Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
|
1.Белки́— высокомолекулярные органические вещества, состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью а-аминокислот. В живых организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется 20 стандартных аминокислот. Множество их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислоты в составе белка часто подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою функцию, и во время его «работы» в клетке. Часто в живых организмах несколько молекул белков образуют сложные комплексы, например, фотосинтетический комплекс. В организме человека содержится свыше 50 000 индивидуальных белков, отличающихся первичной структурой, конформацией, строением активного центра и ф-ми. Белки построены из 20 химически различных аминокислот, каждая из которых может занимать любое положение в полипептидной цепи. Кроме того, белки различаются количеством аминокислот, из которых они построены. Однако большинство таких белков в среде должны принимать множество конформаций с приблизительно одинаковой энергией, но разными химическими свойствами и функциями. в эволюции была отобрана лишь небольшая часть возможных вариантов белков, которые способны принимать единственную стабильную конформацию. первичная структура известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной из возможных конформаций, которая и определяет особенности функционирования данного белка. Возникновение новых белков часто связано с незначительными изменениями в структуре уже имеющихся белков. белок с полезными свойствами или основная структурная часть этого белка могут входить в состав других белков. Такие белки, имеющие схожую последовательность аминокислот и родственные функции, объединяют в семейства родственных белков. В основе структуры любого организма и всех протекающих в нем жизненных реакций лежат белки. Любые нарушения в этих белках приводят к изменению самочувствия и нашего здоровья. Необходимость изучения строения, свойств и видов белков кроется в многообразии их функций. Структурная. Белки формируют вещество соединительной ткани – коллаген, эластин, кератин, протеогликаны. Ферментативная. Все ферменты являются белками. Но вместе с тем, имеются экспериментальные данные о существовании рибозимов, т.е. рибонуклеиновой кислоты, обладающей каталитической активностью. Гормональная. Регуляцию и согласование обмена веществ в разных клетках организма осуществляют гормоны. Часть из них являются белками, например, инсулин и глюкагон. Рецепторная. Эта ф-я закл в избирательном связывании гормонов, биологически активных веществ и медиаторов на поверхности мембран или внутри клеток. Транспортная. Только белки осуществляют перенос веществ в крови, например, липопротеины (перенос жира), гемоглобин (транспорт кислорода), трансферрин (транспорт железа) или через мембраны - Na+,К+-АТФаза (противоположный трансмембранный перенос ионов натрия и калия), Са2+-АТФаза (выкачивание ионов кальция из клетки). Резервная. В качестве примера депо белка можно привести производство и накопление в яйце яичного альбумина. У животных и человека таких специализированных депо нет, но при длительном голодании используются белки мышц, лимфоидных органов, эпителиальных тканей и печени. Сократительная. Существует ряд внутриклеточных белков, предназначенных для изменения формы клетки и движения самой клетки или ее органелл (тубулин, актин, миозин). Защитная. Защитной функцией при инфекциях обладают иммуноглобулины крови, при повреждении тканей - белки свертывающей системы крови. Механическую защиту и поддержку клеток осуществляют протеогликаны. |
7. Первичная структура белков, т.е. последовательность аминокислот в нем, программируется последовательностью нуклеотидов в ДНК. Выпадение, вставка, замена нуклеотида в ДНК приводит к изменению аминокислотного состава и, следовательно, структуры синтезируемого белка. Методы изучения первичной структуры белка. 1. Определение аминокислотного состава белка Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка. Кислотный гидролиз белка Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой. Количественный анализ полученных фракций. нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты. 2. Определение аминокислотной Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков. многие генетические болезни - результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания. Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа: определение аминокислотного состава изучаемого белка; аминокислотной последовательности в белке. Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформе полимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу. Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур. |
8. Вторичная структура белка – пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова. регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура. Вторичная структура образуется только при участии водородных связей между пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.α-Спираль пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль "стягивается" множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается. ?-Спиральная структура - наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается. Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в стороны некоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят: пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб; участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания; участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование ?-спирали, например метионин, триптофан . β-Складчатый слой Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой" Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи. Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатого слоя |
|
9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу ("клубок"). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие: ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные мостики); ионные связи между противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков; водородные связи; гидрофильно-гидрофобные взаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы. Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределена первичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задача предсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков. она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как "структурные мотивы". 1. Супервторичная структура типа б-бочонка каждая б-структура расположена внутри и связана с а-спиральным участком полипептидной цепи, е Супервторичную структуру в виде-б-бочонка имеют некоторые ферменты. 2. Структурный мотив "а-спираль-поворот-а-спиралъ" Этот "структурный мотив" обнаружен во многих ДНК-связывающих белках. Двухспиральная структура ДНК имеет две бороздки - большую и малую. Большая бороздка хорошо приспособлена для связывания белков, имеющих небольшие спиральные участки. В данный структурный мотив входят две а-спирали. Более короткая а-спираль располагается поперёк бороздки, а более длинная а-спираль - в большой бороздке, образуя не-ковалентные специфические связи радикалов аминокислот с нуклеотидами ДНК 3. Супервторичная структура в виде "цинкового пальца" Этот вид супервторичной структуры также часто отмечают в ДНК-связывающих белках. "Цинковый палец" - фрагмент белка, содержащий около 20 аминокислотных остатков, в котором атом цинка связан с радикалами четырёх аминокислот: обычно с двумя остатками цистеина и двумя - гистидина. В некоторых случаях вместо остатков гистидина также находятся остатки цистеина 4. Супервторичная структура Некоторые ДНК-связывающие белки олигомерны, т.е. содержат в своём составе несколько полипептидных цепей. Кроме того, существуют белки, которые функционируют в комплексе с другими белками. Объединение протомеров или отдельных белков в комплексы иногда осуществляется с помощью структурных мотивов, называемых "лейциновая застёжка-молния". |
10. Четвертичная структура белка-это количество и взаиморасположение полипептидных цепей Белки, состоящие из одной полипептидной цепи, имеют только третичную структуру (лизоцим, пепсин, миоглобин, трипсин).Их называют мономерами.Цепи белков соединенные ковалентными связями (например дисульфидными)поэтому инсулин мономерный белок. Для белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, характерна четвертичная структура. Под четвертичной структурой понимают объединение отдельных полипептидных цепей с третичной структурой в функционально активную молекулу белка. Каждая отдельная полипептидная цепь называется протомером и чаще не обладает биологической активностью.Олигомерные белки содержат от 2(гексокиназа)до 312(пируватдегидрогеназа)пртомеров.Специфичность связывания протомеров за счет зависит от совокупности радикалов третичной структуры и определяется комплементарностью протомеров. Комплементарность-пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей. В молекуле белка может быть несколько протомеров, которые при объединении образуют олигомер или мультимер. Для белков с четвертичной структурой характерно понятие субъединицы. Субъединица – это функционально активная часть молекулы белка. Примером белка с четвертичной структурой является гемоглобин, состоящий из 4 протомеров: 2 α и 2 β - цепей. Взаимодействие полипептидных цепей при формировании олигомера происходит за счет полярных групп аминокислотных остатков. Между полярными группами образуется ионная, водородные связи, гидрофобные взаимодействия. Активные центры возникают при образовании четвертичной структуры. В молекуле белка имеются прочные (ковалентные) связи, а также слабые, что обеспечивает с одной стороны стабильность молекулы, а с другой лабильность. Альфа спирали в протомере обозначают латинскими буквами от A до H,начиная с N конца Кооперативные изменения конформации протомеров.
