Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Введение
Микробиология- наука о мельчайших живых организмах - микробах, об их строении, биологических особенностях, об их роли в различных природных процессах, о возможности использования их в различных областях жизнедеятельности человека, о взаимодействии их с другими объектами живой и неживой природы, о методах устранения их вредного влияния.
Основную массу микроорганизмов составляют: бактерии, дрожжи, вирусы, актиномицеты.
Их объединяют: малые размеры, близость форм, общность методов культивирования и исследования, изменение в субстратах и живых организмах, в которых они развиваются.
Таким образом, микробиология- наука о жизни мельчайших существ, населяющих планету.
.
До открытия Левенгуком (1626 г.) микроорганизмов весь живой мир делился на два царства: растения и животные. До середины 19 века микроорганизмы относили к существам животной природы. Во 2-ой половине 19 века немецкий учёный Геккель пришёл к выводу, что микроорганизмы – это особые существа и предложил выделить их в отдельное царство: протисты (Protista). К ним относятся все мельчайшие организмы, у которых отсутствует дифференцировка на органы и ткани и которые занимают промежуточное положение между растениями и животными.
Изучение царства протистов показало, что они неоднородны по своей клеточной организации. По уровню организации клетки они делятся на эукариотов и прокариотов.
Эукариоты – высшие протисты, имеющие строение клетки, подобное растительным и животным организмам (дрожжи, мицелиальные грибы). Прокариоты – низшие протисты (бактерии).
Все химические вещества, входящие в состав живой материи тех и других тождественны, т.е. одинаковы, но специфические структуры различны
Морфология бактерий.
1.Величина и форма бактерий.
2.Строение, химический состав и функции компонентов прокариотной клетки.
1.Величина и форма бактерий.
Само название «микроорганизм» отражает признак малой величины особи. Размеры микробов измеряются микрометрами: 1 мкм = 10-3 мм. Данные о тонкой структуре клетки приводятся в нанометрах: 1 нм=10-3 мкм=10-6мм. В среднем линейные размеры бактерий лежат в пределах 0.5 -3 мкм, в поперечнике - 0.3-1.5 мкм. Но есть среди бактерий свои «карлики» и «гиганты».
По форме бактерии делятся: на сферические, палочки, изогнутые палочки
1. сферические – как шарики (кокки). В зависимости от расположения клеток различают моно-, дипло-, тетра-, стрепто-, стафилококки, сарцины. Если клетки одиночные, то монококки, если клетки делятся в одной плоскости и располагаются парами, то диплококки, если деление кокков в одной плоскости и образуется цепочка, то стрептококки. Существуют кокки, которые делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, образуя группы по четыре кокка – тетрады. Некоторые кокки делятся правильно и относительно равномерно в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и образуют скопления кубической формы, состоящие из 8-16 и так далее кокков. Эти кокки называются сарцинами, что в переводе «соединяю». Некоторые кокки делятся неравномерно в нескольких плоскостях, оставаясь вместе. Они образуют скопления, напоминающие виноградную гроздь, и называются стафилококками. Палочки имеют цилиндрическую форму. Все палочки различаются по величине, отношению длины клетки к ее диаметру. Условно делятся на бациллы и бактерии. Бациллы образуют споры, а у бактерий спор нет. Так как клеточная стенка палочковидных бактерий представляет собой достаточно твердую, неэластичную трубку, то они растут в основном в длину и колебания в их размерах касаются главным образом длины оси. Обычные размеры наиболее распространенных неспороносных бактерий 0.8*2-3мкм, а спороносных бацилл 1,2-1,8*3,2-11мкм. Ширина клетки более устойчива и колеблется в основном в пределах от 0,5 до 1 мкм. Если отношение длины к ширине примерно равно 1, то это коккобактерии или коккобациллы. Если клетки располагаются цепочкой, то -стрептобациллы или стрептобактерии. Если среди палочковидных форм встречаются парные соединения клеток, их называют диплобактериями, или диплобациллами.
Изогнутые палочки- спириллы имеют от 3 до 5 витков, спирохеты от 5 до 8 витков. Изогнутые палочки в форме запятой называются вибрионами, такое название они получили за свою способность к быстрым колебательным движениям (от латинского Vibrio «трепещущий»).
Есть другие формы, которые не относятся ни к одной из групп: в виде замкнутого или разомкнутого кольца в зависимости от стадии роста, некоторые одноклеточные бактерии образуют особые клеточные выросты – пили и простеки. Пили – это жесткие цилиндрические палочки, закрепленные в клеточной стенке. Простеки – это нитевидные выросты клеточной стенки и мембраны. Ветвящиеся бактерии, которые имеют сходство с грибами, называются актиномицеты. Плеоморфисты – это бактерии которые в зависимости от условий могут иметь вид палочек, кокков или слабоветвящихся форм. Раздвоенные палочки называются бифидобактерии ( в форме У или V )
2. Структорно-функциональная характеристика прокариотной клетки.
Окружает клетку клеточная стенка. Это важный и обязательный элемент клетки – механический барьер, придающий клетке форму. Обладает упругостью, жесткостью, полупроницаемостью, составляет от 5 до 50 % сухого вещества клетки. Она ответственна за отношения к окраске по Граму. Окраска по Граму – это сложный метод окрашивания, в результате которого одни бактерии приобретают фиолетовый цвет – грамположительные, другие розовую окраску – грамотрицательные (Г-). Способность приобретать или не приобретать темно-фиолетовое окрашивание определяется химическим составом и строением клеточной стенки, характерным для определенного вида. Это таксономический признак, который используется для классификации и распознавания микроорганизмов, и с которым коррелируют другие свойства бактерий.
Строение клеточной стенки грамположительных бактерий.
Опорным каркасом является полигетероциклическое соединение пептидогликан, или муреин. Он состоит из N-ацетилглюкозоамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью. N-ацетилмурамовая кислота это тот же N- ацетилглюкозоамин, который соединен эфирной связью с остатком молочной кислоты. Последняя через пептидную связь соединена с тетрапептидным хвостом. Этот каркас называется муреиновым «мешком», основной чертой которого является наличие в нем сети полисахаридных параллельных цепей, связанных множеством пептидных поперечных сшивок, что обеспечивает трехмерную его организацию. Мешок полностью окружает клетку, не имеет разрывов, замкнут со всех сторон, пропитан ионами кальция. Могут быть сопутствующие компоненты, в основном, это тейхоеновые кислоты.
Толщина клеточной стенки 15-80 нм. Доля муреина 30-70 % от сухого веса КС
У грамотрицательных бактерий строение КС, более сложное. Муреин образует только внутренний слой КС., не плотно прилегая к ЦПМ. Доля муреина составляет
1-10% сухого вещества КС. Как правило он однослойный, располагается между двумя воздушными пространствами. Сверху находится наружная мембрана Наружная мембрана имеет мозаичное строение, состоит из белков, фосфолипидов
и липополисахаридов.
.
Неодинаковое количество муреина, его расположение определяет строение КС и отношение к окраске по Граму. Г+ и Г- бактерии имеют различный химический состав и ультраструктуру.
ЦПМ - обязательный структурный элемент клетки, составляет 8-15% сухого вещества клетки. Нарушение целостности приводит к гибели клетки.
Это - белково-липидный комплекс (рис.3). Липиды поддерживают механическую стабильность, придают гидрофобные свойства. Толщина ЦПМ-7,5 нм. Мембранные белки-ферменты. Консистенция- мягкая, пластичная, почти жидкая. ЦПМ-центр метаболической активности. ЦПМ бактерий может впячиваться- инвагинировать, образуя мезосомы, прообраз митохондрий у эукариот, в них находятся ферменты дыхательной цепи- цитохромы, образуется АТФ.
Цитоплазма - гетерогенная система, в которой различают дисперсную среду и дисперсную фазу. Вода с растворенными в ней низкомолекулярными веществами представляет собой дисперсную среду, а высокомолекулярные соединения: белки, углеводы и их конъюгаты - дисперсионную фазу. Цитоплазма имеет слабокислый pH
Рибосомы - это нуклепротеиновые частицы, лежащие в цитоплазме. Примерно 80-85% всей бактериальной РНК находится в рибосомах. Число рибосом в клетке 10-4 . Размер их в пределах 20*30*30нм. Отношение РНК: белок в рибосомах E. Coli составляет 2:1, у других прокариот оно может быть сдвинуто в сторону преобладания белка. Рибосомы состоят из двух субчастиц: 30 S (единиц Сведберга) и 50 S, образующих 70 S – рибосомы.
У эукариот более крупные рибосомы. Функция рибосом- синтез белка. Они агрегируются в полисомы с более высокой константой седиментации.
Генетический аппарат - нуклеоид.
Нуклеоид - это молекула ДНК замкнутая в кольцо, сильно спирализованная. Область цитоплазмы, в которую погружена ДНК, менее плотная, чем окружающая цитоплазма. Какой- либо мембранной структуры, отделяющей ДНК от цитоплазмы, не выявлено.
Это единственная хромосома, которая прикреплена в одной точке к перегородочной мезосоме. Играет основную роль при репликации дочерних хромосом.
Мезосомы - образуются в результате инвагинации, т. е. впячивания ЦПМ и играют роль в синтезе АТФ. Мезосомы одного типа - перегородчатые, участвуют в образовании перегородок в процессе деления клетки. Другого типа- боковые, связаны с ЦПМ локально сбоку, не участвуют в образовании перегородок, но в них локализованы ферменты дыхательной цепи, они являются главным местом синтеза мембранных липидов.
Плазмиды. Наряду с хромосомной ДНК многие бактерии имеют внехромосомные молекулы ДНК, тоже двойные спирали, замкнутые в кольцо, но более короткие - плазмиды, которые содержат до 100 генов. Это необязательные структуры, могут быть утрачены или приобретены при делении.
Размножение бактерий.
Для большинства бактерий характерно бинарное равновеликое поперечное деление, приводящее к образованию двух дочерних клеток идентичных материнской. Делению предшествует репликация ДНК, которая протекает по полуконсервативному механизму.
Капсулы и слизи. Некоторые бактерии синтезируют органические полимеры и откладывают их вокруг клетки, в результате чего она окружена слизистым веществом. Это могут быть микро- или макрокапсулы и слизи. Микрокапсулы типичны для грам-отрицательных бактерий. Макрокапсулы- переходные формы от микрокапсул к обильно ослизненным, они хорошо окрашиваются.
Слизи более диффузны. Они выделяются в окружающую среду в форме индивидуального продукта и накапливаются.
Капсулы состоят из водной среды и полисахарида углеводной природы (декстран).
Капсулы некоторых типов состоят из полипептидов( полиглутаминовой кислоты). Капсула не играет жизненно важной роли, не является таксономическим признаком, но увеличивает вирулентность у патогенных бактерий. Капсулу образует Bacillus anthracis.Zeuconostoc.
Капсульные полисахариды используются в биотехнологии , как плазмозаменители крови, пленкообразователи, диагностические средства, стабилизаторы ферментов, как исходный материал для лекарственных препаратов. В пищевой промышленности они опасны Бактерии Leuconstok-приводят к образованию дефектной мелассы ; вызывают склеивание дрожжевых клеток, увеличивают сроки брожения в производстве пива, вызывают порчу сгущенного молока.
Спорообразование бактерий и подвижность.
Ряд бактерий способны перемещаться, у большинства активно движущихся бактерий это связано с наличием жгутиков. Двигаться без жгутиков способны скользящие бактерии и спирохеты. Двигаются полочки, кокки не подвижны. Жгутик может быть один -монотрих или несколько - политрих..
Жгутики - это нитеподобные образования, состоящие на 98% из белка флагеллина, связанного с углеводами. Толщина жгутика 0,013 мкм. Длина от 5 до 50 мкм. Вращательное движение жгутика обеспечивает поступательное перемещение бактерии. Молекулярный механизм этого движения изучен недостаточно.
Жгутик состоит из белка флагеллина, закрученного относительно некоторого воздушного пространства (фибрилла), «крюка»- утолщенной изогнутой структуры, в которую переходит фибрилла у поверхности КС, и базального тельца, вмонтированного в ЦПМ и КС, к которому крепится фибрилла с помощью крюка. Жгутики относятся к видовому признаку, но подвижность не постоянна, зависит от возраста, физиологии, условий выращивания, условий жизни.
Свободно перемещающиеся бактерии способны к таксисам- это направленное движение определяемое внешним стимулом.
Рис. 3.17. Строение жгутика грам отрицательных прокариот:
В зависимости от факторов среды, вызывающих движение, различают: хемотаксис- способность бактерий реагировать на химический раздражитель; фототаксис- движение к свету или от него; аэротаксис- движение к кислороду воздуха
На поверхности многих бактерий обнаружены более мелкие образования - пили или фибрии (основной белок пилин),
через которые осуществляется передача генетического материала от одной клетки к другой.
Спорообразование.
Споры образуются внутри клетки бактерии ( эндоспоры ) при неблагоприятных условиях, т. е. спорообразование ( у бактерий ) это не способ размножаться и способ выживать. Как правило споры образуют Г+палочки, Г-палочки и кокки спор не образуют. Лучше процесс спорообразования изучен у бактерий родов Bacillus и Clostridium
В одной клетке образуется одна спора, она может не изменить форму клетки или придать ей форму барабанной палочки, форму веретена. По Граму споры не окрашиваются.
Виды расположения эндоспор.
А,Г –центральные споры, Б,В,Д- терминальные споры, Е- латеральная спора
А Б В Г Д Е
.
Благодаря ряду свойств :1) большое количество оболочек,2) низкое содержание воды -15%, 3) специфические вещества., спора выдерживает воздействие внешних факторов, сохраняет жизнеспособность в состоянии анабиоза 300 и более лет. Попав в благоприятные условия спора прорастает, чему предшествует ее набухание, т. е. поглощение воды. В ряде случаев необходимо присутствие глюкозы, нуклеотидов и т. д. Прорастая, спора превращается в вегетативную клетку и теряет свои свойства.
Спорообразование – это таксономический признак, но при определенных условиях споры могут не образовываться. При пастеризации споры сохраняются. Помимо эндоспор некоторые бактерии образуют другие покоящиеся формы:1) экзоспоры- возникают путем почкования материнской клетки, подобно эндоспорам, наблюдаются только у бактерий, утилизующих метан. 2) цисты - это шарообразная тонкостенная клетка, при недостатке пищевых ресурсов в цисту превращается вся клетка.
Систематика бактерий
1 Основы систематики микроорганизмов
2 Искусственная и естественная систематики бактерий.
У микроорганизмов помимо таксона вид есть определение штамм. Штамм - это культуры одного вида, выделенные из различных природных сред или из одной среды, но в разное время. Чистая культура- потомство одной клетки. Клон - культура полученная из одной вегетативной клетки. Накопительная культура- это культура, в которой преобладает один вид микроорганизма, но могут присутствовать и другие.
Систематика бактерий.
В настоящее время существуют естественная и искусственная систематики. Естественная разрабатывалась на филогенетической основе, ее задачи объединить родственные формы организмов, исходя из общности их происхождения. В 1936-1950 году ее разрабатывали Сталер, Ван Ниль и Н.А. Красильников.
Имеется «Определитель бактерий» под редакцией Красильникова, в основе положена естественная классификация, но объема знаний об эволюции и филогении бактерий недостаточно, поэтому естественная классификация не закончена.
Искусственная - основана на учете признаков, удобных с точки зрения практики, она ставит целью объединить особи на основе их сходства, чтобы впоследствии распознать и идентифицировать вид. Ее разработал в 1974 году Берги. В искусственной систематике все бактерии распределены по группам с учетом следующих таксономических признаков:
С учетом этих признаков можно выделить 20 групп, в учебнике Г. Шлегеля характеризуются все эти группы.
Современная классификация бактерий в том числе и в последнем 9 издании определителя Берги делит все бактерии на 4 категории, с целью дифференциации, а не классификации. Они соответствуют отделам.
Эукариотные микроорганизмы
Главное отличие это:
2.Грибы.
Относятся к царству Mycota, или Mycetalia. Близки к растениям : строгие аэробы, имеют жесткую КС, содержащую хитин, вакуоли с клеточным соком, движущуюся многоядерную цитоплазму,не способны к активному перемещению, не способны к фотосинтезу. По типу питания это гетеротрофы.
Широко распространены в природе, есть во всех естественных субстратах, есть среди них: сапрофиты, паразиты и даже хищники.
Вызывают плесневение пищевых продуктов, разложение деревянных построек, нефтепродуктов, разлагают различные органические вещества, синтезируют микотоксины, являющиеся метаболитами грибов, которые при попадании в пищу вызывают отравление человека и животных.
Особенность грибов- это способность образовывать тело- мицелий, или таллом, на поверхности питательной среды, он состоит из гиф. Они представляют собой сильно вытянутые нитеподобные клетки, состоят из клеточных стенок, содержащих хитин, и движущейся многоядерной цитоплазмы. Диаметр гиф колеблется от 5 до 50 мкм и более. Рост мицелия происходит за счет кончиков гиф, он почти неограничен. Являясь эукариотными организмами, грибы способны размножаться бесполым и половым путем.
Классификация грибов.
Преследует практические цели, но учитывает и филогенетические связи, при этом учитывается строение мицелия и способ размножения.
Царство Mycota.
В зависимости от строения мицелия делятся на низшие и высшие. Критерием деления является строение мицелия. У низших несептированный, или одноклеточный, т. е. гифы не имеют перегородок. У высших - септированный (многоклеточный).
У низших выделяется подотдел Myхomyceta, или слизевики, они напоминают по своим свойствам грибы, но в определенных циклах жизни сходны с амебами. Масса слизистая, в благоприятной среде прорастает и делится.
3.Дрожжи.
Размножаются как половым так и бесполым путем. Это протоаскомицеты, или почкующиеся немицелиальные грибы. К дрожжам относятся все высшие грибные организмы, находящиеся в одноклеточной форме и размножающиеся почкованием и делением. Клетки дрожжей содержат все органеллы, типичные для эукариот, только аппарат Гольджи обнаруживается редко. КС состоит из гемицеллюлоз, и небольшого количества белков, липидов, хитина, полифосфатов. Клетка имеет разную форму- овальную, округлую и т.д..
Типичный способ бесполого размножения- почкование. Если после почкования клетки не расходятся, то образуется псевдомицелий. Бинарное деление наблюдается редко. При половом размножении образуются сумки с аскоспорами. Гаплоидные почкующиеся клетки могут сливаться- копулировать- это плазмогамия, вслед за которой формируется голый аск с 4 аскоспорами. Аскоспоры могут образовываться как из зиготы так и из одной вегетативной клетки. Встречаются диплоидные и полиплоидные клетки. Они крупнее и физиологически активнее, используются в промышленности. В неблагоприятных условиях диплоидная клетка превращается в аск. Дрожжи могут размножаться делением. Есть более упрощенные формы дрожжей (дикие, несовершенные), лишь некоторые из которых образуют псевдомицелий и размножаются почкованием. К ним относится Candida, Torulа, Hansenula.
Наиболее известные классификации дрожжей - по Лоддеру, К. Ван Раю, также по Кудрявцеву.
Первая основывается на морфологических, физиологических и генетических свойствах. Вторая, кроме этого, учитывает приуроченность вида к определенным условиям обитания. Третья не учитывает несовершенные дрожжи
Вирусы и бактериофаги.
Вирусы очень маленькие микроорганизмы, размеры которых измеряются в нм. Их особенности:
- малые размеры( от десятков до сотен нм)
- проходят через бактериальные фильтры
- осаждаются только в ультрацентрифуге
- не видны в световой микроскоп
-содержат нуклеиновую кислоту(НК) одного типа (ДНК или РНК)
- для их репродукции нужна только НК
- не способны к росту вне клетки хозяина и к размножению делением
- поражают только молодые растущие клетки
Вирусная частица (вирион) состоит из генетического материала (ДНК или РНК), окруженного белковой оболочкой- капсидом. Капсид состоит из капсомеров. Имеет симметрию. Наиболее хорошо изучены вирусы бактерий, или бактериофаги.
Строение Т-фага Eschericha coli.
Состоит из головки и хвоста примерно равных по размеру, воротничка, сократительного чехла, базальной пластинки с шипами, хвостовых нитей, полого стержня.
Действие бактериофагов специфично, т.е они поражают клетки избирательно. Фаги не подвижны, но при смешивании суспензий бактерий и бактериофагов происходят их случайные столкновения. Фаг, узнав свою бактерию, адсорбируется на ее поверхности с помощью нитей и шипов. Затем происходит инъекция, чехол сокращается и ДНК проникает в клетку, через полый стержень. После этого обмен веществ в клетке- хозяина перестраивается, клетка начинает работать не на себя, а на вирус, синтезируя ранние белки и ферменты, а затем поздние белки, из которых происходит формирование частиц фага.
Под действием фагового лизоцима клеточная стенка бактерий растворяется, клетка хозяина погибает, а фаговые частицы выходят наружу. Такой бактериофаг называется вирулентным, т. к. он убивает клетку хозяина.
Другой тип фагов- умеренные. Они не убивают клетку. Умеренные фаги используются в биотехнологии для перенесения генетической информации из одной бактериальной клетки в другую (рекомбинация у прокриот).
Физиология микроорганизмов.
Питание микроорганизмов.
Вода- универсальный растворитель, представляет собой диполи, без нее существование огранизма не возможно. Вода бывает в свободном состоянии, ее содержание зависит от условий культивирования микроорганизма, от его физиологического состояния, может уменьшаться или увеличиваться в зависимости от количества доступной воды в питательной среде. Свободная вода является растворителем, участвует в переносе питательных веществ в клетку и выводе продуктов метаболизма, обеспечивает все гидролитические процессы в клетке. Связанная вода входит в состав структурных элементов клетки, освобождается только после их разрушения, ее количество относительно постоянно.
Сухие вещества клетки представлены различными элементами. По количественному вкладу в построение клетки все элементы делятся на:
3-10% зольные: Ca, Fe, S, F, Mg, K, Na
Микроэлементы играют большую роль. При помощи минеральных веществ происходит регуляция осмотического давления, от них зависит состояние цитоплазмы, скорость биохимических реакций, ряд физиологических процессов клетки. Наиболее значимы K, Mg, Fe, Ca.
При выращивании микроорганизмов питательная среда должна содержать все необходимые элементы.
Для большинства микроорганизмов характерен внеклеточный способ питания. Большинство органических соединений не могут быть поглощены и использованы непосредственно в обмене веществ клетки микроорганизма. Поэтому в ответ на присутствие в среде вещества клетка синтезирует и выделяет в среду специфичный фермент,который расщепляет макромолекулу до мономеров, а они уже поступают в клетку. Этот способ питания характерен только для микроорганизмов. Индуктор заставляет клетку синтезировать нужный фермент.
Поступление питательных веществ осуществляется через КС, капсулу, слизистые слои, ЦПМ . Наиболее активная роль принадлежит ЦПМ. За небольшим исключением поступать могут лишь те вещества, для которых существует специальная транспортная система, представленная мембранными белками – ферментами- пермеазами, которые функционируют в двойном фосфолипидном слое. Существует 4 механизма поступления веществ в клетку;
Пассивная диффузия.
Неспецифичное проникновение веществ в клетку. Осуществляется через поры мембраны, в ее белоксодержащих участках, которые действуют как молекулярные сита или через липидную фазу ЦПМ. Поступление идет «вниз» по градиенту концентрации переносимого вещества или под действием разностм потенциалов (если проникают ионы) Играет роль величина молекул, разность концентраций, потенциалов по обе стороны мембраны, степень липофильности, скорость поступления невелика ( так проникает вода, кислород), ионы, яды, ингибиторы).
Облегченная диффузия.
Поступление вещества в клетку облегчается благодаря пермеазе. Вещества поступают «вниз» по градиенту концентраций. Не накапливаются в клетке против градиента концентраций. Пермеаза захватывает вещества на внешней стороне мембраны, переносит к внутренней стороне и вещество проникает в цитоплазму, энергия не затрачивается.
Активный транспорт.
Вещество поступает в клетку против градиента концентраций. Может накапливаться против градиента концентраций. Участвует пермеаза и затрачивается энергия, которая синтезируется клеткой при дыхании или брожении. Считают, что энергия нужна, т. к. пермеаза в своей работе претерпевает изменения. Когда он обращен к внешней стороне мембраны, он обладает высоким сродством к переносимому субстрату, а когда к внутренней стороне- низким. Энергия нужна, чтобы вновь приобрести сродство.
Перенос групп.
Аналогичен активному транспорту: участвуют транспортные белки, затрачивается энергия. Различие заключается в природе переносимой молекулы. При активном транспорте в цитоплазму поступает такая же молекула, которая была поглощена из питательной среды. При переносе групп в цитоплазму поступает молекула, которая видоизменяется, например фосфорилируется. Фосфотранспортная система переноса глюкозы, фруктозы зависит от фосфоенолпирувата, состоит из специфичных и неспецифичных компонентов. Большинство веществ поступают по третьему механизму.
Вывод продуктов из клетки осуществляется по этим же механизмам. Вещества выделяются, когда в результате перепроизводства накапливается большая их концентрация.
Типы питания.
У микроорганизмов также существует разделение на автотрофы и гетеротрофы. Критерием разделения является источник углерода. Автотрофы- ассимилируют углерод, как и растения, из углекислого газа, восстанавливая его водородом, который отщепляется от воды или другого органического вещества. Для ассимиляции углерода нужна энергия. В зависимости от источника энергии они делятся на :
Фотосинтетики- нуждаются в энергии солнечных лучей, имеется бактериохлорофилл, который отличается от хлорофилла растений тем, что при первом пиррольном кольце имеется ацильная группа, а не винильная. Фотосинтетики осуществляют типичную реакцию фотосинтеза..
Хемосинтетики ассимилируют CО2 в темноте. Хемосинтез был открыт Виноградским в 1888г. Они осуществляют цепь химических экзотермических реакций, в основном это реакции окисления различных неорганических соединений. Пример : NH2 -HNO2 - HNO3
Фотосинтетики и хемосинтетики делятся по донору водорода:
Гетеротрофы – используют в качестве источника энергии органические вещества, окисляя которые они получают энергию и водород .
С учетом всех трех критериев выделяют 8 типов питания микроорганизмов.
Каждому из этих типов соответствует определенное число особей, более или менее многочисленное. Наиболее многочисленный тип питания, к которому относится большинство микроорганизмов- это хемоорганогетеротрофы.
4. Характеристика питательных сред.
Питательные среды для микроорганизмов должны быть стерильны и приспособленными для тех микроорганизмов, которые изучаются.
Выделяют:
1) По составу.
2)По консистенции
3) По назначению.
1. Универсальные- на них растут большинство микроорганизмов (МПА). Используются на производстве для определения общей микробной обсемененности.
2. Элективные - избирательные среды, для определения микроорганизмов определенных групп, например для БГКП- бактерии группы кишечной палочки.
3. Дифференциально- диагностические- для выявления определенного вида микроорганизма
Культивирование микроорганизмов
Микроорганизмы выращивают в больших объемах либо для получения Биомасса- это общая масса клеток в микробной культуре.
В процессе выращивания микробная культура растет и развивается.
Рост- это увеличение размеров и биомассы, за счет потребленных и усвоенных питательных веществ.
Развитие - изменение морфологических, биохимических и физиологических свойств в процессе онтогенеза.
Важной характеристикой является скорость роста ( интенсивность образования клеточной массы).
В микробиологии используют два способа культивирования микроорганизмов.
1.Поверхностный ( твердофазный)
2. Глубинный (жидкофазный)
Поверхностный осуществляется на твердых сыпучих средах или на поверхности тонкого слоя жидкости. Он пригоден только для аэрофилов, в основном грибов. Основа питательной среды – отруби, которые являются отходами мукомольной промышленности. Важную роль играет крахмалистость отрубей, размеры чешуек. Кроме этого способ трудоемок, требует больших площадей, кондиционирования воздуха, установки закрытых линий, сложно автоматизировать, сложно контролировать pH, t°С и т.д.
Получаемые ферментные препараты обладают высокой активностью. Например амилооризин Пх (амило- значит продукт a- амилаза; оризин –продуцент Aspergillus oryzac; П поверхностное выращивание; х - степень концентрирования; если 10х- спиртоосажденный препарат).
Глубинный более перспективный, пригоден для всех микроорганизмов. Осуществляется в специальных емкостях- ферментерах (рис.), где
1-охлаждающая или обогревающая рубашка, 2- система контроля температуры, концентрации кислорода, 3- мотор, 5- мешалка, 6-подача кислорода, 4 – отвод отработанного воздуха
Клетки микробной культуры суспендированы в жидкости, находясь во взвешенном состоянии, есть возможность поддерживать температуру , перемешивать среду, аэрировать, регулировать рН. Мало ручного труда, автоматизация, малые площади, но активность получаемых ферментов ниже. Поэтому специально разрабатывают культуры- продуценты. Выращивают бактерии и грибы.
Поверхностное культивирование всегда периодическое, а глубинное - может быть и периодическим, и непрерывным.
2)Закономерности роста при периодическом культивировании.
При периодическом культивировании в ферментер загружается весь объем питательной среды и весь инокулят. Смена среды не происходит. Создается замкнутая биологическая система. Процесс ведут до определенного количества биомассы или накопления продукта метаболизма. Затем ферментер выгружают, моют и опять используют.
В процессе выращивания изменяется скорость роста, физиолого-биохимических свойства микробной культуры.
Выделяют следующие фазы роста:
Длительность фазы адаптации зависит от условий выращивания инокулята) dx/dτ=0
Микробные клетки увеличиваются в объеме за счет собственных ресурсов, увеличивается и-РНК, но количество ДНК постоянно. Клетки из состояния голодания переходят в состояние, соответствующее способности к размножению. Потребления питательных веществ не происходит, но клетка становится больше в объёме. Длительность фазы 4-5 часов.
По достижении определенного объема наступает переходная фаза (деление клетки)
Переходная фаза – идет репликация ДНК, кариокинез (деление ядра) Плотность популяции увеличивается вдвое. Время между двумя последовательными делениями называется временем генерации. Если обозначить исходное число клеток через С 0, тогда через данное число генерации (n) общее число живых клеток в культуре составит: Сt= С 0 *2n , можно рассчитать n
N=( lg Ct- lg С 0 )/ lg 2
В этой фазе скорость роста увеличивается от 0 до 1, т. е. до максимума, после этого dx/dτ=k*x , в интервале времени τ2-τ3.
В логарифмической, или экспоненциальной фазе, плотность популяции быстро увеличивается. На полную мощь работает генетический аппарат. Питательные вещества быстро вовлекаются в конструктивный обмен.
Поскольку среда несменяемая, то наступает лимит в питательных веществах и культура переходит в фазу затухающего роста. Константа скорости роста уменьшается с 1 до 0.
Когда скорость роста равна нулю, то культура переходит в стационарную фазу dx/dτ=0 Стационарная фаза – роста нет, в культуре присутствуют разные клетки : живые, но голодающие, живые , но ингибированные продуктами метаболизма, мертвые. Уменьшается размер клеток , устойчивость к температуре, рН. Эта фаза длится около суток.
Затем начинается отмирание.
Все эти данные для описания конкретной кинетической кривой роста, полученной в результате эксперимента, но они не являются основой для прогнозирования.
3)Непрерывное культивирование.
Более перспективно непрерывное культивирование. Сущность состоит в том, что в ферментере поддерживается постоянная плотность популяции, а значит микробные клетки долгое время находятся в определенном физиологическом состоянии. Поддерживаются постоянные условия среды за счет подвода свежей питательной среды и отвода продуктов метаболизма, создается открытая биологическая система. Может быть 1 ферментер - это гомогенно непрерывный процесс или батарея ферментеров, соединенных друг с другом, тогда это гетерогенно непрерывный процесс
( в каждом ферментере создаются постоянные условия, но отличные от другого).
При непрерывном культивировании необходим постоянный приток свежего субстрата.
В условиях непрерывного культивирования различают :
- Турбидостатный процесс. Концентрация клеток в популяции регулируется скоростью подачи субстрата с постоянной его концентрацией.
- Хемостатный. Постоянная скорость подачи, но разная концентрация субстрата.
Преимущества непрерывного культивирования:
1.Получение однородного целевого продукта.
2.Полностью используется весь субстрат.
3.Легко автоматизируется процесс.
4.Не требуется больших площадей
5.Малая затрата ручного труда.
Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы.
Существование микроорганизмов зависит от изменения условий их обитания. Внешние факторы являются условиями их среды. Влияние каждого фактора определяется степенью воздействия, или интенсивностью, характеризуются тремя кординальными точками.
Минимум (min-) наименьшее влияние фактора, ниже которого развитие невозможно.
Максимум (max) – значение величины фактора, выше которого развитие невозможно.
Оптимум- (opt) наиболее благоприятные условия для данного микроорганизма.
Эти положения легли в основу закона минимума:
Чтобы приостановить развитие микроорганизма достаточно уменьшить ниже минимума влияние одного фактора.
В биотехнологии этот закон применяют в двух случаях:
1. Когда на жизнедеятельности микроорганизма основан определенный процесс. Успех производства будет зависеть от того , насколько условия будут приближены к оптимальным. На практике используют методы математического планирования для подбора условий культивирования для того или иного продуцента.
2. Когда деятельность микроорганизма нарушает технологический процесс, вызывает порчу продукта, т. е. необходимо подавить деятельность микроорганизма или подавить его развитие.
1) Физические факторы.
Вода- обязательный компонент клетки. Для жизнедеятельности микроорганизмов необходима свободная вода, которая находится в капельно-жидком состоянии. По потребности в этой воде микроорганизмы различаются.
Чтобы сравнить водные растворы и твердые материалы по количеству в них доступной воды, пользуются параметром активность воды (αw)- относительная влажность, это отношение концентрации воды в фазе пара в воздушном пространстве над данным материалом к концентрации воды в воздухе над чистой водой, т. е. влага, которая может легко испарятся. Микроорганизмы способны развиваться при αw=0,6-0,998, грибы – αw=0,6-0,8, дрожжи- αw=0,81, бактерии- αw=0,98 не ниже.
С этим показателем тесно связано осмотическое давление (ОД).
Гибель клетки в гипертоническом растворе, когда ОД среды больше ОД в клетке, - плазмолиз.
Гибель клетки в гипотоническом растворе (ОД в клетке больше ОД окружающей среды) - плазмоптиз.
По отношению к осмотическому давлению существуют осмофильные и осмотолерантные микроорганизмы. Осмофилы любят растворы с высокой концентрацией веществ ( с высоким осмотическим давлением ) дрожжи, грибы. Осмотолерантные – переносят колебания осмотического давления- грибы.
Однако микроорганизмы, которые переносят высокие концентрации углеводов, не переносят высокие концентрации соли (NaCl).
Микроорганизмы, которые переносят высокие содержания соли – галофилы. Умеренные галофилы развиваются при концентрации до 20% , а экстремальные галофилы (Holobacterium, Halococcus) выдерживают до 32% соли.
Некоторые микроорганизмы, несмотря на то, что питание без воды невозможно, могут сохранять жизнедеятельность в совершенно сухом состоянии в течение длительного периода времени. Наиболее устойчивы грибы, они могут переносить водный стресс и развиваться при низком водном потенциале. У бактерий устойчивость к обезвоживанию возрастает, если они способны образовывать споры или цисты (Azotobacter). Спора находится в состоянии анабиоза. Стафилококки сохраняют жизнедеятельность в сухом виде до 2 лет, палочка Коха до 9 месяцев, но при попадании во влажную среду клетка прорастает и дает начало вегетативной клетке.
В биотехнологии для сохранения ЧК применяют метод лиофилизации: высушивание микробной культуры из замороженного состояния (-76,С) под высоким вакуумом.
3. Температура.
Микроорганизмы не имеют механизмов, регулирующих температуру, поэтому их существование полностью зависит от температуры окружающей среды.
По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на 3 группы.
1.Психрофилы (криофилы). Оптимальная температура (+10)С, минимальная: 0-6 С, максимальная: 30-35 С. Это в основном светящиеся бактерии, обитают в водах северных морей, микрофлора холодильников и холодильных камер.
2. Мезофилы. Оптимальная температура 28-35 С, минимальная 5-10 С, максимальная: 43-50 С. Это болезнетворные микроорганизмы, обитают и пищеварительном тракте животных. Среди мезофиллов выделяют термотолерантные, которые при оптимальной температуре 28-35 С, могут переносить колебания температуры до 60С.
3.Термофилы
Оптимальная температура 50-60 С, минимальная: 18-30 С, максимальная: 75-80 С. Они составляют остаточную микрофлору консервов. Имеются среди бактерий, грибов. Участвуют в самосогревании зерна, хлопка.
Низкие температуры оказывают бактериостатический эффект , т. к. приостанавливают жизнедеятельность микроорганизмов. В микробной клетке изменяется вязкость цитоплазмы, дисперсность белковых частиц, инактивируются ферменты, небольшие концентрации соли при температуре 20 С убивают микроорганизмы.
Высокие температуры вызывают свертывание цитоплазмы, коагуляцию белков, полную инактивацию ферментов у психрофилов и мезофилов (60 С и более).
Во влажной среде микроорганизмы гибнут при более низких температурах, чем в сухой. Споры бактерий устойчивы к действию температуры, что обусловлено их строением и составом. В пищевой биотехнологии особенно опасны спорообразующие термофилы.
На действии высоких температур основан ряд методов уничтожения микроорганизмов:
Пастеризация - до 100 С; стерилизация – свыше 100 С.
Радиация и видимый свет.
Для большинства микроорганизмов прямые солнечные лучи, радиация являются вредными, исключение составляют пурпурные и фотосинтезирующие бактерии. Наиболее активный бактерицидный эффект оказывает коротковолновая ультрофиолетовая (УФЛ) часть спектра с длинной волны 220 нм. Это связывают с тем, что спектр их действия соответствует спектру поглощения нуклеиновых кислот. В клетке изменяется структура ДНК, нарушаются процессы размножения.
Очень активны рентгеновские лучи.
Действие всех видов излучения зависит от дозы, от физиолого-биохимического состояния микроорганизма. Многие микрококки содержат каратиноидные пигменты, защищающие от УФ излучения.
Гидростатическое давление
Обычное гидростатическое давление не оказывает влияния на микроорганизмы. Очень высокое –может остановить рост. Есть барофильные микроорганизмы, которые живут при обычном давлении, а размножаться при нем не могут.
Баротолерантные размножаются при нормальном давлении, но переносят высокое давление.
Ультразвуковые колебания с частотой порядка 300 кГц, подавляют жизнедеятельность микроорганизмов. Используются для стерилизации молока, фруктовых соков, воды
Радиоволны - короткие и длинные, инертны, не оказывают влияния , но ультракороткие радиоволны очень активны.
Ток переменный и постоянный не действуют, но токи высокой частоты и сверх высокой частоты (ТВЧ и СВЧ) активны.
Физико-химические факторы (рН, rH2)
рН – показатель активной кислотности среды, которая зависит от концентрации ионов водорода, изменяется в пределах от 0 до 14.
Каждый микроорганизм имеет свой максимум и минимум рН, в пределах которых он может развиваться, для большинства- оптимальное значение близко к 7. Очень кислая и щелочная среды- губительны, но для бактерий предпочтительно рН 6,5-7,5. Для большинства грибов и дрожжей оптимальное значение 4-6, однако есть алкалофильные микроорганизмы, которые предпочитают рН 9 и более, ацидофильные рН 3 и менее. Некоторые кислотообразующие бактерии (молочнокислые) синтезируют столько кислоты, что угнетают собственный рост и развитие. Концентрация ионов водорода оказывает большое влияние на направленность физиологических процессов.
При спиртовом брожении, при рН=4-5 образуется СО2 и С2Н5ОН, а при рН: 7,5 образуется еще и СН3СООН, при рН: 8-9 образуется еще и глицерин.
Влияние рН используется в консервировании продуктов, при приготовлении маринадов, сырокапченных колбас.
rH2 – показатель степени аэробности среды. Возникает между клеточной стенкой и ионами питательной среды. Это отрицательный логарифм давления молекулярного водорода в среде. В водном растворе, насыщенном водородом
rH2=0 , а в водном растворе. rH2=41 . Интервал от 0 до 41 может выразить любую степень аэробности среды. Зависит от дыхательного коэффициента.
Для аэробов требуется rH2 от 10 до 30, для анаэробов rH2 не более 20 для жизнедеятельности и не более 3-5 для размножения.
С учетом отношения к этому фактору (к молекулярному кислороду в среде) все микроорганизмы делятся на 3 группы.
1. Облигатные аэробы (строгие аэробы) не могут жить без кислорода. Они имеют окислительный тип обмена, получают необходимую для жизнедеятельности энергию только путем дыхания. Это все грибы и большая часть бактерий.
2. Облигатные, или строгие анаэробы. Это микроорганизмы, для которых кислород токсичен. Они имеют бродильный тип обмена веществ, растут только в бескислородной среде, получают необходимую энергию только путем брожения. Пример : бактерии рода Clostridium.
3. Факультативные анаэробы. Это микроорганизмы, которые в зависимости от условий могут использовать кислород воздуха для получения энергии или обходиться без него, т. е. переключают свой метаболизм с окислительного на бродильный. Пример : дрожжи- в присутствии кислорода они дышат, размножаются, накапливают биомассу, В отсутствии кислорода превращают углеводы в спирт. Среди них выделяют молочнокислые бактерии - аэротолерантные, в присутствии кислорода они не погибают (переносят его), но не используют его в своем метаболизме, имея только бродильный тип обмена. Есть еще микроорганизмы, которые нуждаются в незначительном количестве кислорода от 0,01 до 0,03 бар. Обычное давление 0,2 бар они не переносят ( микроаэрофилы).
Химические факторы.
Это химические вещества. Попадая в клетку, они взаимодействуют с различными ее структурами и нарушают их функции. Оказывают бактерицидный и бактериостатический эффекты. Действие зависит от природы вещества, его концентрации, экспозиции, состава среды, от состояния микроорганизма, факторов внешней среды.
По характеру действия их делят на группы:
Используются для дезинфекции , т. е. уничтожают патогенные микроорганизмы.
Ионы хлора и кислорода изменяют нуклеоид, ионы водорода действуют на нуклеоид, ДНК и ЦПМ, ионы ОН- вызывают омыление жиров в ЦПМ и ее разрушение
Молочная кислота уничтожает стафилококк, уксусная кислота- вирус ящура. Соду (Na2CO3) используют для отмывания жирных поверхностей. Йод – уничтожает плесень в холодильнике. Жидкая среда способствует действию химических веществ. Твердая среда (навоз, почва) наоборот, обволакивает клетку и предохраняет ее.
Биологические факторы. Симбиоз и его виды
Биологические факторы - это различные взаимоотношения, которые складываются между живыми микроорганизмами в природных условиях.
Тесное сожительство двух организмов называется симбиозом. Он бывает мутуалистическим - взаимовыгодным.
Мутуализм- вид сожительства, когда оба партнера извлекают из сожительства пользу.
В природе возникают различные синтрофные ассоциации (взаимное снабжение микроорганизмов необходимыми веществами) В биотехнологии создаются такие ассоциации: ауксотрофы (молочнокислые бактерии) и прототрофы (дрожжи), используются для производства кваса, кумыса, ржаных заквасок, кефирных грибков.
Метабиоз - один из видов симбиоза. Это форма взаимоотношений, когда продукты обмена веществ одного вида микроорганизма становятся питательным материалом для другого. Пример: дрожжи сбраживают глюкозу, образуя спирт. В среде, насыщенной спиртом развиваются уксусно-кислые бактерии и превращают его в уксусную кислоту. Используя уксусную кислоту, грибы образуют СО2 и Н2О, а автотрофы используют СО2 и образуют глюкозу, т. е. при метабиозе один вид микроорганизма в процессе жизнедеятельности создает условия для развития другого вида.
Метабиоз- это основа круговорота веществ в природе, обуславливает этапность процессов и смену одних форм микроорганизмов другими.
Комменсализм- вид сожительства, когда пользу извлекает один партнер (аэробы и анаэробы, микрофлора кишечника, кожи).
Сателлизм – когда один микроорганизм стимулирует рост другого, который затем становится его спутником
Синергизм- одинаково направленные физиологические процессы разных особей микробной ассоциации, в результате чего увеличивается выход конечных продуктов . Пример : Azotobacter и Bacillus mycoides вырабатывают гетероауксин - стимулятор роста.
Антагонизм- противоположность мутуализма. Это форма конкурентных взаимоотношений, при которых один из видов микроорганизма угнетает или вызывает гибель другого. Обусловлен :
Антибиотики- продукты обмена веществ микроорганизмов и других живых объектов, которые способны в незначительных количествах избирательно задерживать рост и убивать микроорганизмы.
В отличие от асептиков, каждый вид антибиотика подавляет только определенный вид микроорганизма. Они оказывают бактериостатический эффект (приостанавливает рост микроорганизма) и бактериолитический (вызывает лизис- разложение клеток).
Действие антибиотиков зависит от их химической структуры, вида микроорганизма, физико-химических условий (t, pH, rH2), дозы, длительности воздействия.
Повреждающий эффект связан с нарушением действия ферментных систем микроорганизмов, что приводит к подавлению в нем питания, дыхания, размножения.
