У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

Лабораторная диагностика

Работа добавлена на сайт samzan.net:

Поможем написать учебную работу

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

от 25%

Подписываем

договор

Имя

Выберите тип работы:

Принимаю Политику конфиденциальности

Скидка 25% при заказе до 29.12.2024

Красноярский медико-фармацевтический колледж

Перфильева Г. В. , Черемнова С. И.

Методическое пособие

к практическим занятиям

по биохимии

для студентов специальности 0407 «Лабораторная диагностика».

Красноярск 2005

Красноярский медико-фармацевтический колледж

Перфильева Г. В., Черемнова С. И.

Методическое пособие

к практическим занятиям

по биохимии

для студентов специальности 0407 «Лабораторная диагностика».

Красноярск 2005

Перфильева Г. В., Черемнова С.И.

«Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии» -

Красноярск: Издательство КМФК, 2005 г. - с.

Аннотация:

Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии составлено в соответствии с требованиями ГОС СПО, квалификационной характеристикой специалиста и рабочей программой для студентов специальности 0407 «Лабораторная диагностика». Каждая глава содержит вопросы для самоподготовки по теме, описание практических работ, перечень основных терминов. Для каждой практической работы дан перечень оборудования, реактивов, описаны принцип, методика, расчеты и способы оформления, предложены вопросы для защиты работы.

Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии предназначено для студентов медицинского колледжа по специальности 0407 «Лабораторная диагностика». Оно составлено таким образом, что может быть использовано студентами для работы на практических занятиях и для самостоятельной внеаудиторной подготовки.

Рецензент:

Заведующая отделением «Лабораторная диагностика»

Питрукова О. К.

Предисловие.

Целью настоящего пособия является освещение основных практических работ по курсу «Основы биохимии с методами клинических исследований», что должно облегчить изучение данного предмета для студентов и помочь в работе преподавателей.

Пособие состоит из 9 разделов. Каждый раздел начинается с освещения вопроса значения изучаемой темы в курсе подготовки лабораторного техника. В первом разделе освещены вопросы: ТБ при работе в лаборатории, подготовки и хранения биологического материала, принципы, тактика и методы биохимических исследований, этапы лабораторных исследований, единицы измерения в лабораторной диагностике. В разделе 2 рассмотрены практические работы, отражающие химию биоорганических соединений. В разделах 3 - 9 описаны методы исследования, преаналитический этап исследований, даны методики для определения основных компонентов крови, отражающих те или иные обменные процессы в организме. Для каждой практической работы дан перечень оборудования, реактивов, описаны принцип, методика, расчеты и способы оформления, предложены вопросы для защиты работы. Вопросы, предложенные после каждой практической работы дифференцированны, звездочкой * отмечены вопросы повышенной сложности.

Практикум по дисциплине «Основы биохимии с методами клинических исследований» позволяет более рационально организовать работу студентов и преподавателей на занятии и дома, повышает качество труда и в конечном итоге влияет на качество подготовки специалистов.

Раздел 1. Введение в биохимию.

Значение изучаемой темы:

На современном этапе развития медицины резко повысилось значение биохимических анализов. Применение новых лекарственных средств и новых методов лечения требует постоянного биохимического контроля. Биохимические анализы применяются для диагностики, контроля за состоянием пациентов (мониторинг), скрининга различных заболеваний и прогнозирования. Таким образом, главная задача биохимической лаборатории состоит в том, чтобы обеспечить врача биохимической информацией, необходимой для лечения больного. Такая информация представляет ценность только если она точна, соответствует клинической ситуации и правильно используется врачем в процессе принятия решений.

1.1. Биологический материал для биохимических исследований.

Материалом для биохимических исследований в КДЛ могут быть:

Биологические жидкости внутренних сред организма - цельная кровь, сыворотка и плазма крови, спино-мозговая жидкость, лимфаи др.
Биологические выделения (экстракты) – моча, желчь, слюна, желудочный и кишечный соки, кал, пот и др.

Для того, что бы получить данный биологический материал используют следующие методы забора:

Безинструментальный – так собирают мочу, кал, мокроту, слюну и т.д.
Пункционный – материал берут с помощью игл из вены, артерий, спинного мозга.
Прокол иглой – кровь из пальца.
Пункционная биопсия – пункция из внутренних органов.
Зондовый метод – берут желудочный сок, мочу и т.д.
Промывание легких, мочевого пузыря и т.д.
Мазки и соскобы из носовой полости, зева, слизистой матки.
Отпечатки с ран, свищей, эрозий.

Биологический материал имеет разный срок и условия хранения, например, моча храниться 4-6 часов при комнатной температуре, а сыворотка несколько дней.

Весь биологический материал является условно потогенными (инфицированными), поэтому при работе с ним следует соблюдать правила ТБ при работе с инфицированным материалом.

В основном в биохимической лаборатории работают с цельной кровью, сывороткой и плазмой крови. Их получение и способы хранения отражены в таблице.

Характеристика биоматериала.	Цельная кровь.	Плазма.	Сыворотка.
1.Подготовка посуды.	Обрабатывают антикоагулянтом.	Должна быть сухая, чистая.	Должна быть сухая, чистая.
2.Использование специальных веществ.	Антикоагулянты.	Физиологичес кий раствор, антикоагулянты.	Нет.
3. Отстаивание.	Нет.	30 минут.	30-60 минут.
4.Центрифугирование.	Не используют.	5 минут при 2000 об/мин.	15 минут при 2000 об/мин.
5.Условия хранения.	Не хранят.	t 0-4C –3-7 суток; t -20С –1-3 месяца.	t 0-4C – 3-7 суток; t -20С –1-3 месяца.
6. Исследование.	В течение суток.	В зависимости от исслед-го вещества и условий хранения - до 3 месяцев.	В зависимости от исследуемого вещества и условий хранения - до 3 месяцев.
7.Отличительные особенности.	Можно исследовать все компоненты крови.	Отсутствуют форменные элементы крови.	Отсутствуют форменные элементы и факторы свертывания крови (фибриноген и др.).

В качестве антикоагулянтов могут быть использованы следующие вещества:

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) – связывает и эффективно удаляет ионы кальция, защищает клетки крови от разрушения. Добавляют в кровь для выполнения гематологических исследований.
Гепарин (в виде натрий гепарина или калий гепарина) - ингибирует превращение протромбина в тромбин. Используют для получения плазмы крови для биохимических исследований.
Цитрат натрия– связывает и эффективно удаляет ионы кальция. Добавляют для получения плазмы необходимой для исследования процессов свертывания крови.
Оксалат натрия или оксалат аммония – связывает и эффективно удаляет ионы кальция. Добавляют (вместе с фторидом натрия) для получения крови и исследования в ней уровня глюкозы.
Фторид натрия – ферментный яд, который прекращает метаболизацию глюкозы в крови после её сбора, т.е. сохраняет её концентрацию.

Этапы лабораторных исследований.

При лабораторных исследованиях могут возникать случайные или систематические ошибки, которые могут влиять на постановку диагноза, на лечение больного и, в конечном счете, на здоровье человека, поэтому важно соблюдать меры по их предотвращению. Для этого на всех этапах анализа соблюдают следующие правила контроля качества лабораторных исследований:

1 этап клинико-биохимических исследований - преаналитический.

На данном этапе нужно соблюдать 3 условия:

Правильное составление запроса на анализ, в котором должно быть указано следующее:

Фамилия И. О., пол и дата рождения пациента.
Имя врача (в срочных случаях с указанием телефона).
Клинический диагноз (описание проблемы).
Требуемые анализы.
Тип анализируемого материала.
Дата и время взятия пробы.
Назначенное лечение (например, медикаменты).

Строго соблюдать условия забора биологического материала:

Срок сбора, время взятия.
Подготовка обследуемого (или участка тела обследуемого).
Процедура взятия биоматериала.
Чистота посуды и материалов для забора (одноразовые шприцы).
Факторы внешней среды (особенно температура).
Наличие или отсутствие консервантов, антикоагулянтов.
Первичная обработка биоматериала.

Строго соблюдать условия транспортировки биоматериала (особенно при исследовании активности ферментов).

2 этап клинико-биохимических исследований - аналитический.

На этом этапе важно:

Правильно выбрать метод для исследования того или иного вещества. Важно чтобы метод был:

чувствительным (способность метода выявлять наименьшие различия между двумя концентрациями веществ);
специфичным (способность метода измерять лишь тот компонент, для определения которого он предназначен);
точным (степень приближения полученного значения к истинному содержанию вещества в биологической жидкости);
обладать воспроизводимостью (разброс показателей, полученных при анализе нескольких проб одного и того же образца биоматериала);
обладать диагностической ценностью (изменения данного вещества или ряда веществ в биоматериале, должно говорить о каком то определенном заболевании).

Правильно подготовить оборудование, посуду и реактивы в соответствии с методикой.
Точно выполнять исследование по методике.
Правильно проводить расчеты и интерпретировать полученные результаты.

3 этап клинико-биохимических исследований – постаналитический, на этом этапе необходимо обращать внимание на следующее:

Правильность оформления бланков анализа.
Лабораторно-клиническую интерпретацию результатов.
Доведение полученной информации до сведения лечащего врача.

1.3. Принципы биохимических исследований.

Исследования могут проводиться in vitro в пробирках различные биологические жидкости или in vivo с помощью введения в организм датчиков (например, ионоселективных электродов).
При интерпретации полученных биохимических показателей нужно помнить, что каждый отдельный определяемый компонент отражает деятельность многих органов и тканей, а также собственную функцию в организме, поэтому при диагностике заболеваний нужно учитывать комплекс различных биохимических показателей.
На некоторые биохимические показатели могут влиять внешние (смена времен года, погода, пища и т.д.) или внутренние (прием лекарственных средств, положение тела во время анализа и т.д.) факторы.
Некоторые биохимические показатели зависят от пола, возраста, характера питания, труда, образа жизни, генетических особенностей и т.д.
При решение вопроса об отклонениях биохимического показателя от нормы правильнее ориентироваться не на средние показатели, а на референтные (справочные) величины.
Следует строго соблюдать основные правила проведения биохимических исследований.
Трактуя биохимические показатели нужно учитывать условия, в которых находился больной при взятии пробы, в том числе степень физической активности, положение тела (стоя, лежа), другие диагностические обследования (например, проведение нагрузочных проб), лечебные меры (лекарства, физиолечение, хирургическое лечение).
Диагностическое значение результата биохимического исследования зависит от степени связи исследуемого параметра с патологическим процессом (нужно помнить, что большинство биохимических параметров отражает влияние не одного, а нескольких факторов заболеваний).
При диагностике большинства заболеваний нельзя опираться только на биохимические показатели, нужно учитывать и другие методы исследований. Но биохимические методы позволяют диагностировать ранние и скрытые формы некоторых заболеваний, например сахарного диабета, подагры, инфаркта миокарда, нарушений липидного обмена и др.

1.4.Основы тактики биохимических исследований.

При биохимических исследованиях следует соблюдать следующую тактику обследования пациента:

Лабораторные тесты, назначаемые пациенту, должны соответствовать основной клинической цели обследования:

Профилактика – выявление ранее не наблюдавшегося отклонения от нормы.
Диагностика или дифференциально-диагностическое обследование – установление диагноза.
Контроль за лечением (мониторинг)– оценка эффективности лечебных мер.
Прогностическое обследование, диспансерное наблюдение – оценка степени выздоровления и восстановления нарушенных болезнью функций.

Цель исследования должна определять набор, комбинацию и частоту назначения тестов.

Поиск ранее не наблюдавшейся патологии может проводиться как «вслепую», по широкому кругу тестов, так и направленно, по узкому набору тестов. Иногда в стационарах используют так называемый «вступительный скрининг», т.е. проведение каждому поступающему пациенту еще до осмотра лечащего врача заранее отобранного и установленного стандартного набора биохимических тестов.
Целесообразнее назначать биохимические тесты для дифференциальной диагностики заболевания не последовательно (растянуто во времени), а в комплексе (констелляции) тестов, которые выполняются одновременно.
Лучше использовать констелляции не только для диагностики, а для дифференциальной диагностики (набор тестов, которые способны отличить данное заболевание от ряда других похожих).
Лабораторные тесты должны назначаться с учетом их диагностической ценности на различных стадиях заболевания (скрытое течение, острая фаза, криз) и возможностей наблюдения за течением болезни.
Нагрузочные тесты (функциональные и фармакологические пробы) помогают в большей степени выявлять скрытые и неявные изменения биохимических параметров, резервные возможности систем, чем исследования в состоянии покоя. Назначать нагрузочные тесты нужно учитывая состояние больного и возможные отрицательные эффекты пробы.
При биохимическом контроле за результатами действия определенного вида лечения следует учитывать возможные влияния других лечебных воздействий, а также диагностических мероприятий.

1.5. Методы биохимических исследований в КДЛ.

Обмен веществ может изучаться на разных уровнях (уровень всего организма, клеточный уровень и т.д.) и различными методами. Основные методы, которые применяют в КДЛ, приведены в таблице.

Метод.	Сущность метода.	Приборы.	Примеры.
Фотоэлектро Колориметрический.	Сравнение интенсивности окраски исследуемого раствора с окраской раствора, концентрация которого известна (стандартного раствора).	Фотоэлектро колориметр (ФЭК).	Определение общего белка, глюкозы, ТАГ в сыворотке и плазме крови.
Спектрофото метрический	Определение количества вещества в растворе или твердой среде по измерению светопоглощения волн строго определенной длины.	Спектрофото Метр.	Определение количества ионов Nа, К и т. д. В сыворотке и плазме крови.
Потенциометрический.	Измерение разности потенциалов между парой подходящих электродов, погруженных в анализируемый раствор.	Потенциометр.	Определение рН крови.
Электро- форез.	Разделение смеси, состоящей из молекул несущих заряд, на составные компоненты.		Определение количества белковых фракций, изоферментов, в сыворотке и плазме крови.
Хроматография.	Разделение смесей на составные части с помощью адсорбентов (твердых, жидких, газов, гелей)	Хроматограф.	Определение количества липопротеидов в сыворотке и плазме крови.

В настоящее время в КДЛ для проведения биохимических анализов используют специальные полуавтоматические или автоматичесие анализаторы, которые могут определять от одного до нескольких десятков исследований.

В научных лабораториях, для изучения работы организма используют и другие, более современные методы исследований, например использование изотопов, электронная микроскопия, ультрацентрифугирование и др.

1.6.Международная система единиц измерения

в лабораторных исследованиях.

Международная система единиц (СИ) как единая система для всех отраслей науки, техники и производства была принята в 1960 г. XI Генеральной конференцией по мерам и весам. XXX сессия Всемирной Ассамблеи здравоохранения, состоявшейся в 1974 г., рекомендовала принять СИ во всех областях медицины, включая практическое здравоохранение.

В основу СИ положена метрическая система. Международная система включает основные физические величины.

Величины.	Единица.
	Наименование.	Обозначение.
		Русское.	Международное.
Длина.	Метр	м	М
Масса.	Килограмм	кг	кg
Время.	Секунда	с	S
Сила тока.	Ампер	А	A
Количество вещества.	Моль	Моль	мol
Термодинамическая температура.	кельвин	К	К

Наряду с основными единицами в СИ входят и их производные, которые образуются из основных в соответствии с правилами СИ.

Для упрощения работы можно использовать приставки и множители для образования десятичных кратных и дольных единиц.

Приставки.	Обозначение.	Множители.
	Русское.	Международное.
Мега	м	м	10
Кило	к	к	10
Гекто	г	h	10
Дека	да	da	10
Деци	д	d	10
Санти	с	c	10
Милли	м	m	10
Микро	мк	mk	10
Нано	н	n	10
Пико	п	p	10

Существует следующая соразмерность:

Масса. 1 кг = 1 000 г = 1 000 000 мг = 1 000 000 000 мкг.
Объем. 1 л = 10 дл (децилитр) = 100 сл (мантилитр) = 1000 мл = 1 000 000 мкл. Запомните: 1 мл = 1,028 см3.
Количество вещества. 1 моль = 1 000 ммоль = 1 000 000 мкмоль.
Время. 1 ч = 60 мин = 1800 с. 1 мин = 60 с.

Результаты биохимических исследований должны выражаться только в основных единицах или их производных:

Концентрация вещества с известной молекулярной массой в биологических жидкостях (кроме мочи) следует выражать в молях или его долях на литр (моль/л, ммоль/л, мкмоль/л, нмоль/л и т.д.).
В тех случаях, когда молекулярная масса вещества не известна или не может быть определена (в смеси), результат определения нужно выражать в единицах измерения массы на литр (г/л, мг/л и т.д.).
Выведение различных веществ с мочой выражается в долях моля за сутки (если относительная молекулярная масса известна) или в единицах массы за сутки (если относительная молекулярная масса неизвестна).
Плотность веществ указывается в г/л, клиренс в мл/с.
Единицей выражения активности ферментов является «катал» (кат), кат/л = моль/(с*л), мкат/л = ммоль/(с*л), мккат/л = мкмоль/(с*л). В старых методиках еще используют величину измерения активности ферментов МЕ/л= мкмоль/(мин*л).
Для перевода из одних единиц измерения в другие существуют коэффициенты пересчета, например:

нкат/л = 0,06 * мкмоль/(мин*л) или нкат/л = 0,06*МЕ/л.
мкмоль/(мин*л) = 16,67 * нкат/л.
Ранее принятые единицы количества вещества мг% можно пересчитать: 10* мг% = г/л, 17,104*мг% = мкмоль/л, 0,0555*мг% = ммоль/л.

