Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Билет 9.
1.Импорт белков в ядро клетки.
Ядерный поровый комплекс супрамолекулярная структура с молекулярной массой более 125 мДа (у позвоночных), состоящая из более 1000 белков.
Строение ядерной поры:
Ядерные поры сложно устроенные, многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками нуклеопоринами.Коровая часть-заякорена в ядерной оболочке, состоит из восьми доменов, ограничена цитоплазматическим и ядерным кольцами.
Пассивный транспорт
Разные молекулы-разная скорость.
Через ядерную оболочку беспрепятственно в обе стороны происходит пассивный транспорт высокомолекулярных соединений, имеющих массу не более 5 кДа ( в Википедии проходят до 50, 60-70 уже активно)
Активный транспорт
Путём активного транспорта через ядерные поры могут проходить гораздо более крупные молекулы и целые надмолекулярные комплексы (рибосомные субчастицы, например). Причем одни белки должны поступать в ядро конститутивно (например, гистоны), а другие в ответ на определенные стимулы (например, транскрипционные факторы).
Белки должны обладать сигнальными последовательностями. Самая распространенная- NLS- один или два участка положительно заряженных аминокислот, аргинина и лизина.
Впервые аминокислотные последовательности ядерной локализации (NLS) были обнаружены на С-конце субъединиц нуклеоплазмина (ядерный белок, принимающий участие в структуризации хроматина). Если удалить примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни весь нуклеоплазмин, ни его мономеры в ядро не попадают.
Транслокация белков в ядро, в отличие от транслокации в митохондрии и ЭПР, не сопровождается отщеплением этой сигнальной последовательности и разворачиванием полипептидной цепи!
Белок с NLS проходит в ядро в несколько этапов:
1) Связывание NLS с рецептором, импортинами (α и β) и закрепление на цитоплазматических филаментах порового комплекса;
2) Постепенный проход этого комплекса через пору (импортины якобы разрыхляют пространство внутри поры);
3) Импортин β связывается с белком RAN (малая ГТФаза, гидролиз ГТФ делает этот процесс необратимым), происходит распад комплекса (NLS не отщепляется). Импортины возвращаются в цитоплазму (β-импортин в составе с RAN).
2.Определение аминокислотной последовательности белков с помощью секвенаторов.
Секвенирование по Эдману (1960).
Побочная реакция- в присутствии кислорода ФТК- производное пептидов десульфируется и не расщепляется. Также возможно блокирование аминогруппы альдегидами, находящимися в растворе с образованием основания Шиффа
Проблема здесь: если следующая аминокислота глутамин, то возможно превращение в пироглутамин, блокируется дальнейшая деградация.
А в случае связи Asn-Gly происходит образование циклического имида,затем альфа,бета-транспептидация, в итоге Эдман также блокируется.
Аминогруппа треонина серина легко гидролизуется в водной среде.Побочные реакии по остаткам аргинина и гистидина.
Существует большое число аналогов ФИТЦ, которые образуют тиогидантоины, обладающие рядом преимуществ по сравнению с ФТГ.
Наибольшее распространение получил (ДАБИТЦ).
В 1976 Эдманом и Бэггом был создан прототип автоматического жидкофазного секвенатора, где реакции были стандартизированы, был исключён контакт образца (нанесён на твёрдую подложку из квадрола (нековалентно связан)) с воздухом, что привело к увеличению выхода реакции отщепления до 95%.
Далее группой под руководством Ларсена было придумана иммобилизация белка через различные боковые радикалы (в том числе по С-концу) на полистирольную матрицу (ковалентная иммобилизация).
В 1981 году Худ и Ханкепиллер сконструировали газофазный секвенатор. Хитрая конструкция позволила значительно уменьшить расход реактивов, растворителей и исследуемого образца белка (до 100-500 пмоль).
Подробнее со стр. 57 учебника Овчинникова.
3.N- и O-гликозилирование белков в гликопротеинах.
Гликопротеины белки, содержащие ковалентно связанный углеводный компонент. Делят на 2 класса по количеству связанных олигосахаридных цепочек: протеогликаны количество олигосахаридных цепочек многократно превышает пептидную часть; собственно гликопротеины сладенького понемножку.
Углеводный остаток присоединяется к амидному азоту остатка аспарагина (желательна непосредственная близость гидроксиаминокислот). Первым моносахаридным звеном обычно оказывается N-ацетилглюкозамин, так что «узел» присоединения имеет следующую структуру:
N-гликозидная связь легко расщепляется в кислой среде,
В гликопротеинах этого типа к остатку аспарагина присоединен олигосахарид, в котором к «узловому» остатку N ацетилглюкозамина присоединен еще один остаток N-ацетилглюкозамина, далее следуют несколько остатков маннозы, галактозы, нейраминовой кислоты, фукозы и др.
Биосинтез N-гликопротеинов происходит в шероховатом ретикулуме, причём на амидную группу Asn переносится сразу большой-большой олигосахарид, включающий глюкозу, маннозу, ацетилглюкозамин, который подвергается процессингу (обязательное удаление глюкозы и удаление/добавление других сахаров).
Остается ядро, к которому присоединяются другие сахара.
Дальнейшие реакции специфичны, вот как пример
N-гликозилирование характерно для секреторных белков, попадающих в ЭПР, хотя оно не является непременной предпосылкой секреции.
Углеводный остаток присоединяется к оксигруппе Ser или Thr (однозначного сиквенса для гликозилирования нет). Первый моносахарид N-ацетилгалактозамин.
Биосинтез ступенчатый, всё по порядку, количество моносахаридов не такое большое. О-гликозилирование свойственно веществам, определяющим группу крови (муцины).
Углеводный компонент почти никогда не входит в состав каталитического центра, наличие гликозилирования обычно не влияет на скорость ферментативной реакции. Зато олигосахариды в составе гликопротеинов участвуют в процессах межклеточного узнавания, дифференциации, трансформации клеток, связывании гормонов с рецепторными белками.