70–100 нуклеотидов образует две шпилечные структуры, способные взаимодействовать друг с другом путем kissing взаимодействий. Изменение конформации этого участка влечет блокирование инициации репликации, но его полное удаление не влияет на инициацию синтеза (-) цепи. Участок получил даже название элемент Ильфа (так звали вахтера, который тщательно проверял пропуска, но когда пропуска не было, то пропускал так).
Возможно, как у фага Qβ за счет этой структуры происходит запрятывание некоторого элемента, с которым взаимодействует полимераза – поли-А-хвост. Этот элемент открывается в рибонуклеопротеидном комплексе. С этой структурой взаимодействуют вирусные белки 3AB и 3CD. В комплексе белок С вырезает VPg (белок 3В) и полимеразу (белок 3D). Полимераза тут же начинает синтез РНК.
Далее по этой модели при синтезе (-) цепи РНК происходит образование дуплекса РНК, вследствие этого вытесняется 5’-концевой белковый комплекс. Далее он взаимодействует с внутренним ori I. Этот участок имеет конформацию петли и может находится у разных вирусов в разных частях генома, например, у пикорнавирусов в гене 2С, у ринавирусов в гене VP1, у вируса ящура в 5’НТО. Положение петли не имеет решающего значения для репликации.
На этой шпильке происходит синтез множества копий диуридилата, ковалентно-связанного VPg. Механизм такой же как у аденовирусов, φХ174 – шаг вперед, два шага назад. Считается, что эти структуры служат затравками для синтеза (-) цепей РНК. Синтез идет до тех пор пока полимераза не дойдет до этого участка. За это время синтезируется около 100 штук VPg-pUpU, это значит, что должно быть около 100 белков VPg, значит нужно около 100 раз протранслировать (+) цепь.
В итоге образовалась репликативная форма – двуцепочечная ±РНК.
Двуцепочечная форма РНК была впервые обнаружена у вируса энцефаломиокардита. Эта форма инфекционна, тогда как у Qβ – нет. Что дальше: возможна транскрипция ± РНК – (+) РНК или расплетание (у млекопитающих есть клеточные РНК-хеликазы). Факт тот, что свободных (-)цепей в клетке не обнаруживается.
Механизм инициации синтеза (+) цепей.
Может быть для синтеза достаточно VPg-pUpU.
Чтобы на (-) цепи осуществить синтез (+) цепи нужно вытеснить предыдущую цепь. Для этого требуется хеликазная активность. У белка 2С пикорнавирусов имеется участок подобный РНК-зависимой АТФазе и показано, что он участвует в синтезе РНК (в миллимолярных концентрациях). Однако, напрямую не показано, что 2С нужен как хеликаза. У полиовируса РНК-полимераза может сама вытеснять цепь, но хеликаза ей может помочь.
Для синтеза (-) цепи (??????) нужна трансляция. При трансляции происходят структурные изменения (какой цепи?), приводящие к обнажению 3’-конца (какой цепи?).
Транскрипция и трансляция не могут одновременно происходить на одной цепи, они должны быть разнесены во времени.
Переключателем между этими процессами может служить клеверная структура 5’-НТО. Другим переключателем может быть PCBP, который может связываться и с IRES, блокируя инициацию трансляции, следовательно, чем больше РСВР, тем слабее трансляция.
Для образования вирусных частиц нужно 60 молекул структурного белка. Поскольку при трансляции образуется полипротеин, то, в таком случае, образуется столько же копий и неструктурных белков, но их нужно мало. В случае РНК-полимеразы известно, что транскрипцию осуществляет только свежий «фермент».
Генерация разнообразия вирусных геномов.
У полимеразы (как впрочем и у ДНК-зависимой РНК-полимеразы) отсутствует корректирующая активность. Это обусловливает частоту ошибок 10-4, т.е. одна ошибка на 10000 нуклеотидов. Если вспомнить размер генома, то получается, что в среднем каждый геном несет одну ошибку. Это много! Увеличение числа мутация в несколько раз ведет к подавлению размножения вируса. Использование рибоверина, аналога нуклеотидов, вызывающего ошибочное включение U или C, позволяет бороться с инфекциями пикорнавирусов. Можно провести отбор на вируса на устойчивость к рибоверину, так была получена полимераза, делающая меньше ошибок. Повышенная мутабельность– источник разнообразия пикорнавирусов и может иметь адаптивное значение.
Рекомбинация.
Если мы возьмем две цепи РНК и пометим разные их половины, то в инфицированной клетке обнаружим химерные молекулы. Между ними произошла рекомбинация.
Показано два механизма:
1)Репликативная рекомбинация. Полимераза обладает невысокой процессивностью и, начав синтез на одной цепи, может перескочить на другую (смена матрицы).
2)Нерепликативная рекомбинация.
Предполагается, что сначала происходит рекомбинация между гомологичными участками цепей, а потом гибридная молекула реплицируется.
Опыт.
Исходно в опыте использовались два фрагмента РНК, 3’-конец одного фрагмента комплементарен 5’-концу другого (длина участка комплементарности ~180 нт). Комплементарные участки каждого фрагмента маркировались. В эксперименте модифицировались концы фрагментов путем удаления/введения гидроксила/фосфатной группы. В результате, в зависимости от модификации получались рекомбинантные фрагменты, несущие различные маркеры. Механизм не известен.
Опыт.
Изучалось включение меченных рNTP в РНК фага Р4 во время транскрипции. Помимо меченных рNTP, добавляли немеченые pNTP и pNDP. Было установлено, что добавление немеченых pNDP влияет на включение меченных нуклеотидов сильнее, чем добавление pNTP. Возникло предположение о том, что синтез предшественников нуклеотидов осуществляется котранскрипционно, с участием белков ассоциированных с полимеразой (кое-кого напоминает). Эта работа не была ни проверена, ни отвергнута.
Суперсемейство пикорнавирусов.
Вирусы животных и растений. Принципиальных отличий в структуре РНК и механизмах репликации по сравнению с пикорнавирусами нет. Одноцепочечная (+) РНК на 5’-конце ковалентно связана с VPg, который помимо затравочной может выполнять и другие функции, на 3’-конце находится polyA. Геном одно- или двухсегментный, кодирует РНК-полимеразу. Для синтеза (-) цепи нужен 5’-конец. Работа in trans (??????).
Альфавирусы.
Размер Ø 70 нм, капсид икосаэдрический, имеется липопротеидная оболочка. Геном представлен одноцепочечной (+) РНК длиной 11-12 т.п.н. РНК кэпирована и полиаденилирована, полиА-хвост кодируется (-) цепью. Представители: вирус Semlici forest.
Продуктами трансляции являются полипротеин неструктурных белков и полипротеин капсидного белка и гликопротеина оболочки. Последние кодируются так называемой субгеномной кэп+полиА+ РНК (26S), содержащей 3’-область геномной РНК и синтезирующейся в иной рамке считывания.
Таким образом, далее нам предстоит рассмотреть проблемы кэпирования РНК и образования субгеномной РНК.
Функции неструктурных белков.
NS 1. Состоит из двух доменов: N-концевой обладает метил-трансферазной активностью, а С-концевой – гуанилтрансферазной. Это кэпирующий фермент. Отличается последовательность реакций синтеза кэпа: если в клетке сначала происходит присоединение гуанила, а потом его метилирование, то вирусный фермент сначала метилирует гуанин, а потом присоединяет его к 5’-концевому нуклеотиду. Подобный кэпирующий фермент есть у Poxviridae, аналогично ему NS1 (уточнить!!!) может выполнять и другие функции, например, участвовать в регуляции репликации.
NS2 (P2). Обладает тремя активностями: хеликазной, протеазной и γ-фосфатазной. Участвует в кэпировании РНК, процессинге полипротеина.
NS3 (P3). Возможно, он регулирует активность NS2, предполагается, что он может служить мембранным якорем, потому что имеет высокогидрофобные учаскти. И все же его функции не известны.
NS4 (P4). РНК-зависимая РНК-полимераза.
Временная регуляция синтеза РНК α-вирусов.
В клетках пораженных α-вирусами на первой стадии происходит преимущественный синтез (-) цепей. На второй стадии прекращается синтез (-) цепей РНК и происходит накопление (+) цепей геномной РНК. На третьей стадии синтезируются (+) цепи геномной РНК и субгеномная РНК.
У некоторых α-вирусов между генами NS3 и NS4 находится терминирующий кодон. Он преодолевается полимеразой за счет его супрессии.
Связь протеолиза с временной регуляцией синтеза РНК.
На примере α-вирусов хороша заметна роль протеолиза в регуляции репликации вируса. От степени процессированности полипротеина неструктурных белков зависит какой РНК продукт будет преобладать в инфицированной клетке.
123 4 преимущественно синтезируются (-) РНК.
1 23 4 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и какая-то часть (-) РНК
1 2 3 4 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и субгеномная РНК.
Разрезание полипротеина осуществляет белок NS2. Отщепление белка NS4 происходит при in trans протеолизе, когда взаимодействуют две молекулы полипротеина.
Вырезание белка NS1 происходит in cis и, причем медленно. NS2 и NS3 разделяются быстро в in trans протеолизной реакции.
Процессинг полипротеина смоделирован in vitro. Показано также, что процессинг осуществляется в репликативных комплексах и ассоциирован с мембраной. Из клеток можно выделить пузырьки, содержащие полипротеин на разной стадии процессинга, в которых репликация находится на разных стадиях.
Синтез (-) цепи.
Видимо, синтез (-) РНК происходит на циркуляризованной (+) РНК. Образование кольца возможно благодаря взаимодействию PABP, связанного с 3’полиА, с eIF4G – фактора инициации трансляции, связанного с кэпом.