1.7.Техника безопасности при работе в лаборатории.

Правила по охране труда и ТБ направлены на предупреждение опасных и вредных производственных факторов, связанных с особенностями работы в лаборатории, основные из них следующие:

Химические факторы – возникают при работе с реактивами.
Физические факторы – возникают при работе с приборами и аппаратами.
Биологические факторы – возникают при работе с инфицированным биологическим материалом.

В лаборатории нужно соблюдать следующие общие требования:

Работать только в спецодежде – халате, колпачке и сменной обуви.
Приступать к работе только после вводного инструктажа и первичного инструктажа на рабочем месте. Повторный инструктаж проводится не реже 1 раза в 6 месяцев.
Перед работой внимательно ознакомиться с методикой проведения анализа и в соответствии с этим подготовить свое рабочее место.
Перед работой следует убедиться в том, что:

правильно уяснена методика,
правильно подготовлены приборы и оборудование,
взятые вещества соответствуют методике анализа,
все расставлено так, чтобы было удобно достать, не вставая с места, и самое необходимое находится в пределах оптимальной рабочей зоны, соответствующей размаху согнутой в локтевом суставе руки.

Работать только на закрепленном месте.
Рабочее место содержать в чистоте, не загромождать его не нужными предметами.
Во время работы соблюдать тишину, порядок и чистоту.
Не допускать торопливости, невнимательности, беспорядочности и неряшливости.
Не покидать рабочее место во время проведения анализа, не оставлять без присмотра включенные приборы.
Запрещается выполнять работы не связанные с непосредственной работой в лаборатории.
Соблюдать правила ТБ при работе с кислотами, щелочами, летучими и ядовитыми веществами, инфицированным материалом, нагревательными приборами.
Соблюдать правила противопожарной безопасности.
Не наклоняться близко над склянками с реактивами (правильно нюхайте!).
Работать с реактивами только над столом.
Пипетировать вещества только пипеткой с грушей или дозатором.
Запрещено выливать вещества в канализацию, для этого предусмотрены специальные банки.
Не пробовать на вкус в лаборатории любые вещества, даже если они кажется вам знакомыми.
В лаборатории запрещается принимать пищу!
После работы обязательно вымыть руки с мылом!
После работы убрать все приборы и реактивы по местам, выключить все электроприборы, закрыть форточки, краны водоснабжения и протереть рабочий стол.
Уметь оказывать первую медицинскую помощь.

Профилактика профессиональных заражений, связанных с работой с инфицированным материалом, является одной из важнейших задач в работе лаборанта. Меры профилактики сводятся к максимальному предотвращению контактов кожи и слизистых оболочек с кровью и другими биологическими жидкостями, для чего необходимо придерживаться следующих правил:

Работать в спецодежде: халате, шапочке, сменной обуви, резиновых перчатках. При угрозе разбрызгивания крови работать в очках, маске, клеенчатом фартуке.
Повреждения на коже (порезы, царапины) перед работой нужно обязательно заклеить лейкопластырем.
Запрещается пипетирование биологического материала ртом. Обязательно нужно использовать автоматические пипетки или резиновые груши.
Запрещается есть, пить, курить и пользоваться косметикой на рабочем месте.
В случае загрязнения рук кровью их следует немедленно обработать тампоном, смоченным 1 % раствором хлорамина или 70 % раствором спирта в течение 2 минут, а затем вымыть проточной водой с мылом и протереть индивидуальным полотенцем.
При загрязнении кровью перчаток, их протирают тампоном, смоченным в 3 % растворе хлорамина или 6 % перекисью водорода.
При загрязнении стола кровью, его немедленно протирают дезраствором дважды с интервалом 15 минут.
После работы перчатки дезинфицируют в течении 60 минут в одном из дезинфицирующих растворов.
После работы поверхность рабочего стола обязательно продезинфицировать – промыть ветошью смоченной в одном из дезрастворов.
Лабораторный инструментарий, иглы, капилляры, предметные стекла, кюветы ФЭКа, пипетки, резиновые груши и т.д. после работы должны подвергаться дезинфекции и стерилизации.
Для дезинфекции можно применять следующие растворы:

Хлорамин 3 %.
Перекись водорода 6 %.
Моющий раствор (0,5 % раствор СМС и 6 % перекись водорода).
Осветленный раствор хлорной извести 0,6 %.
Сульфохлорантин 0,5 %.
Дезоксон-1 0,5% и т.д.
В настоящее время в лаборатории могут применяться другие, более современные дезинфицирующие средства.

1.8. Практическая работа

«Правила работы с лабораторным оборудованием».

Цели практической работы:

изучить особенности техники безопасности при работе в биохимической лаборатории;
закрепить умения работать химической пипеткой, мерным цилиндром и др. лабораторной посудой;
закрепить умения готовить растворы приблизительной концентрации.

Задания для самостоятельной работы:

Законспектируйте в тетрадь правила техники безопасности при работе в биохимической лаборатории и правила работы с биологическим материалом в КДЛ.
Оборудуйте рабочее место для практической работы согласно методике работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы в тетради по плану:

Название работы.
Задание к работе.
Рисунок.
Наблюдения, расчеты, уравнения реакций и т.д.

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на предложенные вопросы.

Реактивы:

Сульфат меди (сухой).
Гидроксид натрия (сухой).
Серная кислота (конц).
Дистиллированная вода.

Оборудование:

Пипетки на 1 и 2 мл.
Пробирки – 5 шт.
Баночка для воды.
Мерный цилиндр.
Химический стаканчик.
Весы и разновесы.
Стеклянная палочка.
Колба.
Фильтр.
Воронка.

Задание № 1. Работа с пипетками.

Подготовьте пипетки с резиновой грушей на 1 мл или на 2 мл.
Вспомните, как определяется цена деления мерной посуды.
Подготовьте 5 пробирок и баночку с водой.
Налейте в каждую пробирку по 4 мл воды, используя груши на 1 или 2 мл. Работайте медленно. Помните, в работе лаборанта очень важна аккуратность и точность!
Слейте всю воду из пробирок в мерный цилиндр, и измерь количество воды.
Если воды в цилиндре меньше или больше, чем 20 мл, то повторите всю операцию с самого начала.
Если воды в цилиндре ровно 20 мл, то приступайте к выполнению следующего задания.

Задание № 2. Приготовление растворов.

Произведите расчеты, необходимые для приготовления следующих растворов:

20 мл 5 % раствора сульфата меди.
25 мл 10 % раствора гидроксида натрия.
25 мл 5 % раствора серной кислоты.

Приготовьте один из предложенных растворов.
Напишите алгоритм приготовления растворов приблизительной концентрации.

Ответьте на вопросы:

Какой биологический материал можно использовать для биохимических исследований?
Чем отличается цельная кровь, сыворотка и плазма крови?
Как определить цену деления мерной полсуды (на примере цилиндра или пипетки).
Как правильно работать со спиртовкой и другими нагревательными приборами.
Фильтрование: приборы, правила проведения, промывание осадков.
Правила приготовления растворов приблизительной и точной концентрации.
Правила приготовления и хранения растворов кислот, щелочей и солей.
*На чем основаны методы лабораторных исследований (расскажите с использованием примеров).
*Перечислите основные этапы лабораторных исследований. Какие ошибки возможны на каждом из них? Почему?
*Перечислите правила хранения и транспортировки биологического материала.
*Единицы измерения в лабораторной диагностике. Что обозначает запись: гликемия 5,2 ммоль/л, общий белок 65 г/л.

Раздел 2. Химия биоорганических соединений.

Значение изучаемой темы:

В разделе «Химия биоорганических соединений» рассматриваются вещества (белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты, гормоны), которые играют важнейщую роль в жизнедеятельности организма. Основная цель раздела изучить строение, свойства, классификацию и функции этих веществ. Полученные знания являются основой понимания биохимических процессов, протекающих в организме человека и биохимических методов исследования в КДЛ.

2.1. Практическая работа

«Цветные реакции на белки».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении, классификации и функциях белков:
научиться проводить цветные реакции на белки и аминокислоты.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполнитьте практическую работу.
Оформитьте результаты работы в виде таблицы:

Название реакции.

Рисунок.

Используемые реактивы.

Окрашивание. Уравнения химических реакций.

Открываемые группы.

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Цветные реакции на белки и аминокислоты применяются для установления белковой природы вещества, идентификации белков и определения их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях.

Реактивы:

1 % раствор яичного белка.
Неразбавленный яичный белок.
10 % раствор гидроксида натрия.
1 % раствор сульфата меди.
0,5 % раствор нингидрина.
Концентрированная азотная кислота.
Концентрированная серная кислота.
Ледяная уксусная кислота.
Реактив Фоля.

Оборудование:

Пробирки – 5 шт.
Пипетки глазные 2 шт.
Спиртовка.
Спички.
Пробиркодержатель – 1 шт.

Опыт 1. Биуретовая реакция.

Принцип: В основе биуретовой реакции лежит способность пептидных связей (-СО - NH -) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность которых зависит от длины подипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.

Ход работы:

В пробирку налейте 5 капель 1 % раствора яичного белка, 3 капли 10 % раствора NаОН и 1 каплю 1 % pаствоpa CuSO4. Что наблюдаете?

Опыт 2. Нингидриновая реакция.

Принцип: Сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп в альфа - положений, которые присутствуют в природных аминокислотах и белках.

Ход работы:

В пробирку налейте 5 капель 1 % раствора яичного белка и 5капель 0,5 % раствора нингидрина.
Смесь нагрейте на спиртовке до кипения. Что наблюдаете?

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция.

Принцип: При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, которое в присутствии щелочи переходит в оранжевое. Сущность реакции заключается в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной кислотой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.

Ход работы:

В пробирку налейте 5 капель 1 % раствора яичного белка и З капли концентрированной азотной кислоты.
ОСТОРОЖНО нагрейте на спиртовке. Что наблюдаете?
Затем охладите под струей холодной воды и добавьте 10 капель 10 % раствора NаОН. Что наблюдаете?

Опыт 4. Реакция Адамкевича.

Принцип: Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

Ход работы:

К 1 капле не разведенного яичного белка добавьте 10 капель ледяной уксусной кислоты.
Осторожно наслоите 0,5 мл концентрированной серной кислоты (наклоните пробирку под углом 45 и капайте кислоту на стенку пробирки).
Пробирку осторожно поставьте в штатив. Что наблюдаете?

Опыт 5. Реакция Фоля.

Принцип: Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы -SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия, который образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и гидроксидом натрия, образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.

Ход работы:

К 5 каплям 1 % раствора яичного белка добавьте 5 капель реактива Фоля.
Смесь кипятите 2-3 минуты, затем охладите 1-2 мин. Что наблюдаете?

Ответьте на вопросы:

На каких принципах основаны цветные реакции на белки?
На чем основана классификация цветных реакций?
Какую из цветных реакций лучше всего использовать для определения количества белка? Почему?
*Напишите уравнения биуретовой и ксантопротеиновой реакций на примере пептида ТИР – АРГ – ГЛИ.
*Как отличить по химическим свойствам аминокислоты ЛИЗ и ФЕН? Напишите уравнения химических реакций.
*Где на практике применяют цветные реакции на белки?

2.2. Практическая работа

«Обратимое осаждение белков (высаливание белков)».

Цели практиченской работы:

закрепить знания о строение и свойства белков;
научиться проводить обратимое осаждение белков.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Сущность реакции высаливания заключается в удалении гидратных оболочек белковых молекул солями щелочных, щелочно-земельных металлов и иона аммония. Полунасыщенным раствором сульфата аммония осаждается глобулиновая фракция, а насыщенным раствором – альбуминовая.

Реактивы:

Яичный белок.
Насыщенный раствор сульфата аммония (NH4)2SO4.
(NH4)2SO4 кристаллический.
10 % раствор NaOH.
1 % раствор CuSО4.

Оборудование:

Пробирки – 5 шт.
Пипетки глазные – 4 шт.
Воронки – 2 шт.
Фильтровальная бумага.
Стеклянная палочка.

Ход работы:

В пробирку № 1 налейте 30 капель неразведенного яичного белка и добавьте 30 капель насыщенного раствора сульфата аммония (NH4)2SO4.
Содержимое пробирки перемешайте. Что наблюдаете? При этом получается полунасыщенный раствор сульфата аммония (NH4)2SO4, глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая - остается в растворе.
Через 5 минут осадок отфильтруйте в пробирку № 2.
Воронку с фильтром перенесите в пробирку № 3 и добавьте на фильтр 5-10 капель воды. Что происходит с осадком?
Проверьте наличие белка в пробирке № 3 с помощью биуретовой реакции. Для этого добавьте в пробирку 3 капли 10 % NaOH и 1 капля 1 % CuSО4.
В пробирку № 2 добавьте порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает в осадок альбуминовая фракция белка.
Через 5 минут осадок отфильтруйте в пробирку № 4.
Осадок снимите с фильтра аккуратно стеклянной палочкой и перенесите в пробирку № 5.
В пробирку № 5 добавьте 5-10 капель воды. Что происходит с осадком?
Проверьте наличие белка в пробирке № 5 с помощью биуретовой реакции. Для этого добавьте в пробирку 3 капли 10 % NaOH и 1 капля 1 % CuSО4.

Ответьте на вопросы:

Какие факторы устойчивости белка вы знаете?
Какой фактор устойчивости белка удаляется в данной работе?
Чем отличаются гидратные оболочки альбуминов и глобулинов?
Почему для осаждения альбуминов и глобулинов используют различные по концентрации растворы сульфата аммония?
Для чего в данной работе используется биуретовая реакция?
*Почему осадки альбуминов и глобулинов растворяются при добавлении воды?
*Чем высаливание белков отличается от денатурации?
*Где на практике используется обратимое осаждение белков?

2.3. Практическая работа

«Необратимое осаждение белков (денатурация белков)».

Цели практической работы:

закрепить знания о свойствах белков и аминокислот;
научиться проводить необратимое осаждение белков.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Белки в водных растворах имеют два фактора устойчивости: гидратную оболочку и заряд белковой молекулы. При удалении только одного фактора устойчивости, белки осаждаются обратимо. При удалении обеих факторов устойчивости одновременно, происходит необратимое осаждение, т.е. денатурация белка.

Реактивы:

1 % раствор яичного белка.
1 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
Концентрированная серная кислота Н2SO4.
Концентрированная соляная кислота HCl
Концентрированная азотная кислота HNO3.
10 % раствор сульфлсалициловой кислоты.
10 % раствор трихлоруксусной кислоты.
10 % раствор сульфата меди СuSO4.
5 % раствор ацетата свинца Pb(CH3COO)2.
Желатин сухой.
0,5 % раствор желатина.
Буферные растворы с рН = 1,0; 3,7; 4,7; 5,7; 9,0.

Оборудование:

Пробирки – 11 шт.
Глазные пипетки – 4 шт.
Спиртовка.
Штатив под пробирки.
Стеклограф.

Опыт 1. Осаждение белков при кипячении.

В 4 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель 1 % раствора белка.
Затем в пробирку № 2 добавьте 1 каплю 1 % раствора CH3COOH, в пробирку № 3 – 1 каплю 10 % раствора CH3COOH, в пробирку № 4 – 1 каплю 10 % раствора NaOH.
Все 4 пробирки нагрейте до кипения и наблюдайте образование осадка белка. Почему осадок белка образуется не во всех пробирках? Какие факторы устойчивости белка удаляются в каждом отдельном случае?

Опыт 2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

В 3 сухие пробирки налейте по 5 капель концентрированных минеральных кислот – серной, соляной и азотной.
Наклонив пробирку под углом 45*, осторожно, по стенке пробирки, так чтобы жидкости не смешивались, наслоите такой же объем 1 % раствора яичного белка во все пробирки. На границе 2-х слоев наблюдается белое кольцо. Почему?
Осторожно встряхните пробирки. Что наблюдаете?

Опыт 3. Осаждение белков органическими кислотами.

В 2 пробирки налейте по 5 капель 1 % раствора яичного белка.
В пробирку № 1 добавьте 2 капли 10 % раствора сульфосалициловой кислоты, а в пробирку № 2 - 2 капли 10 % ТХУ. Что наблюдается? Почему?

Опыт 4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В 2 пробирки внесите по 5 капель 1 % раствора яичного белка.
В пробирку № 1 добавьте 1 каплю 10 % раствора сульфата меди СuSO4, в пробирку № 2 – 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца Pb(CH3COO)2. Что наблюдается? Почему?

Опыт 5. Определение изоэлектрической точки ИЭТ желатина.

Опыт 5.1.

В три пробирки внесите по 0,2 г порошка желатина и добавьте по 1 мл буферных растворов с рН = 1,0; 4,7; 9,0.
Осторожно встряхните и оставьте стоять на 1 час.
Определите высоту геля в пробирках.
Зарисуйте рузультаты и сделайте выводы о значении ИЭТ по минимуму набухания.

Опыт 5.2.

В три пробирки налейте по 0,5 мл буферных растворов с рН = 3,7; 4,7; 5,7 и по 0,5 мл 0,5% раствора желатина. Что наблюдаете?
Затем во все пробирки добавьте по 1 мл этилового спирта. Что наблюдаете? Почему?

Ответьте на вопросы:

Какие факторы устойчивости белка вы знаете?
Какие факторы устойчивости белка удаляется в каждом опыте данной работы?
Что такое изоэлектрическая точка? Объясните результаты опыта 5.
Как изменяется растворимость белков в изоэлектрической точке?
Сделайте общий вывод по работе, ответив на вопрос: под действием каких факторов происходит денатурация белка?
*Что такое кислый, основной и нейтральный белок? Приведите примеры аминокислот определяющих эти свойства белков.
*Напишите уравнение диссоциации ГЛИ, АСП, ЛИЗ, ФЕН.
*Белок куриного яйца содержит в своем составе в основном моноаминодикарбоновые аминокислоты. Какой заряд имеет молекула такого белка? Каковы реакция среды в растворе яичного белка? При каких условиях этот белок достигает изоэлектрической точки?
*Напишите уравнения химических реакций, которые протекают в пробирках № 2, № 3, № 4 в опыте «Осаждение белков при кипячении», на примере глутаминовой аминокислоты (Глу) или аспарагиновой аминокислоты (Асп).
*Приведите примеры использования явления денатурации в лабораторной практике.

2.4. Практическая работа

«Качественные реакции на составные части молока».

Цели практической работы:

закрепить знания о свойствах белков и аминокислот;
закрепить умение проводить необратимое осаждение белков.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

В состав коровьего молока входят 3,3 % общего белка; 2,7 % казеиногена; 0,6 % альбуминов и глобулинов; 4,8 % лактозы; 3,7 % липидов; 0,7 % солей. Все эти составные части молока можно определить с помощью качественных реакций.

Реактивы:

Молоко.
Дистиллированная вода.
3 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
1 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
Сухой сульфат аммония.
Насыщенный раствор сульфата аммония.
0,2 % щавелевокислый аммоний.
5 % раствор сульфата меди СuSO4.
5 % раствор ацетата свинца Pb(CH3COO)2.
10 % хлорид кальция.
Пепсин.

Оборудование:

Пробирки – 5 шт.
Глазные пипетки – 2 шт.
Пипетка на 1 мл.
Спиртовка.
Штатив под пробирки.
Стеклограф.
Химический стаканчик.
Воронка.
Фильтр.
Термостат.

Опыт 1. Осаждение казеиногена.

Принцип:

Белок молока – казеиноген – относится к сложным белкам – фосфопротеидам, его простетическая группа содержит большое количество ортофосфорной кислоты, соединенной с аминокислотами серином и треонином. Казеиноген не свертывается при нагревании, растворим в растворах слабых щелочей. В молоке он находится в виде растворимых в воде кальциевых солей. В изоэлектрической точке рН=4,7 казеиноген переходит в изоэлектрическое состояние, теряет свою устойчивость и выпадает в осадок.

Ход работы:

В стаканчик налейте 2,5 мл молока и 5 мл дистиллированной воды.
Содержимое стаканчика хорошо перемешайте и добавьте по каплям 0,5 мл 3 % раствора уксусной кислоты.
Затем снова хорошо перемешайте и оставьте стоять 5-10 минут.
Осадок белка отфильтруйте.
Фильтрат разлейте в 3 пробирки и используйте в следующих работах.
Осадок белка промойте водой 1-2 раза.
Растворите осадок на фильтре 1 мл 1 % раствора гидроксида натрия.
С полученной жидкостью проведите биуретовую реакцию: прибавьте 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 5 % раствора сульфата меди. Что наблюдается? Объясните полученные явления.

Опыт 2. Осаждение молочного альбумина и глобулина.

Принцип:

Молочный альбумин и глобулин обладают всеми свойствами белков соответствующих групп (альбуминов и глобулинов): они свертываются при кипячении и высаливаются в насыщенном (альбумины) и полунасыщенном (глобулины) растворе сернокислого аммония.

Ход работы:

В первую пробирку с фильтратом из опыта 1 добавьте равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. Что наблюдаете?
Раствор отфильтруйте.
В фильтрат добавьте порошок сернокислого аммония до насыщения. Что наблюдаете? Объясните наблюдаемые явления.

Опыт 3 . Открытие молочного сахара.

Принцип:

Молочный сахар — лактоза, состоит из остатков бетта-галактозы и альфа-глюкозы, соединенных между собой 1,4-гликозидной связью, вследствие чего обладает восстановительной способностью.

Ход работы:

С фильтратом во второй пробирке из опыта 1 проведите реакцию Троммера, для чего налейте 5—6 капель 10% раствора едкого натрия и по каплям 5 % раствор сернокислой меди до образования легкой неисчезающей мути.
Пробирку осторожно нагрейте. Сначала появляется желтое окрашивание, а затем образуется желтый или красно-коричневый осадок.

Опыт 4. Открытие солей кальция.

К фильтрату в третьей пробирке из опыта 1 прибавьте 2—4 капли 0,2 % раствора щавелевокислого аммония. Что наблюдаете? Выпадает осадок не растворимого в воде щавелевокислого кальция.

Опыт 5. Створаживание молока.

Принцип:

Под влиянием фермента пепсина происходит створаживание молока, так как пепсин обладает способностью превращать казеиноген в казеин, кальциевые соли которого нерастворимы в воде.

Ход работы:

В химическом стаканчике разведите 1 мл молока в 20 раз дистиллированной водой.
В четыре пробирки отмерьте по 3 мл разведенного молока.
В первую пробирку добавьте 5—6 капель раствора пепсина.
Во вторую добавьте 5—6 капель прокипяченного раствора пепсина.
В третью и четвертую пробирки добавьте 5— 6 капель 0,2 % раствора щавелевокислого аммония и встряхните. Затем в каждую налейте по 5—6 капель раствора пепсина.
Все пробирки поместите на 10—15 мин в термостат при температуре 37—42° С.
По истечении указанного времени отметьте, в каких пробирках произошло створаживание молока. Объясните наблюдаемые явления.
В четвертую пробирку добавьте 5—6 капель 10% раствора хлористого кальция. В пробирке выпал осадок казеиногена. Объясните причину наблюдаемого явления.

Опыт 6. Осаждение белков молока солями тяжелых металлов

В три пробирки налейте по 1 мл молока и прибавьте в первую — 2—3 капли 5 % раствора сернокислой меди, во вторую — 2—3 капли 5 % раствора уксуснокислого свинца. Что наблюдаете? Почему?

Ответьте на вопросы:

Как объяснить, что белок молока казеин при кипячении сворачивается (выпадает в осадок), если молоко кислое.
*Каплю раствора, содержащего смесь аминокислот ГЛИ, АЛА, ГЛУ, ЛИЗ, ГИС нанесли на середину элерктрофоретической бумаги, смочили буфером рН 6,0 и приложили электрическое напряжение. Укажите, в каком направлении (к катоду, аноду или остануться на старте) будут двигаться отдельные аминокислоты.
*Трипептид, выделенный из токсина змей, состоит из трех незаменимых аминокислот – серосодержащей, гетероциклической и гидроксилсодержащей. Напишите этот трипептид и определите область рН в которой будет находиться его изоэлектрическая точка.

2.5. Практическая работа

«Качественные реакции на углеводы».

Цели практической работы:

закрепить знания о стороении, свойствах и классификации углеводов;
научиться проводить качественные реакции на углеводы.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Реактивы:

1 % раствор глюкозы.
1 % раствор мальтозы.
1 % раствор сахарозы.
1 % раствор крахмала.
10 % раствор NaOH.
5 % раствор CuSО4.
1 % раствор I2.
Раствор слюны (набрать в рот немного воды, через 2 минуты полученную воду со слюной отфильтровать).

Оборудование:

Пробирки – 7 шт.
Пипетки - 4 шт.
Спиртовка.
Воронка.
Фильтровальная бумага.

Опыт 1. Обнаружение крахмала.

Принцип:

Крахмал состоит из двух видов полимерных цепей линейной (амилоза) и разветвленной (амилопектин), которые обладают специфическими свойствами. Амилоза хорошо растворима в горячей воде, с раствором йода дает синее окрашивание. Амилопектин в горячей воде образует коллоидный раствор и с раствором йода не дает синее окрашивание. Крахмал расщепляется амилазой слюны и амилазой кишечника.

Ход работы:

В первую пробирку налейте 10 капель 1 % раствора крахмала и 1 каплю 1 % раствора йода. Что наблюдаете?
Во вторую пробирку налейте 10 капель 1 % раствора крахмала, 5 капель раствора слюны и оставьте стоять 10-15 минут.
Смесь из второй пробирки разделите на 2 части.
В первую часть добавьте 1 каплю 1 % раствора йода, а вторую часть сохраните для второго опыта. Что наблюдаете? Объясните наблюдаемые явления.

Опыт 2. Восстановительные свойства углеводов (реакция Троммера).

Принцип:

Моно- и дисахариды, имеющие свободную альдегидную группу, обладают способностью восстанавливать в щелочной среде металлы из их окислов в закисные формы.

Ход работы:

Возьмите 4 пробирки и пронумеруйте их.
Добавьте по 10 капель растворов: в первую пробирку - глюкозы, во вторую - мальтозы, в третью - сахарозы, в четвертую - крахмала.
Пробирку из опыта 1 обозначьте № 5.
Затем во все пять пробирок добавьте по 10 капель 10 % раствора NаОН и 2 капли 5 % раствора CuSО4. Смеси перемешайте. Что наблюдаете?
Все смеси нагрейте на спиртовке. Что наблюдаете? Объясните полученные результаты. Напишите уравнения реакции окисления глюкозы до глюконовой кислоты.

Ответьте на вопросы:

Где на практике применяют качественные реакции крахмала и глюкозы?

Почему реакция Троммера не является специфичной для глюкозы?

Амилаза расщепляет крахмал в ЖКТ. Будет ли этот фермент расщеплять гликоген и клетчатку? Почему?
*Как вы думаете, можно ли применять реакцию Троммера для определения глюкозы в крови? Почему?

*Напишите реакцию окисления глюкозы до глюкуроновой кислоты.

*Напишите уравнения реакций образования глюкозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат из глюкозы и фосфорной кислоты.

*Крахмал, гликоген и клетчатка являются полимерами глюкозы. Будет ли синее окрашивание с йодом у гликогена и клетчатки? Почему?

2.6. Практическая работа

«Качественные реакции на липиды».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении, свойствах и классификации липидов;
научиться проводить качественные реакции на липиды.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Физические и химические свойства липидов определяются их строением. Они не растворимы в воде и полярных растворителях, т.к. не способны образовывать водородные связи в растворах, но с рядом веществ способны образовывать эмульсии.

Реактивы:

Растительное масло.
Бензин.
Хлороформ.
Эфир.
Этиловый спирт.
1 % раствор яичного белка.
10 % раствор NaOH.
10 % раствор соды NaHCO3.
Мыльный раствор.
Желчь.
Дистиллированная вода.
Бромная вода.
Сливочное масло.
35 % гидроксид натрия.
Моча.
Порошок серы.

Оборудование:

Пробирки – 11 шт.
Пипетки - 2 шт.
Лопаточка.

Опыт 1. Растворение жиров.

В 4 пробирки внесите по 3 капли растительного масла.
Добавьте по 10 капель: в первую пробирку бензина, во вторую - хлороформа, в третью - эфира, в четвертую - этилового спирта.
Смеси встряхните. Что наблюдаете? Объясните полученные результаты.

Опыт 2. Эмульгирование жиров.

В 5 пробирок внесите по 2 капли растительного масла и по 3 капля дистиллированной воды.
Смеси энергично встряхните. Что наблюдается?
Добавьте по 4 капели: в первую пробирку раствора белка, во вторую - 10 % раствора NaOH, в третью - 10 % раствора соды NaHCO3, в четвертую - мыльного раствора и в пятую - желчь.
Смеси энергично встряхните. Что наблюдается? Объясните полученные результаты.

Опыт 3. Определение непредельности высших жирных кислот.

В 2 пробирки поместите 8-10 капель бромной воды.
В первую пробирку добавьте 2-3 капли растительного масла, во вторую – небольшой кусочек сливочного масла.
Содержимое обеих пробирок взболтайте. Что наблюдается? Объясните наблюдаемые явления.

Опыт 4. Омыление жиров.

В фарфоровую чашечку поместите 0,5 мл растительного масла и 4 капли 35 % раствора гидроксида натрия.
Стеклянной палочкой хорошенько размешайте щелочь с маслом до получения однородной эмульсии.
Поставьте чашечку на электрическую печь и при незначительном подогревании продолжайте помешивать, пока не получиться однородная, прозрачная, слегка желтоватая жидкость.
Добавьте 2 мл воды и вновь нагрейте, тщательно помешивая до полного упаривания воды.
Снимите чашечку с электрической печи. Получиться кусочек твердого белого мыла. Где применяется данное свойство жиров?

Опыт 5. Обнаружение желчных кислот в моче (проба Гея).

Принцип:

Желчные кислоты являются поверхностно-активными веществами (ПВА), снижающими поверхностное натяжение мочи, поэтому порошок серы, помещенный на поверхность мочи, тонет.

Ход работы:

В первую пробирку налейте 3-5 мл мочи, во вторую 3-5 мл желчи.
В обе пробирки добавьте 1 лопаточку порошка серы. Не взбалтывать! В присутствии желчных кислот в моче порошок серы тонет.

Ответьте на вопросы:

Почему жиры не растворимы в воде и растворимы в неполярных органических растворителях?
На чем основано эмульгирование жиров? Какими свойствами должны обладать эмульгаторы?
Как в организме используется способность жиров образовывать эмульсии и мицеллы?
Какие эмульгаторы существуют в организме? Их функции.
На каких свойствах желчных кислот основано их обнаружение в моче?
Почему непредельные жирные кислоты должны поступать в организм с пищей?
*На чем основано омыление жиров? Напишите уравнения химической реакции омыления ТАГ образованного 1 стеариновой и 2 линоленовыми кислотами.
*Чем отличается гидролиз и омыление жиров? Напишите уравнения химической реакции гидролиза и гидрирования ТАГ образованного 1 пальмитиновой и 1 линоленовой и 1 арахидоной кислотами.
*Почему липаза может переваривать только эмульгированные жиры?

2.7. Практическая работа

«Качественные реакции на нуклеиновые кислоты».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении и функциях нуклеиновых кислот;
научиться проводить качественные реакции на нуклеиновые кислоты.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеинов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу и фосфорную кислоту. Продукты могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого вещества реакциями.

Реактивы:

Дрожжи.
Эфир.
Дистиллированная вода.
Стеклянный песок.
0,4 % раствор гидрооксида натрия.
Уксусная кислота.
10 % раствор серной кислоты.
10 % раствор гидрооксида натрия.
1 % раствор сульфата меди.
Раствор аммиака.
Аммиачный раствор оксида серебра.
Молибденовый реактив.

Оборудование:

Пробирки – 6 шт.
Центрифужная пробирка.
Весы и разновесы.
Фарфоровая ступка и пестик.
Химический стакан на 100 мл.
Центрифуга.
Пипетки.
Пробка с обратным холодильником.
Водяная баня.
Воронка.
Фильтровальная бумага.
Лакмусовая бумага.
Спиртовка.

Опыт 1. Извлечение нуклеопротеидов из дрожжей.

В фарфоровую ступку поместите 1 г дрожжей, добавьте 1 каплю эфира, 2 капли дистиллированной воды, около 0,1 г стеклянного песка.
Дрожжевую массу расзотрите пестиком 1-2 минуты для разрушения клеток.
В ступку добавьте 4 мл 0,4 % раствора гидроксида натрия и растирайте еще 5 минут.
Содержимое ступки пипеткой перенесите в центрифужную пробирку и центрифугируйте 10 минут при 2000 об/мин.
Надосадочную жидкость перенесите пипеткой в стакан с 80-90 мл воды, подкисленной до рН=4,5 уксусной кислотой.
Выпавший осадок РНК-протеина отделите центрифугированием 10 минут при 2000 об/мин..

Опыт 2. Изучение химического состава рибонуклеинов дрожжей.

200 мг дрожжей поместите в широкую пробирку и добавьте 5 мл 10 % раствора серной кислоты и 5 мл дистиллированной воды.
Смесь перемешайте и закройте пробкой с обратным холодильником.
Пробирку поместите на кипящую водяную баню и кипятите при слабом нагревании 1 час.
Пробирку охладите.
Отфильтруйте содержимое пробирки.
Фильтрат (гидролизат) используйте в опытах 3 – 6.

Опыт 3. Биуретовая реакция на белок.

