У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

Тема занятия Молекулярное клонирование

Работа добавлена на сайт samzan.net: 2015-07-10

Поможем написать учебную работу

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

от 25%

Подписываем

договор

Имя

Выберите тип работы:

Принимаю Политику конфиденциальности

Скидка 25% при заказе до 27.4.2025

ФИО	Шонина Мария Юрьевна
Занятие №	3		Дата:	2013.10.30
Тема занятия	Молекулярное клонирование. Ферменты рестрикции: параметры и условия работы
Вариант	2
№ PC	11

Исходные данные:

Концентрация ДНК 200 ng/µl, для рестрикции используем 500 ng;

Рекомендуемый объем реакционной смеси 20 µl;

Вариант 2

Задание 1

1) GsuI + BglII

Наименование ферментов в задании	GsuI + BglII
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	BpmI+ BglII
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
GsuI (BpmI) 30°C	C T G G A G (N)16↓	65оС – 20 мин	B (Blue)	100	50-100	0-20	20-50	100	50-100
BglII 37оС	A↓G A T C T	ЭДТА до 20 мМ; “переосаждение”	O (Orange)	0-20	20-50	100	50-100	0-20	100

Можно использовать буферную систему TangoTM Yellow 2x (GsuI, BglII)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер Yellow ТangoTM	10 X	2X	2,5 µl
Рестриктаза GsuI (BpmI)	5 u/µl	1 u (2X)	0,2 µl
H2O		до 20 µl	14,8 µl
Условия реакции: 30°C 1 час. Реакционную смесь нагреть до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер Yellow ТangoTM	10 X	2X	2,5 µl
Рестриктаза BglII	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

2) TaiI + EcoR32I

Наименование ферментов в задании	TaiI + EcoR32I
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	MaeII + EcoRV
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
TaiI (MaeII) 65°C	A C G T↓	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	R (red)	50-100	50-100	20-50	100	100	50-100
EcoR32I (EcoRV) 37°C	G A T↓A T C	80°C 20 мин	R (red)	0-20	50-100	50-100	100	20-50	100

Можно использовать буферную систему R (red) (TaiI, EcoR32I)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза TaiI (MaeII)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 65°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер R (red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза EcoR32I (EcoRV)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

3) HindIII + SmaI

Наименование ферментов в задании	HindIII + SmaI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	TaaI + BspTI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
HindIII 37°C	A↓A G C T T	80 оС – 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100
SmaI 30°C	C C C↓G G G	65°C 20 мин	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	0-20

Можно использовать буферную систему TangoTM Yellow 1x (HindIII, SmaI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер Yellow ТangoTM	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза HindIII	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 30°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер Yellow ТangoTM	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза SmaI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 30°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание до 65 оС – 20 минут.

4) TaaI + Bst1107I

Наименование ферментов в задании	TaaI + Bst1107I
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	HpyCH4III + BstZ17I
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
TaaI (HpyCH4III) 65°C	ACN ↓GT	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	TangoTM	0-20	0-20	0-20	50-100	100	20-50
Bst1107I BstZ17I 37°C	G T A↓T A C	80°C 20 мин	O	20-50	50-100	100	100	0-20	100

Можно использовать буферную R (Red) (TaaI, Bst1107I)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза TaaI (HpyCH4III)	10 u/µl	1u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 65°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза Bst1107I (BstZ17I)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

Задание 2

1) EcoRI + HindIII

Наименование ферментов в задании	EcoRI + HindIII
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	EcoRI + HindIII
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
EcoRI 37°C	G↓A A T T C	65°C 20 мин	EcoRI Buffer [Unique]	0-20	NR	100	100	NR	100
HindIII 37°C	A↓A G C T T	80°C 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100

Можно использовать буферную систему R (Red) (EcoRI, HindIII)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза EcoRI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15, 4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза HindIII	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание до 65 оС.

2) MboI + BamHI

Наименование ферментов в задании	MboI + BamHI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	MboI + BamHI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
MboI 37°C	↓G A T C	65°C 20 мин”	R (Red)	50-100	50-100	50-100	100	50-100	100
BamHI 37°C	G↓G A T C C	80°C 20 мин	BamHI Buffer (Unique)	20-50	100	20-50	50-100	100	50-100

Можно использовать буферную систему R (Red) (MboI, BamHI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза MboI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15, 4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза BamHI	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание 65оС – 20 минут.

3) ScaI + PstI

Наименование ферментов в задании	ScaI + PstI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	ScaI + PstI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
ScaI 37°C	A G T↓A C T	80°C 20 мин	ScaI Buffer (Unique)	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20
PstI 37°C	C T G C A↓G	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	O	50-100	50-100	100	100	50-100	50-100

Можно использовать буферную систему O (Orange) (ScaI, PstI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер O (Orange)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза ScaI	10 u/µl	2,5 u (5X)	0,25 µl
H2O		до 20 µl	15,25 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер O (Orange)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза PstI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

4) Cfr10I + PvuI

Наименование ферментов в задании	Cfr10I + PvuI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	BsrFI+ PvuI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
Cfr10I (BsrFI) 37°C	R↓C C G G Y	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	Cfr10I Buffer [Unique]	0-20	20-50	20-50	50-100	20-50	50-100
PvuI 37°C	C G A T↓C G	80°C 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	50-100	100	50-100	100

Можно использовать буферную систему R (Red) 1x (Cfr10I, PvuI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза Cfr10I (BsrFI)	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза PvuI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

1. Проблемы лесопользования и охраны ценных естественных лесов Карелии
2. заднем направлении контролируется специальными веществами морфогенами они определяют какой из концов
3. Королевство гномов питомник чихуахуа РКФFCI рег
4. Историческая концепция С.М. Соловьева
5. Категории помещений и зданий по взрывопожарной и пожарной опасности
6. ложь Человек верит в Бога или в Богов
7. Охраняемые объекты Пермского края
8. Статья- Кредитование клиентов и рост продаж
9. I. Загальні постанови
10. Курсовая работа- Кассовые операции коммерческих банков

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе