Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция 4
Размеры генома колеблются от 130 до 230 т.п.н. Мы рассмотрим подробно репликацию HSV-1 (152 т.п.н.) и EBV(172 т.п.н.).
По структуре ДНК герпес вирусы можно разделить на 6 групп.
А. На концах длинные повторы (вирус кошачьего сомика).
В. Концевые повторы состоят из повторов.
С.Концевые повторы из повторов и повторы во внутренней части генома.
(вирус обезъян Сайниры)
R4 R3 R2 R1
D.Правый сегмент фланкирован инвертированными повторами и может находится в двух ориентациях, левый сегмент всегда в одной ориентации (вирус псевдобешенства).
UL Us
E.Несколько повторов на концах и внутри генома. Сегменты генома могут находится в двух ориентациях (вирус простого герпеса).
(а)n b UL b' (a)'n c' Us c a
F.Особенные последовательности отсутствуют (вирус тупарий).
Инверсия сегментов не обязательна и возможен переход из одной группы в другую, например, вирус псевдобешенства, может перейти в группу D.
Типы циклов размножения:
-литический цикл (продуктивная инфекция): вирус простого герпеса (HSV)
-лизогенный цикл (латентная форма): EBV (существует в виде плазмиды)
При переходе из латентной в продуктивную форму, вирус вызывает появление лихорадки около губ и носа.
Ранее считали, что рання стадия репликации вируса проходит по схеме Кернса, поздняя – по схеме разматывающегося рулона.
При центрифугировании в градиенте CsCI в присутствии EtBr можно выделить ковалентно-замкнутые кольцевые формы ДНК.
В вирионе ДНК вируса имеет одноцепочечные разрывы, остатки РНК. Видимо, репарация вирусной ДНК осуществляется клеточными системами.
Свидетельство в пользу циркуляризации: появление новых сайтов для рестриктаз.
Механизм циркуляризации.
На концах выступает только по одному нуклеотиду, поэтому потенциал для циклизации есть. Возможно, участвует система рекомбинации клетки. (RCC1 ts мутанты (?)). Однако механизм в деталях неясен.
Репликация вируса осуществляется в ядре. Интересно! При изучении распределения вирусных репликативных белков в ядре с помощью флуоресцентной метки было установлено, что места репликации вирусной ДНК занимают фиксированное положение в ядре.
Инициация репликации.
Инициация внутренняя, без разрыва, посредством РНК затравки.
В геноме 3 ori: один oriL в большом сегменте и 2 oriS в малом сегменте внутри повторов с и с'.
Структура ori.
III I I III
oriL
палиндром 20 нт палиндром
Этот участок трудно клонировать из-за наличия палиндромных последовательностей.
oriS
III I II
палиндром 18 нт
Палиндромные последовательности служат участками узнавания для OBP.
Примечание: oriS был клонирован в плазмиду и его способность к репликации изучалась в присутствии различных комбинаций вирусных и клеточных белков.
В репликации участвуют 7 вирусных белков.
Номенклатура белков HSV.
а) ICPхх (intracellular protein)
б) по положению в геноме: ULхх, USхх.
Мы будем пользоваться в основном второй номенклатурой.
UL9. OBP. Узнает и связывается с ori в виде димера. Взаимодействию способствуют/мешают клеточные транскрипционные факторы: ori фланкирован сайтами связывания SP1 и SP3 (возможно, в районе ori происходит транскрипция, но она не обязательна для репликации). Обладает АТФ-зависимой 3' – 5' хеликазной активностью. Вообщем, белок по своим активностям напоминает Т-Аg SV40.
Предложена вполне правдоподобная модель действия UL9.
UL9, как и Т-Аg SV40, связывается с oriS в форме димера и фиксирует ДНК. После поворота колец друг относительно друга участок oriS подплавляется и в ходе структурной перестройки образует крестобразную структуру - oriS* (при действии UL9 в кольцевая ДНК суперскручивается и одним из способов снятия сверхспиральности – образование крестообразных структур).
III I II III I
III I
Принцип действия: фиксация участков ori ДНК в димере и их физическое изменение, приводящее к локальному плавлению ДНК.
Далее белок работает, как хеликаза и с появляющимися участками одноцепочечной ДНК связывается вирусный белок ICP8 (аналог SSB). Кроме этого, ICP8 взаимодействует с UL9 и стимулирует его хеликазную активность.
Обычно в репликации участвовала клеточная хеликаза с активностью 5'-3' (например, DnaB) в данном случае, к расплетенному участку присоединяется комплекс из трех вирусных белков: UL5 (хеликаза 5'-3'), UL52 (праймаза) и UL8 (вспомогательный белок, стабилизирующий РНК-затравку и активирующий некоторые клеточные белки).
Т.о. с помощью вирусных белков осуществляется расплетание ori, стабилизация расплетенного состояния и синтез затравки.
Отступление. В молекулярной биологии существует большая путанница в отношении того, что считать белком с четвертичной структурой, а что белковым комплексом, состоящим из самостоятельных белковых цепей. Выяснение этого вопроса ничего значимого не дает. Интересен тот случай, когда одна полипептидная цепь способна выполнять задачи, распределенные между отдельными белками. И важно понимание того, какие задачи решаются теми или иными белками, а не структура белковых комплексов.
Элонгация репликации.
В комплекс привлекается вирусная ДНК полимераза. Она состоит из двух субъединиц: UL30, обладающая каталитическим центром, 3'-5' экзонуклеазной и РНКазаН активностями, и UL42 – фактор процессивности. Ранее изученные нами факторы процессивности представляли собой олигомеры в виде колец способные к скольжению вдоль матрицы ДНК (β-субъединица РНК полимеразы III E.coli, фактор PCNA ДНК полимеразыδ эукариот). Однако вирусный белок UL42 работает в виде мономера, не имеет форму кольца и не способен к скольжению вдоль матрицы ДНК: он просто фиксирует полимеразу на участке ДНК. Но для синтеза ДНК необходимо смещение фермента относительно матрицы, как быть?
Предложено два объяснения механизма работы UL42.
Еще один участник процесса репликации клеточная топоизомераза. Фермент снимает сверхспиральность и тем самым не дает запутаться концам линейной ДНК вируса.
Соединение фрагментов Оказаки.
ДНК полимераза вируса удаляет РНК-затравки, клеточная лигаза зашивает разрыв.
Мы отметили, что в начале репликации имеется неопределенность с формой ДНК, но вскоре появляются ветвистые конкатемерные молекулы.
В ветвистом конкатемере ориентация большого сегмента постоянна, а малого меняется.
Ветвистость и инверсии легко объясняются, если предположить, что имеют место рекомбинация. Вирус герпеса имеет все основные компоненты системы рекомбинации аналогичные системе рекомбинации фага λ.
В опыте, в клетках пораженных герпес вирусом ДНК SV40 становится конкатемерной и ветвистой.
Разрешение конкатемера.
Задачи решаемые упаковочной системой вируса:
1)узнать а-элементы генома
2)нарезать эквиваленты генома по а-элементы
3)игнорировать внутренние а-элементы
4)полностью заполнить головку (headfull-упаковка)
Описаны случаи, когда головка упаковывается короткими фрагментами, но их суммарная масса равна массе полного генома.
Структура а-элемента.
DR1(70 п.н.) – Ub(64 п.н.) – DR2(12 п.н.)8-21 – DR4(37п.н.)2-3– Uc(58-64п.н.) – DR1(70 п.н.)
DR – direct repeat. Мы видим, что это структура, состоящая из большого числа повторов.
В вирионе:
5' – AC
3' – GTG
Считается, что Uc является Рас1 участком, при ее узнавании разрыв вносится в правый DR1. Pac 2 участок находится в Ub и если узнается он, то разрыв вносится в левый DR1.
Уже было упомянуто выше, что левый конец может состоять из нескольких а-элементов (могут появиться в результате рекомбинации), какой из них будет узнан – не важно, важно, чтобы упаковался полный эквивалент генома.
Разрыв делает терминаза вируса, состоящая из двух субъединиц: UL28 (узнает Рас1) и UL15 (обладает АТФ-азной активностью).
Странно, что инверсия сохраняется в эволюции.
Белком не обязательным для репликации является тимидинкиназа. Фермент проявляет три активности:
а)тимидинкиназа (ТК)(Т – рТ);
б)тимидинмонофосфаткиназа (ТmP) (dT – ddT);
в)дезоксицитидиндикиназа.
В некоторых клетках он не нужен для репликации, но необходим для репликации вируса в нервных ганглиях (установлено по делеции этого гена).
Основой лекарственных средств, применяемых для лечения герпес-инфекции, является ацикловир. Это соединение фосфорилируется тимидинкиназой вируса. В фосфорилированной форме он является аналогом нуклеотида и блокирует синтез ДНК.
Вирус Эпштейн-Барр (EBV)
Большое количество людей являются носителями этого вируса. В странах Африки вирус вызывает лимфому Берклита, в европе – инфекционный мононуклеоз. Инфекция носит персистентный характер. Вирус находится в клетках в виде плазмиды. Численность плазмид строго контролируется. "Полная гармония с клеткой в S-фазе".
Способы воспроизведения:
а)плазмидная репликация
б)литическая репликация
Плазмидная репликация.
Осуществляется по схеме Кернса. Большинство генов репрессировано, экспрессируется небольшая часть (причем в разных клетках эти группы отличаются составом). В репликации плазмиды участвует один вирусный белок – EBNA-1 (Epshtein-Barr Nuclear Antigen).
