Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
28
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
ФЕДОРЕНКО ОЛЕНА АНДРІЇВНА
УДК 577.352.5:577.353
БІОФІЗИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ІОННИХ КАНАЛІВ
МЕМБРАН ЯДЕРНОЇ ОБОЛОНКИ
03.00.02 –біофізика
Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ-2007
Київ –Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України
Науковий керівник:
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук
Марченко Сергій Михайлович
Інститут фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України
провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи
академік НАН України, доктор біологічних наук
Магура Ігор Сильвестрович
професор Кафедри молекулярної фізіології і біофізики
Фізико-технічного навчального-наукового центру НАН України
кандидат біологічних наук
Любанова Ольга Петрівна
старший науковий співробітник Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України
Захист відбудеться 30.10. 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
за адресою: 01024, м. Київ, вул.. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий 29.09.2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В еукаріотичних клітинах генетичний апарат відокремлений від решти цитоплазми ядерною оболонкою, яка складається з двох окремих мембран, зовнішньої та внутрішньої, між якими знаходиться порожнина - перинуклеарний простір. Транспортну функцію крізь ядерну оболонку виконують числені комплекси ядерної пори, через які здійснюється пасивна дифузія іонів та молекул з малою молекулярною масою, а також високоселективний активний транспорт макромолекул (Keminer & Peters, 1999; Allen et al., 2000; Marelli et al., 2001; Jaggi et al., 2003). Окрім пор, на ядерних мембранах було виявлено багато іонних каналів різних типів з відмінними біофізичними властивостями (Franco-Obergon et al., 2000; Guihard et al., 2000; Mazzanti et al., 2001; Marchenko et al., 2005). Досить суперечливим залишається питання щодо функції іонних каналів ядерної оболонки. Вважають, що вони відповідають за підтримання сталої концентрації різних іонів у перинуклеарному просторі. Крім того, припускають, що деякі канали можуть брати участь у функціонуванні ядерної облонки як кальцієвого депо, з якого Са+ потрапляє всередину ядра (Nicotera et al., 1990; Stehno-Bittel et al., 1995; Marchenko et al., 2005; Marchenko & Thomas, 2006). Збільшення концентрації кальцію в ядрі призводить до змін у активності генетичного апарату клітини, запускаючи транскрипцію генів через активацію нуклеарних Са+-чутливих кіназ та фосфатаз, або через пряму взаємодію з Са+-залежними факторами транскрипції (Bading, 2000; Chawla et al., 2002). Але через свою важкодоступність для прямих експериментів ці канали залишаються мало вивченими.
Було показано, що мембрана і люмен ендоплазматичного ретикулуму морфологічно сполучені та мають спільні біохімічні властивості з зовнішньою мембраною і перинуклеарним простором ядерної оболонки, тому останню можна розглядати як специфічну частину ендоплазматичного ретикулуму (Lanini et al., 1992; Baumann & Walz, 2001; Berridge, 2002).
Отже, дослідження ядерної оболонки являє інтерес у декількох відношеннях. По-перше, ядерна оболонка може брати активну участь y регуляції транспорту між цитоплазмою та нуклеоплазмою і регуляції генетичного апарату клітини. По-друге, зовнішня ядерна мембрана є частиною ендоплазматичного ретикулуму, тому іонні канали ядерної оболонки можна розглядати як канали ендоплазматичного ретикулуму.
На цей час мало відомо про регуляцію Са+ в ядрі нейронів. Тому, основним об’єктом наших досліджень були ядра нейронів різних відділів нервової системи. Для порівняння іонних каналів, які експресуються на ядерних мембранах клітин різних типів були також проведені досліди на ядрах Т-лімфоцитів.
Підгрунтям для даної роботи стали попередні дослідження С.М.Марченка та його співробітників з вивчення іонних каналів на ізольованих ядрах нейронів Пуркін’є мозочка (Marchenko et al., 2005). Розроблена ними методика отримання ізольованих ядер цих клітин дала змогу реєструвати ядерні іонні канали у їх природньому оточенні. Проте безліч питань потребують пояснення, наприклад чи входять іонні канали, які реєструють від мембран ядерної облонки, до складу комплексу ядерної пори; чи відрізняються набори іонних каналів, які експресуються в ядрах клітин різних типів; які можуть бути функціональні особливості іонних каналів ядерних мембран; які властивості необхідні для механізмів регуляції внутрішньоклітинних Са+ сигналів тощо. Відповіді на ці запитання дадуть змогу краще розуміти принципи функціональної активності клітини.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах наукових тем Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.
Мета та завдання дослідження. Метою нашого дослідження було визначити які іонні канали експресуються на мембранах ядерної оболонки клітин різних типів та описати їх основні біофізичні властивості. Для досягнення даної мети було поставлено наступні завдання:
Наукова новизна одержаних результатів. Усі експериментальні дані, що представлені в роботі, отримано вперше: показана наявність та описані основні властивості іонних каналів, які експресуються в ядерних мембранах Jurkаt клітин, пірамідних нейронів ділянки СА1 та гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа; представлені данні, що відкидають гіпотезу про зв’язок каналу для пасивної дифузії комплексу ядерної пори та катіонного каналу великої провідності ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка; описаний новий можливий механізм регуляції Са+ сигналу в ядрі клітини.
Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають насамперед велике теоретичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню механізмів внутрішньоклітинної регуляції, зокрема передачі клітинних сигналів всередину ядра, що спричиняє зміни у активності генетичного апарату. Дані дослідження дають підставу для подальших досліджень властивостей ядерної оболонки та її зв’язку з фізіологічними явищами в клітині, таких, наприклад, як апоптоз, нейродегенерація тощо.
Особистий внесок здобувача. Всі дослідження та обробка експериментального матеріалу було виконано здобувачем особисто. Електрофізіологічні реєстрації поодиноких іонних струмів від ядер пірамідних нейронів ділянки СА1 та гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа було проведено разом із молодшим науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України к.б.н. Дужим Д.Є. Культивування клітин лінії Jurkаt проводилося науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України Волковою Т.М. Планування експериментів, обговорення результатів досліджень та формулювання висновків проводилися спільно з науковим керівником - провідним науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України д.б.н. Марченком С.М.
Апробція результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на низці конференцій, зокрема: з’їзді FEPS (Мюнхен, березень, 2006), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства (Чернівці, травень, 2006 р.), Міжнародній конференції "Механізми функціонування фізіологічних систем" (Львів, жовтень, 2006 р.), IV з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, грудень, 2006 р.), IIІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (Львів, квітень, 2007 р.).
Публікації. За результатами роботи опубліковано 4 статті та тези 6 доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел із 215 найменувань. Робота викладена на 115 сторінках, містить 6 таблиць і 38 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Отримання ізольованих ядер нейронів. Всі експериментальні процедури проводилися відповідно до біоетичних норм законодавства України. Для дослідів брали щурів-самців лінії Вістар або Фішер віком 2-3 тиждні. Щури були декапітовані, після чого виділяли їх мозочок або великі півкулі головного мозку, які клали у посуд з охолодженим (1 –4°C) розчином, що містив (ммоль/л): NaCl - 120, KCl –,5, MgSO –,3, CaCl - 1, NaHPO –,3, NaHCO - 26, глюкоза –; рН 7.3. Робили зрізи мозочка або гіпокампа завтовшки до 400 мкм, які поміщали у розчин, що містив (ммоль/л): глюконату-калію –, HEPES –,5, HEPES-К –,5; рН 7.3. До цього розчину додавали суміш протеїнових ігнібіторів (“Roche Diagnostics”, Велика Британія) у концентраціях, зазначених виробником. Зразки тканини були гомогенізовані шляхом пропускання через металеву голку розміром 0.64 мм. Отриманий гомогенат розміщували на робочій камері під інвертованим мікроскопом Leica DMIRB (“Leica Microsystems”, Німеччина). Через деякий час ядра осідали та щільно прикріплювалися до дна робочої камери, після чого залишки інших органел та ушкоджені ядра відмивали розчином, що містив (ммоль/л): KCl –; HEPES –,5; HEPES-K –,5; pH 7.3. В результаті описаних операції, ядра ставали придатними для петч-клемп реєстацій від зовнішньої мембрани.
Отримання ізольованих ядер Jurkat-клітин. У дослідах використовували лейкемічні Т-лімфобласти людини лінії Jurkat (субклон JMP). Клітини культивували у живильному середовищі RPMI 1640 при наявності таких компонентів: 2 ммоль/л глутаміну, 10% ембріональної телячої сироватки, пеніциліну 100 од/мл і стрептоміцину 50 мкг/мл (усі реактиви фірми “Sigma”, США). Клітинну культуру вирощували при 37оС в атмосфері 5% СО і 95% повітря. У дослідах використовували Т-лімфобласти зі щільністю 3-910 клітин/мл у стадії утворення клітинних агрегатів. Клітини культури центрифугували протягом 7 хв при швидкості обертання 1500 хв-1 і поміщали в розчин, що містив (ммоль/л): глюконату-калію –, HEPES –,5, HEPES-К –,5; рН 7.3. До цього розчину додавали суміш протеїнових ігнібіторів. Подальші процедури проводилися так само, як у випадку з нейронами.
Метод усунення зовнішньої ядерної мембрани. Для петч-клемп відведень від внутрішньої мембрани ядра інкубувалися в 1%-ому розчині цитрату натрію з додаванням 5 ммоль/л діетилтритолу протягом 20-30 хвилин, повільно перемішуючись. Було показано, що дана процедура призводить до усунення зовнішньої ядерної оболонки, не пошкоджуючи внутрішню (Humbert et al., 1996). Подальші процедури проходили так само, як і для дослідів із зовнішньою мембраною.
Петч-клемп реєстрації поодиноких іонних каналів від ядерних мембран. Реєстрація поодиноких іонних каналів проводилася з використаням методу петч-клемп в конфігурації “nucleus-attached” або “excised patches” в режимі фіксації потеніалу. Досліди проходили при температурі 18-20°C. Петч-піпетки були виготовлені з боросілікатного скла (“Sutter Instruments”, США). Їх опір варіював від 5 до 12 МОм. Внутрішньопіпетковий розчини змінювався в залежності від завдання дослідів. Індиферентний електрод Ag-AgCl був сполучений з робочою камерою через агаровий місток. Робочу камеру заповнювали розчином, що містив (ммоль/л): KCl –; HEPES –,5; HEPES-K –,5; pH 7.3, проте від міг змінюватися під час дослідів. Реєстрацію даних проводили за допомогою підсилювача Visual Patch VP-500 (“Bio-Logic”, Франція). Сигнали з підсилювача фільтрували низькочастотним фільтром Бессела (2 кГц), оцифровували з частотою 10 кГц і зберігали на жорсткому диску комп’ютера. Отримані результати були проаналізовані за допомогою аналітичних програмних продуків, а саме pClamp 9.0 (“Axon Instruments”, США) та OriginPro 7.0 (“Microsoft Software”, США). В усіх реєстраціях потенціал розчину в робочій камері приймався за 0 мВ.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Властивості та топологія катіонних каналів великої провідності мембран ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка. Петч-клемп реєстрації від мембран ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка показали наявність декількох типів іонних каналів з різними біофізичними властивостями. Проте більшість мембранних петчів містила катіонні канали великої провідності, які мали повільний характер роботи.
Канали цього типу були зареєстровані як у зовнішній, так і у внутрішній ядерних мембранах.
У симетричному базовому розчині провідність катіонних каналів у внутрішній ядерній мембрані дорівнювала 198 ± 27 пСм (n=58), а у зовнішній - 199 ± 17 пСм (n=5). Отже, канали в обох ядерних мембранах мають ідентичну провідність.
