Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Дата проведения занятий:_________________
Работу выполнил: Ф.И. О. студента, № группа______________________________________
Работу проверил:______________ доцент Л. П. Туровинина
Занятие № 1
Тема: Знакомство с оборудованием и аппаратурой гистологической лаборатории. Освоение техники изготовления гистологического препарата. Структурные элементы организации тканей животного происхождения: клетки и неклеточные формы.
Продолжительность изучения темы - часа.
Из них на занятии - 2 часа,
Внеаудиторная самостоятельная работа 2 часа.
Цели занятия:
Задачи:
Знать:
1. Выработать представление о сущности и содержании основных этапов изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата.
2. Принципы окраски гистологических препаратов. Иметь представление о "базофилии" и "оксифилии" структурных элементов препарата.
3. Структурные организации тканей животного происхождения.
Уметь:
1. Освоить методику окраски гистологических препаратов гематоксилин-эозином.
2. Получить представление о принципах работы и использования приборов специальной микроскопической техники в исследовательских целях.
3. Овладеть техникой микроскопирования гистологического препарата.
4. Освоить алгоритм чтения гистопрепаратов.
5. Идентифицировать клетки и неклеточные формы в гистопрепаратах..
6. Самостоятельно изготовить гистологический препарат.
Значение изучаемой темы:
Развитие гистологии как науки и ее дальнейший прогресс тесно связан с совершенствованием методов исследования. Основными объектами исследования в гистологии являются гистологические препараты и электроннограммы. Основным методом гистологии является микроскопирование, то есть изучение гистологических срезов клеток, тканей, органов с помощью микроскоповс различной разрешающей способностью. Клетки и, образующиеся в результате их жизнедеятельности, неклеточные структуры являются основой строения и функционирования организма. Клетки обеспечивают выполнение специфических функций, размножение, рост, дифференцировку, физиологическую и репаративную регенерацию органов, передачу наследственной информации, адаптацию организма к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Изменение структуры и функции клеток влечет за собой возникновение морфофункциональных изменений в органах и системах. Изучение микроскопического строения клеток, взятых при жизни (биопсия) или от трупа (аутопсия), помогает врачу уточнить диагноз. Широко распространены в клинике цитологические исследование крови, пунктатов костного мозга, селезенки, печени, почек и других органов.
Гистологические методы исследования широко используют в практической медицине врачом-лаборантом, паталогоанатомом, судмедэкспертом. В связи с этим будущему врачу необходимо знание морфологической и цитохимической характеристики клеток и неклеточных форм организации тканей и межклеточного вещества.
Успешное овладение микроскопической техникой и техникой гистологического исследования создает условия для более глубокого и успешного изучения программного материала по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии, а так для изучения других медико-биологических и клинических дисциплин, таких как патологическая анатомия, судебная медицина, курс гематологии и других.
Методические рекомендации для самоподготовки
Теоретические вопросы, подлежащие рассмотрению
Необходимый исходный уровень знаний:
Из других курсов и предшествующих тем.
По теме занятия:
Вопросы учебного плана, вынесенные на самостоятельное изучение.
2. Методы исследования в гистологии.
УИРС (Учебно-исследовательская работа студентов).
Темы рефератов (один - по выбору):
Методические указания к самостоятельной работе по теоретическому материалу.
1. Основные задачи и содержание практических занятий.
Овладение знаниями в области гистологии и эмбриологии не мыслится без изучения микроскопических и ультрамикроскопических структур с помощью светового и электронного микроскопов. Поэтому главным содержанием практических занятий по гистологии и эмбриологии являются изучение с помощью светового микроскопа гистологических препаратов, которые являются одним из источников наших сведений как о микроскопическом строении дефинитивных тканей и органов животных и человека, так и о процессах их развития. При изучении структуры при микроскопировании необходимо применять аналитико- синтетический подход, позволяющий вскрыть исторически сложившиеся взаимоотношения различных элементов в системе целостного организма. Анализ – это глубокое изучение морфологического строения какой-либо части структуры (клетки, неклеточных форм, органелл цитоплазмы). Синтез предполагает выявление связей (генетических, морфологических, функциональных) данной частной структуры с другими структурами. При изучении теоретических вопросов биологические аспекты клетки необходимо связать с курсом биологии.
Уделить особое внимание изучению основных положений клеточной теории, истории ее развития и диалектико-материалистическому подходу к изучению организации животных организмов.
