Тема занятия Молекулярное клонирование

Работа добавлена на сайт samzan.net:

ФИО	Шонина Мария Юрьевна
Занятие №	3	Дата:	2013.10.30
Тема занятия	Молекулярное клонирование. Ферменты рестрикции: параметры и условия работы
Вариант	2
№ PC	11

Исходные данные:

Концентрация ДНК 200 ng/µl, для рестрикции используем 500 ng;

Рекомендуемый объем реакционной смеси 20 µl;

Вариант 2

Задание 1

1) GsuI + BglII

Наименование ферментов в задании	GsuI + BglII
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	BpmI+ BglII
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
GsuI (BpmI) 30°C	C T G G A G (N)16↓	65оС – 20 мин	B (Blue)	100	50-100	0-20	20-50	100	50-100
BglII 37оС	A↓G A T C T	ЭДТА до 20 мМ; “переосаждение”	O (Orange)	0-20	20-50	100	50-100	0-20	100

Можно использовать буферную систему TangoTM Yellow 2x (GsuI, BglII)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер Yellow ТangoTM	10 X	2X	2,5 µl
Рестриктаза GsuI (BpmI)	5 u/µl	1 u (2X)	0,2 µl
H2O		до 20 µl	14,8 µl
Условия реакции: 30°C 1 час. Реакционную смесь нагреть до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер Yellow ТangoTM	10 X	2X	2,5 µl
Рестриктаза BglII	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

2) TaiI + EcoR32I

Наименование ферментов в задании	TaiI + EcoR32I
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	MaeII + EcoRV
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
TaiI (MaeII) 65°C	A C G T↓	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	R (red)	50-100	50-100	20-50	100	100	50-100
EcoR32I (EcoRV) 37°C	G A T↓A T C	80°C 20 мин	R (red)	0-20	50-100	50-100	100	20-50	100

Можно использовать буферную систему R (red) (TaiI, EcoR32I)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза TaiI (MaeII)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 65°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер R (red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза EcoR32I (EcoRV)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

3) HindIII + SmaI

Наименование ферментов в задании	HindIII + SmaI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	TaaI + BspTI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
HindIII 37°C	A↓A G C T T	80 оС – 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100
SmaI 30°C	C C C↓G G G	65°C 20 мин	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	0-20

Можно использовать буферную систему TangoTM Yellow 1x (HindIII, SmaI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер Yellow ТangoTM	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза HindIII	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 30°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер Yellow ТangoTM	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза SmaI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 30°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание до 65 оС – 20 минут.

4) TaaI + Bst1107I

Наименование ферментов в задании	TaaI + Bst1107I
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	HpyCH4III + BstZ17I
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
TaaI (HpyCH4III) 65°C	ACN ↓GT	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	TangoTM	0-20	0-20	0-20	50-100	100	20-50
Bst1107I BstZ17I 37°C	G T A↓T A C	80°C 20 мин	O	20-50	50-100	100	100	0-20	100

Можно использовать буферную R (Red) (TaaI, Bst1107I)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза TaaI (HpyCH4III)	10 u/µl	1u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 65°C 1 час. Реакционную смесь охладить до 37°C и к реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза Bst1107I (BstZ17I)	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

Задание 2

1) EcoRI + HindIII

Наименование ферментов в задании	EcoRI + HindIII
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	EcoRI + HindIII
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
EcoRI 37°C	G↓A A T T C	65°C 20 мин	EcoRI Buffer [Unique]	0-20	NR	100	100	NR	100
HindIII 37°C	A↓A G C T T	80°C 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100

Можно использовать буферную систему R (Red) (EcoRI, HindIII)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза EcoRI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15, 4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза HindIII	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание до 65 оС.

2) MboI + BamHI

Наименование ферментов в задании	MboI + BamHI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	MboI + BamHI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
MboI 37°C	↓G A T C	65°C 20 мин”	R (Red)	50-100	50-100	50-100	100	50-100	100
BamHI 37°C	G↓G A T C C	80°C 20 мин	BamHI Buffer (Unique)	20-50	100	20-50	50-100	100	50-100

Можно использовать буферную систему R (Red) (MboI, BamHI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза MboI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15, 4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза BamHI	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать нагревание 65оС – 20 минут.

3) ScaI + PstI

Наименование ферментов в задании	ScaI + PstI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	ScaI + PstI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
ScaI 37°C	A G T↓A C T	80°C 20 мин	ScaI Buffer (Unique)	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20
PstI 37°C	C T G C A↓G	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	O	50-100	50-100	100	100	50-100	50-100

Можно использовать буферную систему O (Orange) (ScaI, PstI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер O (Orange)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза ScaI	10 u/µl	2,5 u (5X)	0,25 µl
H2O		до 20 µl	15,25 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер O (Orange)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза PstI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

4) Cfr10I + PvuI

Наименование ферментов в задании	Cfr10I + PvuI
Наименование ферментов по каталогу Fermentas	BsrFI+ PvuI
Краткая характеристика ферментов
Название, оптимальная температура	Сайт рестрикции	Условия инактивации	Рекомендуемый буффер для 100% активности	B	G	O	R	Y 1x	Y 2x
Cfr10I (BsrFI) 37°C	R↓C C G G Y	ЭДТА до 20 мМ; “переосаж-дение”	Cfr10I Buffer [Unique]	0-20	20-50	20-50	50-100	20-50	50-100
PvuI 37°C	C G A T↓C G	80°C 20 мин	R (Red)	0-20	20-50	50-100	100	50-100	100

Можно использовать буферную систему R (Red) 1x (Cfr10I, PvuI)

Протокол рестрикции

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК	200 ng/µl	500 ng	2,5 µl
Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза Cfr10I (BsrFI)	10 u/µl	1 u (2X)	0,1 µl
H2O		до 20 µl	15,4 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. К реакционной смеси добавить:

Буфер R (Red)	10 X	1X	2,0 µl
Рестриктаза PvuI	10 u/µl	0,5 u (1X), физически добавляем 1 u	0,1 µl
Условия реакции: 37°C 1 час. Для инактивации ферментов можно использовать переосаждение ДНК.

1. Электричество и магнетизм
2. заперта Откройте райские врата; И то что мы сюда положим под конец всего Всему же и начало
3. Основні засоби; 11
4. Тесты по уголовному праву (общая часть)
5. самая крупная железа нашего организма
6. ДОТ заочной формы обучения Нижегородской правовой академии о прохождении производственной практики в нот
7. Мечникова
8. к только в этом случае новые возможности информационного общества могут быть в полной мере использованы для
9. Пояснительная записка А3 КП 9602
10. Так и будешь вечно плестись позади брата Сэм тяжело вздохнул Гейб опять взялся за старое
11. тема коррупции в России в условиях современных рыночных отношений и построения правового государства несом
12. ХАИ специальность- ФинансыЯзыки- английский базовыйДолжность- товароведОпыт работы- наст
13. Нормы труда и методика их определения
14. тематичної освіти ’2 2013 Міністерство освіти і науки України Сумський державний педагогічни
15. тема трудового права2
16. полезной деятельности удовлетворению информационных потребностей
17. ТЕМАМ КУРСА ПРЕСТУПЛЕНИЯ ПРОТИВ СОБСТВЕННОСТИ Нормативные акты Конституция Российской Федерации
18. последовательность с комплексными членами и комплексные числа причем
19. ЗАДАНИЕ- В каждую ветвь электрической цепи из 1 задача ввести реактивные элементы; выбрать параметры реакти
20. Проектирование районной электрической сети

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе