Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
12
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
СИТНИК
Катерина Сергіївна
УДК 577.21 + 582.926 + 581.174
РОЗРОБКА МОДЕЛЬНОЇ СИСТЕМИ ОТРИМАННЯ
ТРАНСПЛАСТОМНИХ РОСЛИН НА ПРИКЛАДІ
03.00.20 –біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі генетичної інженерії Інституту клітинної біології
та генетичної інженерії Національної Академії Наук України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович,
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН
України, заст. завідуючого відділу генетичної інженерії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Галкін Анатолій Павлович,
Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
завідуючий відділу біоінженерії
доктор біологічних наук, професор
Головко Ераст Анатолійович, Національний ботанічний сад
ім. М.М. Гришка НАН України завідуючий відділу алелопатії
Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України.
Захист відбудеться 24 грудня 2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.
Автореферат розіслано 19 листопада 2004р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.А. Кравець
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Генетично змінені рослини вже багато років використовуються для вивчення фундаментальних питань функціонування рослинного організму та знаходять практичне застосування в різноманітних галузях господарської діяльності людини: сільському господарстві, медицині, фармацевтиці та інших. Генетична трансформація пластидної ДНК є відносно новою технологією, що має ряд переваг порівняно з ядерною трансформацією. Розвиток цієї галузі біотехнології рослин в перспективі може привести до її широкого застосовування для створення систем накопичення корисних білків; їстівних вакцин; рослин, стійких до біотичних та абіотичних факторів. На сьогодні вже є повідомлення про вбудовування в пластом тютюну генів синтезу соматотропіну (Staub et al., 2000), сироваткового альбуміну людини, інсуліну, холерного токсину (Daniell, 2001; Daniell, Dhingra, 2002 ), біополімерів, що підлягають біодеградації (Guda, 2000), стійкості до посухи (Daniell et al., 2001), комах (Kota et al., 1999; De Cosa et al., 2001), грибів (DeGray et al., 2001), гербіцидів (Daniell et al., 1998; Lutz, 2001). Хлоропластні трансформанти отримані для двох видів сільськогосподарсько-важливих рослин: картоплі (Sidorov et al., 1999) та томату (Ruf et al., 2001). Крім того, хлоропластна трансформація є зручним інструментом для досліджень функцій хлоропластних генів, механізмів регулювання експресії, впливу ядерних генів на функціонування пластому.
Хлоропластна трансформація має ряд особливостей, які обумовлюють підвищений інтерес до цієї технології (Bock, 2001): поліцистронний тип експресії дозволяє вводити одразу декілька генів в одній трансформаційній системі (Staub, Maliga, 1995); багатокопійність хлоропластного геному приводить до накопичення великої кількості білку (De Cosa et al., 2001; Daniell et al., 1998); материнський тип успадкування пластид зменшує ризик розповсюдження трансгенів в оточуючому середовищі (Daniell, 1999); наявність в хлоропластах механізму гомологічної рекомбінації дає змогу вбудовувати трансген у визначене місце пластому (Camerini-Otero, 1995).
У той же час, кількість об’єктів, для яких здійснена хлоропластна трансформація, досі є дуже малою і включає, в основному, модельні види. Рутинні, ефективні, відтворювані методики отримання транспластомних рослин існують лише для тютюну. У нашій роботі запропоновано новий підхід до здійснення хлоропластної трансформації. Він базується на таких технологіях: висока ефективність регенерації та генетичної трансформації рослин N. tabacum; наявність відтворюваних методик отримання фертильних транспластомних рослин N. tabacum; можливість створення цитоплазматичних гібридів рослин, що об’єднують цитоплазму одного виду та ядро іншого.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках фундаментальних науково-дослідних робіт відділу генетичної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ: “Вивчення молеулярно-біологічних і генетичних процесів в реконструйованих трансгеномних і трансгенних клітинних лініях і рослинах” (1995 –рр.; не реєструвалася); “Дослідження біологічних процесів в генетично модифікованих рослинах” (2000 –рр.; номер держреєстрації 0101и000390).
Патент: Kuchuk N.V. Methods for transforming plant plastids and making transplastomic plants. U.S. Patent Application No. 60/191,147, International patent application No: PCT/US01/09318, WO01/70939. International publication date 27 September 2001.
В завдання роботи входило:
) отримати транспластомні цибридні рослини Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata), Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis), Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum) та Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna);
2) отримати транспластомні рослини Salpiglossis sinuata шляхом соматичної гібридизації рослин дикого типу з трансформованими цибридними рослинами Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata);
3) вивчити ядерну та мітохондріальну організацію транспластомних рослин Salpiglossis sinuata, отриманих шляхом соматичної гібридизації диких форм з трансформованими цибридними рослинами Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata);
4) отримати транспластомні рослини Nicotiana tabacum з експресією репортерного гену uidA (ген -глюкуронідази) для використання в експериментах із соматичної гібридизації;
) провести соматичну гібридизацію між рослинами Lycium barbarum дикого типу та хлоропластним трансформантом Nicotiana tabacum і дослідити експресію гена uidA.