В 3’ области имеется также консервативная последовательность длиной 19 нт, ее достаточно для инициации синтеза (-) РНК при наличии полиА-хвоста. Можно удалить полиА-хвост, но он все равно восстановится с помощью клеточной полиА-полимеразы по механизму реитерации полимеризации. Можно удалить консервативный элемент и вирус все равно выживает, тогда на его 3’-конце обнаруживаются AU-богатые последовательности.
Известно также, что в клетках гиперинфицированных вирусом появляются дефектные геномы, имеющие делеции протяженных участков генома. Такие дефектные вирусы могут реплицироваться в присутствии вируса-помощника. Следовательно, они имеют все необходимые для репликации регуляторные элементы. У этих РНК была определена структура. Выяснилось, что 5’-конец этих РНК содержит шпилечную структуру (150-200 нт). Далее находятся две несовершенные шпильки, функция которых не ясна.
Синтез субгеномной РНК.
Если (-)цепь всегда находится в дуплексе с (+) цепью РНК, то как инициировать синтез субгеномной РНК? Существует гипотеза о том, что синтез происходит с высвобождением цепи, но у этой гипотезы нет экспериментального подтверждения.
Фактом является наличие промотора для синтеза субгеномной РНК, фланкированный структурами. С использованием этого промотора сконструированы векторы для генной терапии.
В конструкте структурные гены, находящиеся под этим промотором, замещаются на ген нужного белка, например CAT. Можно одновременно вводить в клетку субгеномную РНК, кодирующую капсидные белки, при этом лишив вируса цитотоксичности. В такой системе между обоими РНК будет конкуренция за упаковку в капсид.
Одной из проблем использования РНК-векторов α-вирусов является рекомбинация.
В настоящее время, вирусы объединяют в группу claster C вирусов. Они характеризуются только отличиями в капсидных белках. Отличия обясняются тем, что в природе вирусные геномы рекомбинируют. Поэтому по частичному сиквенсу генома вируса сложно определить таксономическое положение вируса. В эту группу входят EEEV (α вирус), Simbis и WEEV, рекомбинант геномов EEEV и Simbis, от первого получены гены неструктурных белков, а от второго – гены структурных белков.
α вирусы растений.
Геном представлен одноцепочечной (+)РНК. РНК имеет 5’-конце кэп, на 3’-конце может находиться полиА, гетерополимер или тРНК-подобная структура.
В геноме закодированы белки NS1 и NS2, а также аналог NS4.
тРНК подобная структура узнается CTP/ATP-тРНК нуклеотидил трансферазой, которая добавляет А к СС:
СС ССА
Матрица, имеющая на 3’-конце А, более эффективно используется в репликации. Синтез (-) цепи начинается с G.
тРНК подобная структура РНК узнается определенной аминоацил-тРНК синтетазой. Например, РНК вируса табачной мозаики (TMW) узнает гистидиновая аа-тРНК-синтетаза, РНК вируса мозаики костра – тирозиновая, а РНК вируса желтой мозаики турнепса – валиновая аа-тРНК-синтетаза. Часто первой N-концевой аминокислотой становится соответствующая аминокислота. Зачем это нужно? Может так сложилось эволюционно? Нарушение способности РНК вируса акцептировать аминокислоту приводит к подавлению ее трансляции. тРНК-подобная структура, возможно участвует в переключении между репликацией и трансляцией РНК.
Синтез (-) цепи.
На примере вируса мозаики костра. Это трехкомпонентный вирус, т.е. при транскрипции образуется три мРНК. Третья РНК имеет субгеномный промотор.
Синтез (-) цепи инициируется в две стадии. На 3’-конце имеется шпилька, которая связывает РНК-полимеразу. Положение этой шпильки можно изменять, тогда инициация синтеза будет происходит в том месте, где находится шпилька. Синтез РНК начинается на участках СССА и может начаться также на внутренних ССС. Инициация происходит предпочтительно на тех участках, которые находятся вблизи шпильки.
Роль клеточных белков в репликации вирусной РНК.
Могут принимать участие система декэпирования, а также десатураза жирных кислот.
Рекомбинация РНК.
Внутри промоторов для полимеразы локализуются горячие точки рекомбинации.
РНК-интерференция в клетках, пораженных ВТМ.
30 лет назад было обнаружено, что в клетках, инфицированных ВТМ увеличивается количество активной РНК-зависимой-РНК-полимеразы. Тогда предположили, что индуцируется синтез клеточного фермента, но не могли понять почему в клетках специфически синтезируются короткие фрагменты РНК. Явлению не нашли разумного объяснения и забыли, а это была система РНК-интерференции.
VPg PolyA
Капсид 2 3
5’НТО 1 2 3 4 2А 2В 2С 3А 3В 3С 3D 3’НТО polyA
oriL ori I oriR
3АВ
3СD
3АВ
3CD
С
А
А
А
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’ NS 1 NS 2 NS 3 NS 4 PolyA 3’
Cap (42S)
Cap (26S)
1
2
3
4
4321
5’
Структурные белки
САТ
Р
Cap PolyA
Cap Heteropolymer
Cap tRNA-like structur