Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича
Біофізика:
Лабораторний практикум
Чернівці
Чернівецький національний університет
2013
ББК
УДК
Друкується за ухвалою редакційно-видавничої ради
Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича
Біофізика: Лабораторний практикум / Укл. Худа Л.В. Чернівці: Чернівецький національний університет, 2013. –с.
Для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів.
ББК
УДК
|
|
© Чернівецький національний університет, 2013 |
ПЕРЕДМОВА
Лабораторні заняття є однією з важливих ланок навчального процесу, де студенти одержують навички експериментальної роботи, вміння працювати з приладами, самостійно аналізувати дані і робити висновки, тим самим глибше й повніше засвоюючи теоретичний матеріал дисципліни.
Кінетика та термодинаміка біологічних процесів
Лабораторна робота „Визначення стандартної вільної енергії і константи рівноваги хімічної реакції”
Перебіг хімічної реакції визначається величиною зміни вільної енергії ∆G, яка є різницею між значеннями внутрішніх вільних енергій молекул продукту та вихідних речовин. Якщо вільна енергія у вихідних речовин вища, ніж у продуктів (∆G негативне), то можливе самовільне протікання реакції (екзергонічна реакція). Якщо навпаки (∆G позитивне) – самовільний перебіг реакції неможливий (реакція ендергонічна).
Варто розрізняти поняття зміни вільної енергії ∆G і зміни стандартної вільної енергії ∆G°. Величина ∆G чисельно дорівнює величині ∆G° лише у випадку 1М концентрації вихідних речовин і продуктів реакції та стандартних умов проходження реакції. Отже, якщо за позитивного значення величини ∆G реакція термодинамічно неможлива, то при ∆G°>0 реакція все ж може відбуватись за умови такого співвідношення концентрацій вихідних речовин і продуктів, при якому ∆G буде негативним. Відрізнятися такі реакції будуть напрямком перебігу. Так, якщо ∆G°<0, рівновага хімічної реакції буде зсунута в бік прямої реакції (праворуч відповідно до рівняння реакції), якщо ∆G°>0 – у бік зворотної реакції.
Згідно з формулою Вант-Гоффа ∆G°= – RTlnKр.
Таким чином, чим більша константа рівноваги реакції, тим більш від‘ємне значення стандартної вільної енергії.
В даній лабораторній роботі визначається константа рівноваги Kр реакції молочної кислоти СН3-СНОН-СООН (Н2Лакт) з тривалентним залізом Fe3+ та за її величиною розраховується зміна стандартної вільної енергії ∆G°.
Fe3+ + nH2Лакт ↔ Fe(НЛакт)n3-n + nH+
Щоб знайти Kр необхідно знати рівноважні концентрації вільної Н2Лакт, комплексу Fe(НЛакт)n3-n , незакомплексованого заліза та координаційне число n. Координаційне число n визначається, виходячи з константи нестійкості комплексу Fe(НЛакт)n3-n
Якщо останню формулу прологарифмувати та на осі ординат відкласти , а на осі абсцис lg[НЛакт], тоді тангенс кута нахилу одержаної прямої при однаковому масштабі чисельно буде дорівнювати n. Концентрація речовин визначається за допомогою фотоколориметра або спектрофотометра.
Матеріали та методи: фотоколориметр, розчини молочної кислоти та FeCl3, буферний розчин з рН 2, колби на 25 мл.
Завдання 1. Визначення константи рівноваги Kр
Одержати криву залежності оптичної густини від загальної еконцентрації молочної кислоти при постійній концентрації Fe3+ і постійному рН.
До 1 мл 0,012 моль/л розчину тривалентного заліза, налитого в колбу на 25 мл, додати певну кількість молочної кислоти Н2Лакт (згідно з табл.) і розбавити розчин буфером. Розчин перемішати та виміряти оптичну густину Dx на ФЕК при λ=520 нм і в кюветі товщиною 20 мм. Тримані значення занести до таблиці.
Залежність оптичної густини Dx розчинів лактату заліза (рН 2) від концентрації молочної кислоти
|
№ |
0,1 М Н2Лакт, мл |
[L]/100 моль/л |
Dx |
∆D |
Dx/∆D |
- lg[L] |
lg Dx/∆D |
|
1 |
0,1 |
||||||
|
2 |
0,5 |
||||||
|
3 |
1,0 |
||||||
|
4 |
2,0 |
||||||
|
5 |
5,0 |
||||||
|
6 |
6,0 |
||||||
|
7 |
10,0 |
||||||
|
8 |
15,0 |
||||||
|
9 |
17,0 |
||||||
|
10 |
20,0 |
Примітка: Н2Лакт позначено [L], D0- Dx позначено ∆D
На базі даних таблиці побудувати графік залежності оптичної густини Dx від концентрації молочної кислоти [L]/100.
Оптичну густину розчину при досягненні горизонтальної ділянки кривої на графіку визначити як D0.
Далі за отриманими значеннями Dx та D0 виконати необхідні обчислення і результати занести у таблицю.
Побудувати графік залежності lg Dx/∆D від lg[L]. З нахилу цієї лінійної залежності знайти величину координаційного числа n = tg α.
Враховуємо, що рН = 2, тобто [H+]=10-2.
, де Сзаг – загальна концентрація молочної кислоти для даної величини Dx.
Завдання 2. Визначення зміни стандартної вільної енергії за константою рівноваги.
За обрахованою в попередньому завданні величиною константи рівноваги згідно формулт Вант-Гоффа ∆G°= – RTlnKр.визначити зміну стандартної вільної енергії реакції.
Контрольні запитання
1. Охарактеризуйте енергетичні передумови можливості проходження хімічної реакції в живій клітині.
2. Вкажіть фізичний зміст величини стандартної вільної енергії утворення речовини.
