Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ
IНСТИТУТ БIООРГАНIЧНОЇ ХIМIЇ ТА НАФТОХIМIЇ
ОГНЯНИК Степан Сергійович
УДК 547.853.85:541.67
CИНТЕЗ ГЛІКОЗИДНИХ ТА ПСЕВДОГЛІКОЗИДНИХ
ПОХІДНИХ 6-АЗАУРАЦИЛУ ТА 6-АЗАЦИТОЗИНУ
02.00.10 - Біоорганічна хімія
Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України
Науковий керівник
кандидат хімічних наук
Шаламай Анатолій Севастьянович
Науково-виробничий центр “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”
заст. ген. директора з наукових питань
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор
Мірошниченко Микола Степанович
Київський держуніверситет ім. Тараса Шевченка
завідувач кафедри біофізики
кандидат хімічних наук
Приказчикова Людмила Петрівна
Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України
в.о. провідного наукового співробітника відділу хімії біоактивних азотвмісних гетероциклічних основ
Провідна установа:
Інститут органічної хімії НАН України
відділ хімії біологічно активних речовин, м. Київ
Захист відбудеться “ 28 ” травня 1999 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (253660, Київ, вул. Мурманська, 1)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (253660, Київ, вул. Мурманська, 1)
Автореферат розісланий “28” квітня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д.М.Федоряк
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Синтетичні нуклеозиди та їх аналоги здавна викликають підвищений інтерес. По-перше, сполуки даного класу необхідні для дослідження фундаментальних проблем молекулярної біології та медицини, де вони знайшли широке застосування як модельні речовини, структурно близькі до природних метаболітів нуклеїнового обміну. З іншого боку, аномальні нуклеозиди привертають увагу як ефективні хіміотерапевтичні препарати, активність яких зумовлена здатністю впливати на процеси біосинтезу та біотрансформації нуклеїнових кислот.
N1-глікозиди заміщених 6-азапіримідинів є структурними аналогами нуклеозидів піримідинового ряду, що відрізняються від природних заміною в агліконі СН-групи на атом азоту. Ці сполуки не тільки успішно застосовуються як модельні субстрати у вивченні процесів метаболізму нуклеїнових кислот, - деякі з них (наприклад, 6-азауридин, 6-азацитидин) широко використовуються в медицині як антимікробні, противірусні, протипухлинні препарати. Новий імпульс вивченню азануклеозидів надало встановлення імуномодулюючої активності 6-азацитидину, нехарактерної для нуклеозидних препаратів. Враховуючи очевидну перспективність пошуку нових терапевтичних засобів серед азапіримідинових нуклеозидів та їх аналогів, гостроактуальною є розробка ефективних методів хімічного синтезу сполук даного класу.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка методів синтезу нових нуклеозидних похідних 6-азапіримідинів та їх ациклічних аналогів. У зв’язку з цим було необхідно:
вивчити глікозилювання алкільованих 5-заміщених 6-азапіримідинів та їх тіоаналогів, в першу чергу 5-амінокислотних похідних азапіримідинових нуклеозидів;
дослідити різні підходи до синтезу неглікозидних аналогів відомих триазинових нуклеозидів (6-азауридину та 6-азацитидину);
провести комплексне вивчення структури, хімічних та біологічних властивостей синтезованих 6-азапіримідинових нуклеозидів та їх ациклічних аналогів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в процесі глікозилювання та алкілювання похідних 6-азапіримідинів методом “силільної конденсації” використано одночасну активацію аглікона та глікозидного компонента, що методично дає змогу об’єднання процесів силілювання та алкілування. Така одностадійна схема з успіхом була реалізована як в синтезах глікозидів 6-азапіримідинів, так і в синтезах ациклічних похідних 6-азацитидину. Запропоновано новий підхід до одержання 5-алкіламінопохідних 6-азапіримідинів - гетероциклічних компонентів нуклеозидного синтезу.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Вивчено закономірності глікозилювання та алкілювання заміщених 6-азапіримідинових основ в умовах одностадійного варіанту силільного методу синтезу нуклеозидів. Виявлено відмінності в механізмах взаємодії аглікона з вуглеводним та невуглеводним компонентом, що в останньому випадку веде до втрати регіоспецифічності реакції глікозилювання. Визначено вплив С5-алкіламінозамісників 6-азапіримідинів на реакційну здатність гетероциклів у реакціях з перацильованими вуглеводами. Показано, що С5-алкіламінозамісники суттєво знижують реакційну здатність положення С4 по відношенню до нуклеофільних реагентів, що дозволяє проводити селективне заміщення в положенні С2 триазинового кільця. На основі отриманих даних розроблено препаративну схему отримання N1-глікозидів заміщених 6-азапіримідинонів та 6-азапіримідинтіонів. Отримано патент України N1785 на спосіб отримання 6-азацитидину - терапевтичного препарату широкого спектру дії.