К 5-6 каплям гидролизата прибавьте 10 капель 10 % раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1 % раствора сульфата меди. При наличии белка жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

Опыт 4. Серебреная проба на пуриновые основания.

К 0,5 мл гидролизата добавьте раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус и 0,5 мл аммиачного раствора оксида серебра.
Через 5 минут при стоянии выпадает небольшой хлопьевидный осадок серебряных соединений пуриновых оснований.

Опыт 5. Реакция на пентозы.

К 0,5 мл гидролизата добавьте 0,5 мл 10 % раствора гидроксида натрия и по каплям раствор сульфата меди до образования осадка.
Смесь нагрейте до кипения. В случае присутствия моносахаридов (петноз) образуется красный осадок закиси меди.

Опыт 6. Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

К 0,5 мл гидролизата прибавьте равный объем молибденового реактива и кипятите несколько минут. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет.
Смесь охладите. При охлаждении образуется желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.

Опыт 7. Качественная реакция на рибозу.

К 0,5 мл 0,1 % раствора РНК добавьте равный объем орцинового реактива (1г орцина в 500 мл 30 % раствора НCI + 5 мл 10 % раствора хлорида железа(III).
Кипятите 10 минут на кипящей водяной бане. В присутствии рибозы развивается зеленое окрашивание (под влиянием концентрированной соляной кислоты от рибозы отщепляется 3 молекулы воды и образуется метилфурфурол, который с орцином дает зеленое окрашивание).

Ответьте на вопросы:

Какие ферменты расщепляют нуклеиновые кислоты в ЖКТ?
Напишите параллельную цепь ДНК для участка: ААТЦЦГТТАТГГ. Укажите триплеты.
Перечислите основные этапы биосинтеза белка.
*Напишите последовательность цепи РНК для участка ДНК: ЦЦТГАТАЦЦТГА.
*Напишите уравнение реакции гидролиза мононуклеотида, образованного рибозой, аденином и остатком фосфорной кислоты.

2.8. Практическая работа

«Качественные реакции на витамины».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении, классификации и функциях витаминов;
научиться проводить качественные реакции на витамины.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Реактивы:

Витамины или сироп «Пиковита».
Сульфаниловая кислота.
Раствор нитрита натрия.
20 % бикарбонат натрия.
Соляная кислота конц.
Серная кислота конц.
Цинк мет.
10 % уксусная кислота.
Ледяная уксусная кислота.
5 % ацетат меди.
5 % хлорид железа (3).
20 % соляная кислота.
20 % гидроксид натрия.
Реактив Фелинга.
Анилиновый реактив.

Оборудование:

Пробирки - 4 шт.
Глазные пипетки – 2 шт.
Спиртовка.
Пробиркодержатель.

Опыт1. Реакция с диазореактивом на тиамин (витамин В1).

Принцип: В основе реакции лежит способность витамина B1 в щелочной среде с диазореактивом (смесь солянокислого или сернокислого раствора сульфаниловой кислоты с раствором нитрита натрия) образовывать сложное комплексное соединение оранжевого или красного цвета.

Ход работы:

В пробирку налейте 1 мл раствора сульфаниловой кислоты и 1 мл раствора нитрита натрия. Образуется диазореактив.
Внесите небольшое количество (на кончике шпателя) порошка или 0,5 мл раствора тиамина и по стенке пробирки осторожно добавьте 1 мл 20 % раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета или красного цвета.

Опыт 2. Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2).

Принцип: Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин.

Ход работы:

В пробирку прилейте 1 мл раствора витамина В2, О,5 мл концентрированной соляной кислоты и опустите кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается.
Смесь сзболтайте. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.

Опыт 3. Реакция на витамин РР (антипеллагрический, В5).

Принцип: При нагревании витамина РР с раствором ацетата меди образуется плохо растворимый синий осадок медной соли витамина РР.

Ход работы:

В пробирку поместите 5—10 мг витамина РР и 1—2 мл 10 % раствора уксусной кислоты.
Смесь нагрейте.
К нагретому до кипения раствору прибавьте 1-2 мл 5 % раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной.

Опыт 4. Реакция на пиридоксин (витамин В6).

Принцип: При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа фенолята железа.

Ход работы:

В пробирке смешайте 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли 5 % раствора хлорида железа (III) FeCI3.
Смесь встряхните. Наблюдается окрашивание жидкости в красный цвет.

Опыт 5. Реакция на витамин Р (витамин проницаемости, цитрин, рутин).

Принцип:

Хлорид железа (III) FeCI3 образует с рутином комплексные соединения, окрашенные в изумрудно-зеленый цвет.

Концентрированная серная кислота образует в флавонами и флавонолами флавилиевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую окраску.

При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рутинозы. Она затем распадается на глюкозу и рамнозу, которые обладают восстановительными свойствами.

Ход работы:

К 2 мл насыщенного водного раствора рутина прибавьте несколько капель 5 % раствора FeCI3 . Наблюдается появление зеленого окрашивания.
К 2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки 1 мл прибавьте концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо.
К 0,5 г рутина прибавьте 5 мл 20 % раствора соляной кислоты. Смесь кипятите в течении 1 мин, затем отфильтруйте. К фильтрату долейте 3 мл 20 % раствора гидроксида натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга. Смесь снова нагрейте до кипения. Наблюдают образование красного осадка закиси меди.

Опыт 6. Качественная реакция на никотиновую кислоту.

Принцип:
Никотиновая кислота при нагревании с раствором ацетата меди образует синий осадок медной соли витамина, который плохо растворим в воде.

Ход работы:

20 капель 3 % раствора никотиновой кислоты нагрейте до кипения, при этом мутный раствор витамина становится прозрачным.
Прибавьте 20 капель 5 % раствора ацетата меди, нагрейте до кипения и сразу охладите под струей холодной воды. Содержимое пробирки окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.

Опыт 7. Качественная реакция на витамин Е (токоферол).

Принцип:
Спиртовой раствор токоферола окисляется хлоридом железа (III) FeCI3 в токоферрилхинон красного цвета.

Ход работы:

В пробирку налейте 4-5 капель 1 % раствора токоферола.
Добавьте 0,5 мл 1 % раствора хлорида железа (III) FeCI3.
Тщательно перемешайте. Содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.

Опыт 8. Качественная реакция на витамин А (ретинол).

Принцип:

При взаимодействии раствора витамина А или рыбьего жира в хлороформе с ледяной уксусной кислотой, насыщенным раствором сульфата железа и концентрированной серной кислотой появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины при этой реакции дают зеленое окрашивание.

Ход работы:

К 1-2 капли рыбьего жира добавьте 5-10 капель ледяной уксусной кислоты насыщенной сульфатом железа и 1-2 капли концентрированной серной кислоты.
Разотрите мякоть шиповника с песком и прибавьте с содержимому пробирки несколько капель хлороформа. Каротин при этом переходит в хлороформ. Слейте этот раствор в другую пробирку и прибавьте несколько капель концентрированной серной кислоты, нагрейте. Верхний слой хлороформа окрашивается в зеленый цвет, затем в синий.

Опыт 9. Качественная реакция на витамин Д (холекальцеферол).

Ход работы:

Смешайте 1 каплю рыбьего жира с 5 каплями анилинового реактива. Эмульсия окрашивается в желтый цвет, который при нагревании приобретает красную окраску.

Ответьте на вопросы:

1. Чем отличаются авитаминоз и гиповитаминоз?

На чем основано качественное определение витаминов?
*Почему витамины нужно принимать только в определенных дозах? Ответ поясните.
В чем заключается биологическое значение витаминов?
*Приведите примеры участия витаминов в качестве составных частей в биологически активных веществах. Приведите примеры этих веществ.
Как происходит всасывание витаминов в ЖКТ?
Почему тертую морковь рекомендуют кушать с растительным маслом?
*Почему витамин В12 вводят внутримышечно, а не назначают в виде таблеток?
*Приведите примеры, когда минеральные вещества и витамины несовместимы.

2.9. Практическая работа

«Количественное определение витамина С

в моче и пищевых продуктах».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении, свойствах и функциях витамина С;
закрепить умение титровать;
научиться проводить количественное определение витамина С.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Работа № 1. Определение витамина С в моче.

Принцип метода:

Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать краситель 2,6 – дихлорфенолиндофенол. Окисленная форма красителя обладает окраской (в кислой среде - розовой), восстановленная форма – бесцветная. Количество витамина С определяют, титруя исследуемый подкисленный раствор дихлорфенолиндофенолом до появления розовой окраски. Пока в растворе есть аскорбиновая кислота, краситель обесцвечивается, когда вся аскорбиновая кислота будет окислена, титруемый раствор приобретает розовую окраску.

Реактивы:

Уксусная кислота – 3%.
Дихлорфенолиндлфенол– 0,001н.
Дистиллированная вода.
Моча.

Оборудование:

Колба на 50 или 100 мл.
Пипетки на 1 мл и 5 мл.
Бюретка.

Ход определения:

В колбу наливают 1 мл мочи, 7 мл дистиллированной воды, 3 мл уксусной кислоты.
Смесь титруют дихлорфенолиндлфенолом до появления розовой окраски, устойчивой 30 с.
Для расчета содержания витамина С в суточной моче используют формулу:

А * 0.088 * 1500 = витамин С. мг,

Где:

1500 – суточный диурез;

0,088 – количество мг аскорбиновой кислоты, соответствующей 1 мл 0,001 н раствора дихлорфенолиндлфенола;

А – количество мл дихлорфенолиндлфенола, пошедшего на титрование исследуемого раствора.

Норма: с мочой за сутки выделяется от 20 до 40 мг витамина С.

Диагностическое значение: определение содержания витамина С в моче дает представление о запасах этого витамина в организме.

Работа № 2. Определение витамина С в продуктах питания.

Принцип:

Аскорбиновая кислота является сильным восстановителем и может быть определена йодометрическим методом при определенном значении рН раствора (например рН = 7). При титровании йодом аскорбиновая кислота окисляется, образуя дегидроаскорбиновую кислоту.

Реактивы:

Картофель, капуста.
Песок.
2 % соляная кислота.
0,5 % крахмал.
0,003 н. раствор йода.

Оборудование:

Ступка.
Химический стакан.
Воронка.
Вата.
Колба на 100 мл.
Титровальная колонка.

Ход работы:

1. Подготовка экстракта из пищевых продуктов для определения витамина С.

2 г капусты или картофеля натрите на терке в чашке Петри или мелко порежте и разотрите в ступке с небольшим количеством толченого стекла или песка.
Соберите массу из чашки Петри, если измельчали на терке, в стаканчик.
Добавьте 10 мл 2 %-го раствора НС1.
Если измельчали в ступке - добавьте прямо в ступку 10 мл 2 %-го раствора НС1.
Хорошо перемешанную массу отфильтруйте через стеклянную воронку с ватой в коническую колбу на 50 — 100 мл.
Массу на фильтре промойте несколькими каплями воды.

2. Определение количества витамина С.

В фильтрат прилейте 1 мл 0,5% раствора крахмала и оттитруйте его рабочим раствором 0,003 н. йода до появления синего окрашивания.

3. Расчет:

При расчете содержания витамина С в продукте использовать формулу определения массы при помощи титра по определяемому веществу:

М = Н * Э * V / 1000 (г)

Где:

Н - молярная концентрация эквивалента йода;

Э — молярная масса эквивалента аскорбиновой кислоты в г, равная в данном случае 88 г;

V — объем пошедшего на титрование йода, в мл.

Для пересчета на содержание витамина С в 100 г продукта использовать формулу:

Х = М * 1000 / 2 (г)

Норма:

Содержание витамина С в капусте 0,45 мг%, в картофеле — 20 мг%.

Для перевода мг% из грамм результат умножают на 100.

Ответьте на вопросы:

Напишите структурную формулу витамина С.
К какому классу органических соединений можно отнести витамин С?
Какие функции витамин С играет в организме?
На каких свойствах витамина С основано его колическтвенное определение?
В каких продуктах питания содержание витамина С наибольшее?
*От каких факторов зависит содержание витаминов в продуктах питания?

2.10. Практическая работа

«Качественные реакции на гормоны».

Цели практической работы:

закрепить знания о функциях гормонов в организме;
научиться проводить качественные реакции на гормоны.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Реактивы:

Растворы горомнов: инсулина, адреналина, кортизола (спиртовой).
10 % гидроксид натрия.
30 % гидроксид натрия.
1 % сульфат меди.
20 % сульфасалициловая кислота.
5 % ацетат свинца.
1 % сульфаниловая кислота.
Азотная кислота конц.
3 % хлорид железа (3).
5 % нитрит натрия.
10 % карбонат натрия.
2 % м-динитробензол (спиртовой).
Раствор гидроксида тетраметиламмония.
Раствор синего тетразолия.
Моча.

Оборудование:

Пипетки глазные – 2 шт.
Пробирки – 4 шт.
Спиртовка.
Пробиркодержатель.

Опыт 1. Качественные реакции на инсулин.

Принцип:

Инсулин является гормоном белковой природы, поэтому для него будут характерны все качественные реакции на белки.

1. Обнаружение инсулина биуретовой реакцией.

В пробирку к 5 каплям раствора инсулина прибавьте 5 капель 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1 % раствора сернокислой меди.
Смесь перемешайте. Наблюдается появление фиолетового окрашивания. Объяснить механизм реакции.

2. Обнаружение инсулина реакцией с сульфосалициловой кислотой.

В пробирку внесите 1 мл раствора инсулина, добавьте 5 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Наблюдается выпадение осадка белого цвета. Объясните механизм реакции.

3. Обнаружение инсулина реакцией Фоля.

В термостойкую пробирку внесите 5 капель раствора инсулина, 5 капель 30% раствора едкого натра и 1—2 капли 5% раствора уксуснокислого свинца.
Смесь нагрейте. При длительном нагревании жидкость в пробирке буреет и выпадает черный осадок сернистого свинца. Объяснить механизм реакции.

4. Реакция Геллера на инсулин.

К 10 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки прилейте равный объем (10 капель) раствора инсулина.
Пробирку наклоните под углом 45° так, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется белый аморфный осадок в виде небольшого кольца.

Опыт 2. Качественные реакции обнаружения адреналина.

Принцип:

Адреналин (метиламиноэтанолпирокатехин) – гормон мозгового вещества надпочечников – дает реакции, характерные для пирокатехинов. Адреналин с ионами железа (III) образует соединение изумрудно-зеленого цвета, легко окисляется диазореактивом с образованием адренохрома красного цвета.

1. Реакция с хлоридом железа (III).

В пробирку внесите 1 мл адреналина (1:1000), прибавьте 1 каплю 3% раствора хлорида железа (III) и перемешайте. Появляется изумрудно-зеленое окрашивание.
К смеси добавьте 1 каплю 10% раствора едкого натра — возникает вишнево-красное окрашивание.

2. Реакция с диазореактивом.

К 1 мл 1% сульфаниловой кислоты прибавьте 1 мл 5% раствора нитрита натрия (получается диазореактив).
К диазореактиву добавьте 1,5 мл раствора адреналина (1:1000) и 1мл 10% раствора карбоната натрия.
Смесь перемешайте. Раствор окрашивается в красный цвет.

Опыт 3. Качественное обнаружение 17-кетостероидов в моче с помощью m-динитробензола.

Принцип:

К «17-кетостероидам» относят стероиды, которые имеют карбонильную группу у 17 углеродного атома. Это метаболиты горомнов коры надпочечников и половых желез. 17-кетокортикостероиды с м-динитробензолом в присутствии щелочи образуют окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству стероидов в пробе.

В пробирку поместите 5 капель мочи, 5 капель 30% раствора едкого натра и 5 капель 2% спиртового раствора (в этаноле) m-динитробензола.
Смесь перемешайте. Через 2-3 минуты, при наличии 17-кортикостероидов, появляется красное окрашивание за счет образования продуктов конденсации циклопентанопергидрофенантрена с т-динитробензолом.

Опыт 4. Качественная реакция на кортизол.

Принцип:

Кортизол относится к стероидным гормонам. Реакция используется в колориметрическом методе для количественного определения содержания кортикостероидов в биологических жидкостях и основана на восстановлении синего тетразолия за счет оксикетонной группы у 17-го углеродного атома циклопентанпергидрофенантренового ядра.

К 1 мл спиртового раствора кортизола добавьте 0,25 мл раствора гидроксида тетраметиламмония и 0,25 мл раствора синего тетразолия.
Содержимое пробирки встряхните и оставьте в темноте на 25 мин. Жидкость окрашивается в розовый цвет.

Ответьте на вопросы:

На клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия:

а) с инсулином;

б) с глюкагоном;

в) адреналином;

г) йодтиронинами.

Каково влияние инсулина на процессы гликолиза и биосинтеза и распада гликогена?
Каковы пути катаболизма инсулина и адреналина?
В клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия с глюкокортикоидами?
Каков механизм действия глюкокортикоидов на клетки-мишени?
В чем заключается бологическое значение кортизола и 17-кетостероидов?
*Каково влияние глюкагона на процессы обмена углеводов, белков и липидов?
*Каково влияние адреналина на активность процессов в гликолиза, гликонеогенеза, биосинтеза и распада гликогена?
*Каково влияние йодтиронинов на метаболизм в организме человека?
*Каково влияние глюкокортикоидов на обмен углеводов в печени и скелетных мышцах.