Антибиотики синтезируют грибы Penicillum - пенициллин, бактерии (Lactococcus lactis) - низин, который широко используется в пищевой промышленности. Он полипептидного типа, поэтому быстро разрушается ферментами пищеварительной системы. Актиномицеты синтезируют тетрациклин.
Антибиотики нашли применение в консервной промышленности, при сохранении рыбы, птицы, свежего мяса, при хранении сыров и других молочных продуктов, при хранении фруктов, овощей. Их присутствие снижает длительность термообработки, что сохраняет витамины, консистенцию продукта, обеспечивает гибель клостридиальных и термофильных бактерий, устойчивых к температуре.
Синтезировать антибиотики могут высшие организмы. Антибиотики растений называются фитонциды ( лук, чеснок, сирень, хрен, черемуха). Они убивают сарцины, стафилококки, стрептококки, кишечную палочку. Используются при лечении ран (подорожник). при хранении рыбы ( крапива).
Антибиотики животных – лизоцим, обнаружен в слезах, носовой слизи, слюне, яичном белке. Лизоцим не специфичен , т. е. действует на многие микроорганизмы, но более чувствительны Г+. Антибиотик интерферон вырабатывается клетками, пораженными вирусами. Эритрин синтезируется эритроцитами крови.
Обмен веществ микроорганизмов.
Понятие метаболизма, катаболизма, анаболизма и их взаимосвязь
Через живые организмы, которые представляют собой открытые системы, проходят большие потоки веществ и энергии. Совокупность химических реакций, в результате которых из сравнительно простых веществ окружающей среды образуется новое клеточное вещество и энергия, а также все другие проявления жизни, называется метаболизм, или обмен веществ. Он включает два противоположных взаимоисключающих, но одновременно взаимодополняющих друг друга процесса ( катаболизм и анаболизм).
Оба процесса протекают в клетке одновременно. Многие реакции и промежуточные продукты являются для них общими, разделить их практически невозможно, как невозможно разделить дыхание и питание у микроорганизмов.
Катаболизм (включает процессы диссимиляции)- это энергетический обмен . Связан с расщеплением пищевых веществ ( углеводов, жиров, белков) , которые происходят в основном за счет реакций окисления, в результате чего выделяется энергия. Установлено, что микробная клетка запасается энергией в форме соединений, обладающих макроэргической связью; это АТФ, УТФ, АДФ и т.д. При гидролизе, расщеплении этих связей от них отделяется остаток фосфорной кислоты, освобождается энергия, которая может быть использована в процессах синтеза.
У микроорганизмов известны две формы катаболизма: дыхание и брожение.
Дыхание- это сложный процесс биологического окисления, всегда с участием кислорода. Связан с образованием большого количества энергии, СО2 и Н2О.
Известно аэробное дыхание, которое протекает с участием молекулярного кислорода ( кислорода воздуха); анаэробное дыхание – протекает с участием связанного кислорода; неполное окисление.
Брожение- это жизнь без кислорода. Это неполный распад органических веществ с образованием незначительного количества энергии и продуктов, богатых энергией. Отщепляемый при окислении от органического вещества ион водорода передается не на кислород, а на органическое соединение, которое образуется в ходе самого брожения.
Тип брожения называется по виду основного вещества. Пример: спирт - спиртовое брожение.
Ассимиляция связана с анаболизмом клетки.
Анаболизм- это конструктивный обмен, он включает процессы синтеза макромолекул клетки из более простых соединений, присутствующих в окружающей среде. При ассимиляции образуются вещества, которые участвуют в процессе диссимиляции ( ферменты) и потребляется энергия. поставляемая в форме АТФ в процессе катаболизма.
2. Большая роль в процессах метаболизма принадлежит ферментам.
В зависимости от локализованности - расположения, места действия ферментов, различают экзоферменты и эндоферменты.
Экзоферменты связаны с процессами питания, подготавливают питательные вещества к усвоению микробной клеткой. Индуцибельные – вырабатываются клеткой в ответ на присутствие в среде индуктора (субстрата фермента или его аналога). Экзоферменты не связаны прочно со структурой цитоплазмы , легко выделяются в среду при жизни клетки.
Эндоферменты- прочно связаны с цитоплазмой и клеточными структурами. Действуют только внутри клетки, осуществляя превращение поступающих в нее питательных веществ. Пример: оксидоредуктазы, изомеразы, трансферазы.
Катаболитные реакции общие для дыхания и брожения.
Основное вещество, которое используется в катаболизме – глюкоза. И при дыхании, и при брожении глюкоза на I этапе в анаэробных условиях превращается в пировиноградную кислоту. которая занимает центральное положение в промежуточном обмене веществ.
В зависимости от специфики микроорганизма, т. е. набора его ферментных систем, эти превращения могут осуществляться тремя путями:
1.ЭМП (Эмбдена-Мейергофа-Парнаса), или ФДФ (фруктозодифосфатный), гликолитический.
2.КДФГ (Энтнера-Дудорова).
3. Пентозофосфатный.
Степень использования каждого из этих путей различна для микроорганизмов, хотя ферменты I пути (универсального) являются обязательными компонентами любой клетки. Многие бактерии, имея их, осуществляют превращения только в обратном направлении (пировиноградную кислоту в глюкозу)
Универсальный I путь (гликолитический)
(ФГА)
2ФГА
Дальнейшие превращения осуществляются за счет переноса водорода и остатка фосфорной кислоты через ряд органических кислот с участием специфичных дегидрогеназ. В этой цепи реакций происходит синтез двух молекул АТФ, сопряженный с окислением промежуточных метаболитов (субстратное фосфорилирование).
Т. к. окисляется 2 молекулы фосфоглицеральдегида, выделяется свободная энергия, достаточная для образования 4 молекул АТФ.
Общий энергетический выход этого пути- 2 молекулы АТФ, 2 молекулы пировиноградной кислоты и 2 молекулы НАДН2 Ферменты этого пути обнаружены у дрожжей ( они образуют ГТФ, УТФ, ЦТФ) в мышцах животных, у бактерий.
II путь –КДФГ
Начинается с глюкозы, которая превращается в глюкозо-6-фосфат, затем она превращается в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая дегидратируется и образуется КДФГ – 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота. Под действием ферментов I пути она расщепляется на пировиноградную кислоту и 3-фосфоглицеральдегид (фермент- альдолаза), фосфоглицеральдегид превращается во вторую молекулу пировиноградной кислоты и АТФ.
Общий энергетический выход этого пути- 1 молекула АТФ, 2 молекулы пировиноградной кислоты, NADH2, НАДРН2. Этот путь универсален для бактерий, главным образом – аэробных.
III путь- пентозофосфатный.
Начинается с фосфорилирования глюкозы с образованием глюкозо-6-фосфата, 6-фосфоглюконовой кислоты. Затем она декарбоксилируется и образуется пентозофосфат. Дальнейшее превращение рассматривается как преобразование пентозофосфатов в гексозофосфаты, т. е. завершается процесс окисления. Это циклический, побочный путь.
Значение этого пути:
С участием ферментов I пути пентозофосфат частично превращается в фосфоглицеральдегид, затем в пировиноградную кислоту.
Общий энергетический выход- 1 молекула АТФ, 2 молекулы НАДН2, 1 молекула пировиноградной кислоты.
Таким образом, центральное положение в промежуточном метаболизме занимает пировиноградная кислота, которая служит предшественником многих продуктов. Дальнейшие пути окисления ПВК зависят от физиологии микроорганизмов.
4)Аэробное дыхание.
Все строгие аэробы окисляют пировиноградную кислоту в присутствии кислорода воздуха до СО2 и Н2О, с образованием большого количества энергии в форме АТФ.