3. Поясніть різницю між поняттями «зміна вільної енергії ∆G» і «зміна стандартної вільної енергії ∆G°».
4. Що таке константа рівноваги реакції і як її обрахувати?
5. Як за допомогою величини константи рівноваги обрахувати значення зміни стандартної вільної енергії реакції?
Лабораторна робота
«Дослідження кінетики гідролітичного розщеплення сахарози поляриметричним методом»
Процес інверсії сахарози виникає при гідролітичному розщепленні її на глюкозу та фруктозу
С12Н22О11 + Н2О → С6Н12О6 + С6Н12О6
Ця реакція є бімолекулярною, її швидкість можна розрахувати за рівнянням:
V= – dc/dt=kcc1,
де с – концентрація сахарози, с1– концентрація Н2О. Оскільки гідроліз проходить у воді, концентрація якої набагато вища від концентрації сахарози, то без великох похибки можна вважати с1=const. Тому рівняння набуває вигляду:
V= – dc/dt=kc,
тобто швидкість гідролізу залежить практично лише від концентрації сахарози. Ця реакція проходить як реакція першого порядку. Такого типу реакції називаються псевдомолекулярними.
Швидкість гідролітичного розщеплення сахарози в лужному або нейтральному середовищі дуже мала. При зростанні концентрації водневих іонів (рН<7) швидкість реакції зростає, стає доступною для спостереження. оскільки сахароза та її продукти належать до оптично активних речовин, тобто речовин, що змінюють положення площини поляризації світла, то за ходом реакції можна спостерігати за допомогою напівтіньового поляриметра.
Сахароза обертає площину поляризації праворуч ([α]D=66,55º), а суміш продуктів гідролізу – ліворуч (глюкоза – праворуч, [α]гл=52,5º, а фруктоза – ліворуч, [α]фр= - 91,9º). Тому в ході інверсії кут обертання площини поляризації зменшується до нуля, а потім стає від‘ємним. Постійне в часі від‘ємне значення кута α∞ відповідає закінченню реакції.
Матеріали та обладнання: напівтіньовий поляриметр, ультратермостат, колби на 100 мл, мірний циліндр на 50 мл, соляна кислота, сахароза, піпетки, фільтрувальний папір.
Завдання 1. Визначення константи швидкості інверсії сахарози
Перед початком дослідження встановити нульову точку поляриметра. Кювету заповнюють дистильованою водою, накладають захисне скло, встановлюючи збоку так, щоб у трубку не зайшли бульбашки повітря, і щільно закручують. Повертанням диска добитись рівномірного затінення поля зору і зафіксувати показник.
100 мл 20% розчину сахарози розлити порівну по 50 мл у дві колби на 100 мл. В одну з колб додати 50 мл 6н соляної кислоти, перемішати і поставити у термостат при Т=313 К на 3-4 год. У другу колбу влити розчин соляної кислоти заданої (довільної) концентрації. Момент змішування сахарози з кислотою відмітити секундоміром як початок реакції. Суміш перемішати, швидко залити в поляриметричну кювету, попередньо промивши її досліджуваним розчином. Кювету розмістити в жолобку поляриметра. Поле зору змінюється появою темної смуги. Далі обертати аналізатор до досягнення рівномірного затінення та зафіксувати кут.
Показники знімати через кожні 3 хв. (всього 10-15 вимірювань). Фіксувати час вимірювання. Кути обертання за фіксовані інтервали часу t позначати як αt. Після закінчення визначити кут обертання α∞, який відповідає закінченню реакції. Для цього залити в кювету доведений до температури досліду розчин 20% сахарози в 6н соляній кислоті, який перебував у термостаті. Відлік провести одразу та через 30 хв. Якщо кут обертання при цьому не змінився, то прийняти його за α∞.
Результати занести у таблицю:
|
№ |
Час вимірювання, с |
Інтервал часу від початку реакції, с |
αt |
α0 –α∞ |
αt–α∞ |
Константа швидкості К |
|
1 |
||||||
|
2 |
||||||
|
3 |
||||||
|
4 |
||||||
|
5 |
За результатами досліду вираховуємо константу швидкості реакції при даній температурі для кожного моменту часу за формулою:
У зв‘язку з тим, що кут обертання площини поляризації пропорційний концентрації речовини, у попередній формулі концентрації замінюємо різницями кутів обертання. Одержуємо:
Кут α0 , який відповідає початку реакції, визначити важко, оскільки від початку реакції до самого вимірювання проходить певний час. Тому на міліметровому папері будують графік у координатах lg(αt-α∞)=f(t), екстраполяцією отриманої лінії до t=0 визначають lg(αt-α∞), а потім знаходять α0.
Розрахувати значення константи швидкості реакції для кожного моменту часу, вирахувати середнє значення К сер.
Завдання 2. Визначення енергії активації процесу
Величину енергії активації визначити методом розрахунку даних залежності константи швидкості від температури, які отримані експериментально за рівнянням Арреніуса. Дослід провести при двох температурах. побудувати графік залежності ln K від 1/Т. За тангенсом кута нахилу прямої визначити енергію активації.
З графіка знаходимо:
Ea= – Rtg α
Контрольні запитання
1. Що таке константа швидкості реакції та енергія активації? За якими формулами їх можна обрахувати?
2. Чому визначення швидкості гідролізу сахарози можна визначати поляриметричним методом?
3. Опишіть принцип роботи поляриметра.
4. Які Ви знаєте оптично активні речовини і чим обумовлена оптична активність?
5. Опишіть графічний метод, згідно з яким можна обчислити енергію активації реакції в живій клітині.
6. Як залежить енергія активації від температури?
Лабораторна робота
«Визначення температурного коефіцієнту та енергії активації реакції розкладу пероксиду водню каталазою»
Швидкість реакції зростає з підвищенням температури. Найсуттєвішим фактором, який визначає характер впливу температури на швидкість реакції, є кінетична енергія реагентів. Добре відоме емпіричне правило Вант-Гоффа, згідно з яким при підвищенні температури на 10 градусів швидкість реакціїх зростає у 2-3 рази. Відношення сталих швидкостей реакцій при двох температурах, які відрізняються на 10 градусів, позначають Q10 і називають температурним коефіцієнтом швидкості реакції:
Енергією активації називається кількість енергії, яка необхідна для переводу при даній температурі усіх молекул одного моля речовини в активований стан. Чим вища енергія активації, тим повільніше іде хімічна реакція.
Між величиною температурного коефіцієнта реакції та енергією активації існує залежність, яку можна виразити формулою:
Еа=0,46·Т1·Т2·lgQ10
Даною формулою користуються для розрахунку енергії активації біологічних процесів, в тому числі секреції залоз, пульсації скоротливих вакуолей, скорочення м‘язів тощо.
Матеріали і обладнання: газометричний прилад для визначення активності каталази, ступка,секундомір, термостат, рослини, вага, крейда, ножиці, піпетки, пероксид водню.
Хід роботи:
Наважку рослинного матеріалу (1-2г) розтирають у фарфоровій ступці з крейдою для створення слабо лужної реакції, яка є оптимальною для каталази. Розтертий матеріал переносять у каталазник, ступку промивають невеликою кількістю води (загальний об’єм – 10-15 мл), яку зливають у каталазник з рослинним матеріалом. У вставну склянку вносять 5 мл 3% пероксиду водню. Каталазник з’єднують з гумовою трубкою з бюреткою так, щоб передчасно не змішувались рідини в каталазнику і перевіряють герметичність приладу. Для цього опускають скляну грушу вниз до певноготрівня і слідкують за рівнем води у бюретці Якщо він стає вищим від рівня води в скляній груші, то це вказує на герметичність приладу.
Далі відкривають затискач, встановлюють рівень води в бюретці на нуль і закривають затискач. Одночасно вмикають секундомір і змішують пероксид водню з екстрактом різким струшуванням протягом 10 с. Через 1-3 хв. знімають показники приладу по бюретці в мл виділеного кисню. Знову струшують каталазник 10 с. Через наступні 1-3 хв. також знімають показники. Операцію повторюють 5 разів протягом 15 хв.
Аналогічну операцію проводять і при температурі, яка відрізняється на 10 градусів в той чи інший бік. При цьому беруть точну наважку матеріалу, об’єм води і пероксиду водню Отримані дані заносять у таблицю.
Будують криві для двох температур на одному графіку, відкладаючи по осі ординат об’єм виділеного кисню за певний час, а по осі абсцис – час у хвилинах. Розраховують температурний коефіцієнт і енергію активації
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Визначення константи дисоціації і рК амінокислоти гліцину»
Кислоти – це донори протонів, основи – акцептори протонів. рівняння дисоціації молекули може бути зображене у вигляді НА↔ Н+ + А-
У цьому разі НА і А- складають спряжену пару; НА є спряженою кислотою (донор протонів), а А- - спряженою основою (акцептор протонів).
Константа дисоціації речовини НА запишеться як:
К=[ Н+] [А-] / [HA]. Звідси:
[ Н+]=К[ НА]/ [А-]
Прологарифмувавши цей вираз, отримуємо рівняння Гендерсона-Хассельбаха для розрахунку рН
рН=рК + lg ([А-]/[HA])
З цього рівняння видно, що рК – це те значення рН, за якого концентрація кислоти дорівнює концентрації основи, [HA]= [А-]. Силу кислоти характеризують величиною рК (для сильних кислот величини рК від‘ємні). Наприклад, для соляної кислоти К=103 та рК=-3, а, наприклад, для слабкої кислоти НNO2 К=4·10-4 та рК=3,4.
Амінокислоти містять принаймні дві групи, здатні до дисоціації, відповідно мають два значення рК. Значення рН ізоелектричної точки знаходять за формулою:
рНі=1/2(рК1 + рК2)
Матеріали і обладнання: 0,1 н розчин гліцину, 0,1 н КОН та HCl мірні піпетки, склянки на 50 мл, рН-метр.
Завдання 1 Побудова кривої тирування гліцину
Підготувати рН-метр до роботи. В склянку набрати 20 мл 0,1н розчину гліцину. Виміряти його рН. Протитрувати цей розчин 0,1 н КОН. Для цього в склянку додати 0,5 мл лугу. Суміш перемішати скляною паличкою й виміряти рН. Операцію повторити, щоразу доливаючи до розчину гліцину 0,5 мл лугу. Після четвертого вимірювання об’єм лугу збільшити до 2 мл. Титрування зупинити після того, як об’єм прибавленого лугу буде дорівнювати початковому об’єму гліцину (20 мл).
У склянку набрати дистильованої води і відмити електроди. Набрати нову порцію амінокислоти (20 мл). Розчин протитрувати 0,1 н HCl. Результати обох титрувань занести до таблиці.
Еквівалент доданої килоти (чи лугу) визначають як відношення суми об‘ємів доданої кислоти (лугу) до початкового об‘єму гліцину.
|
№ |
Об‘єм доданого КОН |
Сума об‘ємів доданого КОН |
Еквівалент доданого КОН |
рН розчину |
|
1 |
0 |
0 |
0 |
|
|
2 |
0,5 |
0,5 |
0,025 |
|
|
3 |
0,5 |
1 |
0,05 |
|
|
4 |
0,5 |
1,5 |
0,075 |
|
|
5 |
0,5 |
2 |
0,1 |
|
|
6 |
2 |
4 |
0,2 |
Аналогічну таблицю будують для запису результатів титрування кислотою.