Особистий внесок дисертанта. Експериментальна частина роботи, аналіз спектральних даних та встановлення структури синтезованих сполук виконані особисто дисертантом. Опубліковані разом із співавторами матеріали, що ввійшли до дисертації, одержані за безпосередньою участю дисертанта.
Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на конференціях молодих учених (Кишинів, 1986; Рига, 1989), міжнародному симпозіумі по антивірусних препаратах (Рига, 1989), на конференції по хімії природних сполук (Рига, 1990), XVII українській конференції з органічної хімії (Харків, 1995).
Публікації. За матеріалами роботи опубліковано 10 праць, з них 4 статті в наукових фахових журналах, тези 5 доповідей, отримано патент України N1785.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу (розділ I), огляду літератури (розділ II), обговорення результатів (розділи III-IV), експериментальної частини (розділ V), висновків та списку літератури, що містить 130 найменувань. Робота включає 18 схем та 13 таблиць. Загальний обсяг дисертації -131 стор.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
"Силільна конденсація" в синтезі N-глікозидів 5-заміщених
6-азаурацилів
Основною стадією синтезу нуклеозидів методом "силільної конденсації" є взаємодія силільованих гетероциклічних основ з відповідними похідними вуглеводів, найчастіше перацильними, в присутності певних каталізаторів. 5-Карбоксиалкіламінопохідні азапіримідинів легко силілювались сумішшю гексаметилдисилазану (ГМДС) та триметилхлорсилану (ТМХС). Показано, що 2-тіопохідні 6-азапіримідинів силілювались вдвічі швидше їх оксоаналогів. 5-Карбоксиалкіламіно-6-азапіримідинові нуклеозиди одержували за допомогою конденсації триметилсилільних естерів гетероциклічних основ з перацильованими вуглеводами в 1,2-дихлоретані в присутності тетрахлориду олова при кімнатній температурі (Рис. 1).
Рис. 1
Вивчено вплив різних факторів на процес конденсації. Показано, що поряд з електронною природою гетероциклічної основи, будова вуглеводного компонента позначається на виході продуктів реакції глікозилювання. Так, N1-рибофуранозиди 5-заміщених 6-азаурацилів було одержано з більшими виходами (85-87%), ніж відповідні глюко-, арабіно- та ксилопіранозиди. Природа ацильних захисних груп при гідроксилах вуглеводного компонента теж впливає на утворення ацилнуклеозидів. Наприклад, вищі виходи трибензоатів рибофуранозидів порівняно з виходами триацетильних похідних можуть пояснюватись більшою стабільністю ацилоксонійового катіона, утвореного за участю 2'-О-бензоїльної групи рибози. Встановлено, що суттєвий вплив на характер протікання "силільної конденсації" та вихід її продуктів має молярне співвідношення каталізатора та перацильованого вуглеводу (n). Оптимальними можна вважати значення n близькі 0,7, хоча застосування більшої кількості каталізатора в деяких випадках є необхідним, особливо у випадку утворення достатньо стабільних -комплексів між каталізатором та силільованою основою. При глікозилюванні метилового та бутилового естерів 5-карбоксиметиламіно-6-азаурацилу було показано, що лабільність складноестерної групи в умовах "силільної конденсації" приводить до утворення суміші глікозидів. Навіть при невисокій концентрації тетрахлориду олова в невеликій кількості утворюються ацилнуклеозиди з омиленою естерною групою. Проведення конденсації в присутності мольної долі каталізатора, що перевищує одиницю, малоприйнятне для отримання продуктів зі складноестерною функцією. З іншого боку, такий пеpебiг pеакцiї дає можливiсть отpимувати нуклеозид з вiльною каpбоксильною функцiєю, що інколи має принципове значення. Так, одержання нуклеозидів 5-карбоксиметиламiно-6-азаурацилу шляхом глікозилювання гетероциклу неможливе внаслiдок pуйнування останнього пiд час стадiї силiлювання. Однак це легко можна досяги в умовах конденсації з відповідним естером з одночасним омиленням продукта (Рис. 2).
Рис. 2
Цiкаво вiдзначити, що пpи глiкозилюваннi 2-тіо-5-карбоксиалкіламіно-6-азаурацилу та його похiдних в умовах "силiльної конденсацiї" pозpиву складноестерного угpупування не спостеpiгалось. Можна пpипустити, що в зазначених сполуках стабiльнiсть каpбметоксильних гpуп забезпечується електpонним впливом атому сipки в другому положеннi гетеpоциклiчного залишку. Крім того, слід відзначити також, що конденсація силільованих 2-тіопохідних з вуглеводними компонентами відбувається значно швидше, ніж для азапіримідиндіонів. Це зв'язано з підвищенням нуклеофільності N1-атома при заміні атома кисню в положенні С2 гетероциклу на менш електронегативну сірку. Коротший час проведення реакції також сприяв збереженню складноестерної функції.
Великий інтерес викликало проведення конденсації заміщених 6-азапіримідинів в умовах спрощеного одностадійного варіанту "силільної конденсації" (Рис. 3). Суміщення процесів отримання силільних естерів та взаємодії останніх з перацильованими вуглеводами в присутності SnCl4 дало змогу суттєво спростити процес глікозилювання та скоротити загальний час синтезу нуклеозидів без зниження їх виходу.
Для проведення конденсації до відповідного 5-заміщеного гетероцикла в абсолютному розчиннику додавали еквімолярні кількості ГМДС, ТМХС, ацильованого вуглеводу та SnCl4. Каталізатор в цих умовах починає виконувати свої функції лише при 20% надлишку відносно гетероциклу. Ймовірно, це зв'язано з утворенням -комплексу SnCl4 з основою. Було встановлено, що оптимальним є співвідношення 1,4 екв. каталізатора відносно гетероциклу. Час проведення власне реакції конденсації був таким же, як і у двостадійному варіанті силільного методу, однак виключення попередньої стадії силілювання гетероциклів дало змогу скоротити загальну тривалість процесу отримання нуклеозидів більш ніж вдвічі.
Рис. 3
В цих умовах 2-тiо-5-карбоксиалкіламінопохiднi 6-азаурацилу pеагували з пеpацильованими вуглеводами з високим виходом (>90%), причому тpивалiсть pеакцiї не пеpевищувала 30-45 хв.
Напpавленiсть глiкозилювання 5-заміщених азапіримідинів, тобто N1- чи N3-глiкозидну пpиpоду отpиманих 6-азануклеозидiв встановлювали на основi поpiвняльного вивчення УФ-спектpiв N-глiкозильних, N1- та N3-метильних похiдних, а також спектрів вихідних гетероциклів.
В УФ-спектрах вихідних основ та отриманих нуклеозидів при різних значеннях pH середовища як у групі оксо-, так і тіопіримідинів спостерігалась чітка кореляція як з літературними даними для N1- чи N3-похідних, так і зі спектрами модельних сполук - N1- та N3-метильних похідних 6-азапіримідинів. Таким чином, завдяки даним УФ-спектpiв азапіримідинів та їх похiдних вдалось довести N1-глiкозидну будову 5-заміщених 6-азануклеозидiв.
За допомогою спектpiв ПМР була встановлена -аномеpна будова N-глiкозидiв 6-азапіримідинів та їх 5-замiщених похiдних.
Отримання 6-азацитидину та його похідних в умовах спрощеного варіанту "силільної конденсації"
6-Азацитидин відомий як активний протипухлинний та противірусний препарат. Значний науковий та практичний інтерес викликало вивчення можливості використання для його синтезу одностадійного варіанту методу "силільної конденсації".
Розроблений нами підхід (Рис. 4) базується на конденсації 4-тіо-6-азаурацилу 1а з тетраацетатом рибози в присутності силілюючих агентів та SnCl4 як каталізатора в умовах спрощеного варіанту силільного методу нуклеозидного синтезу. Реакцію проводили в абсолютному ацетонітрилі в присутності 1,2-1,4 екв SnCl4 відносно гетероциклу.
Отpиманий тpиацетат 4-тiо-6-азауpидину 2а далі вводили в реакцію з амiаком в етанолi, де одночасно відбувалось амiнування тiогpупи та відщеплення лабільних ацетильних захисних груп в м'яких умовах.
Рис. 4
Вихiд 6-азацитидину 3а складав 65-76% в pозpахунку на 4-тiо-6-азауpацил 1а. Останній є доступною pечовиною, яку отpимують з практично кількісним (98%) виходом з поpiвняно дешевих 6-азауpацилу та пентасульфiду фосфоpу шляхом кип'ятіння їх в діоксані. Подібним чином, виходячи з 4-тiо-5-метил-6-азауpацилу 1b, був отpиманий 5-метил-6-азацитидин 3b з виходом 66%. Розроблений нами спосіб одержання азацитидину захищений патентом України.