2.11. Практическая работа

«Определение окислительных ферментов в биологическом материале».

Цели практической работы:

закрепить знания о механизме образования энергии в организме и её связи с обменом веществ;
научиться определять окислительные ферменты в биологическом материале.

Задания для самостоятельной работы:

1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:

№ п/п	Ход работы. Рисунки.	Наблюдения	Выводы

Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Реактивы:

Раствор формальдегида 0,4 %.
Метиленовая синь.
Растительное масло.
Молоко.
Слюна.
Кровь.
Физиологический раствор.
Раствор Н2SО4 10 %.
Раствор Н2О2 1,5 %.
Раствор КМnО4 0,1н.

Оборудование:

Глазные пипетки – 2 шт.
Пипетка на 1 мл.
Штатив с пробирками.
Термостат.
Коническая мерная колба.

Опыт № 1. Обнаружение альдегидоксидазы в молоке.

Принцип.

Альдегидоксидаза молока является флавопротеидом, способным окислять альдегиды. При добавлении к некипяченому молоку формальдегида и метиленовой сини фермент окисляет альдегид в муравьиную кислоту, а освободившийся при этом водород передается на метиленовую синь, восстанавливая её в бесцветное состояние. Реакцию используют, чтобы отличить кипяченое молоко от некипяченого.

Ход работы:

В две пробирки наливают по 15 капель молока.
Одну пробирку кипятят в пламени спиртовки, а затем охлаждают в струе воды.
В обе пробирки вносят по 1-2 капли 0,4 % раствора формальдегида и по 1 капле раствора метиленовой сини.
Содержимое пробирок перемешивают и добавляют 3 капли масла для создания анаэробных условий.
Пробирки помещяют в термостат при 37С и отмечают постепенное обесцвечивание.

Опыт № 2. Обнаружение каталазы в слюне и крови.

Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много её в строме эритроцитов и печени. В процессе окисления некоторых веществ образуется пероксид водорода, ядовитый для организма. Каталаза расщепляет пероксид водорода на молекулярный кислород и водород.

Ход работы:

В две пробирки внести 10-15 капель раствора перекиси водорода.
В первую пробирку добавить 3 капли слюны, во вторую – 3 капли крови. Что наблюдаете? Почему выделяется газ?
Внести в пробирку тлеющую лучинку. Лучинка вспыхивает. Почему?

Опыт № 3. Определение активности каталазы в слюне.

Принцип.

Метод основан на титриметрическом определении количества перекиси водорода, оставшегося в пробе после действия фермента. Перекись водорода оттитровывают 0,1 н. раствором перманганата калия.

Ход работы:

В две конические колбы (контрольная и опытная) вносят по 1 мл физраствора, 0,3 мл раствора перекиси водорода и 0,5 мл неразведенной слюны.
Опытную пробу оставляют стоять на 15 минут при комнатной температуре.
В контрольную пробу сразу же после добавления слюны приливают 3 мл раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек.
В опытную пробу через 15 минут инкубации добавляют 3 мл раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек.
Расчет проводят по формуле:

А = (К – О) * 0,3 (мг/ мл*мин)

Где:

А – активность каталазы.

К – количество перманганата калия, пошедшее на титрование контроля.

О – количество перманганата калия, пошедшее на титрование опыта.

0,3 – коэффициент, учитывающий титр перекиси водорода, количество

слюны в пробе и время инкубации.

Ответьте на вопросы:

С помощью какой химической реакции можно доказать, что молоко не кипяченое?
Где в организме встречается каталаза?
Какую функцию выполняют альдегидоксидаза и каталаза?
Что вы понимаете под активностью каталазы?
Дайте определение понятиям: цикл Кребса, ферменты, дыхательная цепь.
*Нарисуйте схематично процессы, происходящие в цикле Кребса и ЦПЭ.
*Как связаны в организме процессы обмена веществ и образования энергии?

Раздел 3. Ферменты.

Значение изучаемой темы:

В организме практически нет реакций, которые не катализировались бы ферментами. Ферменты обеспечивают существование таких важнейших процессов жизнедеятельности, как реализация наследственной информации, биоэнергетика, синтез и распад биологических молекул. Наука о питании основана на точных знаниях о расщеплении веществ под влиянием ферментов пищеварительного тракта. Действие многих лекарственных препаратов основано главным образом на взаимодействии с ферментами. Многие проблемы наследственной патологии человека тесно связаны с дефектами или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки, физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ, процессы возбуждения и торможения) определяются в большей степени работой ферментов. Все вышеперечисленное позволяет считать данную тему основой для изучения всех последующих тем.

3.1. Преаналитический этап ферментативных исследований.

Основным биологическим материалом для исследования активности ферментов является свежая негемолизированная сыворотка крови или плазма, иногда свежая капиллярная или венозная кровь.

Забор крови проводится с 7 до 9 ч утра, натощак;
Перед анализом обследуемый должен исключить прием алкоголя, курение, физические нагрузки, прием лекарств;
Сдавливание сосудов при наложении жгута должно быть минимальным и не превышать 30 с;
В качестве антикоагулянта используют гепарин и его соли;
Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме проводят в день взятия биоматериала, гепаринизированную кровь исследуют в течение 1 часа, свежую кровь – в течение 3 минут;
Следует помнить, что на активность ферментов влияет температура, наличие активаторов и ингибиторов, рН среды, поэтому все исследования проводят в сухих чистых пробирках, при 370С, строго соблюдая оптимальную рН исследуемого фермента;
Повторное оттаивание и замораживание сыворотки крови не допустимо.

3.2. Использование ферментов в медицине.

Использование ферментов в медицине возможно по трем направлениям:

1. Энзимопатология – изучает нарушения активности ферментов в развитии заболевания.

Энзимопатии – заболевания, характеризующиеся нарушением содержания того или иного фермента в организме. Они классифицируются:

Наследственные, связанные с полным нарушением биосинтеза какого-либо фермента;
Токсические, связанные с избирательным угнетением активности отдельных ферментов;
Алиментарные, вызванные дефицитом витаминов, белка, микроэлементов;

2. Энзимодиагностика – измерение активности или изоферментов в крови и моче для диагностики заболеваний, сопровождающихся разрушением клеток. Либо это применение ферментов для определения различных веществ в биологических жидкостях – ферментативный метод является наиболее специфичным и точным.

Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях:

Органоспецифичность;
Низкая активность в крови в норме;
Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа;
Высокая стабильность в крови;
Доступная методика определения активности фермента.

3. Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных средств.

Использование пищеварительных ферментов (фестал, мезим) при лечении нарушений пищеварения.
Фибринолизин применяют при лечении незаживающих ран, пролежней, для рассасывания тромбов.
Лидаза используется после операций для предотвращения образования грубых рубцов.
Трасилол, будучи ингибитором протеолитических ферментов, эффективен при лечении острых панкреатитов.

3.3. Практическая работа

«Обнаружение действия и специфичности ферментов».

Цели практической работы:

усвоить представления о диагностическом значение определения ферментов;
научиться обнаруживать действие и специфичность амилазы слюны.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение действия и специфичности амилазы слюны.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Фермент слюны амилаза при определенных условиях производит гидролиз крахмала до мальтозы.

амилаза амилаза мальтаза

(С6Н10О5)у-----------(С6Н10О5)х-------------уС12Н22О11-----------nС6Н12О6

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

Реактивы:

1% раствор крахмала.
2% раствор сахарозы.
1% раствор йода.
5% раствор сульфата меди.
10% раствор гидрооксида натрия.
Амилаза слюны.
Дистиллированная вода.

Оборудование:

Штатив с пробирками (7 шт).
Пипетки глазные.
Воронка.
Стаканчик.
Термостат.
Спиртовка.
Фильтровальная бумага.

Опыт № 1. Обнаружение действия ферментов.

Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);
В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контроль и опыт;
В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;
Перемешайте и поставьте в термостат при 370С на 15 мин;
Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;
В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);
Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Опыт № 2. Специфичность действия ферментов.

В две пробирки налейте по 10 капель раствора слюны, в первую добавьте 10 капель раствора крахмала, во вторую – 10 капель сахарозы;
Пробы перемешайте и поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем первую пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку, и проделайте две реакции: пробу Троммера и реакцию с йодом;
Со второй пробиркой проделайте реакцию Троммера;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Ответьте на вопросы:

Напишите реакцию, которую катализирует амилаза слюны.
Назовите субстраты амилазы.
Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?
Какой специфичностью обладает амилаза слюны?
Как можно измерить активность амилазы?
Дайте определения следующим понятиям: фермент, активный центр, аллостерический центр, простые ферменты, сложные ферменты, апофермент, кофермент, холофермент, обратимость действия, термолабильность, специфичность.

3.4. Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от рН среды».

Цели практической работы:

закрепить знания о свойствах ферментов, кинетике ферментативных реакций, классификации ферментов по сложности строения;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от рН среды.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от рН среды.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Для амилазы слюны оптимальное значение рН лежит в пределах слабощелочной среды, в кислой и сильно щелочной среде активность фермента снижается, и расщепление крахмала происходит не полностью, до стадии декстринов, которые с йодом дают красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.

Реактивы:

1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
фосфатно-цитратный буфер с рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0.
Амилаза слюны.

Оборудование:

Штатив с пробирками (5 шт).
Пипетки на 1 мл, глазные пипетки.
Термостат.

Ход работы:

В 5 пронумерованных пробирок налейте по 1 мл фосфатно-цитратного буфера со значением рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;
Во все пробирки добавьте по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора амилазы;
Затем во все пробирки добавьте по 3 капли раствора йода, тщательно перемешайте;
Все пробирки поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем пробирки охладите под холодной водой и сравнит окраску во всех 5 пробирках;
Сделайте вывод о зависимости активности амилазы от рН среды.

Ответьте на вопросы:

Приведите примеры простых ферментов.
Приведите примеры сложных ферментов.
Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
*Назовите оптимальную рН для следующих ферментов: пепсин, химозин, гастриксин, амилаза слюны, трипсин, липаза, химотрипсин.

3. 5. Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от температуры».

Цели практической работы:

закрепить знания о кинетике ферментативной реакции;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от температуры.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от температуры.
Сделайте выводы по работе, по полученным результатам построить график зависимости активности амилазы от температуры.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Все ферменты являются термолабильными веществами и проявляют свою максимальную активность при 370С. При снижении или повышении температуры активность ферментов падает, что приводит к образованию промежуточных продуктов или к полной остановке реакции. Так, нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, а декстрины (промежуточные продукты распада крахмала) в зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску. Таким образом, по окраске раствора йодом можно судить о степени гидролиза крахмала.

Реактивы:

1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
Раствор амилазы.
Дистиллированная вода.

Оборудование:

Штатив с пробирками (4 шт).
Пипетки на 1 и 2 мл, глазные пипетки.
Термостат.
Водяная баня.
Ледяная баня.
Спиртовка.

Ход работы:

В четыре пронумерованной пробирки налейте по 0,5 мл раствора амилазы;
Пробирку №1 поставьте в лед, №2 – оставьте при комнатной температуре, №3 – в термостат, №4 – в кипящую водяную баню;
Через 5 мин, когда содержимое пробирок примет нужную температуру, в пробирку №1 добавьте 2 мл крахмала, охлажденного до температуры тающего льда.
Во 2-ю,3-ю и 4-ю пробирки добавьте по 2 мл раствора крахмала комнатной температуры;
Во все пробирки добавьте по 2 капли йода;
Перемешайте содержимое и поместите пробирки в те же самые условия на 15 мин;
Затем пробирки достаньте, охладите, и оцените активность амилазы по интенсивности и цвету окраски;
Результаты занесите в таблицу:

№	Субстрат	Фермент	t	Реакция с йодом
1.
2.
3.
4.

Ответьте на вопросы:

Перечислите основные свойства ферментов.
Как влияет температура на активность ферментов?
К какому классу ферментов относится амилаза слюны?
Перечислите классы ферментов с примерами.

5*. Нарисуйте графики зависимости активности ферментов от температуры, рН, концентрации S и Р.

3.6. Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от влияния активаторов и ингибиторов».

Цели практической работы:

закрепить знания об активаторах и ингибиторах, видах ингибирования;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его активации или ингибированию.

Реактивы:

1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
1% раствор сульфата меди.
1% раствор хлорида натрия.
Амилаза слюны.
Дистиллированная вода.

Оборудование:

Штатив с пробирками (3).
Пипетки глазные.
Стаканчики.
Воронка.

Ход работы:

В 3 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель раствора амилазы;
Затем по одной капле добавьте в 1-ю – хлорид натрия, во 2-ю – сульфат меди, в 3-ю – воды (контроль).
Перемешайте, внесите в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставьте стоять на 3 мин при комнатной температуре.
Затем добавьте по 1 капле йода, перемешайте, наблюдайте за окраской растворов и определите, в какой пробирке действовал активатор или ингибитор.
Результаты оформите в виде таблицы:

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом в присутствии
			СuSO4	NaCI	H2O

Ответьте на вопросы:

Дайте определения и характеристику изоферментам на примере ЛДГ и КК.
Дайте определение следующим терминам: активаторы, ингибиторы, денатурация, ингибирование.
Перечислите основные виды ингибирования.
Объясните принцип конкурентного ингибирования.
*Ингибитор снижает активность фермента до 30% от исходного уровня. Повышение концентрации субстрата катализируемой реакции восстанавливает 80% активности фермента. К какому типу относится данный ингибитор?

3.7. Практическая работа

«Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови».

Цели практической работы:

усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;
изучить клинико-диагностическое значение определения амилазы в сыворотке крови и моче;
научиться определять активность панкреатической альфа-амилазы в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Альфа-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы:

Крахмал-субстрат.
Фосфатный буфер рН=7.
Раствор йода 0,01н.
Вода дистиллированная.
Сыворотка крови.

Оборудование:

Штатив с пробирками (2 шт).
Пипетки на 1 мл, 5 мл.
Дозатор на 0,01 мл и на 0,5 мл.
Термостат.
ФЭК.

Ход определения:

Проведите исследование активности амилазы в сыворотке крови согласно таблице.

Реактивы.	Опытная проба, мл.	Холостая проба, мл.
Рабочий реактив	0.5	0.5
Выдержать в термостате при 370С в течение 5 мин.
Сыворотка крови	0.01	-
Вода дистиллированная	-	0.01
Выдержать в термостате при 37С в течение 7,5 мин. Время инкубации строго отсчитывать по секундомеру от момента внесения образца и затем сразу добавить:
Раствор йода	0.5	0.5
Объем проб довести дистиллированной водой до 5 мл, перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и холостой пробы (А2) против дистиллированной воды, при 630-690 нм в кювете на 10 мм.

Расчет проводим по формуле:

Активность амилазы = (А2 – А1)* 44.4/А2, мг/с*л

Активность амилазы показывает количество крахмала в мг, гидролизованного 1л биологической жидкости за 1с при 37 С.

Норма активности амилазы:

Сыворотка крови – 3.3 –8.9 мг/с*л или 16-30 г/ч*л.

Моча - до 44 мг/с*л или 20 –160 г/ч*л.

Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы

Амилаза - фермент, осуществляющий расщеплении крахмала и гликогена. наиболее богаты им поджелудочная и слюнные железы. Содержание амилазы в сыворотке крови связано с приемом пищи: днем активность выше, чем ночью.

Активность амилазы в сыворотке крови повышается (гиперамилаземия) при:

Остром панкреатите (в 10-30 раз, приходя к норме на 6-7 сутки, если активность сохраняется увеличенной более 5 суток, это говорит о развитии хронического процесса);
Обострении хронического панкреатита;
Паротите (воспалении слюнных желез);
Почечной недостаточности;
Может быть вызвана приемом алкоголя, адреналина, наркотических веществ.

Снижение активности амилазы в сыворотке крови (гипоамилаземия) наблюдается при:

Заболеваниях печени (гепатитах, механической желтухе, циррозе);
Сахарном диабете;
Гипотереозе;

Повышение активности в моче (гиперамилазурия) наблюдается при:

Остром панкреатите (имеет большее диагностическое значение, чем определение в сыворотке, так как держится более 7 суток);
Паротите;

Снижение активности фермента в моче (гипоамилазурия) наблюдается при:

почечной недостаточности.

Ответьте на вопросы:

Назовите место локализации, оптимальное рН и биологическое значение амилазы.
Напишите реакцию, которую катализирует амилаза.
К какому классу ферментов относится амилаза?
*Назовите основные заболевания, характеризующиеся повышением активности амилазы. Объясните причину.
*Расскажите о причинах, видах, лабораторной диагностике и профилактике панкреатита.

3.8. Практическая работа

«Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови».

Цели практической работы:

изучить клинико-диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови;
научиться определять активность аминотрансфераз в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

В результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуются щавеливоуксусная и пировиноградные кислоты. При добавлении раствора 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается, и возникают гидразоны пировиноградной кислоты. В щелочной среде они дают окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоте.

Реактивы:

1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый – 2 ммоль/л.

2. 2,4 – динитрофенилгидразин – 1 ммоль/л.

3. Гидрооксид натрия - 0,4 н..

4. Субстрат АсАТ/АлАТ.

5. Сыворотка.

6.Физиологический раствор.

Оборудование:

1. Термостат.

2. ФЭК, кюветы на 1 см.

3. 2 пробирки.

4. Штатив для пробирок.

5. Пипетки на 1 и 5 мл.

6. Дозатор на 0.05 мл.

Ход определения:

Проведите исследование активности аминотрансфераз в сыворотке крови согласно таблице.

Реактивы.	Опытная проба, мл.	Контроль, мл.
Субстрат.	0.25	0.25
Физ. Раствор.	-	0.05
Прогреть 5 минут в термостате при 37оС.
Сыворотка.	0.05	-
Инкубировать в термостате на 30 минут при 37оС.
Динитрофенилгидразин.	0.25	0.25
Оставить стоять при комнатной температуре 20 минут.
Гидрооксид натрия.	2.5	2.5
Оставить стоять при комнатной температуре 5 минут

Оптическую плотность измеряем на ФЭКе при длине волны 500-530 нм (зеленый светофильтр), в кювете на 1 см.

Расчет проводим по калибровочному графику.

Норма активности аминотрансфераз в сыворотке крови:

АсАТ = 0.1 – 0.75 мкмоль/л*ч,

АлАТ = 0.1 – 0.68 мкмоль/л*ч.

Клинико-диагностическое значение

определения аминотрансфераз в крови.

Аминотрансферазы: аспартат- и аланинаминотрансферазы осуществляют весьма важную функцию – обратимый перенос аминогрупп с аминонокислот на кетокислоты. Содержатся во всех клетках человеческого организма (больше всего в ткани печени, мышцах сердца, скелетной мускулатуры, почках). Активность АсАТ преобладает в мышечной ткани, а АлАТ – в печени.

Наиболее часто активность аминотрансфераз исследуют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда. Для этого определяют показатель, который называется коэффициент де Ритиса:

КдР = АсАТ / АлАТ = 1,33.

Увеличение активности аминотрансфераз наблюдается при:

Инфаркте миокарда активность АсАТ в 95% случаев повышается (активность КК, ЛДГ при этом повышена). Возрастание происходит на 4-6 ч. с момента приступа. Оно четко выражено спустя 24-36 ч. (увеличивается в 4-5 раз выше нормы) и лишь на 3-7 сутки снижается до нормы. Отношение показателей активностей КК/АсАТ имеет высокую значимость при дифференциальной диагностике инфаркта миокарда(отношение около 5) и поражениях скелетных мышц (около 27). Коэффициент де Ритиса АсАТ/АлАТ более 1.
Остром вирусном гепатите (АлАТ и АсАТ более чем в 100 раз). Коэффициент де Ритиса менее 1,33.

Быстрое снижение активности аминотрансфераз одновременно с возрастанием гипербилирубинемии свидетельствует об обширных некротических изменениях в ткани печени. В благоприятных ситуациях гепатита активность данных ферментов снижается медленно в течение нескольких недель и даже месяцев.

Хроническом гепатите;
Циррозе печени (активность повышается в 5-8 раз);
Механической желтухе (АлАТ повышается в 50 раз долго остается повышенной, сопровождаясь возрастанием активности ЩФ, ГГТП и содержанием билирубина);
Токсическом поражении печени;
Легочной эмболии (активность КК при этом не повышена);
Поражениях мышц (мышечной дистрофии, дерматоитозит);

Снижение активности АсАТ и АлАТ наблюдаются при:

Снижении содержания в организме витамина В6.
Почечной недостаточности.

Ответьте на вопросы:

К какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?
Назовите место локализации АлАТ и АсАТ.
Что такое коэффициент де Ритиса, как его рассчитывают, что он характеризует.
Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность аминотрансфераз. Объясните причину.
*Напишите уравнение реакции, которую катализирует АлАТ.
*Назовите, какие еще ферменты изменяют свою активность при заболеваниях сердца; печени?

3.9. Практическая работа

«Определение активности кислой и щелочной фосфатаз

в сыворотке крови».

Цели практической работы:

закрепить знания об изоферментах и клинико-диагностическое значении определения фосфатаз в сыворотке крови;
научиться определять активность кислой щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Определение активности фосфатаз основано на способности ферментов, отщеплять неорганический фосфат от нитрофенил-фосфата в щелочной среде.

Реактивы.

Буфер, рН=10,4.
4-нитрофенилфосфат.
NaOH 0.4 ммоль/л
Сыворотка.

Оборудование.

ФЭК, кювета на 10 мм.
Термостат.
Пробирки – 2 шт.
Пипетки на 1 и 5 мл.
Дозатор 0,02 мл

Ход определения:

Провести исследование активности фосфатаз согласно таблице.

Реактив.	Опыт, мл.	Контроль, мл.
Рабочий реактив.	1,00	1,00
Сыворотка.	0,02	-
Перемешать, проинкубировать в течение 20 минут при 300С в термостате.
NaOH	5,00	5,00

Перемешать и измерить оптическую плотность опыта (Ео) против контроля в кюветах на 10 мм, при длине волны 405 нм.

Расчет результатов проводим по формуле:

ЩФ, = Ео * 812 (МЕ/л).

Норма активности фосфатаз в сыворотке крови 30 –90 МЕ/л.

Клинико-диагностическое значение определения активности фосфатаз.

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. Различают, кислую и щелочную фосфатазы.

ЩФ – ряд ферментов оптимум рН которых лежит в пределах 10. ЩФ представлена 11 изоферментами, встречается практически во всех органах и тканях, но наиболее богаты клетки костной ткани и печени.

Служит биохимическим маркером кальциево-фосфорного обмена костной ткани. Активность ЩФ в сыворотке крови детей в 2-3 раза выше активности взрослых (связано с усиленным ростом костей).

N составляет 0.5 – 1.3 ммоль/ч*л.

Увеличение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

механической желтухе;
циррозе печени, холецистите, холестазе;
рахите у детей;
остеомаляции;
болезни Педжета;
миеломной болезни.

Уменьшение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

гипотиреозе;
старческий остеопороз;
замедленном росте у детей;
гиповитаминозе С;
гипервитаминозе Д.

КФ – представлена тремя разновидностями изоферментов:

1. простатический изофермент (локалзован в предстательной железе);

печеночный изофермент;
эритроцитарный изофермент.

Наибольшее диагностическое значение имеет простатическая форма КФ.

N составляет 0.05-0.13 ммоль/ч*л.

Увеличение активности КФ в сыворотке крови наблюдается при:

простатите;
раке предстательной железы;
аденоме предстательной железы;
метастазах;
множественной миеломе.

Уменьшается активность сыворотке КФ при:

тромбоцитопениях.

Ответьте на вопросы:

К какому классу ферментов относятся фосфатазы?
Дайте определение понятию – изоферменты.
Назовите сколько изоферментов существует у кислой фосфатазы, чем они отличаются друг от друга.
*Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность кислой; щелочной фосфатаз. Почему?
*Какие еще ферменты изменяют свою активность при этих заболеваниях?

Раздел 4. Обмен углеводов в норме и при патологии.

Значение изучаемой темы:

Углеводы являются одним из основных источников энергии для организма, а также важным компонентом многих внутриклеточных и внеклеточных структур, из углеводов могут образовываться заменимые аминокислоты и жиры. Нарушения в обмене углеводов приводят к таким заболеваниям как гликогенозы, галактоземия, фруктозурия. Знание гормональной регуляции обмена углеводов в целом и уровня глюкозы в крови, в частности, необходимо для правильной диагностики таких заболеваний как сахарный диабет, панкреатит и других.

4.1. Методы исследования углеводного обмена.

Основным показателем углеводного обмена является глюкоза, ее исследуют многими методами, основными являются:

Редуктометрические методы: основаны на восстановитльных свойствах глюкозы, определяют глюкозу в моче с реактивом Гайнеса-Акимова (этот метод почти не используется).
Колориметрические методы: основаны способности глюкозы образовывать окрашенные соединения. К ним относится ортотолуидиновый метод, унифицирован в 1978 году (почти не используется).
Ферментативные методы: определение глюкозы по реакциям со специфическими ферментами. В основном используют глюкозооксидный и гексокиназный методы. Гексокиназный метод является наиболее точным для определения уровня глюкозы.
Использование диагностических тест-полосок для полуколичественного определения уровня глюкозы в крови и моче.
Использование автоматических и полуавтоматических анализаторов, например «Эксан», карманные глюкометры.
При сахарном диабете проводят специальные исследования, например ГТТ, кортизон (преднизалон) глюкозотолорантный тест КПТГ, инсулиновый тест и др.

4.2. Преаналитический этап исследований обмена углеводов.

Основным показателем обмена углеводов в организме служит глюкоза. Её исследование проводят в цельной крови (капиллярной и венозной), сыворотке, плазме, моче. При заборе, хранении и транспортировке биологического материала нужно соблюдать ряд общих требований.

Подготовка обследуемых:

Забор крови делают утром с 8 до 10 часов утра. В экстренных случаях взятие крови осуществляется в любое время дня.
Кровь берут натощак, после 8-12-часового голодания.
Воздержание от приема алкогольных напитков не менее 24 часов.
Исключается физическое напряжение и эмоциональное возбуждение, для чего дают обследуемому отдохнуть 15 минут.

Получение и хранение биологического материала:

Капиллярную кровь исследуют сразу же после забора материала.
Для получения цельной крови или плазмы венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку с антикоагулянтом (соли ЭДТА, гепарин, гепаринат чистую, сухую пробирку с антикоагулянтом лития, натрия или аммония), стабилизатором или ингибиторолм гликолиза. В качестве ингибиторов гликолиза используют фторид натрия или калия. Соотношение кровь : антикоагулянт : стабилизатор = 1 мл : 2 мг: 2,5 мг. Центрифугирование проводят в обычном режиме.
Для получения сыворотки крови венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку со стабилизатором гликолиза. Центрифугирование проводят в обычном режиме.
Для исследования мочи используют утреннюю порцию. В экстренных случаях можно исследовать любую порцию мочи. Исследование проводят не позднее, чем через 2 часа после взятия пробы. Для сбора мочи используют контейнеры из темного стекла, в которые предварительно добавляют ледяную уксусную кислоту, бензоат натрия или фторид натрия ( ингибиторы гликолиза).

Условия хранения биологического материала:

Биологический материал хранят в хорошо закрытых контейнерах.
Капилярную кровь хранят 1 час. Исследования проводят в течение 10 минут от забора материала (после 10 минут отмечается снижение уровня глюкозы).
Для хранения цельной крови в ней удаляют белки. В таком виде глюкоза стабильна в течение 8 часов при комнатной температуре и 3 дня в холодильнике при 4-6 С.
Плазму и сыворотку отделяют от форменных элементов не позднее 30 минут после забора материала. Плазму и сыворотку можно хранить 12 часов в холодильнике при температуре 4-8 С.. При использовании ингибиторов гликолиза хранить можно: 1 день при комнатной температуре, 7 дней при 4-8 С, 1 месяц при –20 С.
Глюкоза в моче стабильна при комнатной температуре и 4-8 С в течение 2 часов, при –20 С в течение 2 дней.

Примечания:

Концентрация глюкозы в венозной крови на 10 % меньше, чем в капиллярной. Концентрация глюкозы в сыворотке и плазме на 10-13% выше, чем в цельной крови.
Цитрат натрия мешает определению глюкозы.
Повышение глюкозы в крови вызывают следующие факторы: курение, голодание, стресс, прием пищи, кофе, гипертермия, диета с низким содержанием жиров, ожирение, беременность, физические нагрузки, некоторые лекарственные препараты (кофеин, эстрогены, пероральные контрацептивы, диуретики).
Понижение уровня глюкозы в крови вызывает прием алкоголя в больших дозах, длительное пребывание в положении лежа, тепловой стресс, лихорадка, очень тяжелые физические упражнения, сезонное снижение весной, некоторые лекарственные препараты (анаболические стероиды, ацетилсалициловая кислота, антигистаминные препараты).

4.3. Практическая работа

«Определение глюкозы в сыворотке крови

глюкозооксидазным методом».

Цели практической работы:

закрепить знания о превращениях глюкозы в организме;
изучить клинико-диагностическое значение глюкозы;
научиться исследовать уровень глюкозы в крови ферментативным методом.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Определение глюкозы основано на реакции, катализируемой глюкозооксидазой:

Глюкоза + O2 глюкозооксидаза глюколактон + Н2О2

Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта. Увеличение оптической плотности раствора пропорционально концентрации глюкозы в образце.

Реактивы:

1. Фосфатный буфер рН=7.

2. Глюкозооксидаза.

3. Пероксидаза.

4. Калибровочный раствор глюкозы

10 ммоль/л.

5.Сыворотка крови.

Оборудование:

1. Пробирки – 3 шт.

2. Фотоколориметр.

3. Термостат.

4. Пипетки на 5 мл.

Дозатор на 0.05 мл.

Ход определения:

Проведите исследование количества глюкозы в сыворотке крови согласно таблице.

Реактивы.	Контроль, мл.	Стандарт, мл.	Опыт, мл.
Сыворотка.	-	-	0,05
Стандарт.	-	0,05
Рабочий реактив.	2,50	2,50	2,50

Реакционную смесь перемешайте и инкубируйте при 37С не менее 15 минут.
Через 5 минут после начала инкубации пробирки интенсивно встряхните.
После инкубации измерьте оптическую плотность опытной и стандартной проб относительно контроля в кювете на 5 мм при 500 нм.

Расчет концентрации глюкозы производят по формуле:

Сглюкоза = Еоп/Ест * 10 (ммоль/л)

Норма.

Норма глюкозы в цельной крови: 3,3 – 5,5 ммоль/л.

Норма глюкозы в сыворотке крови: 3,7 – 6,1 ммоль/л.

Сразу после рождения уровень глюкозы в крови детей соответствует её содержанию в плазме крови матери. Однако уже в первые часы жизни концентрация глюкозы в крови падает, достигая на вторые сутки 2,5 ммоль/л; к 5-6 суткам концентрация глюкозы крови увеличивается. Постепенное её возрастание происходит и в дальнейшем, но лишь к 15 годам концентрация глюкозы достигает значений, характерных для взрослого человека.

Клинико-диагностическое значение обнаружения глюкозы в крови.

Гипергликемия - увеличение уровня глюкозы в крови, может быть:

Инсулярная – причиной может быть поражение паренхимы поджелудочной железы или гипофункция бетта-клеток островков Лангерганса, при которых снижается уровень выработки инсулина.

Экстраинсулярная – не связана с выработкой инсулина, подразделяется на:

Физиологическую – причина прием углеводной пищи (алиментарная) или различные эмоциональные состояния, при которых возрастает уровень адреналина (нейрогенная).
Патологическая – причинами могут быть заболевания желез внутренней секреции (опухоли передней доли гипофиза, надпочечников, тиреотоксикоз и т.д.), токсикозы различного происхождения, травмы, опухоли мозга, снижение обмена глюкозы при наркозе, воспалениях, септических состояниях, вследствие нарушения функций ферментативных систем.

Гипергликемия встречается при следующих заболеваниях:

Сахарный диабет, поражениях ЦНС, печени, желез внутренней секреции, стрессовых ситуациях, обильном приеме углеводной пищи, приеме некоторых лекарственных средств (кофеин, стрихнин, адреналин, эфир, опий, морфий, хлороформ и т.д.).

Гипогликемия - уменьшение уровня глюкозы в крови, встречается при:

Снижении гормональной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза.
Увеличение функций инсулярного аппарата поджелудочной железы.
Некоторые формы поражения почек (нефриты, нефрозы).
Некоторые формы поражения печени (гепатиты, жировая инфильтрация печени).
Гликогенозы.
Некоторые формы поражения тонкого кишечника, удаление значительной части желудка.

Ответьте на вопросы:

Какие методы определения глюкозы в крови вы знаете?
Почему основным показателем обмена углеводов является глюкоза?
Для диагностики каких патологий назначается анализ глюкозы в крови?
Каково нормальное содержание глюкозы в артериальной и венозной крови, сыворотке и моче?
*Какой из известных методов определения глюкозы является наиболее специфичным? Почему вы так считаете?
*Отличается ли содержание глюкозы в крови у детей и взрослых? Почему?
*Спортсмен пробежал 100-метровую дистанцию. Измениться ли содержание молочной кислоты у него в крови? Почему?

4.4. Практическая работа

«Определение концентрации глюкозы

на полуавтоматическом анализаторе "Эксан".

Цели практической работы:

научиться исследовать уровень глюкозы в крови на полуавтоматическом анализаторе «Эксан».

Задания для самостоятельной работы:

1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

2.Оборудуйте рабочее место для практической работы.

Выполните практическую работу.

Сделайте необходимые расчеты.

Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.

Сделайте вывод по работе и рисунки.

Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип работы.

Действие анализатора основано на электрохимическом амперометрическом определении продуктов ферментативной реакции окисления глюкозы, катализируемой ферментом глюкозооксидазой, с последующим преобразованием в постоянное напряжение и фиксацией аналого-цифровым преобразователем.

Реактивы:

Калибровочный раствор глюкозы 10 ммоль/л.
Сыворотка крови.
Буферный раствор для «Эксана».

Оборудование:

Дозатор на 0,05 мл.
Анализатор «Эксан».
Мембраны на «Эксан».

Калибровка прибора.

Включите прибор в сеть.
Включите тумблер прибора.
Прогрейте 15 мин.
Нажмите на клавишу "Промывка".
Промойте прибор 2-3 раза.
Нажмите клавишу "Сброс" на табло должны высветиться цифры 0 +/- 0,05. Если показания больше 0,05 - ручкой на задней панели прибора установите 0.
Для калибровки анализатора используйте калибровочный раствор глюкозы концентрации 10 ммоль/л.
Наберите дозатором пробу 0,05 мл и введите ее в датчик (на глубину 5-8 мм.).
При установившемся показании индикаторного табло калибровочными ручками «Грубо», «Плавно» установите показания индикаторов 10,0.
Нажмите клавишу "Промывка".
После промывки, нажмите клавишу "Сброс". При этом на табло должно высвечиваться 0 +/- 0,05, а перед цифрами должен погаснуть хотя бы верхний сегмент. Если погаснет 2 верхних сегмента - промыто хорошо. Если горят все 3 сегмента - мембрана старая, подлежит замене. Если показания на табло быстро увеличиваются, или не погас верхний сегмент - промойте еще раз.
Калибровку (пункты 4-11) проведите несколько раз до получения стабильного результата в пределах 10,0 +/- 0,1.
Калибровку анализатора проводят каждые 4 часа, после 10 определений исследуемых проб или при изменении температуры окружающей среды более чем на 5 градусов Цельсия.

Определение уровня глюкозы в крови (сыворотке, плазме).

Перед введением пробы в датчик промойте анализатор (нажмите кнопку «Промывка»).
После остановки насоса нажмите кнопку "СБРОС". Индикаторы должны показывать в пределах 0,00... 0,05. В противном случае проведите установку нуля и калибровку прибора.
Введите в анализатор пипеточным дозатором (сменив наконечник!) кровь или сыворотку. При установившемся значении показаний индикаторов (около 10 сек.) на табло высветится содержание глюкозы в ммоль /л.
Нажмите кнопку "Промывка", а после остановки насоса нажмите кнопку "Сброс". Анализатор готов для введения новой пробы.
Для набора новой пробы дозатором замените его насадку новой.
Через 10 определений - проверьте прибор по стандартному раствору глюкозы (провести калибровку). По мере старения мембраны может не устанавливаться 10 ммоль/л по калибровочному раствору глюкозы. В этом случае можно увеличить чувствительность прибора, переключив тумблер на задней панели прибора max – min.

Ответьте на вопросы:

В каких случаях необходимо исследование концентрации глюкозы в крови и моче?
Чем опасна для организма человека длительная гиперглигемия.
Какие гормоны и как влияют на процессы гликолиза, глюкогеогенеза и гликогенеза?
Чем отличаются процессы глюконеогенеза, гликолиза, гликогенеза?
*Какие ферменты участвуют в процессах гликогенеза, гликолиза, глюконеогенеза? Напишите схематичные уравнения реакций, укажите эти ферменты.
*Напишите уравнения реакции образования глюкозо-6-фосфата и ПВК из глюкозы.

4.5. Практическая работа

«Определение количества глюкозы и кетоновых тел в моче

с помощью индикаторных полосок».

Цели практической работы:

закрепить знания о превращениях глюкозы в организме;
научиться исследовать уровень глюкозы и кетоновых тел в моче с помощью индикаторной бумаги.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип.

При окислении глюкозы с помощью фермента глюкооксидазы образуется перекись водорода. Она разлагается другим ферментом - пероксидазой и окисляет краситель орто-толуидин, который изменяет свой цвет, что говорит о наличии глюкозы в моче. Этот метод определения глюкозы в моче - полу качественный - дает возможность определить сахар ориентировочно.

Реактивы:

Моча.
Диагностические тест-полоски.

Оборудование:

1.Пробирка.

Ход определения:

Индикаторную бумагу смочите исследуемой мочой и сравните со стандартной цветной шкалой.
Индикаторная бумага пропитана реактивной смесью, содержащей ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу и много других веществ, среди них 0-толуидин – краситель.

Оценка результатов.

При увлажнении мочой светло-желтой полосы:

1. Если цвет полосы не изменяется - глюкоза отсутствует.

2. Если цвет становится от светло-зеленого - до темно-зеленого - глюкозы содержится 0,1-2%.

3.Интенсивность не меняется - глюкозы больше 2%.

Этот метод прост, быстро выполним, и может быть использован при массовых исследованиях. Комплект содержит 100 полосок индикаторной бумаги, цветную шкалу. Индикаторная бумага имеет поперечную полосу светло-желтого цвета, пропитанную раствором фермента.

4.6. Практическая работа

«Определение пировиноградной кислоты в

биологических жидкостях скрининг - тестом».

Цели практической работы:

закрепить знания о превращениях глюкозы в организме;
научиться определять наличие ПВК в биологических жидкостях.

Задания для самостоятельной работы:

1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Трихлористое железо в присутствии соляной кислоты дает с

кетокислотами соединение, окрашенное в желто-зеленый цвет.

Реактивы:

1. 10% раствор FeCI3.

2. 10% раствор HCI.

3.Моча.

Оборудование:

1. Пробирка.

2. Дозатор на 0.5 мл.

3. Пипетка на 1мл.

Ход определения:

В пробирку поместите 0.5 мл мочи.
Добавьте 0.25 мл раствора трихлористого железа и 2 капли соляной кислоты.
Перемешайте и наблюдайте за развитием окраски.
При положительной реакции окраска будет желто-зеленой.

Норма:

Содержание пировиноградной кислоты (ПВК) в крови здорового человека

колеблется 0.05-0.14 ммоль/л, а в моче от 10 до 25 мг в суточном диурезе.

Клинико-диагностическое значение.

Повышение уровня ПВК отмечается при:

Мышечной работе и В1-витаминной зависимости;
Больших физических нагрузках содержание ПВК может повышаться до

мг/100 мл;

Паренхиматозных заболеваниях печени;
Сахарном диабете;
Токсикозах.

В спинномозговой жидкости концентрация ПВК значительно повышается

после травмы черепа, при воспалительных процессах - менингите,

абсцессе мозга.

Повышенное содержание ПВК токсично для организма.

Ответьте на вопросы:

Напишите схематично процесс гликолиза. Какие ферменты участвуют в этом процессе? В каком отделе клетки он протекает?
Назовите причины глюкозурии.
Дайте определение почечного порога глюкозы. При каких заболеваниях он изменяется?
*Напишите уравнение реакции превращения ПВК в лактат. Какой фермент ускоряет эту реакцию?
*Назовите пути использования организмом ПВК и ацетил-КоА.

4.7. Практическая работа

«Определение сиаловых кислот в сыворотке крови».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении и функциях гетерополисахаридов;
научиться определять количество сиаловых кислот в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип.

Метод основан на реакции сиаловых кислот с индикатором. В результате реакции при нагревании образуется окрашенное соединение интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации сиаловых кислот.

Реактивы:

Реагент 1.
Основной раствор.
Дистиллированная вода.
Сыворотка или плазма крови.

Оборудование:

Водяная баня.
Центрифуга.
ФЭК.
Кюветы на 1 см.
Штатив с пробирками.
Пипетки на 1, 2, 5 мл.
Фильтровальная бумага.

Ход определения:

Проведите исследование сиаловых кислот в сыворотке крови согласно таблицы.

Реактивы.	Опытная проба, мл.
Сыворотка.	0,60
Реагент 1.	3,00
Пробу нагреть в кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего охладить в холодной воде и центрифугировать 5 минут при 3000 об/мин. Далее в чистуб пробирку помещаем:
Надосадочная жидкость.	2,00
Основной раствор.	0,40
Пробу вновь нагреть на кипящей водяной бане в течение 15 минут, охладить в холодной воде и добавить:
Дистиллированная вода.	2,00
Пробу перемешать и фотометрировать против дистиллированной воды, при длине волны 500-560 нм, в кювете 1 см.

Расчет результатов проводим по формуле:

С = Е * 1000 / Ео

Где:

С – содержание сиаловых кислот в ммоль/л.

Е – экстинция опытной пробы.

Ео – средний молярный коэффициент экстинции, Ео = 135.

Норма сиаловых кислот в сыворотке и плазме крови 1,8 – 2,7 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения сиаловых кислот.

Сиаловые кислоты представляют собой N-ацетилпроизводные нейраминовой кислоты. Они находятся во всех тканях и биологических жидкостях, являются важной составной частью углеводно-белковых комплексов, в которых занимают краевое положение. После отщепления от комплексов свободные сиаловые кислоты инактивируют многие бактериальные и вирусные болезнетворные агенты, поэтому увеличесние содержания в крови сиаловых кислот может быть проявлением компенсаторной, защитной воспалительной реакции. В моче сиаловые кислоты обнаруживаются только при протеинурии.

Увеличение концентрации сиаловых кислот в крови наблюдается при:

Ревматизме.
Туберкулезе (особенно активном).
Инфаркте миокарда.
Раке.
Остеомиелите.
Лейкимии.
Других заболеваниях преимущественно воспалительного характера, а также сопровождающихся распадом соединительной ткани.

Снижение концентрации сиаловых кислот наблюдается при:

Гемахроматозе.
Дегенеративных процессах в ЦНС.

Ответьте на вопросы:

Какие вещества относятся к гетерополисахаридам?
Какие функции выполняют в организме гетерополисахариды?
Почему при воспалительных процессах в крови увеличивается содержиние сиаловых кислот?
Почему при заболеваниях сопровождающихся распадом соединительной ткани в крови увеличивается содержиние сиаловых кислот?
*Может ли изменяться количество сиаловых кислот при циррозе печени, инфаркте миокарда, почечной недостаточности? Почему?

4.8. Практическая работа

«Определения гликозилированного гемоглобина

в венозной и капиллярной крови”

Цели практической работы:

закрепить знания о сахарном диабете и его диагностике;
научиться определять количество гликозилированного гемоглобина в крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Метод основан на аффинной хроматографии гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина в гемолизате крови. Используемый в микроколонках набора сорбент с привитой 3-аминофенилборной кислотой обеспечивает на первой стадии специфическое связывание гликозилированного гемоглобина и его отделение от негликозилированной фракции. На второй стадии происходит полная элюция гликозилированной фракции за счет вытеснения с сорбента сорбитолом.

Измерение оптических плотностей обеих фракций при длине волны 414 им позволяет рассчитать относительное содержание гликозилированного гемоглобина в анализируемой пробе.

Реактивы:

Рабочий буферный раствор 1.
Рабочий буферный раствор 2.
Регенерирующий раствор (уксусная кислота, 10%).
Вода дистиллированная;
Контрольный образец гликозилированного гемоглобина.
Цельная кровь.

Оборудование:

Пластиковые микроколонки.
Фотоэлектроколориметр.
Штатив для пробирок.
Пипетки на 0,02 и 5,0 мл.
Пробирки химические на 5 мл.
Емкость для воды (кастрюля, поддон) на 2-5 л;
Бумага фильтровальная;
Перчатки резиновые хирургические.

Ход определения:

1. Подготовительные операции.

Поместить колбу с рабочим буферным раствором 1 в емкости с воды (температура воды 25 С) и выдержать в течение 15 мин при периодическом перемешивании.
Промаркировать по 2 стеклянных пробирки для каждого анализируемого образца крови (А и Б).
Вставить микроколонку в пробирку А и выдержать в течение 15-20 минут при комнатной температуре.

2. Проведение анализа образцов крови.

В микроколонку внести 5,0 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
После полного стекания жидкости в микроколонку влить 0,1 мл цельной крови.
Выдержать 1 -2 мин.
Затем в микроколонку внести 0,1 мл рабочего буферного раствора 1 и выдержать 5-10 мин.
Затем внести в микроколонку 5,0 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
Микроколонку перенести пробирку Б и внести 4,0 мл рабочего буферного раствора 2.
Дать жидкости стечь.
Вынуть микроколонки из пробирок.
Растворы в пробирках А (фракция А) и Б (фракция Б) перемешать.
Измерить оптическую плотность растворов из пробирок А и Б при длине волны 414 нм в кювете на 1 см, используя в качестве контроля дистиллированную воду.

Расчет содержания гликозилированного гемоглобина в процентах рассчитать по формуле:

% GHb = (ЕБ*100) / (ЕБ + 2,55*ЕА)

где:

ЕБ - оптическая плотность фракции Б;

ЕА - оптическая плотность фракции А;

2,55 - пересчетный коэффициент оптической плотности фракции А;

100 - пересчетный коэффициент для вычисления процентного содержания.

Норма гликизированного гемоглобина в крови здоровых людей 4,4 - 8 %.

Клинико-диагностическое значение определение гликозилированного гемоглобина.

Определение гликозилированного гемоглобина проводят для ранней диагностики сахарного диабета, особенно при массовых обследованиях населения на скрытые формы диабета, а также для ретроспективной оценки степени декомпенсации данного заболевания за последние три месяца для улучшения контроля за эффективностью лечения сахарного диабета.

Ответьте на вопросы:

Перечислите основные лабораторные исследования при сахарном диабете.
Чем опасна длительная гипергликемия?
Почему при длительной гипергликемии количество гликозилированного гемоглобина возрастает?
Чем опасно для организма человека увеличесние количества гликозилированного гемоглобина?
На клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия:

а) с инсулином; б) с глюкагоном; в) адреналином; б) йодтиронинами?

*Напишите схематично образование гликированных белков в крови.
*Каково влияние инсулина и адреналина на ферменты: а) гликолиза? б) биосинтеза и распада гликогена? в) глюконеогенеза? г) ЦТК?

4.9. Практическая работа

«Глюкозотолерантный тест».

Цели практической работы:

закрепить знания о причинах, осложнениях и диагностике сахарного диабета;
научиться строить гликемическую кривую и определять её тип при ГТТ;
научиться решать ситуационные задачи.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения ГТТ.
Зарисуйте схематично гликемические кривые в норме, при латентном и явном сахарном диабете.
Решите предложенные преподавателем задачи.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип.

В ответ на поступление в организм углеводов, вырабатывается инсулин, который ограничивает повышение уровня глюкозы в крови. Если степень гипергликемии превосходит обычную, то говорят о снижении толерантности организма к глюкозе.

Методика проведения ГТТ с однократной нагрузкой.

Натощак берут кровь из пальца и определяют в ней содержание глюкозы унифицированным методом.
Затем дают выпить раствор 75 грамм глюкозы на 200 мл воды (1,75 г глюкозы на 1 кг веса), подкисленный лимонной кислотой.
Через 30, 60, 120, 180 минут после приема сахара определяют уровень глюкозы в крови.
Результаты вносят в таблицу и на их основании строят гликемические кривые, откладывая на оси абсцисс время забора крови, а на оси ординат – найденное содержание сахара в крови в ммоль/л.
При анализе гликемических кривых обращают внимание на следующие параметры:

Начальное содержание глюкозы в крови.
Быстроту и высоту подъема гликемической кривой.
Продолжительность гипергликемии и характер её снижения.

Методика проведения ГТТ с двойной нагрузкой.

ГТТ с двойной нагрузкой проводится подобно ГТТ с однократной нагрузкой с тем лишь отличием, что обследуемый получает 2 порции глюкозы с интервалом в 1 час.
При оценке результатов учитывают, что в норме второй пик гипергликемии должен быть меньше первого или отсутствовать. Если же инсулина недостаточно на второй прием глюкозы, то уровень гликемии будет выше –что указывает на сахарный диабет.

Методика проведения преднизалоновой пробы.

Учитывая, что глюкокортикоиды повышают содержание глюкозы в крови, предварительный прием преднизалона, способствует выявлению скрытых форм сахарного диабета.
Суть преднизалоновой пробы в том, что обследуемому за 12 и за 2 часа до сахарной нагрузки дают по 10 мг преднизалона. При этом в норме величина гликемии оказывается выше, и патология выявляется чаще.
Остальное обследование и оценка результата проводиться подобно ГТТ с однократной нагрузкой.

Факторы, влияющие на результаты ГТТ:

Характер питания.
Характер труда.
Курение.
Беременность.
Гормональные нарушения.

В связи с этим были разработаны следующие рекомендации по проведению преаналитического этапа ГТТ:

Обследуемый на протяжении трех дней не должен менять привычного режима питания и работы.
За 3 дня отменяются инъекции глюкозы, кофеина, адреналина.
Последний прием пищи должен быть не позднее, чем в 20 часов вечера накануне обследования.
Перед проведением теста необходимо 30 минут спокойно посидеть.
Во время пробы нельзя курить, нервничать, заниматься физической работой и принимать лекарственные препараты.