Завдання 2 Визначення константи дисоціації гліцину
Згідно результатів попереднього завдання побудуйте графік титрування. З графіка знайдіть значення рКа1 та рКа2 проекції точок перегину кривої на шкалу рН. Розрахуйте константу дисоціації гліцину.
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Визначення в’язкості розчинів»
Матеріали та методи: термостат, віскозиметр Оствальда, віскозиметр ВК-4, секундомір, розчини гліцерину, сахарози, альбуміну, плазма крові.
Завдання 1. Визначення відносної та питомої в’язкості гліцерину і сахарози
За допомогою віскозиметра Оствальда визначте час витікання дистильованої води (контроль) при 293 К. Аналогічне визначення проведіть для 20% гліцерину та 20% сахарози. Розрахуйте відносну і питому в’язкість для вказаних розчинів.
Завдання 2. Визначення характеристичної в’язкості
Приготуйте розчини сахарози концентрацій 20, 30, 40 і 50%. Для контролю візьміть дистильовану воду. Визначте відносну, питому, приведену в’язкості. Для кожної концентрації зробіть не менше трьох вимірів. Результати занесіть у таблицю. Побудуйте графік залежності приведеної в’язкості від концентрації і визначте характеристичну в’язкість.
Завдання 3 Визначення впливу температури на в’язкість розчинів
Визначте питому в’язкість для 20% сахарози при таких фіксованих температурах: 293, 298, 308, 312 К. Побудуйте графік залежності питомої в’язкості від температури.
Завдання 4 Визначення молекулярної маси білків віскози метричним способом
Приготувати розчини сироваткового альбуміну у концентраціях 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 мг/мл. Визначте для цього білка характеристичну в’язкість при 293 К. Розрахуйте молекулярну масу, маючи на увазі, що цей білок являє собою впорядковану глобулярну структуру, для якої α=1,7 і К=5∙10-5.
Завдання 5 Визначення в’язкості плазми крові
Кров стабілізують цитратом натрію, центрифугують 10 хв. при 3000 об/хв. і відділяють плазму. У віскозиметр втягують дистильовану воду і плазму до мітки 0, визначають в’язкість. Для кожного визначення проводять по 5-6 вимірювань і вираховують середнє арифметичне з усіх отриманих значень.
Контрольні запитання
Лабораторна робота
«Визначення поверхневого натягу методом Дю Нуї»
Матеріали та обладнання: торсійні ваги, універсальний штатив, платинове кільцегодинникове скло, спиртівка, піпетки на 1-2 мл, фізіологічний розчин, рінгерівський розчин, 0,1% розчин олеату натрію, етиловий спирт, ацетон, скипидар, бензол, гліцерин, екстракти рослин.
Завдання 1 Визначення коефіцієнта поверхневого натягу води й константи кільця
Визначити поверхневий натяг дистильованої води. Константу кільця обчислити, виходячи з відомих коефіцієнтів поверхневого натягу дистильованої води й етилового спирту та вимірювань сили відриву від цих рідин.
Завдання 2 Визначення поверхневого натягу різних рідин
Визначити поверхневий натяг ацетону, бензолу, гліцерину, скипидару. Для кожного визначення беруть чисте годинникове скло, а платинове кільце прожарюють.
Завдання 3 Вивчення впливу поверхнево-активних речовин на поверхневий натяг розчину Рінгера
Налити 0,5 мл розчину Рінгера на годинникове скло, визначити 2 рази з інтервалом 5 хв. поверхневий натяг. Далі додавати до розчину одну краплю 0,1% розчину олеату натрію і визначати силу відриву відразу після додавання через 1, 5, 10, 15 і 20 хв. Обчисліть величину коефіцієнта поверхневого натягу та побудуйте графік зміни в часі цієї величини.
Завдання 4 Визначення поверхневого натягу водної витяжки рослин
Проростки або листя рослин (1-2 г) розтирають у фарфоровій ступці, доливають 10-15 мл дистильованої води (або буферний розчин з рН 7,0) і фільтрують через паперовий фільтр. З фільтрату відбирають 0,5 мл, поміщають на годинникове скло й визначають силу відриву кільця. Повторюють визначення через кожні 5 хв. протягом 30 хв. Аналогічні вимірювання проводять з витяжкою рослин, які попередньо зазнали впливу високих і низьких температур.
Контрольні запитання
Лабораторна робота
«Фізико-хімічні характеристики ліпідних моношарів. Визначення розміру молекул за допомогою моношарів»
Матеріали і обладнання: віск, тальк, пластмасова ванночка, дрібне сито, мікробюретки, мірні колби на 50-100 мл, бензол, олеїнова кислота, лінійка.
Стінки ванночки покрити воском або парафіном та заповнити дистильованою водою. З цупкого паперу вирізати дві смуги шириною 10-15 мм і довжиною, більшою ніж ширина ванночки. Смуги паперу також покривають воском. Дві смуги кладуть на поверхню води на відстані 3-5 см, згинаючи кінці так, щоб вони легко могли пересуватись по стінках ванночки. Між смугами паперу на поверхню води через дрібне сито насипають тальк. Смугу, ближчу до середини, забирають. Край тальку є межею мономолекулярної плівки досліджуваної речовини. Біля краю ванночки на протилежному від смуги боці встановлюють бюретку з досліджуваною речовиною і виливають на поверхню деяку кількість досліджуваного розчину. Обережно рухають смуги паперу вздовж ванночки – папір рухає тальк і стискає мономолекулярну плівку. Стиснений шар штовхає тальк зі смугою паперу назад, щоб зайняти максимальну поверхню води. У цю мить вимірюють площу, яку займає моно шар.