Для того, щоб визначити селективність цих каналів до інших катіонів, К+ у розчині в робочій камері був заміщений на Na+, Rb+, Cs+, Li+, Са+ і Ва+. Результати показали, що данний тип каналів є
малоселективним для одновалентних катіонів і практично непроникним для двовалентних. Селективність каналів у зовнішній та внутрішній мембранах ядерної оболонки була однаковою.
Активність катіонних каналів великої провідності залежала від мембранного потенціалу, при зміні якого змінювалась вірогідність їх відкритого стану (Po).
Канали, які були зареєстровані в зовнішній ядерній мембрані, при негативних потенціалах майже весь час були відкриті (Po>0.8), а при позитивних потенціалах їх активність різко зменшувалась. У випадку з каналами у внутрішній ядерній мембрані, ми спостерігали цілком протилежну залежність вірогідності відкритого стану від мембранного потенціалу.
Цей факт, а також однакові провідність та селективність катіонних каналів зовнішньої та внутрішньої ядерних мембран, вказує на те, що в обох мембранах ядерної оболонки експресуються ідентичні іонні канали, які інгібуються негативним потенціалом у перинуклеарному просторі.
Дослідження іонних каналів ядерної оболонки пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа. При дослідженні зовнішньої мембрани ядер пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа ми виявили іонні канали з швидкою кінетикою та чітко вираженою потенціалзалежністю. При позитивних потенціалах канал мав дуже низьку Ро. При від’ємних потенціалах активність каналу значно збільшувалась.
У симетричному розчині 150 ммоль КСІ вольт-амперна характеристика цього каналу мала лінійний характер та його провідність дорівнювала 156 ± 4 пСм (n=6).
Для визначення селективності каналу ми замінили розчин 150 ммоль КСІ у
робочій камері на розчин, який містив (ммоль/л): КСІ –, глюканат-К –, HEPES-KOH –.5, pH-7.3. За таких умов значно зсувався потенціл реверсії струму. За нашими підрахунками потенціал реверсії для іонів хлору за таких умов дорівнював 50,9 мВ, а для іонів калію –мВ. Дані отримані під час експерименту більше відповідають першій величині. Отже даний канал був проникним для іонів СІ¯ та практично непроникним для іонів К+.
У внутрішній мембрані ядерної оболонки пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа ми зареєстрували іонні канали з дуже характерним типом активності. Канал мав повільну кінетику та сильно флуктуював.
Вірогідність відкритого стану каналу залежала від потенціалу. При позитивних потенціалах він майже весь час був відкритий, а при негативних потенціалах вірогідність
його відкритого стану суттєво зменшувалась. При великих негативних потенціалах (нижче - 40 мВ) канал повністю закривався. Провідність каналу в симетричному розчині 150 ммоль/л КСІ становила
248 ± 6 пСм (n=8).
Для того, щоб визначити селективність цого каналу, ми замістили стандартний
розчин КСІ в робочій камері на розчин тріс-Cl, внаслідок чого на всіх потенціалах в діапазоні від +80 до -80 мВ спостерігався виключно вхідний струм. Ці дані підтверджують те, що даний канал був селективний до катіонів.
У внутрішній ядерній мембрані також були зареєстровані інозитолтрифосфатні рецептори, рецепторні локуси яких були спрямовані в нуклеоплазму. Вони мали дуже швидкий характер роботи. Час їх відкритого стану дорівнював лише 1,1 ± 0,15 мс. Активність цих каналів з’являлася при 0,1 мкмоль інозитолтрифосфату в розчині, проте насичуюча концентрація ІР становила 1 мкмоль. Це дає підстави припускати, що IPRs, які ми зареєстрували на ядрах пірамідних нейронів, належать до типу І.
У симетричному розчині 150 ммоль КСІ інозитолтрифосфат-активовані канали мали лінійну вольт-ампарну характеристику та провідність 366 ± 5 пСм (n=6).
Нам не вдалося зареєструвати будь-які інші іонні канали в мембранах ядер пірамідних нейронів. Тому можна припустити, що рианодинові рецептори відсутні на ядерній оболонці цих клітин, або ж їх щільність настільки мала, що вони не можуть бути зареєстровані електрофізіологічними методами.
Іонні канали ядерних мембрани гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа. При дослідженні поодиноких іонних каналів від мембран ядерної оболонки нейронів зубчастої звивини гіпокампа було виявлено декілька їх типів з різними біофізичними властивостями.
На зовнішній ядерній мембрані ми зареєстрували іонний канал, який демонстрував досить повільну кінетику роботи та не мав чіткої потенціал залежності. Цей канал був з високою провідністю, середнє значення якої у симетричному розчині 150 ммоль КСІ дорівнювало 329 ± 16 пСм (n=5). Для визначення іонної селективності цього каналу ми змінили стандартний базовий розчин у робочій камері на розчин тріс-Cl. За таких умов на всіх потенціалах в діапазоні від + 40 до - 80 мВ ми спостерігали як вхідний, так і вихідний струми. Потенціал реверсії змінювався несуттєво. Це свідчить про те, що даний канал був селективний для іонів хлору і практично непроникний для К+.
У внутрішній ядерній мембрані було виявлено канали двох типів. Вони мали майже однакову провідність, проте різко відрізнялися за характером своєї роботи.
Характер роботи каналів першого типу був досить повільним та залежав від потенціалу мембрани. На позитивних потенціалах канал майже весь час був відкритий та сильно флуктуював, а на негативних потенціалах його активність зменшувалась. Перший тип каналів у розчині 150 ммоль КСІ мав провідність 179 ± 15 пСм (n=6).
Для того, щоб визначити селективність цого каналу, ми замістили стандартний розчин 150 ммоль КСІ у робочій камері на еквімолярний розчин глюконату - калію. В цих умовах спостерігали як вхідні, так і вихідні струми, що свідчить про непроникність цього каналу для іонів Сl¯. Потім розчин у робочій камері замінили на тріс-Cl, внаслідок чого на всіх потенціалах у діапазоні від + 80 до - 80 мВ реєстрували виключно вихідний струм.
