Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
25
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Родіонова Наталія Львівна
УДК 611. 311: 616. 003. 93: 615. 832. 9
РЕГЕНЕРАЦІЯ ТКАНИН
СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ПОРОЖНИНИ РОТА
ПРИ КРІО- І ТЕРМОДЕСТРУКЦІЯХ
14.01.35 - кріомедицина
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків –
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків
|
Науковий керівник: |
доктор медичних наук, професор, Куцевляк Валентина Федорівна, Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач кафедри терапевтичної та дитячої стоматології |
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Гарюк Григорій Іванович,
Харківська медична академія післядипломної освіти,
завідувач кафедри оториноларингології
кандидат медичних наук, доцент Ніконов Віктор Володимирович,
Харківський державний медичний університет, кафедра стоматології
дитячого віку, дитячої щелепно-лицьової хірургії і імплантології
Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра
терапевтичної стоматології, міністерство охорони здоров’я України
Захист відбудеться “ 15 ” жовтня 2002 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.
Автореферат розісланий “ 11 ” вересня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор мед. наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Регенерація тканин при локальному кріовпливі є актуальною медико-біологічною проблемою. Низькі температури (-80С...-196С) широко використовуються в багатьох галузях медицини, починаючи з 60-х років минулого століття (період створення оптимальної кріогенної техніки). Постійно розширюється діапазон галузей медичного застосування кріогенного методу. Прогностична оцінка дозволяє встановити, що його роль як методу лікування буде зростати.
В стоматології низькотемпературний вплив застосовується для лікування передракових і пухлиноподібних захворювань слизової оболонки порожнини рота і червоної облямівки губ. У зв’язку з тим, що рак червоної облямівки нижньої губи і слизової оболонки порожнини рота складає 4,2 % усіх злоякісних новоутворень, то зрозуміла актуальність його профілактики, що включає насамперед своєчасне виявлення і лікування передракових станів (хвороба Боуена, лейкоплакія, папіломатоз, фіброма, ерозивно-виразкова і гіперкератотична форми червоного плискатого лишаю й ін.). Для цього була створена і далі буде удосконалюватися різна кріогенна апаратура, розроблені методики впливу на патологічні осередки (В.А.Нікітін,1974; К.В.Божко,1978,1990; В.Ф.Куцевляк,1990 та ін.), проводяться дослідження дії глибокого холоду на тканини (Б.П.Сандомирський, 1984; О.Н.Сирота, 1992 та ін.).
Численні спостереження показують, що загоєння слизової оболонки після кріодеструкції є більш сприятливим у порівнянні з іншими методами впливу - діатермокоагуляцією, хірургічним методом: формування рубцево-сполучних тканин є мінімальним, спостерігається більш швидка епітелізація осередка ураження. Однак механізм цього явища залишається багато в чому неясним. Для з'ясування цих питань необхідні поглиблені морфологічні та біохімічні дослідження, що дозволять уточнити молекулярно-клітинні механізми регенерації після локального кріовпливу.
Останнім часом накопичена достатня кількість доказів важливої ролі вільнорадикального окислювання в загоєнні ран. Передбачається, що перекисне окислювання ліпідів (ПОЛ) - основний шлях утворення вільних радикалів - регулює перебіг тканинних метаболічних процесів, що впливають на хід регенерації. Надлишок вільних радикалів, які накопичуються в результаті ланцюгової реакції (активних форм кисню (АФК) —синглетний кисень, гідроксильний і супероксидний радикали, перекис водню), викликає перекисну модифікацію ліпідів і ліпопротеїдів, зміну структури і деструкцію клітинних мембран (А.М. Белоус, В.А.Бондаренко и др., 1982, 1994).
Дотепер ці питання залишаються практично маловивченими, і ми вважаємо доцільним провести їхнє дослідження при кріодеструкції слизової оболонки порожнини рота, а також у порівняльному аспекті з високотемпературним впливом на тканини. Крім того, певний інтерес представляє вивчення змін клітинного складу й імунних реакцій у зоні впливу.
У післяопераційному періоді особлива увага приділяється процесам регенерації тканин в осередках локального кріовпливу. Ми вважаємо за доцільне застосування в прогресивній фазі регенерації засобів, здатних прискорити процеси відновлення клітин і тканин слизової оболонки порожнини рота.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок досліджень продовжує науковий напрямок кафедри терапевтичної стоматології ХМАПО, пов’язаний з лікуванням передракових и пухлиноподібних захворювань слизової оболонки порожнини рота методами кріодеструкції та діатермокоагуляції та пов’язаний з науковою темою ІПКіК НАН України: “Дослідити біологічну дію нативних и кріоконсервованих екстрактів плаценти та ембріональних тканин”(шифр –, № держреєстрації 0100U004048).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення ролі вільнорадикальних процесів у динаміці регенерації тканин слизової оболонки порожнини рота в експерименті в порівняльному аспекті після кріодеструкції, діатермокоагуляції та їх комбінованого впливу, а також обгрунтування доцільності застосування водно-сольового екстракту плаценти “Плацентек” у прогресивній фазі регенерації.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
Об’єкт дослідження. Регенеруюча тканина слизової оболонки порожнини рота після кріодеструкції, діатермокоагуляції, їх комбінованого впливу.
Предмет дослідження. Перебіг процесів перекисного окислювання ліпідів, активність ферментативної антиоксидантної системи групи глутатіона, структурні та імуноморфологічні особливості гомогенатів регенеруючої тканини слизової оболонки, регенерація тканин слизової оболонки після впливу водно-сольового екстракту плаценти “Плацентек”.