Завдання 1 Визначення довжини й площини поперечного перерізу молекул олеїнової кислоти
Приготувати розчин 0,001% олеїнової кислоти в бензолі. На поверхню води у ванночку вилити 0,3 мл розчину олеїнової кислоти і за допомогою лінійки виміряти довжину і ширину моно шару. Ванночку ретельно промити і знову заповнити дистильованою водою, вилина на поверхню 0,4 мл і знову виміряти розміри моно шару. Такі ж вимірювання провести для 0,5 мл.
З цих трьох дослідів зробити розрахунки довжини (нм) і площини (нм2) молекули олеїнової кислоти. Підставляючи цифрові дані, спочатку обчисліть об’єм олеїнової кислоти в 0,3-0,5 мл 0,001% розчину цієї кислоти. Визначити відносну похибку отриманих величин.
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Дослідження набухання тканин»
Матеріали та обладнання: ваги торсійні, бюкси, вата, фізіологічний розчин, фосфатний буфер, 0,1 н розчини HCl та NaOH, відпрепаровані тканини і органи щурів.
Завдання 1 Дослідження набухання різних тканин ваговим методом
З відпрепарованих шматочків тканини приготувати приблизно однакові наважки по 200 мг. Кожний шматочок тканини поміщають в окремий бюкс з рідиною, в якій він має набухати. Розчин повинен покривати шматочок тканини повністю. Через 5 хв тканину зважують, попередньо осушивши фільтрувальним папером. Зважування припиняють, коли результати двох останніх вимірювань стануть однаковими. Результати заносять до таблиці.
Завдання 2 Вплив активної реакції розчину на набухання м’язової тканини.
Приготувати розчини фосфатного буфера з рН 5,2, 7,1 і 8,0. Додати по 1 мл розчину буфера до 9 мл фізіологічного розчину.
Дослід проводити способом, описаним вище, використовуючи чотири шматочки м’яза, один з яких помістити в фізіологічний розчин, а інші, відповідно, у розчини з додаванням фосфатного буфера.
Завдання 3 Дослідження впливу кислоти та лугу на набухання м’язової тканини
Для досліду взяти три шматочки м’яза. Один помістити у фізіологічний розчин, другий – у фізрозчин з додаванням HCl, третій – з додаванням NaOH. Отримані дані занести у таблицю. Крім того, результати кожного з цих дослідів оформлюють у вигляді графіку, де по осі абсцис відкладають час, а по осі ординат – масу тканини у відсотках до вихідної.
Завдання 4 Вивчення впливу іонів кальцію на величину набухання скелетного м’яза
Чотири шматочки м’яза поміщають в бюкси, один з яких містить фізіологічний розчин, а три інших – фізрозчин з додаванням відповідно 0,1 мо, 0,2 мл та 0,3 мл 10% CaCl2. Дані занести у таблицю.
Завдання 5 Дослідження набухання тканин у гіпо- та гіпертонічних розчинах
Для роботи приготувати наступні розчини NaCl - гіпотонічний розчин (0,4%), ізотонічний (0,9%) та гіпертонічний (1%). Простежити набухання скелетного м’яза й печінки в цих розчинах. Дані заносять у таблицю й оформлюють у вигляді графіка.
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Дослідження стійкості мембран еритроцитів до дії гемолітичних факторів»
Еритроцити є зручною моделлю для дослідження стійкості мембран під впливом зовнішніх факторів (іонний склад, температура, поверхнево-активні речовини тощо).
Гемолізом називають руйнування плазматичної мембрани еритроцитів, що супроводжується виходом з них гемоглобіну в плазму крові, яка при цьому забарвлюється в червоний колір і стає прозорою («лакова кров»). Руйнування еритроцитів може бути спричинено зменшенням осмотичного тиску, що спочатку призводить до набухання, а потім до руйнування еритроцитів – осмотичний гемоліз. Мірою осмотичної стійкості (резистентності) еритроцитів є концентрація NaCl, при якій починається гемоліз. У розчині 0,34 % NaCl руйнуються всі еритроцити. Під час деяких захворювань осмотична стійкість еритроцитів зменшується і гемоліз відбувається при високих концентраціях NaCl у плазмі.
Хімічний гемоліз відбувається за дії речовин (ефір, хлороформ, спирти, бензол, жовчні кислоти, сапонін тощо), що руйнують білково-ліпідну мембрану еритроцитів; механічний виникає при сильних механічних впливах на кров, термічний – при заморожуванні і розморожуванні крові, біологічний – при переливанні несумісної крові, за дії імунних гемо лізинів тощо.
Внутрішньоклітинний гемоліз відбувається всередині клітин ретикулоендотеліальної системи, головним чином, в селезінці, а внутрішньосудинний – у циркулюючій крові.
Гемолітична стійкість еритроцитів визначається їх віком. Молоді еритроцити, які виходять з кісткового мозку, є малостійкими (1 група стійкості). Старіння еритроцитів у кров‘яному руслі виражається поступовим зменшенням їхньої стійкості до гемолітичних речовин у порівнянні зі зрілими еритроцитами. Крива розподілу еритроцитів за стійкістю називається еритрограмою. Форма еритрограми дозволяє визначити кількість еритроцитів кожного віку (певної стійкості) у момент дослідження.
Метод побудови еритрограм. суть методу полягає у фото колориметричному вимірюванні динаміки руйнування еритроцитів за дії гемолітичної речовини (соляної кислоти). Критерієм стану еритроцитів слугує їхня здатність до гемолізу. Час дії соляної кислоти є виміром стійкості еритроцитів. Реакція гемолізу протікає при постійній температурі та постійній концентрації соляної кислоти.
Під час руйнування еритроцитів в процесі гемолізу відбувається зменшення мутності суспензії, а відповідно і збільшення світло пропускання. Розчин стає прозорішим. Зміна пропускання світла суспензією еритроцитів або зміна оптичної густини є мірою гемолізу. Щоб поглинання гемоглобіну не заважало вимірюванню світлорозсіювання, визначення гемолізу проводять із червоним світлофільтром, тобто у спектральній області, де гемоглобін не поглинає, і всі зміни світло пропускання зв‘язані виключно із зміною прозорості розчину суспензії. У результаті буде отримано ряд значень оптичної густини, які зменшуються і кожне з них відповідає ступеню гемолізу в момент вимірювання. Це зменшення оптичної густини в часі характеризує зменшення кількості еритроцитів під впливом гемолітичної речовини. Зменшення спостерігається, поки не зруйнуються останні еритроцити. Тривалість гемолізу еритроцитів крові ссавців у даних умовах досліду досягає, як правило, 10-20 хв. За різних впливів на еритроцити будуть спостерігатись зсуви еритрограм, що певним чином характеризуватиме ці впливи.
Матеріали і методи: фотоколориметр, пробірки, фізіологічний розчин, 0,004 н соляна кислота.
Завдання 1. Реєстрація еритрограм.
Приготувати суспензію еритроцитів у фізіологічному розчині. Кров з антикоагулянтом центрифугують при 3 тис. обертів, відокремлюють осад еритроцитів. Отримані еритроцити промивають подвійним чи потрійним об‘ємом фізрозчину і знову центрифугують (процедуру повторюють 2-3 рази). Еритроцитарна суспензія готова до фото колориметричного дослідження гемолізу.
Для вимірювання оптичної густини еритроцитів спочатку розводять їх до стандартної концентрації фізрозчином, контролюючи розведення за допомогою ФЕК. 2 мл розчину стандартної концентрації наливають у робочу кювету. Набирають піпеткою 2 мл соляної кислоти і вносять у кювету, швидко перемішуючи скляною паличкою, включають секундомір. Через кожні 30 с реєструють значення оптичної густини D. Якщо протягом двох 30-секундних інтервалів значення не змінюються, це свідчить про завершення гемолізу. Значення оптичної густини заносять у графу 3.
За початкову оптичну густину D0 , беруть ту, якій відповідає мінімальне значення ∆D. Цій D0 відповідає початок гемолізу еритроцитів. Різницю оптичної густини ∆D за 30-секундний інтервал відмічають у графі 4.
|
Стадія гемолізу |
Час гемолізу, хв. |
Оптична густина D |
Різниця ∆D |
∆D, % |
∆D, ∑% |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
0 |
|||||
|
0,5 |
|||||
|
1,0 … |
Розподіл еритроцитів за стійкістю подається у відсотках (графа 5). За 100% береться різниця ∆Dмакс між оптичною густиною D0 і оптичною густиною Dг після закінчення гемолізу. Відсотковий розподіл еритроцитів за їх стійкістю зображають графічно у відсотках різниці оптичної густини (∆D/∆Dмакс∙100% або відсотках еритроцитів (%Е) залежно від часу гемолізу. Ця крива називається еритрограмою.
Еритрограма (графа 5) є диференціальною кривою залежності D=f(t) (графа 3). Зростаючі відсотки гемолізу розраховують, знаходячи суму відсотків ∆D (∑%∆D) (графа 6). До кінця гемолізу ∑%∆D досягає 100% з допустимим відхиленням 100±1%.
Завдання 2 Вивчення впливу Ca2+ на гемоліз еритроцитів
Дослідити стійкість еритроцитів у присутності іонів кальцію. Для цього слід додати 10 ммоль/л CaCl2 і зняти еритрограму.
Лабораторна робота
«Дослідження електропровідності рідин біологічного походження»
Електропровідність біологічних систем – здатність живих тканин і організмів пропускати електричний струм. Зумовлюється наявністю в клітинах і міжклітинних просторах іонів, і, в меншій мірі, заряджених молекул. Основний внесок в електропровідність біотканин вносять такі середовища як кров, лімфа, міжклітинна і внутрішньоклітинна рідини. Провідність для цих середовищ організму знаходиться в діапазоні 0,1 –2,0 [См/м]. Електропровідність органів на 2-5 порядків нижча, ніж провідність біологічних рідин, що визначається наявністю мембран з відносно високим опором.
Тканини характеризуються певними величинами електропровідності, зміни яких є показниками фізіологічного стану тканин. Метод визначення електропровідності використовується в біології для характеристики властивостей живого й вивчення змін, пов‘язаних з порушенням фізіологічних процесів.
Матеріали та обладнання: кондуктометр, 0,01%, 0,05%, 0,15%-розчини NaCl та CaCl2, буферні розчини з рН 3, 7, 9, суспензія еритроцитів, плазма крові, фруктовий сік, мед, молоко, водяна баня, мірні циліндри, піпетки, фільтрувальний папір.
Завдання 1. Вивчення впливу концентрації електролітів на величину електропровідності.
Заміряти величину електропровідності для трьох концентрацій (0,01%, 0,05%, 0,15%-розчини) NaCl та CaCl2. Результати досліджень оформити у вигляді графіку, де по осі абсцис відкласти значення концентрацій, а по осі ординат – значення електропровідності.
Завдання 2. Вивчення впливу температури на величину електропровідності.
Заміряти величину електропровідності 0,05% NaCl за різних температур (20°С, 30°С, 40°С). Результати досліджень оформити у вигляді графіку, де по осі абсцис відкласти значення температур, а по осі ординат – значення електропровідності.
Завдання 3. Вивчення впливу рН розчину на величину електропровідності.
Заміряти величину електропровідності за різних рН розчину (рН 3, 7 та 9). Результати досліджень оформити у вигляді графіку, де по осі абсцис відкласти значення рН, а по осі ординат – значення електропровідності.
Завдання 4. Визначення електропровідності різних рідин біологічного походження.
Заміряти величину електропровідності плазми крові, суспензії еритроцитів, суспензії дріжджів, фруктового соку, меду, молока. Результати занести у таблицю.
Контрольні запитання
Лабораторна робота
«Визначення редокс-потенціалу рідин біологічного походження»
В основі біологічного окиснення лежать окисно-відновні реакції, у процесі яких відбувається перенесення електронів від однієї молекули до іншої. Окисники й відновники завжди функціонують як спряжені окисно-відновні пари (редокс-пари).
Існує 4 способи передачі електронів від однієї молекули до іншої: пряме перенесення електронів; перенесення електронів за участю атомів водню; перенесення електронів від донора до акцептора у формі гідрид-іона (Н-), що несе два електрони; перенесення шляхом взаємодії органічного відновника з киснем. Усі чотири способи перенесення електронів мають місце в живих клітинах.
Спорідненість з електронами визначається через окисно-відновний потенціал (редокс-потенціал). Від‘ємний редокс-потенціал означає низьку спорідненість з електронами, додатний – високу. Наприклад, ОВП цитоплазми амеби в умовах анаеробіозу становить приблизно -0,275 В, а при аеробіозі +0,070 В. Це різниця потенціалів, яка створюється в процесі окисно-відновної реакції перенесення електронів від відновника до оксиника й характеризує дане електролітичне середовище.
Редокс-потенціал, що виникає на електроді, зануреному в окисно-відновну систему, залежить від природи системи і співвідношення окисненої та відновленої форм. Кожна редокс-система характеризується відповідним співвідношенням активностей окисненої та відновленої форм (ox-red). При високих співвідношеннях ox-red система буде функціонувати як окисник або акцептор, а при низьких – як відновник, або донор електронів.
Здатність будь-якої спряженої редокс-пари оборотно віддавати електрони кількісно характеризується за допомогою стандартного окисно-відновного потенціалу Е0. Його величина характеризує окисно-відновні властивості системи, визначає її здатність приймати чи віддавати електрони і використовується для порівняння окисно-відновних систем. Стандартний редокс-потенціал дорівнює електрорушійній силі у вольтах, що виникає в на півелементі, в якому донор електронів і спряжений з ним акцептор електронів у концентраціях 1 моль/л при 25°Сі рН 7,0 перебувають у рівновазі з електродом, здатним приймати електрони від донора й передавати їх акцептору.
В експерименті величину редокс-потенціалу Е визначають потенціометричним методом. При цьому вимірюється електрорушійна сила ланцюга, що складається з електрода вимірювання і електрода порівняння
Завдання 1 Вимірювання окисно-відновного потенціалу суспензії дріжджів.
Заміряти окисно-відновний потенціал води. Приготувати суспензію дріжджів (0,5 г сухих дріжджів, 100 мл H2O, 5 г сахарози), провести визначення ОВП. При постійному нагріванні суспензії дріжджів (35-40º C) заміряти ОВП через кожні 5 хвилин експерименту. Результати досліджень оформити у вигляді графіку, де по осі абсцис відкласти значення часу, а по осі ординат – значення редокс-потенціалу.
Завдання 2. Визначення окисно-відновного потенціалу різних рідин біологічного походження.
Заміряти величину окисно-відновного потенціалу наданих рідин: плазми крові, суспензії еритроцитів, бактеріальної суспензії, фруктового соку, меду, молока тощо. Результати занести у таблицю.
Контрольні запитання
Лабораторна робота
«Концентраційна колориметрія»
Матеріали та обладнання: колориметр фотоелектричний концентраційний, кювети, розчини досліджуваних речовин різних концентрацій.
Завдання 1 Вибір світлофільтра з ефективною довжиною хвилі
Налити розчин у кювету і визначити оптичну густину для всіх світлофільтрів. За отриманими результатами побудувати графік, відкладаючи по горизонталі довжини хвиль, що відповідають максимуму коефіцієнта пропускання світлофільтрів, а по вертикалі – відповідні значення оптичної густини розчину. Позначити ту ділянку кривої, для якої виконуються такі умови: оптична густина має максимальну величину, хід кривої майже паралельний горизонтальній осі, тобто оптична густина мало залежить від довжини хвилі.
Завдання 2 Вибір кювети
Попередній відбір кювет здійснюється візуально, відповідно інтенсивності забарвлення розчину. Якщо розчин інтенсивно забарвлений, слід користуватись кюветами з малою робочою довжиною (1-3 мм). У випадку слабо забарвлених розчинів рекомендують працювати з більшими кюветами (30-100 мм).
У попередньо підібрану кювету налити розчин і виміряти його оптичну густину. Якщо отримане значення складає близько 0,3-0,5 – вибрати дану кювету з цим розчином. У випадку невиконання цієї умови слід випробувати іншу кювету. Якщо величина більша 0,5-0,6, беруть кювету меншої робочої довжини, якщо менша 0,3-0,2 – більшою.
Завдання 3 Побудова градуйованої кривої для розчину
Приготувати ряд розчинів даної речовини з відповідними концентраціями. Виміряти оптичну густину всіх розчинів і побудувати криву, відкладаючи по осі х концентрації, а по осі у – значення оптичної густини.
Завдання 4 Визначення концентрації речовини у розчині
За градуйованою кривою визначити невідому концентрацію речовини у досліджуваних розчинах. Для цього розчин налити в ту ж кювету, для якої побудована градуйована крива і, поставивши той самий світлофільтр, визначити оптичну густину розчину. Потім за градуйованою кривою знайти концентрацію, що відповідає виміряному значенню оптичної густини.