Кислород связывается с протомерами гемоглобина чере железо(2),который соединен с 4 атомами азота пиррольных колец и атомом азота Гис F8 белковой части протомера.Связывание кислорода с оставшейся координационной связью железа происходит по другую сторону от плоскости гема.Гис Е7 обеспечивает оптимальные условия.Присоединение кислорода к атому железа одного протомера вызывает его перемещение в плоскостьь гема,за ним перемещаются остаток Гис F8 и полипептидная цепь.Так как протомер связан с остальными протомерами,а белки обладают конформационной лабильностью,происходит изменение конформации всего белка.Конформационные изменения ,произошедшие в других протомерах,облегчают присоединение следующей молекулы кислорода ,что вызывает новые конформационные изменения в белке и ускорение связывания следующей молекулы кислорода .Четвертая молекула кислорода присоединяется к гемоглобину в 300 раз легче первой. Изменение конформациивсех протомеров олигомерного белка при присоединение лиганда только к одному из них носит название Кооперативные изменения конформации протомеров. Аналогичным образом в тканях диссоцифция каждой молекулы кислорода изменяет конфоормацию всех протомеров и облегчает отщепление последующих молекул кислорода. |
11. АмфотерностьТак как белки содержат кислые и основные аминокислоты, то в их составе всегда имеются свободные кислые (СОО–) и основные (NH3+) группы. Заряд белка зависит от соотношения количества кислых и основных аминокислот. Поэтому, аналогично аминокислотам, белки заряжаются положительно при уменьшении рН, и отрицательно при его увеличении. Если рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка, то заряд белка равен 0. Если в пептиде или белке преобладают кислые аминокислоты (глутамат и аспартат), то при нейтральных рН заряд белка отрицательный и изоэлектрическая точка находится в кислой среде. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 4,8-5,4, что свидетельствует о преобладании в их составе глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. Если в белке преобладают основные аминокислоты (лизин и аргинин) – при нейтральных рН заряд положительный и обусловлен этими, положительно заряженными, аминокислотами. Амфотерность имеет значение для выполнения белками некоторых функций. Например, буферные свойства белков, т.е. способность поддерживать неизменным рН крови, основаны на способности присоединять ионы Н+ при закислении среды или отдавать их при защелачивании. С практической стороны наличие амфотерности позволяет разделять белки по заряду (электрофорез) или использовать изменение величины рН раствора для осаждения какого-либо известного белка. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов в белке обуславливает их способность к высаливанию, что удобно для выделения белков в нативной конформации. Влияние рН на заряд белка При смещении рН в растворе изменяется концентрация ионов Н+. При закислении среды (при снижении рН) ниже изоэлектрической точки ионы Н+ присоединяются к отрицательно заряженным группам глутаминовой и аспарагиновой кислот и нейтрализуют их. Заряд белка при этом становится положительным. При увеличении рН в растворе выше изоэлектрической точки концентрация ионов Н+ снижается и положительно заряженные группы белка (NH3+-группы лизина и аргинина) теряют протоны, их заряд исчезает. Суммарный заряд белка становится отрицательным. Растворимость. Так как большинство белков несет много заряженных групп, то в целом они водорастворимы. Растворимость объясняется:
|
|
2) РАЗДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии: 1. Разрушение клеток изучаемой ткани и получение гомогената. 2. Разделение гомогената на фракции центрифугированием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей искомый белок.
Избирательная тепловая денатурация - кратковременное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей . Высаливание. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая ее концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольшой концентрации солей. 5 Гель-фильтрация — метод молекулярного просеивания молекул через набухшие гранулы сефа-декса (трехмерные полисахаридные цепи декстра-на, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы: чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки. Ультрацентрифугирование — метод, заключающийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: более тяжелые белки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие — к поверхности. Ионообменная хроматография - метод фракционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных нерастворимых полимеров. Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка. Белки, адсорбированные на ионообменном полимере, можно смыть возрастающими концентрациями NaCl; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaCl потребуется, чтобы смыть белок, прикрепленный к ионогенным группам смолы. Аффинная хроматография — наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков. К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании раствора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок. Электрофорез белков Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора бел- ки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (—). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакрила-мидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду,в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, а,-глобулины, а2-глобулины, в-глобулины и у-глобулины Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе. |