1-й этап включает серию реакций, благодаря которым органический субстрат окисляется до СО2, а освобождающиеся атомы водорода перемещаются к акцептору, т. е. осуществляется ЦТК (цикл трикарбоновых кислот). Участвуют специфические декарбоксилазы и дегидрогеназы.
Значение ЦТК состоит в том, что образуется ряд промежуточных продуктов (органических кислот, играющих роль предшественников для биосинтеза макромолекул клетки). В ЦТК кроме углеводов вовлекаются и продукты катаболизма жирных кислот и аминокислот.
2-й этап включает окисление освобождающихся атомов водорода кислородом с образованием АТФ. Отщепленные атомы водорода (специфическими дегидрогеназами) акцептируются коферментами НАД и ФАД, а затем переносятся по дыхательной цепи. В сущности происходит перенос электрона Fe2+--- Fe3++ e
При переносе электрона на отдельных участках цепи образуется большое количество свободной энергии и образуется АТФ. В клетках имеется механизм, объединяющий выделение энергии и образование АТФ, который называется окислительное фосфорилирование ( в митохондриях, ЦПМ). Ионы водорода акцептируются кислородом воздуха с образованием воды. Всего 36 молекул АТФ.
Все аэробы и факультативные анаэробы имеют дыхательную цепь. Большинство анаэробов не имеют цепи переноса электронов, поэтому при наличии кислорода воздуха водород с ФАДН2 переносится на кислород с образованием перекиси водорода. Н2О2 может разлагаться каталазой до Н2О и О2, но каталаза у анаэробов отсутствует. Поэтому Н2О2 накапливается в клетке и убивает ее.
5) Неполное окисление.
Ряд бактерий (рода Pseudomonos) и грибы (рода Aspergillus )неполностью окисляют углеводы. В среде накапливаются неполно окисленные органические соединения (трикарбоновые кислоты: лимонная, уксусная, фумаровая и пр.). Процессы идут в присутствии кислорода, поэтому ближе к дыханию. Энергетически выгодны для микроорганизмов.
В биотехнологии это используют в производстве органических кислот.
6)Анаэробное дыхание.
Это тип метаболизма, который также протекает с участием кислорода, но не молекулярного, а «связанного» кислорода. Носителями его могут быть: нитраты, сульфаты, карбонаты и другие неорганические соединения.
Способность к переносу иона водорода на сульфат, нитрат или карбонат позволяет бактериям осуществлять достаточно полное окисление, извлекая энергии больше, чем при брожении. Такие бактерии имеют цитохромы. Процесс похож на дыхание, но так как используется связанный кислород, то дыхание называется анаэробным. Энергии образуется на 10% меньше чем при аэробном дыхании.
Типы брожения.
Из трех возможных способов регенерации АТФ ( фотосинтез, дыхание, брожение), брожение наиболее простой. Молекулярный кислород не участвует.
Выход энергии приблизительно в 30 раз меньше, чем при дыхании.
Тип брожения зависит от основного продукта, который образуется. Каждый тип брожения имеет своего возбудителя.
1. Спиртовое брожение.
Основной продукт окисления органических субстратов, (сбраживаемых углеводов) - этиловый спирт. Главные продуценты - дрожжи, особенно Saccharomyces cerevisiae:
В анаэробных условиях брожение очень интенсивно, но роста дрожжей почти не происходит, при аэрации брожение ослабевает, уступая место дыханию, т. е. кислород подавляет брожение (эффект Пастера), поэтому если надо получить спирт, необходима изоляция от кислорода, если надо получить биомассу, то через питательную среду пропускают кислород.
Могут образовываться сивушные масла: амиловый, изоамиловый, бутиловый, изобутиловый и другие спирты. Это продукты обмена некоторых аминокислот: лейцина, валина, изолейцина. Качество спирта зависит от условий брожения. Обычно спирт получают при рН=4-5, Т=30 ˚С. Если реакцию среды повысить до рН= 8, то образуется глицерин.
Характеристика возбудителей.
Дрожжи- эукариоты, одноклеточные, немицелиальные грибы аскомицеты, мезофилы, факультативные анаэробы, прототрофы, хемоорганотрофы. Способ бесполого размножения - почкование.
Некоторые бактерии также способны образовывать этанол. Сарцина вентрикули образует ПВК по ЭМП пути , бактерии Zymomonos - по КДФГ пути, продукты брожения этанол, СО2 и немного молочной кислоты.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии Leuconostos mesenteroides сбраживают глюконат по ПФ пути, образуется спирт и немного лактата.
2. Молочнокислое брожение.
Основной продукт брожения - молочная кислота. Возбу дители молочнокислого брожения- молочнокислые бактерии (МКБ) рода :Lасtососсus, Lactobacilllus, Leuconostoc.
Длинные и короткие цепочки палочек и кокков (стрептобактерии). Все Г+, не образуют спор, большинство неподвижны, в качестве источника энергии используют углеводы, выделяют молочную кислоту. Факультативные анаэробы (аэротолерантные). Каталазы и цитохромов не имеют. Ауксотрофы, хемоорганогетеротрофы, мезо- и термофилы. В зависимости от продуктов брожения различают типы:
2. Гетероферментативное молочнокислое брожение
Возбудители палочки Lactobacillus brevis, L. citrovorum
3)Бифидоброжение- возбудители бифидобактерии
Бифидобактерии строгие анаэробы, но переносят кислород в присутствии СО2, по форме раздвоенные палочки.
Все МКБ и бифидобактерии являются пробиотиками, нормализующими микрофлору ЖКТ. Способствуют их размножению в организме пребиотики ( углеводы, например инулин ).
3. Маслянокислое брожение.
Возбудители маслянокислые бактерии, род Clostridium. Это палочки, Г+, образуют спору, подвижные. Строгие анаэробы, мезофиллы, хемоорганогетеротрофы. В присутствии кислорода переносят водород от окисляемого субстрата на кислород с образованием перекиси водорода- Н2О2. По способности ассимилировать органические субстраты подразделяются на :
сахоролитические, сбраживающие углеводы (Cl. рasteurianum, Cl. вutyricum), усваивают углеводы : глюкозу, крахмал, органические кислоты, спирты.
пептолитические, сбраживающие белки и полипептиды до аминокислот, которые затем используют.
При маслянокислом брожении образуются в различном соотношении продукты: кислоты (масляная, уксусная, молочная ), спирты (бутанол, этанол, изопропанол), ацетон и газы (Н2, СО2). Брожение начинается с окисления углеводов по ЭМП пути. Процесс преобразования пировиноградной кислоты очень сложный, катализируется несколькими ферментными системами.
Какие образуются продукты зависит от условий брожения, вида микроорганизма.
Пример: Сl. вutyricum окисляет углеводы до масляной кислоты, уксусной и газов.
К этому же роду относятся возбудители Cl. аcetobutylicum, сбраживают углеводы с образованием органических растворителей, применяются для их промышленного производства.
Брожение смешенного типа или муравьино-кислое брожение.
Возбудители бактерии семейства Enterobacteriaceaе –это палочки, неспорообразующие, грамотрицательные, подвижные- перетрихи, встречаются и неподвижные виды, факультативные анаэробы, не требовательны к питанию, хемоорганотрофы. Представители Salmonela, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Entherobacter aerogens. В отличии от кишечной палочки, он вызывает протеолиз, т. е. разложение белков, образуется много газов,
Escherichia coli – санитарно показательный микроорганизм. В пищевой промышленности контролируется показателем БГКП. На каждый продукт устанавливается минимальный обьем, в котором недолжны обнаруживаться эти бактерии.
Химизм. ПВК образуется по ЭМП из гексоз, иногда по ПФ пути, из глюконата по КДФГ пути. Продукты: кислоты (янтарная, молочная, уксусная, муравьиная); этанол, бутандиол, Н2, СО2. Преобладает муравьиная кислота.
PAGE 30