Об’єкти дослідження - генетична інженерія пластидної ДНК.
Предмет дослідження –отримання, морфологічний та молекулярно-біологічний аналізи хлоропластних трансформантів та соматичних гібридів.
Методи дослідження - метод генетичної трансформації пластому шляхом прямого перенесення трансгенів в протопласти за допомогою поліетиленгліколя (ПЕГ), метод соматичної гібридизації рослинних клітин, методи аналізу отриманих в результаті трансформації та соматичної гібридизації рослин (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), дослідження рестриктних спектрів хлоропластної та мітохондріальної ДНК, вивчення множинних молекулярних форм ферментів амілази та естерази, тест на активність гена -глюкуронідази).
Наукова новизна.
Практичне значення одержаних результатів. Технологія пластидної трансформації дозволяє створювати рослини з новими властивостями для використання їх у різноманітних галузях промислової діяльності, зокрема в сільському господарстві та фармацевтиці. Багато сільськогосподарсько-важливих рослин є рослинами з низьким регенераційним та трансформаційним потенціалом, що робить їх проблемними з точки зору роботи в культурі in vitro та проведенні генетичної трансформації. Підхід, запропонований у роботі, дозволяє підвищувати ефективність хлоропластної трансформації рослин з низьким трансформаційним та регенераційним потенціалом.
Підхід також передбачає можливість перенесення за допомогою соматичної гібридизації трансформованих пластид до інших, корисних, види, ядра яких є сумісними з даним трансформованим пластомом. Створення за допомогою хлоропластної трансформації маркованих пластомів та їх перенесення до інших видів є зручними системами для вивчення ядерно-цитоплазматичних взаємовідносин.
Рослини Lycium barbarum, які мають їстівні плоди, обрані як об’єкт для дослідження експресії репортерного гена uidA в різних типах пластид, зокрема в хромопластах, через потенційну можливість використання рослин Lycium barbarum для створення їстівних вакцин. Їстівні вакцини з часом можуть стати альтернативним, більш дешевим та зручним, способом виробництва та споживання вакцин.
Можливість використання запропонованого підходу показана в роботі на прикладі модельних та диких представників видів родини пасльонових. В подальшому планується його застосування для корисних видів з цієї родини та з інших родин.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто були розроблені завдання досліджень, сплановані та проведені всі експерименти. Особистий внесок здобувача полягає також в обробці та інтерпретації результатів роботи, аналізі літератури, написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок та концепцію досліджень, основні ідеї роботи, структуру дисертаційної роботи, проведено вибір об’єктів. Векторні конструкції були люб’язно надані професором Коопом (Інститут Ботаніки, Мюнхенський Університет, Німеччина). Молекулярно-біологічні аналізи з використанням полімеразної ланцюгової реакції та дослідження рестриктних спектрів проведені за допомогою к.б.н. Комарницького І.К. (ІКБГІ НАНУ), аналіз множинних молекулярних форм ферментів виконано нс Черепом М.Н. (ІКБГІ НАНУ).
Апробація роботи. Результати досліджень доповідалися на 2 –гій міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”, Харків, 2003; IV Міжнародній конференції “Геном растений”, Одеса, 2003; Всеросійській науково-практичній конференції молодих вчених “Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке”, Санкт-Петербург, 2001; Міжнародному симпозіумі “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология”, Москва, 2001; Міжнародній конференції “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”, Ялта, 2002; Конференції молодих вчених “Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics”, Київ, 2003.
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, у тому числі 3 статті в провідних наукових журналах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків і списку літератури, що містить 148 посилань. Робота викладена на 120 сторінках, включає 9 таблиць та 35 рисунків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Векторні конструкції та бактеріальні штами. Плазмідні векторні конструкції pCB033 та pICF584 були люб’язно надані проф. H.-U. Koop (Інститут Ботаніки, Мюнхенський Університет, Німеччина). Для ампліфікації плазмід використовували клітини Escherichia coli, штам XL-Blue. Для відбору бактерій плазміди несуть ген стійкості до ампіциліну.