3) Хроматография. Принцип основан на способности веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке. Ионообменная хроматография метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий . В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анио-нообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу , и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу содержащую анионные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионооб-менник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионо-обменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли -СМЫВАются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с ка-тионообменной смолой. Такая синтетическая смола содержит прочно связанные с ней отрицательно заряженные группы (например, остатки сульфоновой кислоты ~S03~), к которым присоединены ионы Na+ ( В катионообменник вносят смесь аминокислот в кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут положительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше суммарный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, аргинин и гистидин наиболее прочно связываются с катионообменником, а аспарагиновая и глу-таминовая кислоты — наиболее слабо. Высвобождение аминокислот из колонки осуществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличивающейся ионной силой (т.е. с увеличением концентрации NaCl) и рН. При увеличении рН аминокислоты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и прочность связи с отрицательно заряженными частицами смолы. Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Со-бирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фракции, содержащие отдельные аминокислоты. |
4):Азотометрические методы основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков.. В методе Кьельдаля, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости. Гравиметрические методы Гравиметрические (весовые) методы определения белка основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови. «Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа). Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител. Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями. Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке. Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л. Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод. Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. показатель преломления воды равен 1,3332,. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке. Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя. Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств). |
|
5) По форме молекул белки можно разделить на две большие группы — глобулярные (имеющие сферическую форму) и фибриллярные (удлиненной формы). К глобулярным относят белки, у котор.молекула имеет форму эллипса.их Большинство и. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Наглядные примеры строения и функционирования глобулярных белков — рассмотренные выше миоглобин и гемоглобины. Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин — белок свёртывающей системы крови. 1, Строение и функции коллагенов механические свойства связаны с их первичной и пространственной структурами. Молекулы коллагена состоят из трёх полипептидных цепей,. В состав коллагенов могут входить три одинаковые или разные цепи. каждая третья аминокислота в полипептидной цепи представлена глицином, около 1/4 аминокислотных остатков составляют пролин или 4-гидроксипролин, около 11 % — аланин. В коллагене отсутствуют такие аминокислоты, как цистеин и триптофан, а ги-стидин, метионин и тирозин находятся лишь в очень небольшом количестве. В составе первичной структуры а-цепи коллагена содержится также— гидрокси-лизин. Полипептидную цепь коллагена можно представить как последовательность триплетов Гли-X-Y, где X и Y могут быть любыми аминокислотами, но чаще в положении X стоит пролин, а в положении Y — гидроксипролин или гидроксилизин. Пролин благодаря своей структуре вызывает изгибы в полипептидной цепи, стабилизируя левозакрученную спиральную конформацию. На один виток спирали приходится 3 аминокислотных остатка, а не 3,6. Спираль пептидной цепи коллагена стабилизирована не за счёт водородных связей (так как пролин их не образует), а силами стерического отталкивания пирролидиновых колец в остат ках пролина. В результате расстояние межд аминокислотными остатками увеличивается, и она оказывается более развёр нутой Спирализованные полипептидные цепи, пе ревиваясь друг около друга, образуют трехце почечную правозакрученную суперспиральную молекулу «Жёсткие» аминокислоты — пролин и гидроксипролин — ограничивают вращение полипеп тидного стержня и увеличивают тем самым стабильность тройной спирали. Глицин, всегда находите в месте пересечения цепей; отсутствие радика ла позволяет цепям плотно прилегать А. Структура и функции миоглобина Миоглобин относят к классу гемсодержа-щих белков, т.е. он содержит простетическую группу — гем, довольно прочно связанную с белковой частью. Миоглобин относят к глобулярным белкам; он имеет только одну полипептидную цепь.