Прочные знания цитологии, эмбриологии, общей и частной гистологии являются теоретической основой для изучения других биологических и медицинских дисциплин: нормальной и патологической анатомии и др. Кроме того, в настоящее время в медицинскую практику при обследовании больного внедряется морфологический метод: взятие биопсий (прижизненное иссе чение пункционными иглами кусочка размером до I куб. мм того или иного органа I. Метод позволяет наиболее точно поставить диагноз больного, определить методы лечения и контролировать ход выздоровления.
Таким образом, задачами студента являются:
-научится анализировать наблюдаемые структуры, давать им оценку и делать правильные выводы, следовательно, работа с препаратами заключает в себе элементы исследования,
-овладеть алгоритмом микроскопирования.
2. Конструктивный подход к изучаемым структурам.
При изучении гистологического препарата необходимо учитывать следующие особенности: в поле зрения микроскопа "элементы тканевых структур представляются, за небольшим исключением, в разрезе. Воссоздание цельности структур совершается после их рассмотрения путем воображаемой реконструкции. В отдельных случаях структура в целом может быть воспроизведена посредством графической или пластической реконструкции по многим строго последовательным срезам. Желающий научится микроскопировать, должен стремиться выработать у себя трехмерное представление о микроскопических структурах. При анализе полых органов необходимо учитывать характер среза (поперечный, продольный, тангенциальный).
3. Цель зарисовки.
Изучение препаратов должно сопровождаться их зарисовкой. Зарисовка микроскопических срезов представляет важный методический прием при исследовании клеток, тканей и органов. Зарисовка - не самоцель. Она помогает сосредоточить внимание на изучаемых объектах, выделить их со всеми деталями из окружающего. Зарисовка включает в себя элемент самоконтроля.
Обязательным условием успешного выполнения практических занятий является систематическая подготовка к ним по материалам лекций, учебнику, рекомендуемой дополнительной научной литературе.
4. Цель и принципы окрашивания гистологического препарата.
Клетки и ткани животного происхождения обладают избирательной способностью к красителям. Поэтому окрашивание срезов необходимо производить для того, чтобы в преломляющем свете микроскопа можно было отчетливо рассмотреть различные тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах можно рассмотреть только такие части, которые отличаются друг от друга различными преломлением световых лучей. Выявление невидимых на срезе деталей строения основано на неодинаковом (избирательном) их отношении к различным красителям.
5. Свойства красителей, принципы окрашивания.
Красители классифицируются по происхождению и химическому составам. По свойствам они делятся на группы кислых и основных красителей. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями т.е. обладают оксифильными (ацидофильными) свойствами. К группе кислых красителей относятся: кислый фуксин, пикрофуксин, пикриновая кислота, эозин. Чаще всего мы будем изучать срезы, обработанные эозином, который окрашивает цитоплазму, оболочку клеток, межклеточное вещество соединительной ткани в розовый цвет. По происхождению - эозин искусственный краситель.
К группе основных (базофильных) красителей, с которыми реагируют базофильные компоненты клеток и межклеточного вещества кислой природы (РНК, ДНК, гиалуроновая к-та и др.). относятся: кармин, сафранин, метиловый синий, азур, гематоксилин ( по способу приготовления краски различают гематоксилин Майера, Бемера. Вейгерта, железный гематокси лин Гейденгайна и др.). Красящим свойством обладают не сам гематоксилин, а продукт его окисления. Гематоксилин окрашивает базофильные структуры в синий или фиолетовый цвет. Этот краситель растительного происхождения, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и у нас в Армении. Гематоксилин выявляет четко ядра клеток. Изучаемые нами препараты чаше всего будут окрашены гематоксилин-эозином. Кармин, также ядерный краситель, но животного происхождения, вырабатывается из насекомых кошенели, живущих на кактусовых деревьях. Большинство же красителей получены синтетическим путем (искусственные краски). Имеются красители со специальными свойствами, позволяющие выявить ее компоненты, окрашиваемые черным цветом (импрегнация солями серебра – для окраски нейронов, судан черный, осмиевая кислота выявляют липиды). Гликоген выявляется кармином Беста или шик реакцией по мак-Манусу. В данном случае, мы видим в срезах не сам гликоген, а продукт реакции его с красителем, просматривающийся в виде гранул лилово-красного цвета.
Изготовление гистологического препарата.
Процесс обработки материала для изготовления гистологических препаратов слагается из следующих этапов:
1. Взятие материала. Из органа вырезается кусочек, размеры которого не должны превышать 1 куб .см.
2. Фиксация материала. Фиксация проводится для того, чтобы остановить в тканях протекающие жизненные процессы и предупредить последующий их распад. Фиксирующие жидкости: 10-12% раствор формалина в воде (фиксировать от 3 часов до 1 суток и более).
3. Обезвоживание материала, обезжиривание и уплотнение его. Этот процесс осуществляется в спиртах возрастающей крепости и в растворах спирта с эфиром в следующей последовательности: зафиксированный кусоочек материала проводят через батарею спиртов: 5-. 70, 96 градусов (две порции), абсолютный спирт, абс. спирт + эфир) (две порции). В каждом отмеченном растворе кусочек находится не менее суток.
4. Заливка материала. Заливка производится в парафин, целлоидин или желатину. Наиболее распространенный способ заливки в целоидин. Для этого готовится раствор целлоидина разной консистенции (измельченная кинолента растворяется в смеси 100 спирта с эфиром в соотношении 1:1). Обезвоженный, уплотненный кусочек материала проводится в 3-х порциях целлоидина возрастающей крепости. В каждой порции раствора целлоидином кусочек материала переносят в плоскодонную чашку, которую до краев заполняют густым раствором целлоидина. В чашке кусочек органа, пропитанный целлодином, подсыхает до плотности рога и оказывается залитым в целлоидин. Залитый материал может долго храниться.
5. Приготовление гистологических срезов. Залитый в целлоидин кусочек материала наклеивают на блок (деревянный или стеклянный кубик), укрепляют на предметном столике микротома (микротом-прибор оснащенный бритвой для приготовления гистологических срезов) и бритвой производятся срезы, толщина которых не должна превышать 10-12 микрон. Каждый студент должен самостоятельно сделать 3-4 среза.
6. Окраска гистологических срезов. Различные тканевые элементы избирательно относятся к красителям, что, позволяет их дифференцирование окрасить. Ядра клеток прочнее окрашиваются основными красителями (гематоксилин, азур, кармин и др.). Цитоплазма красителя кислыми красителями (эозин, фуксин, аналин и др.).
7. Обезвоживание, просветление окрашенных срезов и заливка их в бальзам. Окрашенные срезы обезвоживают в 2-х порциях 96 спирта, просветляют в карболе-ксиоле. переносят посредством шпателя на предметное стекло, наносят на срез каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Препарат готов для исследования может храниться долгое время.
Каждый студент должен самостоятельно в течение семестра освоить технику изготовления гистопрепаратов и приготовить к итоговому зачету по общей гистологии гистосрезы того или иного органа. Работа будет проводиться под руководством сотрудника в научной лаборатории кафедры морфологии.
1. Этап: Депапарафинирование срезов:
1. Ксилол –1 (бензол, толуол) - 2 мин - 4 мин
2. Ксилол-2 - 2 мин - 4 мин
3. Спирт- 1 (АБС) - 2 мин - 3 мин
4. Спирт 96% - 2 мин - 3 мин
5. Вода дистиллированная - 2 мин - 5 мин.
2. Этап: Окраска гистосрезов по методу гематоксилин Майера - эозин
1. Гематокеилин Майера - 2 мин
2. Вода водопроводная - 2 мин до 5 мин
3. Эозин - 2 мин
4. Вода дистиллированная. - 1 мин (сполоснуть)
5. Спирт 96° - 1 мин
6. Спирт .96° - 2 мин
7..Ксилол-1 - 2 мин
8. Ксилол –2 -2 мин
9. Заключить срез в бальзам.
Методические указания к самостоятельной работе на занятии.
Задания и ориентировочные основы действий.
1.Изучить и зарисовать различные по строению клетки и неклеточные структуры по следующим препаратам.
2.Закрепить правила работы с микроскопом и освоить алгоритм чтения препарата.
Методические указания к самостоятельной работе на занятии.
Задания и ориентировочные основы действий.
Закрепите правила работы с микроскопом и освойте алгоритм чтения препарата.
Помните: при анализе и определении формы клеток и ядер данный плоскостной срез структур представляйте в объеме (трехмерном пространстве).
Усвойте закон: Форма ядер повторяет форму клеток. Так как оболочки клеток окрашены в розовый цвет и очень тонкие, в микроскопах на световом уровне практически не просматриваются. Ядра окрашены в фиолетовый тон и контрастно просматриваются на фоне розового цвета. Поэтому, чтобы определить форму клеток, анализируйте вначале форму ядер. Круглые ядра характерны для сферических и кубических клеток. Овальные ядра – для веретенчатых миоцитов; овальных клеток соединительной ткани; призматических, плоских клеток эпителия.