Отримані результати підтверджують те, що цей канал був селективний до катіонів.
Канали другого типу мали зовсім інший характер роботи. Вони часто та швидко флуктуювали між двома рівнями провідності. Значення максимального рівня провідності у розчині 150 ммоль КСІ було 157 ± 9 пСм (n=5). Провідність другого рівеня становила 84 ± 8 пСм (n=5), що дорівнює приблизно половині значення максимального рівня. Для визначення селективності цього каналу розчин у робочій камері замінили на еквімолярний розчин глюконату –калію. У піпетці залишився стандартний розчин 150 ммоль КСІ. За таких умов на всіх потенціалах в діапазоні від –мВ до + 60 мВ спостерігався виключно вхідний струм, що свідчить про селективність цього каналу до іонів хлору.
Нам не вдалося зареєструвати рианодинові чи інозитолтрифосфатні рецептори в зовнішній і внутрішній мембранах ядерної оболонки гранулярних нейронів гіпокампа.
Дослідження іонних каналів ядерних мембран Jurkat-клітин. Реєстрації поодиноких каналів від зовнішньої ядерної мембрани показали наявність іонних каналів з дуже характерним типом активності. В усіх без винятку випадках канал демонстрував два чітко виражених підрівня. В жодній реєстрації ми не спостерігали каналів з одним рівнем провідності.
У симетричному розчині 150 ммоль КСІ провідність максимального рівня складала близько 70 ± 2 пСм (n=18). Провідність підрівня становила рівно половину цієї величини, а саме 35 ± 1 пСм (n=18).
Для того, щоб визначити селективність цього каналу ми заміщали стандартний розчин 150 ммоль КСІ в робочій камері на еквімолярний розчин глюконату-калію. В цих умовах ми спостерігали на всіх потенціалах в діапазоні від -80 мВ до +80 мВ виключно вхідний стум. Це свідчить про те, що канал був селективний для іонів СІ¯ і практично непроникний для К+.
На внутрішній мембрані ядер Т-лімфобластів ми зареєстрували два типи спонтанно активних каналів, які відрізнялися за своєю провідністю, селективністю та кінетикою роботи.
Перший тип каналів за характером активності дещо нагадував хлорні канали, які ми зареєстрували в зовнішній ядерній мембрані. Так само як і хлорні канали в зовнішній мембрані, цей канал у внутрішній мембрані завжди демонстрував наявність двох рівних підрівнів. Кінетичні характеристики каналу суттєво залежали від потенціалу. При позитивних потенціалах спостерігалась порівняно повільна робота каналу. При негативних потенціалах кінетика роботи каналу різко прискорювалась. Але при будь-яких потенціалах канал ясно демонстрував наявність двох рівних за амплітудою підрівнів. Проте провідність максимального рівня каналу у внутрішній ядерній мембрані у симетричному розчині 150 ммоль КСІ складала близько 382 ± 3 пСм (n-12), що більш ніж в 5 разів перевищувало провідність каналу в зовнішній мембрані. Для визнчення селективності каналу іони К+ у розчині в робочій камері ми замістили на NMDG. Концентрація іонів СІ¯ була ідентична з обох боків мембрани. За даних умов спостерігались як вхідні, так і вихідні струми і вольт-амперна характеристика змінювалась не суттєво. Тому можна стверджувати, що даний канал є селективним для іонів хлору.
Другий тип каналів, які ми зареєстрували у внутрішній ядерній мембрані Т-лімфобластів, різко відрізнявся за характером своєї активності від хлорного каналу і очевидно являв собою інший тип іонного каналу. Канал мав повільну кінетику та сильно флуктуював. У симетричному розчині 150 ммоль КСІ цей канал мав провідність 152 ± 4 пСм (n=14) та характеризувався незначним вхідним випрямленням.
Для визначення селективності каналу ми замістили іони К+ у внутрішньопіпетковому розчині на NMDG, у робочій камері залишався стандартний розчин 150 ммоль КСІ. За таких умов, реєструвалися поодинокі канали вхідного струму, які не реверсували в діапазоні від
-80 мВ до +80 мВ. Це дало нам підставу стверджувати, що досліджений нами іонний канал є селективним для іонів К+. Він однаково пропускав й інші одновалентні катіони, наприклад натрій. Високі концентрації Са+, які необхідні для визначення селективності каналу пригнічують його активність. Вірогідність відкритого стану цього каналу залежала від мембранного потенціалу. При позитивних потенціалах він майже весь час був відкритий, а при негативних потенціалах вірогідність відкритого стану суттєво зменшувалась. При значних негативних потенціалах (нижче -60 мВ) канал повністю, але зворотньо, блокувався.
Залежність властивостей іонних каналів ядерних мембран пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа та нейронів Пуркін’є мозочка від потенціалу мембрани. У цій роботі ми вивчали властивості іонних каналів внутрішньої мембрани ядерних оболонок нейронів Пуркін’є мозочка та пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа. Раніше було показано, що внутрішня мембрана ядер цих клітин, навідміну від зовнішньої, містила катіонні канали великої провідності та інозитолтрифосфатні рецептори (Marchenko et al., 2005).
Інозитолтрифосфатні рецептори ядер обох типів нейронів мали однаковий характер роботи. Імовірно, обидва IPRs належать до одного типу (ІРR1). Як вже було зазначено, IPR пірамідних нейронів у симетричному розчні 150 ммоль КСІ мали провідність 366 ± 5 пСм (n=6). Провідність IP-рецепторів ядер нейронів мозочка становила 356 ± 4 пСм (n=7). Провідності каналів практично співпадали та їх різниця була недостовірною (Р > 0.05).