Миоглобин содержится в красных мышцах и участвует в запасании кислорода. Апомиоглобин — белковая часть миоглобина; первичная структура представлена последовательностью из 153 аминокислот, которые во вторичной структуре уложены в 8 а-спи-ралей. а-Спирали содержат от 7 до 23 аминокислот. Третичная структура имеет вид компактной глобулы (внутри практически нет свободного места), образованной за счёт петель и поворотов в области неспирализованных участков белка. Внутренняя часть молекулы почти целиком состоит из гидрофобных радикалов, за исключением двух остатков Гис располагающихся в активном центре. Белки — высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков — и от количества входящих в него протомеров методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (регистрируется автоматически Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и аппаратуры. разработаны 2 простых метода (гель-хроматография и электрофорез. гель-хроматография, преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии Электрофорез -прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. |
6) В составе белков в организме человека встречают только 20 а-аминокислот. 1. Общие структурные особенности аминокислот, входящих в состав белков Общая структурная особенность аминокислот — наличие амино- и карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же а-углеродным атомом. R — радикал аминокислот — в простейшем случае представлен атомом водорода (глицин), но может иметь и более сложное строение. 2. Классификация аминокислот по химическому строению радикалов По химическому строению аминокислоты можно разделить на алифатические, ароматические и гетероциклические 3. Классификация аминокислот по растворимости их радикалов в воде Аминокислоты с неполярными радикалами К неполярным (гидрофобным) относят радикалы, имеющие алифатические углеводородные цепи (радикалы аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина и метионина) и ароматические кольца (радикалы фенилаланина и триптофана). Аминокислоты с полярными незаряженными радикалами серин, треонин и тирозин, имеющие гидроксильные группы, аспарагин и глутамин, и цистеин Аминокислоты с полярными отрицательно заряженными радикалами аспарагиновую и глу-таминовую аминокислоты, Аминокислоты с полярными положительно заряженными радикалами имеют лизин и аргинин. Строение И СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ Аминокислоты могут ковалентно связываться друг с другом с помощью пептидных связей. Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и а-аминогруппой другой, т.е. является амидной связью. При этом происходит отщепление молекулы воды 1. Строение пептида Количество аминокислот в составе пептидов может сильно варьировать. Пептиды, содержащие до 10 аминокислот, называют олигопептиды. Часто в названии таких молекул указывают количество входящих в состав олигопептида аминокислот: трипептид, пентапептид, октапептид и т.д. Пептиды, содержащие более 10 аминокислот, называют «полипептиды», а полипептиды, состоящие из более чем 50 аминокислотных остатков, обычно называют белками.. Мономеры аминокислот, входящих в состав белков, называют «аминокислотные остатки». Аминокислотный остаток, имеющий свободную аминогруппу, называется N-концевым и пишется слева, а имеющий свободную -карбоксильную группу — С-концевым и пишется справа. Пептиды пишутся и читаются с N-конца. Цепь повторяющихся атомов в полипептидной цепи -NH-CH-CO-носит название «пептидный остов» ( Пептиды различаются по аминокислотному составу, количеству и порядку аминокислот. 2. Характеристика пептидной связи Пептидная связь имеет характеристику частично двойной связи, поэтому она короче, чем остальные связи пептидного остова, и вследствие этого мало подвижна. Электронное строение пептидной связи определяет плоскую жёсткую структуру пептидной группы. Плоскости пептидных групп расположены под углом друг к другу Связь между углеродным атомом и аминогруппой или а-карбоксильной группой способна к свободным вращениям (хотя ограничена размером и характером радикалов), что позволяет полипептидной цепи принимать различные конфигурации. Пептидные связи обычно расположены в транс-конфигурации, т.е. -углеродные атомы располагаются по разные стороны от пептидной связи. В результате боковые радикалы аминокислот находятся на наиболее удалённом расстоянии друг от друга в пространстве Пептидные связи очень прочны и самопроизвольно не разрываются при нормальных условиях, В живых организмах пептидные связи в белках разрываются с помощью специальных про-теолитических ферментов Для обнаружения в растворе белков и пептидов, а также для их количественного определения используют биуретовую реакцию |
12. Денатурация белков Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит случайный характер, то молекулы одного индивидуального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубковПотеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка.
соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность; детергенты - вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). Пример денатурации - свертывание яичных белков при варке яиц. Денатурация бывает обратимой и необратимой. Необратимая денатурация может быть вызвана образованием нерастворимых веществ при действии на белки солей тяжелых металлов — свинца или ртути. РЕНАТУРА́ЦИЯ — процесс восстановления структурной организации биополимера (белковой молекулы или молекул нуклеиновых кислот). Ренатурация возможна только при обратимой денатурации. Ренатурация лежит в основе многих биологических механизмов. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима. Ренатурация возможна только если затронута третичная или вторичная структура. При этом восстанавливаются функции данного белка. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности,гидрофобны взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры. |