Изучите и зарисуйте различные по строению клетки и неклеточные структуры следующих препаратов.
Препарат № 70 (или № 106). Гладкие мышечные клетки (миоциты) на примере мышечной оболочки мочевого пузыря.
Окраска: гематоксилин-эозин. Ядра окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет, Оболочки клеток, цитоплазма и межклеточное вещество в розовый.
Алгоритм чтения микропрепарата: Настроить препарат на малое (объектив 8 или10) увеличение. Определите в препарате ярче окрашенную в розовый цвет мышечную оболочку стенки мочевого пузыря. Обратите внимание на то, что мышечные клетки располагаются пучками (группами) между прослойками соединительной ткани, окрашенными более светлым тоном. Клетки соединительной ткани располагаются беспорядочно. В соединительной ткани преобладает межклеточное вещество.
Переведите на большое увеличение (объектив-40). Определите и изучите миоциты в пучках. Клетки в одних пучках в виде мелких веретенец, ядра - в центре, овальной формы. В данном случае клетки срезаны продольно. Определите пучок миоцитов, в котором клетки просматриваются круглой формы. Определите цитоплазму розового цвета, фиолетового цвета ядро круглое, также в центре, оболочка клетки не просматривается, а сливается с цитоплазмой. В этом пучке клетки срезаны поперечно. Следует вывод: миоциты пучков мышечной оболочки располагаются относительно просвета мочевого пузыря циркулярно и продольно.
Зарисовать и обозначить:
1. Продольный разрез миоцита: а) оболочка, цитоплазма, в)ядро.
2.Поперечный срез: а) оболочка, цитоплазма, в)ядро.
Препарат № 76. Мазок крови. Определить: 1. Форменные элементы крови. Лейкоциты с различной формой ядер, и различными ядерно-цитоплазменными отношениями.
2.Постклеточные формы: эритроциты без ядер. Кровяные пластинки (тромбоциты) - участки цитоплазмы мегакариоцитов.
Окраска: по Романовскому-Гимза.
Настроить препарат на малое (объектив 8 или10) увеличение. Выбрать поле зрения с
наличием клеток крови с ядрами, окрашенными гематоксилином в фиолетовый цвет.
Перевести на большое увеличение (объектив-40), определить в поле зрения и изучить 1. безъядерную клетку – эритроцит, цитоплазма окрашена эозином в розовый цвет; 2. клетку с крупным круглым ядром – лимфоцит, 3. клетку с сегментированным ядром - нейтрофильный лейкоцит.
Препарат изучить. Микрофото обозначить.1.Эозинофил. 2.Нейтрофилы.3.Лимфоциты.
Препарат № 108.
Неклеточная форма - симпласт (миосимпласт или мышечное волокно)- структурная единица скелетной поперечно-полосатой мышечной ткани. Гистосрез спинки языка.
Окраска: Железный гематоксилин по Гейденгайну.
При малом увеличении изучите препарат. Обратите внимание на цвет окрашенных структур. Найти продольно и поперечно срезанные пучки симпластов - мышечных волокон, окрашенных в темно-серый цвет. По форме срезов симпластов определите их характер среза. Между пучками симпластов, расположенных в разных направлениях определите светлее окрашенные прослойки рыхлой соединительной ткани.
При большом увеличении определите в миосимпластах сарколемму, под которой расположены многочисленные палочковидной формы ядра. В продольно срезанных волокнах обратить внимание на оптическую поперечно-полосатую исчерченность обусловленную миофибриллами – органеллами специального назначения.. На поперечных срезах миосимпластов ядра округлой формы расположены также по периферии, в центре среза пучки миофибрилл выглядят в виде точек. Мышечные волокна отделены друг от друга тонкими прослойками рыхлой неоформленной соединительной ткани, называемой эндомизием. Обратите внимание на размер и форму клеток и межклеточное вещество соединительной ткани.
Зарисовать при большом увеличении часть среза с продольно и поперечно срезанными волокнами.
Обозначить:1. продольный срез миосимпласта.2. поперечный срез. 2а). сарколемма,
2б). саркоплазма, 2г).ядра, 2д). поперечно-полосатая исчерченность. 3. Соединительная ткань. 3а).клетки.3б). межклеточное вещество.