Активність каналів IP-рецепторів внутрішніх мембран ядер центральних нейронів залежела від мембранного потенціалу. Вірогідність відкритого стану каналів була значно вищою на позитивних потенціалах, та суттєво зменшувалась на негативних. При чому залежність Ро IPRs ядер нейронів гіпокампа від мембранного потенціалу була дещо крутішою, аніж IPRs ядер нейронів мозочка. Зміни у вірогідності відкритого стану каналів при швидкому перемиканні з
одного потенціалу на інший відбувалися за дуже короткий проміжок часу. Наприклад, в ядрах пірамідних нейронів гіпокампа при змінні потенціалу з +80 мВ на -80 мВ за першу секунду Ро зменшувалась більш ніж в два рази. При більш тривалому часі (від 1,5 с і більше) на потенціалі -80 мВ та нижче інозитолтрифосфатні рецептори ядерної мембрани пірамідних нейронів гіпокампа цілком інгібувалися. Але таке інгібування не спостерігалося у випадку із ядрами нейронів Пуркін’є мозочка, хоча їх активність також спадала до найменших значень.
Катіонні канали великої провідності, які були зареєстровані у внутрішній ядерній мембрані нейронів Пуркін’є мозочка, та катіонні канали ядерних мембан пірамідних нейронів
ділянки СА1 гіпокампа мали подібні основні біофізичні властивості. Зокрема, канали мали однакову дуже повільну кінетику. Вони були малоселективними для одновалентних катіонів та не потребували жодної стимуляції для своєї активації. Проте провідність каналів дещо відрізнялась. У симетричному розчині 150 ммоль КСІ катіонні канали великої провідності ядерних мембран пірамідних нейронів гіпокампа мали провідність 248 ± 16 пСм (n=21), а провідність катіонних каналів ядер нейронів Пуркін’є мозочка становила 198 27 пСм (n=58), що на 20% менше, ніж у каналів з ядер пірамідних нейронів гіпокампа.
Активність катіонних каналів великої провідності, також як і ІР-рецепторів, була потенціалзалежною. На позитивних потенціалах вони майже весь час були відкриті, а при негативних потенціалах їх Ро різко зменшувалась. При більш негативних потенціалах, а саме при ≤ - 40 мВ для каналів ядерних мембран пірамідних нейронів, та ≤ - 80 мВ для каналів ядер нейронів Пуркін’є, канали повністю блокувалися. Для обох каналів таке інгібування було цілком зворотнє.
Стала часу інгібування каналу ядерної оболонки нейронів Пуркін’є негативними потенціалами при перемиканні з 60 мВ на -60 мВ наближувалася однією експонентою та становила 1.88 с.
ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ
Чи є катіонний канал великої провідності, який ми реєструємо, дифузійним каналом ядерної пори? Щільність пор на ядерній оболонці клітин різних типів варіює від одиниць до декількох десятків пор на 1 мкм (Garcia-Segura et al., 1989). Така висока щільність дає підстави припускати, що під час реєстрацій у петч-піпетці може міститися велика кількість ядерних пор. Таким чином, можна очікувати, що опір під час петч-клемпу буде дуже низьким. Проте, насправді з ядерною мембраною може бути встановлений щільний гігаомний контакт (Mazzanti et al., 1990), завдяки чому низка іон-селективних каналів була описана в ядерній оболонці клітин різних типів (Rousseau et al., 1996; Draguhn et al., 1997; Franco-Obergon et al., 2000; Guihard et al., 2000; Mazzanti et al., 2001; Nagasawa et al., 2001; Marchenko et al., 2005). Для того щоб пояснити ці розбіжності у даних, було запропоновано, що катіонні канали великої провідності (декілька сотен пСм), що були знайдені в мембранах ядерних оболонок різних типів клітин, являють собою канали комплексів ядерної пори для пасивної дифузії, які, маючи воротні механізми, можуть поводити себе як звичайні іонні канали (детальний огляд –Mazzanti et al., 2001). На користь цієї гіпотези виступають декілька груп вчених (Innocenti et al., 1993; Assandri et al., 1997; Tonini et al., 1999; Bustamante et al., 2000; Bustamante, 2006), проте їх дані викликають деякі сумніви.
У даній роботі ми досліджували біофізичні властивості катіонних каналів великої провідності, які являли собою основний тип спонтанно активних іонних каналів, що були зареєстровані в мембранах ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка. Їх щільність була дуже високою та становила 7 ± 3 каналів на один петч (n=372). Опір петч-піпеток у наших дослідах дорівнював 10 - 15 МОм. Такий опір відповідає площі мембрани в піпетці близько 1 мкм (Sakmann & Neher, 1998). Отже, щільність катіонних каналів великої провідності в ядерних мембранах нейронів Пуркін’є становила приблизно 7 каналів на 1 мкм. Електронномікроскопічні дослідження показали, що щільність ядерних пор в ядерній оболонці цих клітин дорівнює 22 ± 3 пори на мкм (Garcia-Segura et al., 1989). Проте не всі дифузійні канали комплексів ядерної пори одночасно перебувають у відкритому стані, деяка їх кількість може бути закритою під час реєстрацій. Отже, рівень щільності каналів великої провідності в мембранах ядер нейронів Пуркін’є відповідає рівню ядерних пор у цих клітинах.
Катіонні канали великої провіності були єдиним типом серед інших іонних каналів, зареєстрованих у ядерних мембранах нейронів Пуркін’є, які відповідають характеристикам, зокрема провідності, діфузійного каналу пори. Декілька інших типів спотнанно активних каналів, які були зареєстровані на тих самих клітинах, мали дуже низьку щільність та провідність (<70 пСм) (Marchenko et al., 2005), щоб бути ядерною порою (Mazzanti et al., 2001).
Ми показали, що катіонні канали великої провідності можуть бути зареєстровані як у зовнішній, так і внутрішній ядерній мембрані. В обох випадках канали мали ідентичну провідність, селективність, кінетику, але дуже відрізнялися за свєю потенціалзалежністю. Канали в зовнішній ядерній мембарні інгібувалися позитивними потенціалами в петч-піпетці, а у внутрішній –негативними. Ці дані швидше узгоджуются із локалізацією даних каналів у мембранах, аніж з їх асоціацією із комплексом ядерної пори. Топологічна орієнтація каналів відносно до ядерних мембран була ідентична для обох каналів. Ці канали інгібувалися негативним потенціалом всередині люмену ядерної оболонки, що вказує на знаходження сенсорної ділянки їх молекули у перинуклеарному просторі.
Отримані результати вказують на те, що катіонні канали великої провідності не пронизують подвійну ядерну оболонку, а забезпечують прямий контакт між нуклеоплазмою або цитоплазмою та перинуклеарним простором. Ми припускаємо, що катіонні канали великої провідності можуть належати до іонних каналів ендоплазматичного ретикулуму та необхідні для його специфічних функцій. Наприклад, вони можуть брати участь у регуляції вивільнення Са+ з депо.
Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки клітин різних типів. У даній роботі були досліджені іонні канали ядерних мембран пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа щурів, гранулярних клітин зубчастої звивини гіпокампа щурів та Т-лімфоцитів людини. Припускають, що cпонтанно активні аніонні та катіонні канали в ядерній оболонці необхідні для підтримання між цитоплазмою та перинуклеарним простором іонного балансу, який може суттєво змінюватися під час певних фізіологічних явищ, наприклад звільнення Са+ з ядерної оболонки.
З літературних джерел відомо, що серед хлорних каналів на внутрішньоклітинних мембранах експресуються представники родини CLIC та деяки з родини СІС. Молекулярна структура цих каналів була досліджена завдяки клонуванню їх генів (Tonini et al., 2000; Debska et al., 2001; Jetsch et al., 2001). Всі СІС канали є гомодимерами. Вони демонструють два чітких рівних за аплітудою рівня провідності, що свідчить про наявність у молекулі каналу двох ідентичних пор. Більшість СІС характеризуються чіткою потенціалзалежністю, крім того мають подвійний воротній механізм: по-перше, кожна з пор каналу може закриватися незалежно, по-друге, є механізм, який одночасно закриває обидві пори (Jetsch et al., 2001). Воротні механізми каналів залежать від мембранного потенціалу, а також модулюються концентрацією аніонів та рН цитоплазми (Kourie, 1999). СІС були знайдені у саркоплазматичному ретикулумі, в ендосомах та синаптичних везикулах, ендоплазматичному ретикулумі, лізосомах (Kourie, 1999; Tonini et al., 2000; Guihard et al., 2000; Debska et al., 2001; Jetsch et al., 2001; Mazzanti et al., 2001), проте, імовірно, вони можуть бути локалізовані й в інших внутрішньоклітинних мембранах.
Іншою родиною хлорних внутрішньоклітинних каналів є CLIC. Вони були знайдені на мембранах ядерної оболонки, де спричиняють рух аніонів крізь неї (Jetsch et al., 2001).
Всі іонні канали, які були досліджені вперше в наших дослідах, та їх основні біофізичні властивості представлені у табл.1.
Таблиця 1.
Іонні канали ядерних мембран клітин різних типів
|
Тип каналу |
Тип клітини |
Ядерна мембрана |
Провідність |
|
Катіонні канали великої провідності |
ПН |
Внутрішня |
248 |
|
ГН |
Внутрішня |
179 |
|
|
ТЛ |
Внутрішня |
152 |
|
|
Хлорні канали родини СІС |
ТЛ |
Зовнішня |
70 |
|
ТЛ |
Внутрішня |
382 |
|
|
ГН |
Внутрішня |
157 |
|
|
Невизначені хлорні канали |
ПН |
Зовнішня |
156 |
|
ГН |
Зовнішня |
329 |
|
|
Кальцієві канали |
ПН |
Внутрішня |
366 |
ПН - пірамідні нейрони СА1 ділянки гіпокампа; ГН - гранулярні нейрони зубчастої звивини гіпокампа;
ТЛ - Т-лімфобласти.
Спираючись на вище наведені літературні дані, ми можемо припустити, що частина хлорних каналів, які ми зареєстрували, належить до родини СІС, адже вони демонстрували два однакових за значенням рівня провідності. Ці канали мають подібну кінетику, але суттєво відрізняються за провідністю. Тому можна стверджувати, що ми маємо справу з різними типами іонних каналів, але зі схожою молекулярною будовою.
Іншу частину хлорних каналів ми не змогли віднести до будь-якої групи вже відомих каналів, оскільки таке завдання не вдається вирішити електрофізіологічними методами. Вони можуть належати до CLIC, ажде вони мали лише один рівень провідності. Проте, ці канали також можуть належати до іншої (ще неописаної) родини внутрішньоклітинних хлорних каналів.
З таблиці 1 видно, що у внутрішній мембрані ядерних оболонок всіх трьох типів клітин, які були об’єктами наших досліджень, присутні катіонні канали великої провідності. Ці канали мають однакові характери роботи та селективність. Всі вони демонструють потенціалзалежність, проте, у каналів ядер різних клітин вона має різні ступені вираженості. До того ж, ці три канали суттєво відрізняються за провідністю. Тому можна припустити, що в ядерних мембранах пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа, гранулярних нейронів зубчастої звивини та Т-лімфобластів присутні не ідентичні, але близькі за своєю молекулярною структурою іонні канали. На цей час є низка робіт, в яких, використовуючи електрофізіологічні методи, були описані малоселективні катіонні канали на внутрішніх мембранах ядер клітин. Проте, вони не були виділені та клоновані, адже досі не знайдено їх блокатори, чи інші молекули, за допомогою яких ці канали можна було б ідентифікувати поза мембраною.
Також ми показали наявність у внутрішній ядерній мембрані пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа кальцієвих каналів, які за своїми біофізичними властивостями можуть бути віднесені до інозитолтрифосфатних рецепторів типу І (Humbert et al., 1996; Bezprozvanny, 2005; Berridge, 2007). Наші дані вказують на те, що ядерна оболонка цих нейронів може виконувати роль кальцієвого депо, з якого під час певних фізіологічних станів вивільнюється Са+ у нуклеоплазму клітини. Було чітко показано, що збільшення внутрішньоядерної концентрації Са+ призводить до запуску ряду фізіологічних явищ, зокрема до активації факторів транскрипції (наприклад, CREB або DREAM) (Bading, 2000; Chawla, 2002; Josselyn & Nguyen, 2005; Marchenko & Thomas, 2005). У клітинах хребетних CREB має критичне значення для формування довготривалої потенціації в нейронах гіпокампа (Bading, 2000; Limback-Stokin et al., 2004; Josselyn & Nguyen, 2005). У свою чергу, на ядрах гранулярних клітин ми не зареєстрували Са+ каналів, тому можемо припустити, що їх ядерна оболонка не бере участь у кальцієвій регуляції подібним чином. Проте, ми не можемо відкидати можливість наявності Са+ каналів і в ядерних оболонках цих клітин, оскільки ми могли їх не зареєструвати через низку щільність у тих мембранах.
Потенціалзалежність активності іонних каналів ядерних мембран може бути механізмом регуляції тривалості кальцієвого сигналу. У даній роботі ми досліджували залежність властивостей катіонних каналів великої провідності та IP-активованих Ca+-каналів внутрішньої мембрани ядерних оболонок нейронів Пуркін’є мозочка та пірамідних нейронів ділянки СА1 гіпокампа від мембанного потенціалу. Активність обох типів каналів на позитивних потенцалах була значно вищою, ніж на негативних. Ми припускаємо, що потенціалзалежне інгібування ІР-рецепторів може бути одним з механізмів обмеження тривалості Са+ сигналу в ядрі.
Механізми активації ІР-рецепторів їх агоністами (ІР та Са+) добре досліджені, проте механізми термінації кальцієвого сигналу залишаються не до кінця з’ясованими. Є декілька гіпотез щодо припинення вивільнення Са+ з внутрішньоклітинних депо. По-перше, блокування руху іонів Са+ може відбуватися за рахунок зменшення електрохімічного градiєнту для Са+ за рахунок спустошення кальцієвого депо. По-друге, є роботи, автори яких припускають, що інгібування IPRs відбувається за рахунок підвищення концентрації Са+ біля зовнішньої частини рецептора, де, як вважають, знаходиться його інгібуючий центр (Bezprozvanny, 2005). Ми не відкидаємо можливість того, що ці явища дійсно беруть участь у регуляції кальцієвого сигналу. Крім того, ми пропонуємо ще один можливий механізм термінації вивльнення Са+.
Вивільнення Са+ із внутрішьоклітинних депо, наприклад ядерної оболонки, спряжене з перенесенням великого електричного зряду крізь її мембрану та спричиняє появу негативного потенціалу в перинуклеарному просторі (Yamashita et al., 2006). Як показали наші дослідження, при негативних потенціалах активність катіонних каналів великої провідності у внутрішній мембрані ядер пірамідних нейронів гіпокампа та нейронів Пуркін’є мозочка значно зменшується, і вони поступово інгібуються. Досі відсутні наглядні результати дослідження функцій цих каналів, але ми припускаємо, що вони необхідні для регуляції тривалості активності ІР-рецепторів. Струм одновалентних катіонів, який спрямований в протилежний бік від струму іонів Са+ при вивільненні з депо, перешкоджає дуже різкому зниженню потенціалу в люмені і таким чином збільшує тривалість кальцієвого сигналу.
Блокування негативним потенціалом струму К+ призводить до ще більшого зниження потенціалу в перинуклеарному просторі. При досягненні значних негативних значень мембранного потенціалу починається зниження активності з поступовим повним блокуванням ІР-рецепторів, припиняючи вивільнення Са+ з депо. Зважаючи на те, що в мембранах ендоплазматичного рекулуму, який вважається основним кальцієвим депо клітини, також присутні ІР-рецептори та катіонні канали великої провідності, то можна припустити, що в ендоплазматичному ретикулумі діє подібний механізм регуляції привалості вивільнення Са+.
Тривалість елементарних подій у Са+ сигналізації становить 1-5 с (Berridge, 1997; Bootman et al., 2001), причому стадія активації одного IPR чи їх групи триває 12 та 19 мс відповідно (Rose et al., 2006; Shuai et al., 2006). Одже, на більш повільну стадію інактивації залишається приблизно декілька секунд. Враховуючі наші часові показники для інгібування катіонних каналів великої провідності (~2 c) та IP-активованих Ca+-каналів (~1 c), можна зробити висновки, що результати наших досліджень цілком відповідають часовим межам, які були отримані в інших лабораторіях.
Порівняльний аналіз даних, що були отримані від ядер нейронів Пуркін’є мозочка та пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа вказує на деякі відмінності у потенціалзалежності IP-активованих Ca+-каналів та катіонних каналів великої провідності різних нейронів. Крім того, дослідження ядерних мембран гранулярних клітин мозочка (Marchenko et al., 2005) та гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа показали відсутність іонних каналів цих двох типів. Це дає підстави припускати, що в різних типах клітин існують різні механізми регуляції внутрішьонуклеарного кальцієвого сигналу.
ВИСНОВКИ
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Статті:
Тези доповідей:
АНОТАЦІЇ
Федоренко О.А. Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 –біофізика. –Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2007.