Методи дослідження. Використовувалися біохімічні методи дослідження, біохемілюмінесценція, імунофлюоресценція, світлова мікроскопія, морфометрія.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що важливу роль у механізмі більш сприятливого загоєння слизової оболонки порожнини рота після кріодеструкції відіграють вільнорадикальні процеси, що регулюють перебіг тканинних метаболічних процесів. Встановлено, що при усіх видах ураження у клітинах розвиваються процеси ПОЛ, що супроводжуються досить добре вираженою хемілюмінесценцією (ХЛ), однак динаміка змін є різною. Показано, що при кріодеструкції спостерігається найменший рівень концентрації продуктів ПОЛ у тканинах слизової оболонки порожнини рота, ніж при інших відах впливів. Активність ферментів системи глутатіона при кріодеструкції знижується в меншому ступені стосовно контролю і відновлюється швидше, ніж при діатермокоагуляції та комбінованому впливі. При кріодеструкції спостерігали наявність I і III типів колагенів у зоні ураження, що збігаються за локалізацією. При діатермокоагуляції та комбінованому впливі зони локалізації інтерстиціальних колагенів не збігалися, переважав колаген ІІІ типу. Отримано дані про високий терапевтичний ефект застосування препарату “Плацентек” у післяопераційному періоді після кріодеструкції передракових і пухлиноподібних захворювань слизової оболонки порожнини рота.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених наукових досліджень дали можливість простежити важливу роль вільнорадикальних процесів у механізмі загоєння осередків локальної кріодеструкції, дозволили обґрунтувати перевагу кріодеструкції перед іншими видами впливів на тканини слизової оболонки порожнини рота і можуть бути використані в наступних дослідженнях з вивчення патогенезу регенерації тканин після кріодеструкції. Проведені дослідження показали доцільність використання при лікуванні передракових і пухлиноподібних захворювань слизової оболонки порожнини рота і червоної облямівки губ метода кріодеструкції з наступним застосуванням біостимулятора “Плацентек”.
Особистий внесок здобувача. Усі розділи дисертації написані особисто автором. Самостійно виконани експериментальна і клінічна частини роботи, а також аналіз матеріалу. Статистична обробка і наукова інтерпретація всіх даних проведені також особисто автором.
Апробація результатів дисертації. Про результати досліджень проінформовано на конференції молодих вчених “Застосування холоду в медицині і біології” в ІПКіК НАН України (2001 р., Харків), на Республіканській науково-практичній конференції “Нове в стоматології і щелепно-лицевій хірургії” у Харківському державному медичному університеті (2001 р., Харків), на засіданні Харківського осередку Асоціації стоматологів України (2002 р.).
Публікації. Основні положення дисертації викладені в чотирьох роботах: з них - три наукові статті, опубліковані в фахових виданнях.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 196 стор. формату А4 і складається зі вступу, огляду літератури, 3-х розділів власних досліджень, заключної частини, висновків і списку літератури, що включає 318 найменувань джерел, викладених на 31 сторінці. Робота ілюстрована 10 таблицями і 45 малюнками, викладеними на 30 сторинках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика і основні методи дослідження.
Експериментальні дослідження проводилися на базі відділу кріобіохімії (зав. відділу, д.б.н. проф. О.Ю. Петренко) Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (директор Інституту –академік НАН України, проф. В.І.Грищенко). Клінічні спостереження проведені на кафедрі терапевтичної і дитячої стоматології (зав. каф., д.м.н. проф., В.Ф.Куцевляк) Харківської медичної академії післядипломної освіти (ректор проф. М.І.Хвисюк).
Дослідження проводили на білих щурах-самцях лінії Вістар вагою 200-250 г. Усі операції над тваринами виконували після введення їм внутрішньочеревинно тиопентала натрію і дії наркозу. Тварини були розділені на 5 груп:
у першій групі (40 щурів) –тваринам проводили локальний кріовплив на слизову оболонку щоки кріотерапевтичним інструментом КАС-01 на відстані 2-3 мм від поверхні, голка № 0625. Діаметр зони обмороження склав 6-7 мм при глибині деструкції 0,7-0,8 мм в межах власне слизової оболонки порожнини рота; експозиція впливу складала 8-10 с, температура в межах власне слизової оболонки знижувалась до —ºС … —°С (В.А Нікітін, 1972, 1990);
в другій групі (40 щурів) за тих же умов проводили локальну діатермокоагуляцію за допомогою діатермокоагулятора стоматологічного ДКС-2М нагріванням до температури 95-110°С високочастотним розрядом потужності 0,6-0,8 Вт і частотою 110 кГц протягом 8-10с;
у третій групі (40 щурів) за тих же умов проводили комбінований вплив на слизову оболонку порожнини рота (попередня кріообробка слизової, а потім діатермокоагуляція);
у четвертій групі (20 щурів) після кріодеструкції патологічних осередків у післяопераційному періоді, починаючи з другої доби, застосовували “Плацентек” у вигляді аплікацій з експозицією 20-25 хв.
Діаметр зони обмороження і діатермокоагуляції в усіх випадках був однаковим і складав 5-6 мм, глибина деструкції – 0,7-0,8 мм - у межах власне слизової оболонки порожнини рота.
п’ята група була контрольною.
Тварин виводили з експерименту на 1, 3, 10 і 21 доби. Для біохімічного дослідження висікали ділянки ураження в межах очевидно здорових тканин, потім гомогенізували в холодному фосфатному буфері рН 7,4 (з додаванням інгібітору протеаз PMSF - фенілметилсульфонілфлуориду) за допомогою ручного скляного гомогенізатора.
Про інтенсивність ПОЛ у гомогенатах тканини у тварин судили за кількістю утворення первинних молекулярних продуктів ПОЛ - дієнових коньюгатів (ДК) –і вторинних –малонового диальдегіду (МДА), а також за рівнем спонтанної і люміноліндукованої хемілюмінесценції (ХЛ). Люміноліндукована ХЛ (із введенням у систему додаткового хімічного активатора –люмінола) дозволила зареєструвати світіння за рахунок АФК. Оцінювали стан ферментативної антиоксидантної системи за зміною активностей ферментів глутатіонпероксидази (ГП) і глутатіонредуктази (ГР).
Концентрацію МДА визначали модифікованим методом (Е.М.Коробейнікова), в основі якого лежить реакція МДА з тиoбарбітуровою кислотою (ТБК), що дає при високій температурі і кислому середовищі пофарбований комплекс. Для визначення кількості ДК використовували метод екстракції гідроперекисів ліпідів сумішшю гепатан-ізопропанол (1:1) з наступною реєстрацією поглинання кон’югованих структур в області 232-234 нм (В.Б. Гаврилов та ін.). Спонтанну ХЛ зразків визначали на хемілюмінометрі БХЛ-06. Для визначення активності ГП використовували методику В.Ф. Моїна, засновану на оцінці субстрату (відновлений глутатіон) у процесі пероксидазної реакції. Активність ГР визначали методом Л.Ф. Панченка, заснованим на вимірюванні швидкості окислювання відновленого НАДФ(нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату) у процесі реакції.
Для проведення порівняльних структурних та імуноморфологічних досліджень метаболічних процесів у тканинах слизової оболонки порожнини рота щурів після різнотемпературних видів впливів ділянки поразки висікали в межах здорових тканин, фіксували в забуференому 10% водяному розчині формаліну і піддавали целлоідин - парафіновій проводці. Готували серійні зрізи товщиною 5-6 мкм. Оглядові препарати офарблювали гематоксиліном та еозіном. Іншу частину препаратів офарблювали фукселеном на виявлення еластичних волокон по Вейгерту з дофарбовуванням пікрофуксином за методом Ван-Гізона для виявлення і диференціювання сполучнотканинних структур.
Провели гістологічне, гістохімічне, морфометричне дослідження матеріалу, диференціювання імунних клітин, типів колагену в осередках ураження за допомогою моноклональних антитіл (МКА) до різних типів клітин. Приготовлені для дослідження гістологічні та гістохімічні препарати вивчали і фотографували під світловим мікроскопом МБІ-16. Імунофлюоресцентне дослідження проводили на парафінових зрізах товщиною 5-6 мкм непрямим методом Кунса за методикою Brosman.
Клінічне спостереження і лікування було проведено 94 хворим із передраковими й пухлиноподібними захворюваннями слизової оболонки порожнини рота. З них у 63 чоловік патологічний осередок був зруйнований методом кріодеструкції, у 31 хворого —методом діатермокоагуляції. З метою прискорення темпів регенерації тканин у післяопераційному періоді в 25 хворих, що пройшли лікування методом кріодеструкції, нами був апробований препарат “Плацентек”, розроблений в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини і що є нативним водно-сольовим екстрактом плаценти людини. Ми припустили, що даний препарат може бути ефективним для стимуляції репаративних процесів після кріодеструкції, тому що містить широкий набір біологічно активних речовин: комплекс репродуктивних імуномодуляторів, гормони, що трансформують фактор росту, адаптогени, а також мікроелементи і вітаміни, що мають антиооксидантні властивості.
Обробку цифрових даних, отриманих у ході досліджень, проводили на IBM PC Pentium-II з використанням програми “Статистична обробка біомедичної інформації”. Для визначення вірогідності розходжень вибору застосовували Т-критерій Стъюдента.
Результати власних досліджень. Проведені структурні та імуноморфологічні дослідження стану слизової оболонки порожнини рота щурів після локальної кріодеструкції, діатермокоагуляції та їх комбінованого впливу показали, що після кріодеструкції процес регенерації протікав найбільш інтенсивно і до 10-ї доби завершувався повною епітелізацією. Запальна реакція до 3-ої доби стихала, носила обмежений характер, відзначали початок утворення грануляційної тканини і проліферативні процеси в базальному шарі епітелію.
При діатермокоагуляції і комбінованому впливі деструктивно-запальні зміни в тканинах були більш вираженими, носили розповсюджений характер, спостерігали більш повільне розгортання процесу проліферації фібробластів, більш пізніше настання максимуму його прояву, гальмування синтезу мукополісахаридів, РНК, ДНК. Після діатермокоагуляції запально-некротичні процеси зберігалися аж до 10-ої доби спостереження, епітелізація також затримувалася і до 10-ї доби не завершувалася.
При комбінованому впливі на тканини некротичні зміни і запальна реакція в зоні ушкодження були виражені максимально, із залученням у деструктивно-запальний процес м'язів, судин і слинних залоз. Запальна реакція зберігалася аж до 21-ої доби. Відзначали важкі циркуляторні розлади з розвитком тромбозу, масивних крововиливів, геморагічного просочування тканин. Застосування нагрівання безпосередньо після створення захисної гіпотермічної зони в даному випадку дозволяло забезпечити отриманий при охолодженні лімфо- і гемостатичний ефект холоду, виключивши при цьому підживлення патологічної тканини, за рахунок чого ступінь її деструкції був вищим. Однак, при проведенні комбінованої методики, очевидно, відбувалося пригнічення захисних властивостей і репаративних можливостей біотканини, що призводило до уповільнення процесів регенерації, подовження термінів епітелізації.
Імуноморфологічне дослідження показало, що при кріодеструкції визначали завжди меншу лейкоцитарну інфільтрацію, більш швидке наростання частки Т і В лімфоцитів у запальному інфільтраті, ніж при інших видах впливів. У підсумку це проявлялось скороченням прогресивної фази запалення. При діатермокоагуляції і комбінованому впливі нейтрофільний характер інфільтрату був більш виражений і зберігався довше. Також при кріодеструкції відзначали перевагу Т-хелперів над Т-супресорами вже до 3-ої доби після впливу, на відміну від двох інших видів впливів, коли дану особливість відзначали лише після 10-ої доби. При кріодеструкції спостерігали наявність I і III типів колагенів, що збігаються за локалізацією, що дозволяє зробити висновок про більш високий ступінь дозрівання сполучної тканини. У підсумку це виявляється мінімальними рубцевими деформаціями. При двох інших видах впливів зони локалізації інтерстиціальних колагенів не збігалися, переважав колаген III типу.
Таким чином, ми бачимо, що темпи регенерації слизової оболонки неоднакові при різних видах впливів і найкращі при кріодеструкції. Припущення про те, що ці розходження в динаміці місцевого запального процесу, термінах епітелізації пов'язані з особливостями перебігу вільнорадикальних процесів у тканинах, визначило слідуючу серію біохімічних експериментів. Отримані результати біохімічних досліджень добре корелювали з вищенаведеними даними морфологічних досліджень і показали, що в усіх випадках у клітинах розвиваються процеси ПОЛ, що супроводжуються досить добре вираженою хемілюмінесценцією, однак динаміка цих процесів різна.
При кріовпливі в першу добу спостерігалося помірне збільшення концентрації ДК і МДА стосовно контролю (р < 0,05) –на 29,2 % (з 12,14 ± 0,61 в.о./мг білка до 15,68 ± 1,10 в.о./мг білка) і на 43,6 % (з 140,15 ± 8,21 нмоль/г до 201,24 ±11,31 нмоль/г), відповідно (мал.1 і мал.2). Надалі, починаючи з третьої доби, що відповідає, за даними морфологічного дослідження, початку утворення грануляційної тканини і проліферативній фазі запалення, відбувалося помірне зниження рівня ДК і МДА –до 13,72 ± 0,67 в.о./мг білка і до 162,94 ± 8,14 нмоль/г, відповідно. До 10-ої доби їхній зміст практично не відрізнявся від контролю –,66 ± 0,67 в.о./мг білка і 156,04 ± 7,44 нмоль/г, відповідно.
При діатермокоагуляції слизової оболонки в першу добу рівні ДК і МДА були значно вищими стосовно контролю (р < 0,05), ніж після кріодеструкції –на 43,9 % (17,48 ± 1,64 в.о./мг білка), і на 106,8 % (289,78 ± 15,16 нмоль/г), відповідно. На третю добу відбувалося помітне зниження концентрації ДК і МДА –до 13,96 ± 1,14 в.о./мг білка і 170,04 ± 8,11 нмоль/г, відповідно.
Це може бути пов'язано, з одного боку, із закінченням травматичної фази запалення, а з іншого боку –з активацією захисних антиокисних систем організму. У наступний період, що триває до 8-10-ої доби і відповідає проліферативній фазі запалення, спостерігалося повторне зростання рівня МДА і ДК у тканині - до 16,64 ± 1,14 в.о./мг білка, і 199,21 ± 11,21нмоль/г, відповідно.
Нарешті, у третій період загоєння ран (з 8-10-ої доби до кінця спостереження), що характеризується початком дозрівання грануляційної тканини, знову відзначалося зниження концентрації ДК і МДА, однак їхній рівень залишався підвищеним стосовно контролю (р<0,05) до 21-ої доби на 20,8% (14,67 ± 0,95 в.о./мг білка) і 21,4 % (177,83 ± 9,12 нмоль/г), відповідно.
Після комбінованого впливу спостерігалися зміни ДК і МДА, подібні з другою групою, однак, більш виражені і до 21-ої доби їхній рівень у тканинах залишався підвищеним стосовно контролю на 26,8% (15,40 ± 1,12 в.о./мг білка) і на 30,7 % (183,12 ± 9,12 нмоль/г), відповідно. Це пов'язано, можливо, з більш глибокою деструкцією тканини слизової оболонки порожнини рота після застосування комбінованого кріо- і термовпливу.
Отримані результати свідчать про те, що динаміка зміни інтенсивності ПОЛ корелює з фазами раневого процесу і залежить від його характеру. При кріовпливі спостерігається незначне збільшення концентрації продуктів ПОЛ у тканинах і найшвидше зниження їх вмісту стосовно контролю, а при двох інших видах впливів (з різною інтенсивністю) –рівень ДК і МДА у тканинах вище, характеризується двома піками –на 1-2 і 8-10 добу та залишається істотно підвищеним стосовно контролю до 21-ї доби.
З метою подальшого уточнення перебігу процесів ПОЛ ми використовували метод хемілюмінесценції (ХЛ). Ті ж закономірності зберігалися при реєстрації спонтанної ХЛ гомогенатів тканини слизової оболонки порожнини рота щурів і ХЛ із додаванням люмінола, що дозволяє зареєструвати світіння АФК у системі (табл.1). Присутність АФК у тканинах є мінімальною після кріовпливу і більш вираженою після діатермокоагуляції і комбінованого впливу. Максимум рівня ХЛ із люмінолом після кріовпливу був вищим відносно контролю (р<0,05) у першу добу на 34,5% (299,9 ± 14,0 імп/30 с), а після двох інших видів впливу –на 44,2% (321,1 ± 9,0 імп/30с) і на 49,8% (333,8 ±10,9 імп/30с), відповідно.
Таблиця 1
Динаміка зміни рівня ХЛ у гомогенатах тканини після впливу на слизову оболонку порожнини рота щурів, імп./ 30 с.; без люмінола - “—”; із додаванням люминола - “+” (М ± m)
|
Види впливу |
Терміни дослідження, доба |
|
1 |
||||
|
Кріодеструкція “—“ люмінол “+” люмінол |
,2 ± 18,4* ,9 ± 14,0* |
144,0 ±11,9 ,8 ± 12,5* |
133,7 ± 9,2 ,9 ± 11,4* |
131,4 ± 8,4 ,9 ± 9,8 |
|
Термокоагуляція “—“ люмінол “+” люмінол |
,3 ± 17,8* ,1 ± 9,0* |
73,2 ± 3,9* ,6 ± 11,6* |
156,4 ± 18,7* ,7 ± 10,5* |
142,7 ± 7,7* ,9 ± 15,2* |
|
Комбінований вплив “—“ люмінол “+” люмінол |
,0 ± 15,1* ,8 ± 10,9* |
66,2 ± 4,1* ,8 ± 5,8* |
162,0 ± 11,4* ,6 ± 14,0* |
159,5 ± 4,8* ,6 ± 12,0* |
*—р < 0,05 у порівнянні з контролем; контроль: без люмінола 127,6 ± 4,9 імп./ 30 с, із люмінолом 222,9 ± 3,1 імп./ 30 с.
Таким чином, установлена наявність достовірного зв'язку між темпами нагромадження продуктів ПОЛ, концентрацією АФК у тканинах слизової оболонки при запаленні і темпами загоєння раневих осередків після різнотемпературних видів впливів.
При визначенні активності ферментів глутатіонредуктази (ГР) і глутатіонпероксидази (ГП) видно, що при усіх видах впливів активність глутатіонзалежних ферментів змінювалася, хоча динаміка змін є різною (мал.3 і мал.4).
ал.3. Зміна активності ГР після різних видів впливу на слизову оболонку порожнини рота щурів: 1 –кріодеструкція; 2 –діатермокоагуляція; 3 –комбінований вплив; 4 –контроль.
Мал. 4. Зміна активності ГП після різних видів впливу на слизову оболонку порожнини рота щурів: 1 –кріодеструкція; 2 –діатермокоагуляція; 3 –комбінований вплив; 4 –контроль.
При кріовпливі активність ГР у 1-у добу вірогідно (р<0,05) знижувалася стосовно контролю –на 37,3 % (з 11,0 ± 1,1 до 6,9 ± 0,7 мкмоль НАДФН/г хв). Діатермокоагуляція та комбінований вплив на слизову оболонку призводили на 1-у добу приблизно до такого ж зниження активності ГР, як і після кріовпливу (6,7 ± 1,0 мкмоль НАДФН/г хв та 6,1 ± 0,5 мкмоль НАДФН/г хв, відповідно), однак подальші темпи відновлення активності фермента були різними. Активність ГП у 1-у добу після кріовпливу вірогідно (р<0,05) знижувалася стосовно контролю - на 15,5 % (з 97,0 ± 1,0 до 82,0 ± 8,0 мкмоль GSH/г хв), а після діатермокоагуляції та комбінованого впливу –на 23,7 % (74,0 ± 3,0 мкмоль GSH/г хв) і на 27,9 % (69,9 ± 5,8 мкмоль GSH/г хв), відповідно.
Активність ферментів системи глутатіону при кріодеструкції відновлюється швидше стосовно контролю, ніж при інших видах впливу: після кріодеструкції відновлення активності ГР і ГП спостерігали до 3-ої добі; після діатермокоагуляції активність ГП відновлювалася до 21-ої доби, а активність ГР до 21 доби залишалася зниженою на 28,2 % (7,9 ± 0,6 мкмоль НАДФН/г хв); після комбінованого впливу активність ферментів ГР і ГП до 21-ої доби також не відновлювалася і залишалася зниженою на 31,8% (7,5 ± 1,5 мкмоль НАДФН/г хв) і 17,7% (80,2 ± 4,3 мкмоль GSH/г хв), відповідно. Зміна активності ГП була виражена менше, ніж ГР при усіх видах впливу.
Таким чином, установлено, що при кріодеструкції активність ферментів системи глутатіону знижується в меншому ступені і відновлюється швидше стосовно контролю, ніж у двох інших групах спостережень.
При кріодеструкції ми можемо говорити про кращий перебіг регенерації, менший рівень концентрації продуктів ПОЛ у тканинах слизової оболонки порожнини рота щурів і більший рівень активації ферментів захисної антиокисної системи. Отримані результати свідчать про існування тісного взаємозв'язку нагромадження токсичних продуктів ПОЛ у тканинах слизової оболонки при запаленні й активності ферментів глутатіонзалежної антиоксидантної системи, а також їхнього спільного впливу на рівень проліферативних пластичних процесів.
Очевидно, більш глибокі порушення метаболізму тканин при діатермокоагуляції і комбінованому впливі значною мірою обумовлені посиленням процесу утворення ліпідних перекисів і недостатньо високою ефективністю їхнього знешкодження, чим і можна пояснити розходження в перебігу відбудовних процесів при різнотемпературних деструкціях. Дані експерименту підтверджують перспективність застосування методу кріодеструкції в клінічній практиці.
В групі тварин, яким застосовували в післяопераційному періоді після кріодеструкції водно-сольовий екстракт плаценти “Плацентек” у вигляді аплікацій з експозицією 20-25 хв з метою стимуляції процесів регенерації вміст продуктів ПОЛ у тканинах відновлювался швидше і вже до 3-4-ої доби вірогідно (р<0,05) не відрізнявся від контролю (табл. 2), тоді як при кріовпливі вміст кінцевих продуктів ПОЛ вірогідно не відрізнявся від контролю до 8-10-ої доби. При застосуванні “Плацентека” на 3-ю добу вміст МДА у тканинах слизової оболонки склав 145,30 ± 5,16 нмоль/г, що істотно (р < 0,05) нижче у порівнянні з 162,94 ± 8,14 нмоль/г при кріовпливі На 10 добу –вміст МДА (141,22 ± 5,11нмоль/г) у тканинах також нижче після застосування “Плацентека” в післяопераційному періоді, чим в групі тварин, де після кріовпливу цей стимулятор не застосовувся (156,04 ± 7,44 нмоль/г).
Опираючись на дані проведеного експерименту, ми вважили за доцільне включити даний препарат у комплексне лікування передракових захворювань порожнини рота и дослідили його регенеративну активність в клініці.
Таблиця 2
Кількісний вміст МДА в тканині після кріовпливу на слизову оболонку порожнини рота щурів та кріодеструкції із застосуванням “Плацентека”,нмоль/г.
|
Види впливу |
Терміни дослідження, доба |
|
Кріодеструкція |
201,24±11,31** |
,94 ±8,14** |
156,04 ± 7,44 |
,25 ± 6,47 |
|
Кріо+ “Плацентек” |
,30 ± 5,16* |
,22 ± 5,11* |
,81 ± 5,95 |
*- р<0,05 відносно групи з кріовпливом;
** - р<0,05 відносно контроля.
Дані клінічних спостережень за 94 хворими з передраковими й пухлиноподібними захворюваннями порожнини рота, що пройшли лікування методами кріодеструкції (63 хворих) і діатермокоагуляції (31 хворий) доводять відомі переваги кріотерапії: безкровність, мінімальну хворобливість під час проведення операції, більш сприятливий перебіг післяопераційного періоду.
Для проведення кріодеструкції був використаний кріоорошувач автономний стоматологічний - КАС-01, розроблений у ФТІНТ АН України разом з кафедрою терапевтичної стоматології ХМАПО. За допомогою КАС -01 створюється парорідинний струмінь рідкого азоту (-196С), який направляється на тканини, що підлягають кріодеструкції. Це дає можливість візуального спостереження за зоною, що проморожується, на відміну від кріозондів, де робоча частина наконечника безпосередньо контактує з тканиною. Діатермокоагуляцію проводили за допомогою апарату ДКС-2М. На відміну від кріодеструкції, дане втручання проводили під надійною місцевою анестезією, уникали контакту активного електрода з неушкодженими ділянками слизової оболонки, у разі потреби очищали активний електрод від некротизованих плівок.
Темпи регенерації тканин слизової порожнини рота після різнотемпературної деструкції порівнювали за такими показниками як наявність набряклості навколишніх тканин, утворення некротичної плівки і відторгнення некротичних мас, початок і повна епітелізация раневого осередку. У порівнянні з діатермокоагуляцією, кріодеструкція дозволяє скоротити терміни загоєння слизової оболонки в середньому з 16,4 ± 3,2 до 11,2 ± 0,9 доби, а коли в післяопераційному періоді застосовувався препарат "Плацентек" (25 хворих) –до 5,9 ± 0,4 доби.
Таблиця 3
Динаміка регенерації слизової оболонки після різних видів впливу
|
Види впливу |
Зміна стану тканин (доба) |
|
Набряк |
Утворення некротизованої плівки |
Відторгненя струпу |
епітелізація |
||
|
початок |
закінчення |
||||
|
кріодеструкція |
1,2±0,6*** |
2,2 ± 0,5 |
6,1±1,2*** |
7,3 ± 0,6 |
11,2±0,9**,*** |
|
кріо+”Плацентек” |
1,1±0,5*** |
1,9 ± 0,7 |
4,2±1,2*** |
4,6±0,7*,*** |
,9 ± 0,4*,*** |
|
термокоагуляція |
7,5±1,1*,** |
0” |
10,5±1,5*,** |
,5±2,7*,** |
16,4 ± 3,2*,** |
0” –безпосередньо після впливу
*- вірогідно стосовно групи з кріодеструкцією (р<0,05); ** - р<0,05 стосовно групи кріо+”Плацентек”;***- р<0,05 стосовно групи з діатермокоагуляцією.
Застосування препарату “Плацентек” у вигляді аплікацій дозволило досягти стійкого терапевтичного ефекту, скоротити терміни загоєння слизової оболонки, після епітелізації патологічного осередку спостерігали мінімальні рубцеві деформації навіть у випадках із великою площею ураження й у хворих літнього віку зі свідомо зниженою регенеративною здатністю тканин. Виявлена терапевтична дія цього біостимулятора пов'язана насамперед із присутністю в ньому природних антиоксидантів, біологічно активних речовин у нативній формі –найкращій для засвоєння, що сприяє їхньому ефективному впливу на репаративні процеси у тканинах, захисту клітинних мембран від агресивних активних форм кисню (вільні радикали), запобіганню розвитку ПОЛ, підтримці рівня колагену і протеїну.
Безпосередні і віддалені результати проведеного лікування показали, що при лікуванні методом кріодеструкції рецидив виник лише в одного хворого з 63 (1,6 ± 0,4%), а при лікуванні методом діатермокоагуляції –у трьох хворих з 31 (9,7 ± 0,7%).
Дані проведеного дослідження показали важливу роль вільнорадикальних процесів у загоєнні патологічних осередків після різнотемпературних видів впливів. Динаміка процесів ПОЛ у тканинах, що регенерують, є різною і найбільш сприятливо ці процеси протікають після кріодеструкції (менша концентрація продуктів ПОЛ, найшвидше зниження їх вмісту у тканинах), що свідчить про перевагу методу кріодеструкції перед діатермокоагуляцією.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації приведені теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, що стосується регенерації слизової оболонки порожнини рота в порівняльному аспекті після кріодеструкції, діатермокоагуляції і їхнього комбінованого впливу. Проведені дослідження показали, що важливу роль у механізмі більш сприятливого загоєння ран після кріодеструкції відіграють вільнорадикальні процеси, що регулюють перебіг тканинних метаболічних процесів, дозволили обґрунтувати перевагу кріодеструкції перед іншими видами впливів на тканини слизової оболонки порожнини рота і можуть бути використані в наступних дослідженнях з вивчення патогенезу регенерації тканин після кріодеструкції.
2. При кріодеструкції спостерігається менший рівень продуктів ПОЛ у тканинах слизової оболонки порожнини рота і найшвидше зниження їх вмісту у тканинах стосовно контролю, ніж при їнших видах впливів: вміст ДК і МДА в першу добу після кріодеструкції збільшився на 29,2 % і 43,6% стосовно контролю, при діатермокоагуляції на 43,9 % і 106,8 %; при комбінованому впливі –на 63,4 % і 115,9 %, відповідно; вміст ДК і МДА після кріодеструкції вірогідно не відрізнявся від контролю вже на 10-у добу, а при діатермокоагуляції –до 21-ої доби був вище стосовно контрольних величин на 20,8 % і 21,4 %; при комбінованому впливі –на 26,8 % і 30,7 %, відповідно. Присутність активних форм кисню в тканинах є мінімальною після кріовпливу і більш вираженою після діатермокоагуляції і комбінованого впливу: максимум інтенсивності ХЛ із люмінолом у першу добу після кріодеструкції був вищим у порівнянні з контролем на 34,5 %, а при двох інших видах впливу –на 44,2 % і 49,8 %, відповідно.
3. Вміст ДК і МДА в тканинах слизової порожнини рота щурів після застосування в післяопераційному періоді після кріодеструкції водно-сольового екстракту плаценти “Плацентек” відновлювался швидше стосовно кріодеструкції і вже до 3-4-ої доби вірогідно не відрізнявся від контролю, тоді як при кріовпливі вміст кінцевих продуктів ПОЛ вірогідно не відрізнявся від контролю лише до 8-10-ої доби.
4. Активність ферментів системи глутатіона при кріодеструкції знижується в меншому ступені і відновлюється швидше стосовно контролю, ніж при інших видах впливів: активність ГП у першу добу після кріодеструкції знизилася на 15,5 % стосовно контролю, а після двох інших видів впливів – на 23,7 % і 27,9 %, відповідно; після кріодеструкції відновлення активності ГР і ГП спостерігали до 3-ої добі; після діатермокоагуляції активність ГП відновлювалася до 21-ої доби, а активність ГР до 21 доби залишалася зниженою на 28,2% стосовно контролю; після комбінованого впливу активність ферментів ГР і ГП до 21-ої доби також не відновлювалася і залишалася зниженою відносно контролю на 31,8% і 17,7%, відповідно.
5. Структурні та імуноморфологічні дослідження показали, що темпи регенерації слизової оболонки не однакові при різних видах впливів і найкращі при кріодеструкції, коли визначали меншу лейкоцитарну інфільтрацію осередку ураження, більш швидке підвищення процентного вмісту Т и В лімфоцитів –збільшення кількості CD-3,CD-5 (Т-лімфоцити) і CD-22 (В-лімфоцити) спостерігали вже на 3-ю добу після впливу, а після діатермокоагуляції і комбінованого впливу –лише після 10-ої доби. Також при кріодеструкції відзначали перевагу Т-хелперів над Т-супресорами вже до 3-ої доби після впливу, на відміну від двох інших видів впливів, коли дану особливість відзначали лише після 10-ої доби.
6. При кріовпливі спостерігали більш високий ступінь дозрівання сполучної тканини (наявність I і III типів колагенів, що збігаються за локалізацією), що виявляється мінімумом утворення рубцевої тканини. При двох інших видах впливів зони локалізації інтерстиціальних колагенів не збігалися, переважав колаген III типу.
. Порівняльна оцінка методу кріодеструкції і діатермокоагуляції в клініці при лікуванні передракових захворювань слизової порожнини рота і червоної облямівки губ показала, що кріодеструкція дозволила скоротити терміни загоєння слизової в середньому з 16,4 ± 3,2 до 11,2 ± 0,9 доби, а коли в післяопераційному періоді застосовувався препарат “Плацентек” –до 5,9 ± 0,4 доби. При кріодеструкції спостерігали менший відсоток ускладнень (1,6 ± 0,4%), ніж при діатермокоагуляції –,7 ± 0,7 %.
. Проведені клінічні дослідження препарату фетальних тканин “Плацентек” показали доцільність його застосування в комплексному лікуванні передракових і пухлиноподібних захворювань порожнини рота.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЇ
Родіонова Н.Л. Регенерація тканин слизової оболонки порожнини рота при кріо- і термодеструкціях. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 - кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2002 р.
Вивчено вплив вільнорадикальних процесів на регенерацію слизової оболонки порожнини рота після кріодеструкції, діатермокоагуляції та їхньої комбінованої дії. Отримані результати свідчать про існування тісного взаємозв'язку між концентрацією продуктів ПОЛ у тканинах слизової оболонки порожнини рота, зміною активностей ферментів системи глутатіона, а також їхнього спільного впливу на рівень проліферативних пластичних процесів після всіх видів деструкції тканин. При кріодеструкції спостерігали наименьший вміст продуктів ПОЛ в тканинах слизової оболонки та найшвидше їх зниження відносно контролю у порівнянні з діатермокоагуляцією та комбінованим впливом. Показано, що важливу роль у механізмі більш сприятливого загоєння ран після кріодеструкції відіграють вільнорадикальні процеси, що регулюють перебіг тканинних метаболічних процесів.
Установлено достовірний зв'язок між темпами загоєння раневих дефектів після різнотемпературної деструкції, зміною якісного складу імунокомпетентних клітин та типами колагену у зоні впливу. Проведені дослідження підтвердили доцільність застосування препарату “Плацентек” в комплексному лікуванні хворих на передракові і пухлиноподібні захворювання порожнини рота.
Ключові слова: передракові захворювання слизової оболонки порожнини рота, кріодеструкція, діатермокоагуляція, регенерація слизової оболонки, вільнорадикальні процеси, перекисне окислення ліпідів, ферменти системи глутатіона.
Родионова Н.Л. Регенерация тканей слизистой оболочки полости рта при крио- и термодеструкциях. –Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2002 г.
Изучено влияние свободнорадикальных процессов на регенерацию слизистой оболочки полости рта после криодеструкции, диатермокоагуляции и их комбинированного воздействия. Исследована динамика интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах тканей слизистой оболочки полости рта крыс, состояние ферментативной антиоксидантной системы, изучены структурные и иммуноморфологические изменения в слизистой оболочке в динамике регенерации.
Показано, что наиболее интенсивно процесс регенерации протекал после криодеструкции и к 10 суткам завершался полной эпителизацией. Установлена достоверная связь между темпами заживления раневых дефектов после разнотемпературной деструкции и изменением качественного состава иммунокомпетентных клеток, типов коллагена в зоне воздействия.
Интенсивность ПОЛ оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) и диенових коньюгат (ДК). Установлено, что динамика уровня ПОЛ отличается при различных видах деструкции слизистой оболочки. При криодеструкции наблюдалось незначительное увеличение —в первые сутки, соответствующие фазе травматического воспаления, и более быстрое снижение концентрации ДК и МДА относительно контроля по сравнению с двумя другими видами воздействия —начиная с 3-их суток, соответствующих началу образования грануляционной ткани и пролиферативной фазе воспаления. В двух других группах —с разной интенсивностью —уровень концентрации ДК и МДА был достоверно выше относительно контроля и имел 2 пика: на 1-2 сутки, соответствующие фазе воспаления, и на 8-10 сутки после нанесения раны, что соответствует фазе пролиферации. При криодеструкции наблюдали наименьшую концентрацию продуктов ПОЛ в тканях слизистой и наиболее быстрое их снижение относительно контроля по сравнению с диатермокоагуляцией и комбинированным воздействием. С целью дальнейшего уточнения процессов ПОЛ была проведена спонтанная и люминолиндуцированная хемилюминесценция (ХЛ). Показано, что наименьшее содержание активных форм кислорода наблюдалось в тканях слизистой оболочки после криодеструкции.
Состояние ферментативной антиоксидантной системы оценивали по изменению активностей ферментов глутатионредуктазы (ГР) и глутатионпероксидазы (ГП) в различные сроки исследования после деструкции. Установлено, что активность глутатионсодержащих ферментов изменяется подобным образом при всех видах воздействий,хотя динамика изменений различна. При криовоздействии в 1-е сутки (соответствующие фазе альтерации), активность фермента снижалась. Потом, начиная с 3-их суток, соответствующих началу образования грануляционной ткани и пролиферативным процессам в базальном слое эпителия, постепенно увеличивалась и нормализовалась. При диатермокоагуляции и комбинированном воздействии (с различной интенсивностью) активность ферментов, также как и после криовоздействия снижалась в первые сутки, но в большей степени, а потом постепенно нормализовалась к 21-м суткам. При криовоздействии течение регенерации наиболее благоприятно, активность ферментов снижается в меншей степени и воостанавливается быстрее относительно контроля в сравнении с двумя другими видами воздействий, то есть уровень активации ферментов защитной антиокислительной системы выше.
Полученные результаты свидетельствуют про наличие тесной взаимосвязи между концентрацией продуктов ПОЛ в тканях слизисой оболочки полости рта, изменением активностей ферментов системы глутатиона и уровнем пролиферативных пластических процессов после всех исследуемых видов деструкции тканей.
Также исследовано влияние препарата “Плацентек” на регенерацию тканей слизистой оболочки полости рта после локальной криодеструкции предраковых и опухолеподобных заболеваний в клинике. Выявлено его эффективное терапевтическое действие.
Проведенные исследования показали, что важную роль в механизме более благоприятного заживления ран после криодеструкции играют свободнорадикальные процессы, регулирующие течение тканевых метаболических процессов. Эти показатели могут быть использованы как для изучения механизмов заживления ран, так и для разработки патогенетической терапии и оценки её эффективности.
Ключевые слова: предраковые заболевания слизистой оболочки полости рта, криодеструкция, диатермокоагуляция, регенерация слизистой оболочки, свободнорадикальные процессы, перекисное окисление липидов, ферменты системы глутатиона.
Rodionova N.L. Regeneration of mucous oral cavity tissues at cryo- and thermodestruction. –Manuscript.
The thesis for obtaining the degree of candidate of medical sciences on the specialty 14.01.35 –cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2002.
The study of the effect of free radical processes on the regeneration of mucous oral cavity tissues at cryodestruction, diathermocoagulation and their combined effect has been performed. Obtained results testify to the existence of a tight dependence of the accumulation of LPO toxic products in mucous membrane tissues, as well as gluthathione system enzymes activity and their common effect on the rate of proliferative plastic processes after all types of tissue destruction. During cryodestruction we have observed a less level of LPO product concentration in tissues of rat mucous membrane and more rapidly its decrease in respect to the control in comparison with diathermocoagulation and combined effect. It has been established, that significant role in more favorable wound healing after cryodestruction is played by free radical processes, regulating the course of tissue metabolic processes.
The presence of a statistically significant connection between the regeneration rates at different types of a temperature damage and the change of the qualitative composition of immunocompetent cells, types of collagen in an injury site have been established. Investigations, carried-out by us, confirmed the expediency of the “Placentek” preparation application in a complex treatment of the patients with pre-cancerous disease of mucous membrane of the oral cavity.
Key words: рrecancerous disease of mucous membrane of oral cavity, сryodestruction, diathermocoagulation, regeneration of mucous oral cavity tissues, lipid peroxidation, free radical processes, gluthathione system enzymes.