Препарат № 96. Межклеточное вещество на примере эластического хряща ушной раковины.
Окраска: гематоксилин-орсеин-пикроиндиго.
При малом увеличении в центре среза определить эластическую хрящевую ткань. Снаружи хрящ как орган покрыт надхрящницей, которая окрашена более светло.
При большом увеличении изучить собственно хрящ. В центре среза хряща располагаются группы клеток (изогенные группы). Обратите внимание, что их форма чаще овальная и состоят они из 2- 3 клеток - хондроцитов. Между изогенными группами расположено межклеточное вещество – хондромукоид, в котором просматриваются волокна в виде тонких переплетающихся нитей. Это эластические волокна, окрашенные орсеином в бурый, или темно вишневый цвет. Обратите внимание, что волокна сгущаются вокруг изогенных групп, маскируя их. К периферии хряща волокна истончаются и переходят в надхрящницу. Эластические волокна замурованы в основное вещество. Оно окрашено оксифильно, а вокруг изогенных групп - базофильно. Это свидетельствует о его различном химическом составе в зависимости от расположения, а так же от возраста хряща.
Зарисовать. Обозначить: Собственно хрящ.1. изогенные группы.3. хондромукоид.3 а) эластические волокна. 3 б) основное вещество.
Ознакомиться c микрофотографиями.
1. Гликозаминогликаны и гликопротеины в межклеточном веществе гиалинового хряща. Альциановый синий – ШИК–реакция
2. Щелочная фосфатаза во всасывающей каемке кишки. Метод Гомори
3. Одноклеточные эндоэпителиальные железы (бокаловидные клетки кишечника).
ШИК–реакция гематоксилин
Контрольные вопросы для самопроверки:
Ответы оформите лаконично под вопросами.
Чему равна разрешающая способность светового и электронного микроскопа?
Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата?
В чем сущность фиксации и какие требования предъявляют к фиксаторам?
Для чего необходимо уплотнение ткани при изготовлении гистологического препарата и какие используют уплотняющей среды?
Как называются приборы для получения срезов?
Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин и целлоидин?
Какова цель окрашивания гистологического препарата?
Какие группы красителей используют в гистологической практике? Назовите примеры.
Какие структуры при окрашивании называются «оксифильными» и «базофильными»?
Что является целью последнего этапа изготовления гистологического препарата?
11.Назовите важнейшие отличия эукариотических клеток от прокариотических.
12.Перечислите основные физиологические признаки живой соматической клетки.
Ситуационные задания.
Основные термины к теме
Основные термины к разделу “цитология”
|
Аутофагирующая вакуоль |
Vacuolia autophagica |
|
Гетерохроматин |
Heterochromatinum |
|
Десмосома (пятно слипания) |
Macula adherens |
|
Замыкательная пластинка |
Zonula occuludens |
|
Кариоплазма |
Caryoplasma |
|
Клетка |
Cellula |
|
Плазмалемма |
Plasmalemma |
|
Лизосома |
Lysosoma |
|
Межклеточное вещество |
Sudstantia intercellularis |
|
Микроворсинка |
Microvillus |
|
Митоз |
Mitosis cellularis |
|
Митотическое веретено |
Fusus mitoticus |
|
Нексус |
Nexus |
|
Пероксисома |
Peroxysoma |
|
Пиноцитозный пузырек |
Vesicula pinocytotica |
|
Полудесмосома |
Hemidesmosoma |
|
Реснички |
Cilium |
|
Рибосома |
Ribosoma |
|
Синаптический контакт |
Synapsis |
|
Соединение зубчатое (контакт по типу замка) |
Junctio intercellularis denticulata |
|
Сединение клеток простое |
Junctio cellularum simplex |
|
Фаголизосома |
Phagolysosoma |
|
Фагосома |
Phagosoma |
|
Хроматин |
Chromatinum |
|
Цитоплазма |
Cytoplasma |
|
Эндоплазматическая сеть зернистая |
Reticulum endoplasmaticum granulosum |
|
Эндоплазматическая сеть незернистая |
Reticulum endoplasmaticum nongranulosum |
|
Эухроматин |
Euchromatinum |
|
Ядерная мембрана внутренняя |
Membrana nuclearis interna |
|
Ядерная мембрана наружная |
Membrana nuclearis externa |
|
Адерная пора |
Porus nuclearis |
|
Ядро |
Nucleus |
|
Ядрышко |
Nucleolus |