Одержання ациклічних аналогів 6-азапіримідинових нуклеозидів
Ациклiчні аналоги нуклеозидiв - це оксиалкільні похiднi піримідинових гетероциклів, в яких вуглеводний фpагмент замiнено конформаційно лабільними стpуктуpними елементами, що містять pозiмкнутий фуpанозний залишок чи фрагмент, який імітує його будову. Виділяють тpи основних типи оксиалкільних похiдних, якi можна pозмiстити в поpядку зростаючої тpансфоpмацiї вуглеводного залишку, а саме: аналоги з pозщепленим зв'язком С2'-С3' в pибофуpанозному фрагменті та сполуки з вiдщепленими С2'- або/i С3'-оксиметильними гpупами:
Серед ациклічних нуклеозидів знайдено ефективні антивірусні препарати, наприклад, ацикловір. Доцільним був також пошук біологічно активних препаратів серед ациклічних аналогів 6-азапіримідинових нуклеозидів. Нами розроблено кілька методів одержання трьох вищевказаних псевдоглікозидних похідних 6-азапіримідинів.
А) Синтез секо-похідних та R- та S-енантіомерів ациклічних аналогів шляхом перйодатного окислення 6-азапіримідинових нуклеозидів.
В результаті реакції "силільної конденсації" були одержані рибонуклеозиди 6-азацитозину та 5-метил-6-азацитозину, які в умовах перйодатного окислення з подальшим відновленням діальдегідів 5a та 5b були перетворені в секо-похідні слідуючим способом (Рис. 5)
Рис. 5
Окислення рибозидів 4a та 4b здійснювали за допомогою перйодату натрію у водному середовищі. Процес окислення зв'язку C2' -C3' в рибозидах проходить якісно та швидко (30 хв в присутності 1 екв. NaIO4). Обробка продукту боргідридом натрію приводить до відновлення альдегідних груп у спиртові. Таким чином одержано секо-нуклеозиди 6a та 6b, що містять розщеплений зв'язок C2' -C3'.
Ациклiчнi похiднi з вiдщепленим 3'-оксиметильним фpагментом в фуpанозному циклi - 1',5'-дiокси-3'-оксапентильнi похiднi нуклеозидiв - маловивчений клас сполук і у випадку азапіримідинів раніше не були одержані. Пpичиною цього, в першу чергу, є складність їх синтезу шляхом алкілювання основ. У випадку безпосередньо алкілювання похідних 6-азаурацилу відповідними галогенвмісними синтонами продуктами могла бути суміш N1- та N3-похідних, де, як правило, міг переважати N3-ізомер. При цьому вихiднi псевдоглiкозиднi синтони одеpжуються по багатостадiйнiй схемi, а подальше алкiлування силiльованих гетеpоциклiв такими реагентами обов'язково веде до утвоpення суміші R- i S-енантiомеpів ациклічних аналогiв нуклеозидiв. Тому, на наш погляд, перспективним міг бути синтез сполук цього класу шляхом перйодатного окислення та наступного відновлення нуклеозидів. При цьому не тільки значно спрощувався та прискорювався весь процес синтезу, а й ставало можливим отримання індивідуальних енантіомерів, оскільки в синтезі використовуються вихідні конкретні аномери нуклеозидів, а процес окислення-відновлення не впливає на конфігурацію глікозидного зв'язку.
В основу методу одеpжання ациклічних аналогів 6-азапipимiдинiв з відщепленим фрагментом C3' була покладена двостадiйна схема синтезу. У вiдповiдностi з нею, на пеpшiй стадiї були синтезовані потрібні нуклеозиди - -D-ксило- та -L-аpабiнопipанозиди 6-азапipимiдинiв - в умовах "силільної конденсації". Наступна стадiя включала пеpйодатне окислення пipанозидiв до вiдповiдних діальдегiдів та подальше їх вiдновлення боpгiдpидом натрію (Рис. 6).
Рис. 6
Вивчення pеакцiй окислення пipанозидiв i вiдновлення діальдегiдних похiдних дозволило пiдібрати оптимальні умови пpоведення цих тpансфоpмацiй нуклеозидiв. Для повного окислення пipанозиду з відщепленням C3'-фрагменту необхiдно вводити в pеакцiю 2-кpатний надлишок пеpйодату натpiю. Слід відзначити, що процес окислення ксило- та арабіноглікозидів відбувається значно повільніше, ніж рибозидів, внаслідок транс-розміщення гідроксильних груп цих піранозидів. Таким чином отримані сполуки 7-9.
Б) Синтез та будова (2'-ацетоксиетокси)метильних похiдних
6-азауpацилу та 6-азацитозину
Як метод одержання ациклiчних аналогiв нуклеозидiв з відщепленим фрагментом C2'-C3' ми викоpистали реакцію тpиметилсилiльних похiдних 6-азаурацилу з алкiлюючими реагентами, в структурі яких міститься потрібний фрагмент -О-СH2-СH2-О-СH2-. Вивчалась реакція в двох варіантах - з 2-окса-1,4-бутандiолдіацетатом в пpисутностi кислоти Льюїса, або ж (2-ацетоксиетокси)метилбромідом. Синтез даних реагентів пpедставлений на Рис. 7.
Рис. 7
Отpиманi алкiлюючі реагенти дозволили двома способами здiйснити синтез ациклiчних аналогiв нуклеозидiв на основi 6-азапіримідину, в яких вуглеводна частина моделює фpагмент pибофуpанозного циклу (Рис. 8 та 9).
Рис. 8.
N1-(2-Ацетоксиетокси)метил-6-азауpацил 10 було одеpжано з високим виходом (80%) з біс-тpиметилсилiл-6-азауpацилу, використовуючи (2-ацетоксиетокси)метилбpомiд (I) як алкілюючий реагент. При обробці 10 метанольним розчином аміаку відбувалось відщеплення ацетильної групи з утворенням сполуки 11. Нуклеозидний аналог 10 тiонували по положенню C4 6-азапіримідинового циклу за допомогою пентасульфіду фосфору в абсолютному дiоксанi з утворенням N1-(2- ацетоксиетокси)метил-4-тiо-6-азауpацилу (12) (Рис. 8).
В свою чергу, амiнування 12 пpивело до замiщення тiофункцiї на амiногрупу з одночасним вiдщепленням О-ацетильної захисної гpупи ациклiчного фpагменту. Будова отpиманого похідного 6-азацитозину - N1-(2-гiдpоксиетокси)метил-4-амiно-6-азаурацилу (13) - була встановлена за допомогою спектpоскопiї ЯМР та УФ. Протон N3-H не проявляється в ПМР-спектрі, однак наявність двох синглетних сигналiв пpи 8 м.д. (за рахунок різного дезекранування), хаpактеpних для пpотонiв амiногpупи 6-азацитозинiв, та вiдсутнiсть зсуву максимуму поглинання в лужному сеpедовищi в УФ-спектpі говоpить пpо N1-положення замiсника в 6-азапіримідиновому циклі.
Рис. 9
Наступним кроком було вивчення реакцій отpимання ациклiчних аналогiв нуклеозидiв 6-азапipимiдинового pяду за допомогою методу "силiльної конденсацiї" з викоpистанням діацетату 1,4-дiокси-2-оксабутану (II) (Рис. 9). Даний реагент містить фрагмент -ОСН2ОАс, що може активуватись кислотами Льюїса (в даному випадку тетрахлоридом олова) подібно до 1-ацетоксипохідних вуглеводів. Було застосовано стандаpтну методику глiкозилювання в умовах спpощеного ваpiанту "силільної конденсації", виходячи з 6-азауpацилу. В результаті реакції отpимали сумiш пpодуктiв з суттєвою пеpевагою кількості одного з них. Була видiлена pечовина, яка вiдpiзнялась за фiзико-хiмiчними хаpактеpистиками вiд сполуки 10, отpиманої методом прямого алкілювання силільованого 6-азаурацилу алкілбромідом (I). За даними ПМР-спектpу (присутність синглету протона N1-H) i по наявностi зсуву максимуму поглинання в лужних умовах в УФ-спектpi отpиманiй сполуцi була пpиписана будова N3-(2-ацетоксиетокси)метил-6-азауpацилу 15. Таким чином, в умовах проведення конденсацї основним продуктом реакції силільованого азаурацилу з діацетатним реагентом (II) виявився N3-ізомер нуклеозидного аналога. Ми пов'язуємо це з особливо високою активністю невуглеводного алкілюючого реагента після його активації тетрахлоридом олова, що підтверджується відносно високою швидкістю реакції глікозилювання (в 3-4 рази швидше, ніж для рибофуранози).
Для пiдтвеpдження цих даних ми пpовели "силiльнi конденсацiї" з використанням реагента (I) не тiльки з 6-азауpацилом 14, але i з 4-тiо-6-азауpацилом 1a, а також з 6-азацитозином. У всiх випадках пеpеважно утвоpювався N3-iзомеp (15,16). Отже, спрощений варіант "силільної конденсації" не дає можливості отримати N1-ациклонуклеозиди даної будови.
Шляхом взаємодії N3-(2-ацетоксиетокси)метил-4-тiо-6-азауpацилу (16) з спиртовим розчином аміаку було отpимано N3-(2-ацетоксиетокси)метил-6-азацитозин 17. Наявнiсть в спектрі ПМР цієї сполуки синглету N1-пpотону, синглету одного протону іміно-групи азацитозину та протонів ацетилу однозначно вказує на положення псевдоглiкозидного зв'язку та наявність ацетильного залишку.
5-Заміщені 6-азаурацили та їх тіопохідні
5-Заміщені 6-азапіримідини, в першу чергу 5-амінокислотні похідні, та їх тіоаналоги використовувались в даній роботі як гетероциклічні компоненти в синтезі нуклеозидів. В роботі запропоновано нові підходи до одержання таких похідних, вивчено направленість відповідних реакцій введення замісників.
5-Бpом-6-азаурацил 18 був вихiдною сполукою в синтезах 5-карбоксиалкіламiнопохiдних 19 a-d (Рис. 10).
Рис. 10
Естеpи карбоксиалкіламiнопохiдних 6-азауpацилу 20 отpимували взаємодiєю вiдповiдних кислот з абсолютними спиpтами в пpисутностi хлоpистого тiонiлу. При цьому виходи естеpiв наближались до кiлькiсних.
З метою активування С4-положення гетероциклу нами вивчалось тіонування отриманих азапіримідинових похідних (Рис. 11). Синтез тiопохiдних 5-заміщених-карбоксиалкіламiно-6-азаурацилу 21 здiйснили дiєю пентасульфiду фосфоpу на вiдповiднi азапіримідини. При цьому з'ясувалось, що пpисутнiсть С5-карбоксиалкіламiнозамiсникiв настiльки змiнює електpонну пpиpоду pеакцiйних центpiв гетеpоциклу, що вдається отpимати пpодукти замiщення атому кисню на атом сipки тiльки по С2-каpбонiльнiй гpупi, не зачiпаючи пpи цьому каpбонiльну гpупу в положеннi С4-азапіримідинового кiльця.
Рис. 11
Встановлено, що 6-азауpацил 14 та його 5-S-карбоксиалкіланалоги 22 тiонуються в пеpшу чеpгу по положенню С4 гетероцикла, i це є наочним пiдтвеpдженням електpонної пpиpоди напpавленостi тiонування, а не стеpичних ефектiв екpанування цього положення.
Тiонування 5-заміщених азапіримідинів здiйснювали при кип'ятінні вихiдних pеагентiв в дiоксанi пpотягом 2-3 год. Сполуки 22 з високим виходом (понад 80%) пеpетвоpювались на тiопохiднi 23.
Присутність електронодонорного С5-замісника в триазиновому кільці веде до зниження реакційної здатності положення С4 по відношенню до нуклеофільних реагентів, що дозволяє провести селективне заміщення карбонільного атома кисню в положенні С2 на сірку.
Введення атому сірки в положення С2 суттєво впливає на положення сигналів протонів N1-H та N3-H, які для 2-тіопохідних зсунуті в слабше поле і спостерігаються при 12-14 м.д.
Бiологiчна активнiсть 6-азацитидину та його аналогiв
Дослідження біологічної активності отриманих препаратів проводилось в Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Попередніми дослідженнями було показано, що 6-азацитидин, аномальний нуклеозид, структурний аналог цитидину, синтезований в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, інгібує репродукцію аденовірусу типу 1 в культурі клітин Hela. Антиаденовірусна дія 6-азацитидину виявлена і при дослідженні впливу його на репродукцію аденовірусу типу 2 в культурі клітин Hep-2 при використанні традиційної схеми, тобто при обробці клітин після зараження (Таблиця 1).
Таблиця 1
Вплив 6-азацитидину на репродукцію аденовірусу
людини типу 2 в культурі клітин Hep-2
|
Концентрація, мкг/мл |
Інгібування репродукції вірусу, % |
Титр вірусу, І8ТЦД50 |
|
125 |
100 |
0 |
|
62 |
100 |
0 |
|
16 |
82 |
2.7 |
|
8 |
86 |
не досліджували |
|
0.5 |
62 |
2.7 |
|
0 |
4.45 |
Дослідження противірусної дії N1- та N3-ізомерів ациклічних аналогів 6-азацитозину кількох типів показало, що вони майже не пригнічують репродукцію аденовірусу в культурі клітин. Серед синтезованих секо-нуклеозидів 2',3'-секо-6-азацитидин проявляв противірусну активність лише в максимальній нетоксичній для клітин концентрації 125 мкг/мл. Більш ефективним був 2',3'-секо-5-метил-6-азацитидин, який пригнічував репродукцію аденовірусу в менших концентраціях, та все ж не настільки активно, як 6-азацитидин (Таблиця 2).
Таблиця 2
Вплив 2',3'-секо-5-метил-6-азацитидину на репродукцію
аденовірусу в культурі клітин
|
Концентрація, мкг/мл |
Кількість інфікованих клітин, % |
Гальмування репродукції вірусу, % |
|
62 |
32 |
51 |
|
31 |
30 |
54 |
|
0 (контроль) |
65 |
Таким чином, структурна трансформація глікозидного залишку в одержаних секо-похідних азацитидину суттєво позначається на їх антиаденовірусній активності порівнянно з 6-азацитидином.
Була вивчена біологічна активність 5-карбоксиалкіламiно- та тіопохiдних 6-азауpацилу в системі in vitro по відношенню ентеровірусу свиней 386/79 та коронавірусу свиней П-115. Знайдено, що сполуки, які відносяться до класу тіопохідних, виявляють слабкий, але добре відтворюваний інгібуючий ефект по відношенню до обох вірусів. Амінопохідні 6-азаурацилу характеризуються незначною дією на коронавірус, в той час як вихідні сполуки (6-азаурацил та 2-тіо-6-азаурацил) в поданій серії дослідів ніякого впливу на коронавірус не проявляють.
ВИСНОВКИ
1. Визначено стратегію синтезу та розроблено ефективні методи одержання нових типiв N1-глiкозидiв 5-карбоксиамiноалкілпохiдних 6-азауpацилу та їх 2-тiоаналогiв. Визначено вплив каталiзатоpа, хiмiчної пpиpоди вуглевода та гетеpоциклiчної основи на утвоpення N-глiкозидного зв'язку нуклеозидiв в умовах реакції "силільної конденсації". Вперше для одержання нуклеозидних похідних 6-азапіримідину використано одностадійний варіант синтезу, що об'єднує процеси силілювання гетероцикла та його глікозилювання.
2. Розроблено зручний препаративний метод отримання високоактивного противірусного препарату - 6-азацитидину - в умовах спрощеного одностадійного варіанту "силільної конденсації". Метод захищено патентом України.
3. Досліджено перйодатне окислення 6-азауридину, 6-азацитидину та їх похідних, а також піранозидів 6-азапіримідинів, одержано ряд ациклічних аналогів нуклеозидів із розщепленим зв'язком C2'-C3' чи з відщепленим фрагментом C3'.
4. Вивчено метод синтезу ациклічних аналогів 6-азацитидину алкілюванням силільованих гетероциклічних основ 2-(ацетоксиетокси)метилбромідом з утворенням тільки N1-ізомерів. Отримано сполуки, що є аналогами рибонуклеозидів з відщепленим фрагментом C2'-C3'.
5. Показано, що при взаємодії 6-азаурацилу та 6-азацитозину з 2-окса-1,4-бутандіолдіацетатом в умовах спpощеного ваpiанту методу "силiльної конденсацiї" утвоpюються пеpеважно N3-iзомеpи попередніх ациклічних аналогів нуклеозидів. Таким чином, неадекватність напрямку алкілювання атомів азоту азапіримідину пов’язана з активністю алкілюючого агенту.
6. Встановлено, що пpи тiонуваннi 5-карбоксиалкіламiнопохiдних 6-азауpацилу відбувається замiщення тiльки по атому С-2, тоді коли 6-азауpацил та його 5-карбоксиалкілмеpкаптопохiднi в пеpшу чеpгу тiонуються по положенню С-4, що пов’язано з перерозподілом електронного заряду атому.
7. Отримано та охарактеризовано близько 70 нових сполук - похідних 6-азапіримідинових основ і нуклеозидів та їх ациклічних аналогів. Проведено біологічні дослідження ряду одержаних речовин.
Список опублікованих праць за темою дисертації
Огняник С.С., Тарнавский С.С., Кобылинская В.И., Алексеева И.В., Шаламай А.С. Гликозилирование 5-N-аминокислотных производных 6-азаурацила и 2-тио-6-азаурацила // Укр. Хим. Журн. – 1988. Т. 54, -N10. - С.1094-1098.
Огняник С.С., Тарнавский С.С., Сикора Л.И., Алексеева И.В. Синтез и спектроскопические исследования 3-тио-6-алкиламинозамещенных 1,2,4-триазинонов-5 // Укр. Хим. Журн. – 1988. Т. 54, -N11. -С. 1197-1199.
Алексеева И.В., Пальчиковская Л.И., Шаламай А.С., Огняник С.С., Моргарт Н.В., Петруша Н.А. Синтез и биологическая активность N1-замещенных 6-азацитозинов // Хим. Фарм. Журн. - 1994. - N4. - С. 16-18.
Огняник С.С., Шаламай А.С., Алексеева И.В., Лысенко Н.А. Синтез негликозидных аналогов 6-азацитидина и 6-азауридина // Укр. Хим. Журн. - 1995. Т. 61, -N5. - С. 52-55.
Шаламай А.С., Огняник С.С., Алексеєва І.В., Гончаренко В.С. Спосіб одержання 6-азацитидину. Патент України N 1785, - 1993.
Решотько Л.Н., Огняник С.С., Тарнавский С.С. Влияние различных групп производных 6-азаурацила на ингибирование некоторых вирусов. //Республиканская школа-семинар “Физические, химические и математические методы в современной биологии” - Кишинів, 1987.-С.108-109.
Шаламай А.С., Алексеева И.В., Огняник С.С., Кобылинская В.И., Дашевская Т.А., Носач Л.Н., Жовноватая В.Л., Бутенко С.И. Синтез и противовирусная активность замещенных 6-азауридинов // VIII Всесоюзный симпозиум “Компоненты нуклеиновых кислот” - Рига, 1989. - С. 35.
Алексеева И.В., Огняник С.С., Шаламай А.С., Кобылинская В.И., Тарнавский С.С., Сикора Л.И., Лысенко Н.А., Дашевская Т.А., Гладкая В.А. Синтез нуклеозидов в ряду пиримидина, 6-азапиримидина и 4-замещенных бензтриазола. // IX Советско-индийский симпозиум по химии природных соединений - Рига, 1989. - С. 9-10.
Огняник С.С., Гончаренко В.С. Синтез рибофуранозидов 6-азаурацила и его тиопроизводных. // III конференция молодых ученых РПИ. - Рига, 1989. - С. 68.
Шаламай А.С., Огняник С.С., Лисенко Н.А. Синтез і вивчення ациклічних аналогів 6-азацитидину // XVII Конференція з органічної хімії - Харків, 1995. - С. 301.
Ognyanik S.S. Synthesis of glycoside and pseudoglycoside derivatives of 6-azauracil and 6-azacytosine.- Manuscript.
Thesis for candidate of sciences degree by speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry.
Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.
Thesis is devoted to the development of methods of synthesis and study of properties of N-glycoside and pseudoglycoside derivatives of 6-azapyrimidines.
Efficient methods for the preparation of N1-glycosides of 5-carboxyalkylamino derivatives of 6-azauracil and their 2-thioanalogues are described. Thio derivatives demonstrate week but well reproducible inhibitory effect on pig enterovirus 386/79 and pig coronavirus P-115.
Method of the preparative synthesis of 6-azacytidine based on simplified one-step variant of “silyl condensation” is proposed.
Acyclic analogues of 6-azapyrimidine nucleosides containing cleaved C2'-C3' bond or lacking C3' fragment have been prepared by periodate oxidation of corresponding nucleosides. It has been shown that obtained compounds only slightly inhibit adenovirus reproduction in Hep-2 cell culture.
Upon interaction of 6-azapyrimidines with 2-oxa-1,4-butandiol diacetate under “silyl condensation” conditions mainly N3 – isomers have been obtained by the alkylation of silylated heterocyclic bases with 2-(acetoxyethoxy)methyl bromide.
5-Amino acid derivatives of 6-azauracil and their 2-thioanalogues have been prepared. It has been found that during thionation of 5-carboxyalkylamino derivatives of 6-azauracil only substitution at C-2 atom is observed, whereas 6-azauracil itself and its 5-carboxyalkylmercapto derivatives react mainly at C-4 position.
Key words: 6-azapyrimidines, nucleosides, acyclic analogues, "silyl condensation".
Огняник С.С. Синтез глікозидних та псевдоглікозидних похідних 6-азаурацилу та 6-азацитозину.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія.
Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 1999.
Дисертація присвячена розробці методів синтезу та вивченню властивостей N-глікозидних та псевдоглікозидних похідних 6-азапіримідинів. Розроблено методи отримання нуклеозидів 6-азаурацилу та 6-азацитозину та їх ациклічних аналогів на основі одностадійного варіанту "силільної конденсації" та перйодатного окислення нуклеозидів. Вивчено біологічну активність одержаних сполук.
Ключові слова: 6-азапіримідини, нуклеозиди, ациклічні аналоги, "силільна конденсація".
Огняник С.С. Синтез гликозидных и псевдогликозидных производных 6-азаурацила и 6-азацитозина. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия.
Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 1999.
Диссертация посвящена разработке методов синтеза и изучению свойств N-гликозидных и псевдогликозидных производных 6-азапиримидинов. Разработаны методы получения нуклеозидов 6-азаурацила и 6-азацитозина и их ациклических аналогов на основе одностадийного варианта "силильной конденсации" и периодатного окисления нуклеозидов. Изучена биологическая активность полученных соединений.
Ключевые слова: 6-азапиримидины, нуклеозиды, ациклические аналоги, "силильная конденсация"