Використовуючи метод петч-клемп, у мембранах ізольованих ядер пірамідних нейронів СА1 ділянки і гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа та Т-лімфоцитів були виявлені іонні канали, більшість з яких описані вперше, й досліджені їх біофізичні властивості. Ми показали, що катіонні канали великої провідності не пов’язані з комплексами ядерної пори, як це вважали раніше. Виявилося, що в ядерних мембранах клітин різних типів експресуються спонтанно активні іонні канали з відмінними біофізичними властивостями. Крім того, набори іонних каналів у внутрішній та зовнішній ядерних мембранах різко відрізняються, що дає підставу стверджувати про фізіологічну спеціалізацію цих двох мембран. У внутрішній ядерній мембрані пірамідних нейронів вперше були виявлені інозитолтрифосфатні рецептори (ІРRs). Отже, ядерна оболонка цих клітин може функціонувати як кальцієве депо, з якого Са2+ вивільнюється в нуклеоплазму. У мембранах ядер гранулярних нейронів не вдалося зареєструвати жодних Са+-каналів, що можна пояснити різними механізмами у регуляцій кальцієвої сигналізацї в різних клітинах. ІРRs та катіонні канали великої провідності в ядерних мембранах центральних нейронів інгібувалися негативним потенціалом у перинуклеарному просторі, що може бути одним з механізмів регуляції тривалості вивільнення Са+ з внутрішньоклітинних депо.
Кючові слова: іонні канали, ІР-рецептори, ядерні пори, ядерна оболонка, ендоплазматичний ретикулум, звільнення Са+.
Федоренко Е.А. Биофизические свойства ионных каналов мембран ядерной оболочки. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 –биофизика. –Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2007.
Используя метод пэтч-клэмп, в мембранах изолированных ядер пирамидных нейронов СА1 области и гранулярных нейронов зубчатой фасции гиппокампа, а также Т-лимфоцитов были обнаружены ионные каналы, большенство из которых описаны впервые, и изучены их биофизические свойства. Мы показали, что катионные каналы большой проводимости не связаны с комплексами ядерной поры, как это ранее предполагали. Оказалось, что в ядерных мембранах клеток разных типов экспрессируются спонтанно активные ионные каналы с различными биофизическими свойствами. Кроме того, наборы ионных каналов внутренней и внешней ядерных мамбран резко отличаются, что дает повод предполагать физиологическую специализацию этих двух мембран. Во внутренней ядерной мембране пирамидных нейронов впервые были обнаружены инозитолтрифосфатные рецепторы (ІРRs), таким образом ядерная оболочка этих клеток может функционировать как кальциевое депо, из которого Са+ выделяется в нуклеоплазму. В мембранах ядер гранулярных нейронов не удалось зарегистрировать Са2+-каналы, что можно объяснить различными механизмами в регуляции кальциевой сигнализации. ІРRs и катионные каналы большой проводимости в ядерных мембранах центральных нейронов ингибировались негативным потенциалом в перинуклеарном пространстве, что может быть одним из механизмов регуляции продолжительности выделения Са+ из внутриклеточных депо.
Кючевые слова: ионные каналы, ІР-рецепторы, ядерные поры, ядерная оболочка, эндоплазматический ретикулум, выделение Са+.
Fedorenko O.A. Biophysical properties of ion channels in the nuclear envelope membranes. –Manuscript.
Thesis for PhD degree by specialty 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology NAS of Ukraine, Kiev, 2007.
The nuclear envelope is a double membrane shell that isolates chromosomes from the cytoplasm in eukaryotic cells. The nuclear envelope is pieced by numerous nuclear pores which contain a rout for passive diffusion of relatively small molecules and an elaborate, highly selective transport system for macromolecules. It has been argued that large conductance ion channels recorded from the nuclear envelope of a variety of cells are the channels of the nuclear pore complex for passive diffusion. But our data demonstrate that these channels in the nuclear envelope of cerebellar Purkinje neurons are not associated with the nuclear pore, and provide the rout for moving of monovalent cations between the perinuclear space and the nucleoplasm or the cytoplasm.
Using the patch-clamp technique we have investigated ion channels in the membranes of nuclei isolated from pyramidal neurons of CA1 region and granular neurons of the dentate gyrus of the hippocampus and T-lymphocytes. The majority of these channels were found at the first time. Our research has shown that different types of cells express different sets of ion channels in the nuclear membranes. Furthermore the inner and the outer nuclear membranes express ion channels with different biophysical properties. This fact suggests that the two membranes of the nuclear envelope have their own special functions. The physiological role of these ionic nuclear channels is not clear, but they may be important for the ion balance between the cytoplasm and the lumen of the nuclear envelope as well as endoplasmic reticulum, because the nuclear envelope of eukaryotic cells is considered to be the integral part of the endoplasmic reticulum.
Inositoltrisphosphate receptors were found in the inner nuclear membrane of pyramidal neurons from CA1 region of the hippocampus. So the nuclear envelope of these cells can function as Ca2+ store. We were unable to record inositoltrisphosphate or ryanodine receptors in the nuclear membranes of granular neurons of the dentate gyrus. We suppose that different mechanisms of Ca2+ regulation take place in these cells.
Intracellular Ca+ signals consist of local short releases of Ca+ from stores. The mechanisms of the activation of IP-receptors are well studied, but much less is known about the mechanisms of its inactivation. Our data demonstrate that the activity of ion channels in the inner nuclear membrane from the Purkinje neurons of the cerebellum and pyramidal neurons of the hippocampus is voltage-dependent. The IP-activated Ca+ and the large conductance cationic channels are activated by positive potentials and inhibited by negative potentials in the perinuclear space. When Ca+ ions release from the Ca+ store the negative potential develops in its lumen. This potential leads to blockade of the large conductance cationic channels that further negativation of the potential. Then IP-receptors are inhibited, that result in termination of the Ca+ release. So we suggest that these two types of ion channels take part in the regulation of the Ca+ signal in the nucleus.
Key words: ion channels, IP-receptors, nuclear pore, nuclear envelope, endoplasmic reticulum, Ca+ release.
Віддруковано з готових позитивів
ДП “Друкарня ДУС”.
01008, м. Київ, вул. Шовковична, 4а.
Формат 60х 84/16. обсяг 1,4 ум. др. арк.
Зам. 979. Тираж 100 пр. 2007 р.