Инициация репликации происходит на участке, называемом oriP (plasmid ori). Его длина около 1700 п.о, внутри на расстоянии 1000 п.н. друг от друга расположены два участка DS (Diad Symmetry) и FR (Family of Repeats).
FR 1000 п.н. DS
DS состоит из четырех элементов, связывающих EBNA-1.
FR состоит из 20 прямых повторов длиной по 30 п.о. Каждый содержит сайт связывания EBNA-1 (есть предположение, что это нужно для титрации белка).
Остальные белки, участвующие в репликации – клеточные. Каждая плазмида делится только один раз за клеточный цикл и дочерние клетки получают по одной копии.
ORC (Origin Recognition Complex). С помощью EBNA-1 узнает и связывается с oriP в районе DS. Остается связанным с плазмидой в течение всего цикла репликации.
CDC6 – loader хеликазы. Сdt1 – регулирует активность CDC6. Оба белка присоединяются к ORC в G1фазе. Далее загружается гексамер хеликазы MCM. В S-фазе к расплетенному участку ДНК присоединяется ДНК полимераза α/праймаза.
Контроль количества плазмиды осуществляется CDC6 и Cdt1. CDC6 гиперфосфорилируется в S-фазе и экспортируется из ядра в цитозоль, где разрушается протеасомой. Cdt1 ингибируется геминином. В отсутствие CDC6 и Cdt1
Контроль над распределением плазмид между дочерними клетками осуществляет EBNA-1, связывающийся с участком FR.
Литическая репликация.
Другой ori – Orilyt. Плохо изучена.
В репликации принимает участие множество вирусных белков, однако, отсутствует аналог UL9. Неясно как происходит узнавание участка ori, но известно, что ori фланкирован участками для связывания транскрипционных факторов, поэтому, возможно, для инициации репликации необходима транскрипция района ori.
Репликация с участием конкатемерных молекул. Инициация репликации внутренняя.
Фаг Т7.
Геном 40 000 п.н. на
концах прямые повторы 160 п.н.
Особенность фага в том, что гены организованы в оперон и транскрипция идет в одном направлении. Левая часть (обозначена как 1) траскрибируется клеточной полимеразой, правая (большая) – вирусной.
Причина в том, что фаг вводит ДНК в клетку в две стадии. На первой стадии вводится небольшой участок ДНК, который транскрибируется клеточной РНК-полимеразой. С этих траскриптов синтезируются фаговые белки, которые способствуют вхождению в клетку остальной части ДНК.
1,1 А и 1,1 В – промоторы генов, здесь же находится ori. Это необычный участок, когда РНК-полимераза открывает промотор, она синтезирует РНК длиной 10 п.н. и сваливается. Структура участка такова, что гетеродуплекс РНК-ДНК стабильнее, чем ДНК-ДНК, поэтому РНК остается и служит затравкой для вирусной ДНК-полимеразы. Но репликация вирусной ДНК двусторонняя, откуда взять вторую затравку?
ДНК полимераза Т7. Продукт гена V. Масса 84 кДа. Помимо полимеразной активности обладает рибонуклеозидредуктазной. Фактором процессивности служит клеточный тиоредоксин (!), фаговый тиоредоксин в репликации не участвует. Если домен, связывающий тиоредоксин вставить в ДНКазу I, то процессивность этого фермента в присутствии тиоредоксина увеличивается. Объяснение (не от лектора!): тиоредоксин индуцирует конформационные изменения в молекуле полимеразы, в результате которых полипептидная цепь крепче обхватывает ДНК и в таком состоянии ей труднее соскочить с ДНК.
Отступление: измерение процессивности полимеразы: в качестве матрицы используют меченую одноцепочечную ДНК затем реакционную смесь разводят немеченной матрицей, продукты разделяют электрофорезом и следят за подвижностью меченой ДНК. Если фермент непроцессивный – подвижность фрагмента большая, если процессивный – низкая из-за наличия длинной второй цепи ДНК.
Хеликаза (5'-3')/праймаза. Продукт гена IV. Способен к олигомеризации, образует гексамеры и стабильный комплекс с полимеразой (разведение реакционной смеси не влияет на процессивность и длину фрагментов Оказаки). Затруднение в том, что праймаза движется в одном направлении, а хеликаза – в другом. Объяснение – модель трубы. Существует также предположение, что при этом одни субъединицы гексамера могут работать как праймаза, другие как хеликаза. "Трубу " наблюдали в микроскоп!
Ген IV имеет два промотора. С одного синтезируется полный продукт, с другого – белок с укороченным N-концом, этот укороченный продукт обладает только хеликазной активностью.
Клеточные праймазы имеют довольно широкую специфичность, вирусная же имеет еще более широкую специфичность (на грани с неспецифичностью).