Завдання 5 Кількісне визначення рослинних пігментів
Зважити 0,5-1 г листків, подрібнити ножицями і розтерти в фарфоровій ступці, куди для попередження феофетинізації необхідно додати невелику кількість крейди. Препарат розтерти з декількома мл 80% ацетону. Екстракт фільтрують.
Готують ряд розведень розчину хлорофілу відомої концентрації (20, 10, 5, 2 та 1 мг/мл). За калібрувальною кривою, отриманою для даних розведень, визначити кількість пігменту у витяжці.
Вимірювання проводити в кюветі товщиною 1 см з використанням червоного світлофільтра. Контроль – 80% ацетон..
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Вимірювання спектрів поглинання амінокислот і білків»
Матеріали та обладнання: спектрофотометр, розчини ароматичних амінокислот тирозину й триптофану, розчини білків (трипсин, рибонуклеаза)
Завдання 1 Вимірювання спектрів поглинання ароматичних амінокислот
Приготувати розчини у воді триптофану 0,0147 мг/мл, тирозину 0,053 мг/мл і фенілаланіну (0,352 мг/мл) і зняти їх спектри поглинання в області від 210 до 320 нм через кожні 5 нм. За триманими значеннями оптичних густин знайти молярні коефіцієнти екстинкції триптофану, тирозину й фенілаланіну на 250 і 280 нм.
Приготувати розчини триптофану у воді в концентраціях 0,00735; 0,0147; 0,22 і 0,249 мг/мл і перевірити справедливість закону Ламберта-Бера.
Приготувати розчини триптофану і тирозину в 0,1 н NaOH, зареєструвати спектри поглинання і порівняти зі спектрами поглинання нейтральних розчинів у воді.
Завдання 2 Вимірювання спектрів поглинання білків
Приготувати розчини з концентраціями 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мг/мл таких білків: сироваткового альбуміну, трипсину, рибонуклеази і актоміозину. Зареєструвати спектри цих білків, провести їх порівняння. Перевірити справедливість закону Ламберта-Бера для розчинів. Знайти співвідношення Е280/Е260.
Контрольні запитання:
Лабораторна робота
«Вимірювання спектрів поглинання нуклеїнових кислот і пігментів»
Матеріали та обладнання: спектрофотометр, розчини ароматичних амінокислот тирозину й триптофану, розчини білків (трипсин, рибонуклеаза)
Завдання 1 Вимірювання спектрів поглинання нуклеїнових кислот
Приготувати 3-4 мл розчину ДНК у 0,1М NaCl розведенням концентрованого розчину або розчиненням сухого препарату комерційної ДНК. Добитися, щоб Е260 складало 0,5-0,6 (0,2-0,25 мкг/мл). Виміряти спектр поглинання в області 220-230 нм. Знайти співвідношення Е280/Е260.
Завдання 2. Визначення гіперхромного ефекту ДНК.
Приготувати 6-7 мл розчину ДНК концентрацією 0,2-0,25 мкг/мл 0,1М NaCl. Виміряти Е при 260 нм. Розчин розлити порівну в дві пробірки з притертими корками. Далі опустити пробірки в гарячу водяну баню (368К) на 10-15 хв. Після цього одну пробірку опустити в лід, а другу залишити у водяній бані, яку поступово охолоджують до кімнатної температури. Виміряти Е260 денатурованої ДНК (швидко охолодженої) і денатурованої. Порівняти значення. Розрахувати гіперхромний ефект.
Завдання 3 Визначення концентрацій хлорофілів а і в в екстрактах зелених листків
Як у попередній роботі приготувати ацетонову витяжку з 2.-3 г листків. Приготовлена витяжка має бути прозорою. Зробити декілька розведень у ацетоні так, щоб одне з них мало поглинання в максимумі 660 нм біля 0,5-1,0 шкали Е. Виміряти спектр поглинання цього розчину. Вимірювання проводити при двох довжинах хвиль – 640 нм (максимум поглинання для Хл в) та 665 нм (максимум для Хл а).
Завдання 4 Вивчення залежності поглинання від концентрації речовини
Приготувати ацетонову витяжку листків. Довести розчин до 10 мл 80% ацетоном і поділити на 2 частини по 5 мл. З однієї частини приготувати розведення у 2, 4, 8, 16, 32 рази, а другу залишити без змін.
Виміряти величини оптичних густин при 662 нм для вихідного розчину і розведень (як контроль - 80% ацетон). Перевести програму вимірювань приладу на світло пропускання Т і визначити значення Т при 662 нм для розведень. Використовуючи одержані значення побудувати графіки залежності Е та (1-Т) від концентрації. Порівняти концентрації, для яких зберігається лінійність за оптичною густиною та поглинанням (1-Т). Встановити, чи застосовується закон Ламберта-Бера для даного випадку.
Контрольні запитання:
Список рекомендованої літератури
ДОДАТКИ
Зміст
|
Передмова …………………………………………………. |
3 |
|
Теоретичні відомості ……………………………………… |
4 |
|
Завдання для підготовки до семінарсько-практичних занять ………………………………………………………. |
27 |
|
Приклади розв’язку задач ………………………………… |
37 |
|
Задачі для самостійного розв’язування ………………….. |
40 |
|
Приклади тестових завдань ………………………………. |
47 |
|
Перелік питань до підсумкового контролю ……………... |
65 |
|
Орієнтовні теми індивідуальних завдань ………………... |
70 |
|
Відповіді на задачі ………………………………………… |
72 |
|
Відповіді на тестові завдання …………………………….. |
73 |
|
Список рекомендованої літератури ……………………… |
74 |
|
Додатки …………………………………………………….. |
76 |
Худа Лідія Вікторівна
Біофізика: Лабораторний практикум
Відповідальний за випуск Марченко М.М.
Літературний редактор
45