Плазміда pCB033 містить ген aadA (аміноглікозид 3`- аденілінтрансфераза), що знаходиться під контролем промотору 16S рДНК тютюну та має термінатор гена rbc (велика субодиниця рибулозо-1,5-бісфосфат-карбоксилази) з пластому Chlamydomonas reinhardii. Селективний ген оточений генами rpl32 (рибосомальний білок) і trnL (тРНК лейцину) малої унікальної ділянки тютюнового пластому, що забезпечує вбудовування гена aadA у визначену ділянку хлоропластного геному. Плазміда pICF584 містить, крім селективного гена aadA, репортерний ген uidA (ген -глюкуронідази). Гени знаходяться між послідовностями psbA (D1 білок фотосистеми ІІ) і trnH (тРНК гістидину) великої унікальної області пластома тютюну.
Виділення і культивування протопластів. В усіх експериментах використовували протопласти тканин листка. Листя ферментували в розчинах, що містили різні концентрації ферментів Cellulase Onozuka R-10, Macerosim R-10 та Cellulisin. Виділяли фракцію живих протопластів і культивували в рідкому середовищі KM8p (Kao, Michayluk, 1975). Для регенерації рослин тютюну, цибридів з ядром тютюну та колоній, отриманих в результаті соматичної гібридизації Lycium barbarum та Nicotiana tabacum використовували 1 мг/л БАП (6-бензиламінопурин) і 0,1 мг/л НОК (-нафтилоцтова кислота). Для регенерації рослин S.sinuata замість БАП додавали 1 мг/л зеатину.
Генетична трансформація та соматична гібридизація. Плазмідну ДНК для проведення експериментів виділяли з нічної культури Escherichiacoli, використовуючи набір Qiagen tip 500 (Qiagen, Hilden, Germany) для виділення ДНК відповідно інструкціям до нього. Трансформацію проводили, як описано в статті Koop et al., 1996, з деякими модифікаціями. Перед проведенням соматичної гібридизації рослини – донори хлоропластів опромінювали -променями в дозі 500 –Гр (джерело - Со, 0,1 Гр/сек). Соматичну гібридизацію здійснювали відповідно методиці Menczel et al., 1981 з незначними модифікаціями.
Молекулярно-біологічний аналіз отриманих рослин. Аналіз рослин, отриманих у результаті генетичної трансформації проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції використовуючи праймери, специфічні до селективного гена aadA, репортерного гена uidA та до ділянок хлоропластної ДНК. Для аналізів використовували тотальну рослинну ДНК, яку виділяли згідно протоколу Cheung et al., 1993. Аналіз ділянок хлоропластної, мітохондріальної та ядерної ДНК рослин, отриманих у результаті соматичної гібридизації виконували, досліджуючи спектри фрагментів, синтезованих за допомогою ПЛР та одержаних в результаті обробки синтезованих фрагментів ендонуклеазами рестрикції. Ядерну природу гібридних рослин вивчали, також, порівнюючи множинні молекулярні форми естераз та амілаз. Для виконання аналізів використовували методики, прийняті в нашому Інституті (Биохимический анализ в клеточной биологии растений. –Киев. –. –Препринт /АН УССР, Институт ботаники, 88.1). Активність репортерного гена uidA в трансгенних пластидах виявляли, проводячи гістохімічну реакцію за Jefferson (1987).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Загальна концепція роботи. Ефективність трансформації рослинного організму завжди залежить від ефективності та імовірності двох процесів: вбудовування трансгену в рослинну ДНК та регенерації трансформованої клітини. Регенераційна здатність рослинної клітини залежить від багатьох причин: ступеня її диференційованості, типу тканини, ендогенного гормонального балансу, виду, зовнішніх умов, складу живильного середовища, екзогенних гормонів тощо. В усіх дослідженнях з хлоропластної трансформації відмічалося, що однією з головних передумов, необхідних для отримання трансформантів, є розробка ефективної системи регенерації (Bock, 2001; Sidorov et al., 1999; Ruf et al., 2001). Отже, наявність високорегенераційної системи культивування експлантів є одним з вирішальних факторів для здійснення стабільної пластидної трансформації.
Тютюн, модельна рослина біотехнологів рослин, є єдиним видом для якого розроблена ефективна та відтворювана методика хлоропластної трансформації (Kanevski et al., 1999; Rochaix, 1997; Hager et al., 1999; Kofer et al., 1998; Eibl et al., 1999; Bock, 2001; Staub, Maliga, 1995). Безумовно, однією з причин цього є висока регенераційна та трансформаційна здатність тютюну.
Виходячи з вищесказаного ми вирішили запропонувати та розробити новий підхід до здійснення хлоропластної трансформації. Він полягає у поєднанні за допомогою технології соматичної гібридизації в одній клітині органел тютюну з органелами інших видів. Імовірно, за регенераційну здатність рослинного організму відповідає генетична інформація, закодована в ядерній ДНК, отже цибридні рослини з ядром тютюну та хлоропластами інших видів будуть мати високу регенераційну здатність. Разом з тим, під час трансформації цих рослин трансген, оточений гомологічними послідовностями пластидної ДНК, має вбудовуватися в хлоропластну ДНК того виду, пластиди якого знаходяться в цибридній клітині. Потім трансгенні хлоропласти можна переносити з цибридних рослин або до клітин того ж виду, до якого належать і хлоропласти, або до клітин іншого виду. Експерименти, необхідні для виконання запропонованого підходу схематично представлені на рисунку 1.
d0.1. Cf5 .
Рослина 1 на рис.1 може бути будь-якою, але такою, хлоропласти якої сумісні з ядром тютюну. Рослина 2 повинна мати ядро, що є сумісним з хлоропластами рослини 1.
Таким чином здійснюється трансформація хлоропластів тих видів, які цікавлять дослідника, але мають низький трансформаційний та регенераційний потенціал, а клітини тютюну є посередниками, в яких знаходяться хлоропласти, що цікавлять. Ще одним шляхом виконання запропонованого підходу є отримання хлоропластних трансформантів тютюну та перенесення трансгенних хлоропластів тютюну з клітин тютюну до клітин інших видів.
Генетична трансформація пластомів цибридних рослин. Для розробки нашого підходу ми використали раніше отримані цибридні рослини (див. матеріали і методи). Трансформацію проводили векторною конструкцією pCB033. Після проведення генетичної трансформації зелені колонії відбирали на регенераційному середовищі MS з селективними агентами (300 - 400 мг/л спектиноміцину або 200 мг/л спектиноміцину та 200 мг/л стрептоміцину). Результати оцінки ефективності трансформації наведені в таблиці 1. Аналіз отриманих рослин виконували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Результати аналізу представлені на рисунку 2.
Таблиця 1.
Ефективність трансформації пластомів цибридних рослин.
|
Цибридна рослина |
Кількість експериментів |
Кількість стійких клонів |
Кількість трансформованих клонів |
|
Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) |
4 |
||
|
Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) |
2 |
||
|
Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum) |
2 |
||
|
Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica) |
2 |
||
|
Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna) |
1 |
d0. 2. - .
1 - 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco); 2- , N. tabacum; 3 - N. tabacum (+ S. carniolica); 4 - N. tabacum (+ S. sinuata); 5 - N. tabacum (+ Ph. officinalis); 6 - , N. tabacum.
Транспластомні рослини Salpiglossis sinuata. Наступним етапом роботи було повернення за допомогою соматичної гібридизації трансгенних хлоропластів з цибридної рослини N. tabacum (+ S. sinuata) в клітини S. sinuata дикого типу.
Після злиття протопластів транспластомного цибриду N. tabacum (+ S. sinuata) та рослини S. sinuata дикого типу в суміші знаходяться протопласти S. sinuata дикого типу, транспластомні протопласти N. tabacum (+ S. sinuata) та протопласти з ядром S. sinuata і трансформованим пластомом S. sinuata. Для здійснення відбору необхідних протопластів, а саме протопластів з ядром S. sinuata та трансформованим пластомом S. sinuata, необхідно позбутися протопластів інших типів. Розвиткові протопластів N. tabacum (+ S. sinuata) з трансформованим пластомом S. sinuata запобігали опроміненням рослини перед виділенням протопластів. Протопласти S. sinuata дикого типу інактивували додаванням селективного агенту, спектиноміцину. Лінії, відібрані на селективному середовищі (400 мг/л спектиноміцину) могли бути: рослинами S. sinuata з трансформованими пластидами; асиметричними гібридами S. sinuata з трансформованими пластидами та деякою кількістю ядерного матеріалу N. tabacum.
З чотирма рослинами S. sinuata, відібраними на селективному середовищі після проведення соматичної гібридизації транспластомних цибридних рослин N. tabacum (+ S. sinuata) та рослин S. sinuata дикого типу, був здійснений молекулярний аналіз хлоропластної, мітохондріальної та ядерної ДНК.
d0. 3. S. sinuata, e3b3.
1– 6 - f4 trnL f2 ndhD, b3 ee EcoRI; 7 - 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco); 8 - 13 - , , ee aadA, e0 ; 14 - 20 - , f1 aadA; 1 - N. tabacum; 2, 9, 16 - S. sinuata, ; 3, 10, 17 - S. sinuata, 1; 4, 11, 18 - S. sinuata, ea 2; 5, 12, 19 - S. sinuata, ea 3; 6, 13, 20 - S. sinuata, ea 4; 8, 15 - N. tabacum (+ S. sinuata); 14 - , 033.