|
13) Свойства белковых растворов определяются большими размерами молекул, т.е. белки являются коллоидными частицами и образуют коллоидные растворы. К свойствам белковых растворов относятся: 1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах – опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля). 2. Белковые растворы в отличие от истинных обладают малой скоростью диффузии. 3. Неспособность белковых частиц проникать через мембраны, поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы "искусственной почки" при лечении острой почечной недостаточности. 4. Создание онкотического давления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки. 5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней. Главными факторами устойчивости белка в растворе служат заряд молекулы и гидратная оболочка. Реакции осаждения белков Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора. Обратимое осаждение. Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция. Реактивы: 1) неразведенный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) NaOH, 10% раствор, 4) CuSO4, 1% раствор; 5) дистиллированная вода; 6) сульфат аммония в порошке. Необратимое осаждение белков. Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов. Осаждение при кипячении. Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе. |
14. Классификация белков
Б. Классификация белков по форме молекул Это одна из самых старых классификаций, которая делит белки на 2 группы: глобулярные ифибриллярные. К глобулярным относят белки, соотношение продольной и поперечной осей которых не превышает 1:10 имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови. Классификация белков в зависимости от выполняемых функций:
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы; 3) NaOH, 10% раствор. Осаждение концентрированными минеральными кислотами. Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота. Реактивы: 1) яичный белок,1% раствор; 2) концентрированная серная кислота; 3) концентрированная хлористоводородная кислота; 4) концентрированная азотная кислота. Осаждение органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче. Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор; 3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор. Осаждение белка солями тяжелых металлов. Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле. Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) сульфат меди, 10% раствор; 3) ацетат свинца, 5% раствор; 4) нитрат серебра, 5% раствор |
15. Простые белки белки содержат в своём составе только полипептидные цепи, состоящие из аминокислотных остатков. Их называют "простые белки". основные белки хроматина - гистоны; в их составе содержится много аминокислотных остатков лизина и аргинина, радикалы которых имеют положительный заряд Сложные белки белки, кроме полипептидных цепей, содержат в своём составе небелковую часть, присоединённую к белку слабыми или ковалентными связями. Небелковая часть может быть представлена ионами металлов, органическими молекулами с низкой или высокой молекулярной массой. Такие белки называют "сложные белки". Прочно связанная с белком небелковая часть носит название простетической группы. Простетическая группа может быть представлена веществами разной природы. напр белки, соединённые с гемом, носят название гемопротеины. В состав гемопротеинов, кроме уже рассмотренных выше белков гемоглобинов и миоглобина, входят ферменты - цитохромы, каталаза и пероксидаза. Гем, присоединённый к разным белковым структурам, выполняет в них характерные для каждого из белков функции Белки, соединённые с остатком фосфорной кислоты, называют фосфопротеинами. Фосфорные остатки присоединяются сложноэфирной связью к гидроксильным группам серина, треонина или тирозина при участии ферментов, называемых протеинкиназами. В состав белков часто входят углеводные остатки, придающие белкам дополнительную специфичность и часто уменьшающие скорость их ферментативного протеолиза. Такие белки носят название гликопротеинов. Белки, функционирующие в комплексе с липидами, называют липопротеинами, а в комплексе с металлами - металлопротеинами. Сложный белок, состоящий из белковой части (апопротеин) и небелковой части (простетическая группа), называют "холопротеин |
|
17В основе функционирования любого белка лежит его способность к избирательному взаимодействию с каким-либо другим веществом — лигандом. Лигандом может быть как низкомолекулярное вещество, так и макромолекула, в том числе другой белок. Лиганд присоединяется к определенному участку на поверхности белковой молекулы — центру связывания (активный центр). Активный центр белков – определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении, сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга. Тот факт, что ферменты обладают высокой специфичностью, позволил в 1890 г. выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как "ключ замку". После взаимодействия субстрата ("ключ") с активным центром ("замок") происходят химические превращения субстрата в про,5дукт. Активный центр при этом рассматривался как стабильная, жёстко детерминированная структура. В 1959 г. был предложен другой вариант гипотезы "ключ-замок", объясняющий события в активном центре фермента. По этой гипотезе активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции. Эта "гипотеза индуцированного соответствия" впоследствии получила экспериментальное подтверждение. |
20.взаимосвязь функции и особенностей строения структурных фибриллярных белков. Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови. На примере коллагенов и эластина рассмотрим особенности строения этих белков и связь их строения с функцией. 1. Строение и функции коллагенов Коллагены - семейство родственных фибриллярных белков, секретируемых клетками соединительной ткани. Коллагены - самые распространённые белки не только межклеточного матрикса, но и организма в целом, они составляют около 1/4 всех белков организма человека. В межклеточном матриксе молекулы коллагена образуют полимеры, называемые фибриллами коллагена. Фибриллы коллагена обладают огромной прочностью и практически нерастяжимы. Они могут выдерживать нагрузку, в 10 000 раз превышающую их собственный вес. По прочности коллагеновые фибриллы превосходят прочность стальной проволоки того же сечения. Именно поэтому большое количество коллагеновых волокон, состоящих из коллагеновых фибрилл, входит в состав кожи, сухожилий, хрящей и костей. Необычные механические свойства коллагенов связаны с их первичной и пространственной структурами. Молекулы коллагена состоят из трёх полипептидных цепей, называемых α-цепями. Идентифицировано более 20 α-цепей, большинство которых имеет в своём составе 1000 аминокислотных остатков, но цепи несколько отличаются аминокислотной последовательностью. В состав коллагенов могут входить три одинаковые или разные цепи. Первичная структура α-цепей коллагена необычна, так как каждая третья аминокислота в полипептидной цепи представлена глицином, около 1/4 аминокислотных остатков составляют пролин, около 11% - аланин. В коллагене отсутствуют такие аминокислоты, как цистеин и триптофан, α гистидин, метионин и тирозин находятся лишь в очень небольшом количестве. В составе первичной структуры α-цепи коллагена содержится также необычная аминокислота - гидроксилизин. Полипептидную цепь коллагена можно представить как последовательность триплетов Гли-X-Y, где X и Y могут быть любыми аминокислотами, но чаще в положении X стоит пролин, а в положении Y - гидроксипролин или гидроксилизин. Каждая из этих аминокислот имеет большое значение для формирования коллагеновых фибрилл. Пролин благодаря своей структуре вызывает изгибы в полипептидной цепи, стабилизируя ле-возакрученную спиральную конформацию. Спираль пептидной цепи коллагена стабилизирована не за счёт водородных связей (так как пролин их не образует), а силами стерического отталкивания пирролидиновых колец в остатках пролина. В результате расстояние между аминокислотными остатками по оси спирали увеличивается, и она оказывается более развёрнутой по сравнению с туго закрученной α-спиралью глобулярных белков. Таким образом, аминокислотная последовательность полипептидных цепей коллагена позволяет сформировать уникальную по своим механическим свойствам структуру, обладающую огромной прочностью. Изменение в первичной структуре коллагена может приводить к развитию наследственных болезней. |
|
21.взаимосвязь структуры и функции иммуноглобулинов Иммуноглобулины, или антитела, - специфические белки, вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродных структур, называемых антигенами. В организме человека вырабатывается около 107 клонов В-лимфоцитов, каждый из которых специализирован на выработке одного из 107 видов иммуноглобулинов. Все иммуноглобулины характеризуются общим планом строения, который мы рассмотрим на примере строения IgG. Молекула IgG состоит из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких (L - от англ, light), содержащих около 220 аминокислотных остатков, и двух тяжёлых (Н - от англ. heavy), состоящих из 440 аминокислот каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями. Поэтому молекулу IgG относят к мономерам. Лёгкие цепи IgG состоят из 2 доменов: вариабельного (VL), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Каждый из доменов состоит из 2 слоев с β-складчатой структурой, где участки полипептидной цепи лежат антипараллельно. β-Слои связаны ковалентно дисульфидной связью примерно в середине домена (рис. 1-45). Тяжёлые цепи IgG имеют 4 домена: один вариабельный (VH), находящийся на N-конце, и три константных (СН1, СН2, СH3). Домены тяжёлых цепей IgG имеют гомологичное строение с доменами лёгких цепей. Между двумя константными доменами тяжёлых цепей СH1, и СН2 есть участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Этот участок называют "шарнирной областью"; он придаёт молекуле гибкость. Между вариабельными доменами тяжёлых и лёгких цепей находятся два идентичных участка, связывающих два одинаковых специфических антигена; поэтому такие антитела часто называют "биваленты". В связывании антигена с антителом участвует не вся аминокислотная последовательность вариабельных доменов обеих цепей, а всего лишь 20-30 аминокислот, расположенных в гипервариабельных областях каждой цепи. Именно эти области определяют уникальные способности каждого клона антител взаимодействовать с соответствующим (комплементарным) антигеном. Основные функции антител - обнаружение и связывание чужеродных антигенов, находящихся в организме вне его клеток (в крови, лимфе, межклеточной жидкости, в слизистых секретах). Это происходит с помощью специфических антигенсвязывающих участков разных клонов иммуноглобулинов. Кроме, того, благодаря связыванию антигена с антителом облегчается процесс дальнейшего разрушения чужеродных веществ. |
22.определение понятия фермент. биологическая роль. Особенности ферментативного катализа. Ферме́нты, или энзимы— обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах. Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами. Ферментативная активность может регулироваться активаторами и ингибиторами (активаторы — повышают, ингибиторы — понижают). Специфичность Биологическая функция фермента, как и любого белка, обусловлена наличием в его структуре активного центра. Лиганд, взаимодействующий с активным центром фермента, называют субстратом. В активном центре фермента есть аминокислотные остатки, функциональные группы которых обеспечивают связывание субстрата, и аминокислотные остатки, функциональные группы которых осуществляют химическое превращение субстрата. Условно эти группы обозначают как участок связывания субстрата и каталитический участок, однако следует помнить, что не всегда эти участки имеют чёткое пространственное разделение и иногда могут "перекрываться". В участке связывания субстрат при помощи нековалентных связей взаимодействует (связывается) с ферментом, формируя фермент-субстратный комплекс. В каталитическом участке субстрат претерпевает химическое превращение в продукт, который затем высвобождается из активного центра фермента. Схематично процесс катализа можно представить следующим уравнением: Е + S ↔ ES ↔ ЕР ↔ Е + Р, где Е - фермент (энзим), S - субстрат, Р - продукт. Специфичность - наиболее важное свойство ферментов, определяющее биологическую значимость этих молекул. Различают субстратную и каталитическую специфичности фермента, определяемые строением активного центра (рис. 2-2). 1. Субстратная специфичность Под субстратной специфичностью понимают способность каждого фермента взаимодействовать лишь с одним или несколькими определёнными субстратами. Различают:
Абсолютная субстратная специфичность Активный центр ферментов, обладающих абсолютной субстратной специфичностью, комплементарен только одному субстрату. Следует отметить, что таких ферментов в живых организмах мало. Пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - аргиназа, катализирующая реакцию расщепления аргинина до мочевины и орнитина: Другой пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - уреаза, катализирующая гидролиз мочевины до диоксида углерода и аммиака. Групповая субстратная специфичность Большинство ферментов катализирует однотипные реакции с небольшим количеством (группой) структурно похожих субстратов. Так, фермент панкреатическая липаза катализирует гидролиз жиров в двенадцатиперстной кишке человека, катализируя превращение любой молекулы жира (триацилглицерола) до молекулы моноацилглицерола и двух молекул высших жирных кислот. Панкреатическая липаза гидролизует эфирную связь у α-атомов углерода глицерола, независимо от того, какие жирные кислоты входят в состав молекулы жира Большинство протеолитических ферментов, осуществляющих гидролиз белков, имеет групповую субстратную специфичность, гидролизуя пептидные связи, образованные разными аминокислотами. Стереоспецифичность При наличии у субстрата нескольких стерео-изомеров фермент проявляет абсолютную специфичность к одному из них. В организме человека наблюдают специфичность ферментов к следующим стереоизомерам.
78
|
23.понятие холофермент, апофермент, кофактор, субстрат, продукт реакции, ингибитор,активатор.примеры. 1.Простетические группы прочно связаны с белками и даже могут быть присоединены ковалентными связями. Часто играют важную роль в функционировании ферментов. Белок без простетической группы называется «апобелок», а белок с присоединенной группой — «холобелок» (или, соответственно, в случае ферментов — апофермент и холофермент). Примером может являться гем, который является простетической группой в молекуле гемоглобина. 2.Кофактор-небелковое вещество, которое обязательно должно присутствовать в организме в небольших количествах, чтобы соответствующие ферменты смогли выполнить свои функции. В состав кофактора входят коферменты и ионы металлов (например, ионы натрия и калия). 3.субстрат-вещество, подвергающееся превращению под действием фермента; 4. Ферментативный ингибитор — вещество, замедляющее протекание ферментативной реакции. Различают обратимые и необратимые ингибиторы.Изучение ингибирования ферментов играет важную роль в создании лекарств, в изучении механизма действия и структуры ферментов. Обратимое ингибирование: Конкурентное ингибирование(этом случае ингибитор связывается в активном центре фермента и конкурирует за него с субстратом.);( ингибирование сукцинатдегидрогеназ-ной реакции малоновой кислотой) Неконкурентное ингибирование Неконкурентный ингибитор не мешает связыванию субстрата с ферментом. Он способен присоединяться как к свободному ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу с одинаковой эффективностью( К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра.) Бесконкурентное ингибирование(при бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, что катализ становится невозможным.)( Активатор-вещество,ускоряющее скорость ферментативной реакции. |