Анализ гликемических кривых.

Кривая здорового человека отличается быстрым подъемом, максимальный подъем отмечается через 30 минут после приема глюкозы. Количество глюкозы в крови может при этом удвоится, но не повышается более 10 ммоль/л.

При сахарной болезни уровень сахара в крови возрастает дольше и достигает максимума через 30-60 минут или еще позднее, причем достигает очень высоких цифр – 14 ммоль/ л глюкозы крови и более.

Понижение гликемической кривой (уменьшение глюкозы в крови) у здорового человека наступает быстро и через 1,5-2,5 часа возвращается к исходной величине, а иногда оказывается ниже её.

При диабете повышение глюкозы в крови держится 5-7 часов и возвращается к исходной величине очень медленно. При сахарном диабете происходит снижение толерантности к глюкозе.

	Глюкоза натощак	Глюкоза через 1 час	Глюкоза через 2 часа	Глюкозурия
Норма	Менее 6,7	Менее 10	Менее 6,7	Нет
Сомнительный результат	Менее 6,7	Менее 11	Менее 8,3	Нет
Латентный диабет	Менее 7,2	Более 11	Более 8,3	Часто отсутствует
Явный диабет	Более 7,2	Более 11	Более 8,3	Почти всегда есть

Диагноз сахарный диабет ставят в тех случаях, когда гликемия натощак белее 7,0 ммоль/л и через 2 часа после нагрузки более 11 ммоль/л.

Ответьте на вопросы:

На каком принципе основано проведение ГТТ.
Почему у здорового человека при проведении ГТТ с двойной нагрузкой второго пика гликемии чаще всего не бывает.
Постройте в тетради гликемические кривые характерные для нормы, сомнительного результата, латентного диабета и сахарного диабета.
Дайте определение понятиям: сахарный диабет, гликемические кривые, почечный порог для глюкозы, латентный диабет, нарушение толерантности к глюкозе.
*Объясните, почему характер питания, труда и эмоциональное состояние могут влиять на результаты ГТТ.
Расскажите о преаналитическом этапе исследований обмена углеводов.

Раздел 5. Обмен белков в норме и при патологии.

Значение изучаемой темы:

В количественном отношении белки занимают первое место среди всех содержащихся в живой клетке макромолекул. Велико также их многообразие, в одной клетке можно обнаружить сотни различных видов белков. Выполняя ряд уникальных функций, белки определяют не только микро- и макроструктуру отдельных субклеточных образований, специфику клеток, органов и целого организма, но и, в значительной степени, динамическое состояние между организмом и окружающей средой.

Белковый обмен строго специфичен, обеспечивая непрерывность воспроизводства и обновления белковых тел в организме. Кроме этого белки выполняют каталитическую и гормональную функции, благодаря чему координирует, регулирует и интегрирует многообразие химических превращений в организме.

Состояние белкового обмена определяется множеством факторов, как экзогенных (окружающая среда, характер питания и др.), так и эндогенных (физиологическое состояние организма). Знание закономерностей изменений обмена белков необходимо для правильной диагностики, мониторинга, лечения и профилактики заболеваний.

4.1. Методы исследования белкового обмена.

Используя знания о свойствах белков и пептидов можно применять различные методы определения белков и пептидов в биологических жидкостях. В практике используют следующие методы определения:

Электрофоретический – основан на разделении белков в постоянном электрическом поле в зависимости от величины белковой молекулы.
Ультрацентрифугирование – основано на различной скорости седиментации отдельных белков в зависимости от их молекулярной массы.
Хроматографические:

Ионнообменная хроматография основана на различной способности отдельных белков к обмену с ионами ионнообменных смол,
Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация) – на сефадексах – белки разделяются в зависимости от величины молекулы,
Аффинная хроматография – белки делятся на индивидуальные в зависимости от сродства к аффинату (наполнителю колонок).

Высаливание – основано на удалении водной оболочки различными концентрациями солей щелочных и щелочно-земельных металлов и иона аммония. Это старый метод разделения белков.
Аминокислотный состав белков и пептидов после гидролиза определяют в аминокислотном анализаторе.
Определение количества белка по белковому азоту – пробу сжигают в присутствии серной кислоты и перекиси водорода (окислитель), при этом происходит минерализация белка в виде сульфата аммония, количество которого потом определяют реактивом Несслера.
Использование цветных реакций – например биуретовая на общий белок, ксантопротеиновая на циклические аминокислоты и т.д. интенсивность окраски измеряют колориметрически.
Иммунологические методы – используют для количественного определения индивидуальных белков. При взаимодействии со специфической антисывороткой образуется мутный раствор, интенсивность помутнения измеряют колориметрически.

Преаналитический этап исследования обмена белков.

Для характеристики обмена белков можно определять различные показатели (общий белок, белковые фракции, мочевину, билирубин и т.д.) в цельной крови (капиллярной и венозной), сыворотке, плазме, моче, спиномозговой жидкости. При заборе, хранении и транспортировке биологического материала нужно соблюдать ряд общих требований.

Подготовка обследуемых:

Забор крови делают утром с 8 до 10 часов утра. В экстренных случаях взятие крови осуществляется в любое время дня.
Кровь берут натощак, после 8-12-часового голодания.
Воздержание от приема алкогольных напитков не менее 24 часов.
Исключается физическое напряжение.

Получение и хранение биологического материала:

Для исследований используют чистую сухую посуду без следов моющих средств.
Желтушные, гемолизированные, хилезные сыворотка или плазма не пригодны для исследования.
Для получения плазмы венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку с антикоагулянтом. Соли ЭДТА, гепарин, гепаринат лития, оксалат натрия, цитраты снижают результаты. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 5 часов от забора материала.
Для получения сыворотки крови венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 5 часов от забора материала.
Для исследования мочи используют утреннюю порцию. В экстренных случаях можно исследовать любую порцию мочи. Исследование проводят не позднее, чем через 2 часа после взятия пробы.

Условия хранения биологического материала:

Биологический материал хранят в хорошо закрытых контейнерах.
Цельная кровь не пригодна для хранения, даже в присутствии консервантов.
Плазму и сыворотку можно хранить 1 день при комнатной температуре, 7 дней при 4-8С, от 3 до 6 месяцев при –20 С.
В закрытых сосудах белок стабилен в моче 2 дня при комнатной температуре, до 17 дней в холодильнике (4-8 С).

Примечания:

уровень общего белка может зависеть от возраста (у детей и пожилых ниже), пола (у мужчин выше), характера питания.
Повышение белков в крови вызывают следующие факторы: длительное пребывание в вертикальном положении, стресс, прием алкоголя, некоторые лекарственные препараты (цефотаксим, фуросемид, фенобарбитал, преднизалон, прогестерон).
Понижение уровня белков в крови вызывают: травма, курение, беременность, голодание, перерыв в приеме алкоголя, нарушение питания, ожирение, некоторые лекарственные препараты (декстран, ибупрофен, пероральные контрацептивы).

4.3. Практическая работа

«Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции».

Цели практической работы:

закрепить знания о строении, свойствах и функциях белков в организме;
научиться исследовать содержание общего белка в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип метода.

Метод основан на образовании окрашенных комплексных соединений меди при взаимодействии пептидных группировок молекул белков с биуретовым реактивом.

Опыт № 1. Построение калибровочного графика для определения общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции.

Реактивы.

Раствор альбумина плацентарного 10 %.
Раствор натрия хлористого 0.9 %.
Биуретовый реактив

Оборудование.

ФЭК с кюветой на 1 см

Пробирки 5 шт.

Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл

Ход работы:

Приготовить контроль - к 50 мл биуретового реактива прибавляют 0.1 мл 0.9 % раствора хлористого натрия, смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут (не позднее чем через 1 час) измеряют оптическую плотность.
Из калибровочного раствора белка готовят калибровочные растворы, как указано в таблице.

№	Калибровочный раствор белка, мл	0.9% раствор хлористого натрия, мл	Концентрация белка, г/л
1	0.4	0.6	40
2	0.6	0.4	60
3	0.8	0.2	80
4	1.0	-	100

Из каждого разведения берут 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл биуретового реактива.
Через 30-60 минут измеряют на ФЭКе оптическую плотность всех проб против контроля в кювете 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр). По полученным данным строят калибровочный график.

Опыт № 2. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.

Реактивы.

1. Раствор альбумина плацентарного 80 г/л.

2. Раствор натрия хлористого 0.9 %.

3. Биуретовый реактив.

Сыворотка или плазма крови.

Оборудование.

1. ФЭК с кюветой на 1 см

2. Пробирки 5 шт.

3. Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл.

Ход определения:

Проведите определение общего белка в сыворотке крови в соответствии с таблицей.

Реактивы.	Опытная проба, мл.	Калибровочная проба, мл.	Холостая проба, мл.
Биуретовый реактив.	5	5	5
Сыворотка.	0,1	-	-
Калибровочный раствор.	-	0,1	-
Физраствор.	-	-	0,1

Содержимое пробирок перемешать и оставить стоять для развития окраски на 30 минут при комнатной температуре.
Измерить оптические плотности опытных и калибровочных проб против холостой пробы не позднее чем через 60 минут. Измерения проводить при длине волны 540-560 нм в кювете на 1 см.

Расчет результатов провести по формуле:

С = Ск * Ео / Ек

Где:

С - концентрация белка, г/л.

Ск – концентрация калибровочного раствора альбумина (80 г/л).

Ео – оптическая плотность опытной пробы.

Ек – оптическая плотность калибровочной пробы.

Расчет можно проводить по калибровочному графику.

Примечание:

При содержании белка в исследуемой пробе больше 120 г/л, сыворотку развести физраствором в соотношении 1 : 1, а полученный результат умножить на 2.

Норма общего белка в сыворотке и плазме крови 65 – 85 г/л, у детей до 6 лет 56-85 г/л.

Клинико-диагностическое значение определения общего белка.

Гипопротеинемии (снижение уровня общего белка в крови) встречаются:

при недостатке белковой пищи (голодании, недоедании);
сужении пищевода, нарушениях работы ЖКТ (например, воспалительного характера - при энтеритах);
воспалительных процессах печени, при которых подавляется биосинтез белка (цирроз печени, интоксикации);
врожденные нарушения в синтезе отдельных белков (анальбуминемия, болезнь Вильсона-Коновалова);
при повышенном распаде белков (ожоги, злокачественные опухали, гиперфункции щитовидной железы);
при беременности и лактации;
при увеличении количества воды в кровеносном русле (например, при уменьшении диуреза, прекращении выделения мочи), внутривенном введении большого количества глюкозы, выделение в кровь большого количества антидиуретического гормона гипоталамуса.

Гиперпротеинемия (увеличение уровня общего белка в крови) бывает 2 видов:

Абсолютная гиперпротеинемия (не связанная с нарушением водного баланса) - встречается редко. Значительное возрастание концентрации общего белка (до 120 г/л) встречается при миеломной болезни. Менее выраженная гиперпротеинемия отмечается при хроническом полиартрите.

Относительная гиперпротеинемия (вызвана уменьшением содержания воды в русле крови) возникает из-за потери жидкости организмом больных, страдающих тяжелыми ожогами, генерализованным перитонитом, непроходимостью кишечника, неукротимой рвотой, поносом, несахарным диабетом, хроническим нефритом. Она может отмечаться при усиленном потоотделении.

Ответьте на вопросы:

Что понимают под определение «общий белок крови»?
Расскажите о строении белков.
Расскажите о свойствах белков.
Почему растворы белков устойчивы?
*Почему белки способны двигаться в электрическом поле? Ответ поясните на примере пептида МЕТ – ТРИ – ИЗОЛЕЙ – ПРО - АРГ.
*Что такое изоэлектрическая точка? Ответ поясните на примере пептида АРТ – ЦИС – ФЕН – АСП.

4.4. Практическая работа

«Определение альбумина в сыворотке крови

по биуретовой реакции».

Цели практической работы:

закрепить знания о промежуточном обмене белков;
научиться исследовать содержание альбуминов в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

Оборудуйте рабочее место для практической работы.

Выполните практическую работу.

Сделайте необходимые расчеты.

Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.

Сделайте вывод по работе и рисунки.

Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

При добавлении к пробам сыворотки крови эталонного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) определенной концентрации альбумин, в отличии от других белков, не подвергается осаждению, оставаясь в подкисленном спиртовом растворе, что позволяет установить его содержание методом, основанном на биуретовой реакции.

Реактивы.

Изотонический раствор.

0,2 н раствор едкого натра.

Биуретовый реактив.

Стандартный раствор альбумина.

Спиртовой раствор ТХУ.

Оборудование:

Центрифуга.

ФЭК с кюветами на 1 см.

Пробирки.

Центрифужные пробирки.

Пипетки на 1, 5 и 0,1 мл.

Стеклянная палочка.

Ход определения:

В центрифужную пробирку вносят 0,75 мл раствора ТХУ и 0,25 сыворотки крови, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут при комнатной температуре.
Центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин.
0,2 мл центрифугата (должен быть совершенно прозрачным) переносят в другую пробирку и добавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.
Параллельно определяют содержание общего белка, для чего к 0,1 мл сыворотки добавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.
Пробы оставляют для окрашивания на 30 - 60 минут.
Фотометрируют при зеленом светофильтре 540-560 нм (546 нм) в кювете на 1 см. В качестве контроля берут биуретовый реактив.

Расчет.

Расчет ведут по калибровочной кривой. Для его построения из основного раствора белка готовят рабочие стандартные растворы.

Стандартный раствор белка, мл	Изотонический раствор, мл	Концентрация альбумина, г/л
0,2	0,8	20
0,3	0,7	30
0,4	0,6	40
0,5	0,5	50
0,6	0,4	60
0,7	0,3	70

На основании построенной кривой находят фактор пересчета F (для этого концентрацию делят на экстинцию F = C / А).

Для определения количества альбумина применяют формулу:

С (г/л) = Аоп * F * 2

Норма альбумина в сыворотке крови 35-55 г/л.

Клинико-диагностическое значение определения альбуминов в крови.

Альбумины - это простые белки (протеины) плазмы крови, которые определяют большую часть онкотического давления, участвуют в обезвреживании и транспортировке и жирных кислот, холестерина, билирубина, лекарственных веществ, образую с ними водо-растворимые комплексы. Альбумины сравнительно легко обновляются в организме. Основным местом их синтеза является печень.

Гипоальбуминемия (снижение концентрации альбумина в крови) - наблюдается при:

Голодании;
воспалительных заболеваниях;
циррозе печени;
злокачественных опухолях;
кровотечениях;
после удаления желудка;
выхода белка из русла крови: в просвет кишечника – при завороте кишок, перитоните; на ожоговую поверхность – при обширных ожогах; с мочой – у больных, страдающих нефротическим синдромом (для которых характерно повышенное выделение почками альбумина и некоторых других белковых фракций);
остром и хроническом гломерулонефрите, почечной недостаточности, лейкозах.

При падении уровня альбуминов ниже 30 г/л, «освободившаяся» вода перемещается из сосудов в более плотные ткани, вызывая отеки.

Гиперальбуминемия (возрастание уровня альбумина в крови) практически не встречается, а если и обнаруживается, то она, как правило, вызывается уменьшением содержания воды в кровеносном русле (дегидратацией), гемоконцентрацией и внутривенном введении больших количеств концентрированных растворов альбумина.

Ответьте на вопросы:

Расскажите о строении, свойствах альбуминов.
Перечислите функции альбуминов.
На каком свойстве альбуминов основано их определение в сыворотке крови?
При каких заболеваниях уровень альбуминов изменяется? Почему?
*Напишите строение пептида АЛА – ТРИ – ЦИС – ЛЕЙ. Какой зарад будет у него в водном растворе? Как он будет двигаться а электрическом поле? В какой среде он будет достигать изоэлектрической точки?

4.5. Практическая работа

«Определение белковых фракций

экспресс-методом в сыворотке крови».

Цели практической работы:

закрепить знания о составе и функциях белковых фракций крови;
изучить понятие о диспротеинемии и парапротеинемии;
научиться исследовать содержание белковых фракций в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе.
Зарисуйте протеинограммы схематично в виде графиков.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Метод основан на том, что растворы фосфатного буфера определенной концентрации осаждают с образованием очень мелких хлопьев различные фракции белков.

Реактивы:

Основной фосфатный буфер.
Рабочий раствор фосфатного буфера А.
Рабочий раствор фосфатного буфера Б.
Рабочий раствор фосфатного буфера В.
Рабочий раствор фосфатного буфера Г.

Оборудование:

Пробирки - 6 шт.
Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл
ФЭК с кюветой на 1 см.

Ход определения.

0,5 мл сыворотки крови, 0.75 мл воды, 3.75 мл основного фосфатного буфера вносят в пробирку, хорошо перемешивают.
Пять пробирок нумерую.
В нумерованные пробирки вносят по 0,5 мл полученной смеси.
В пробирку № 1 вносят 5 мл рабочего раствора А.
В пробирку № 2 вносят 5 мл рабочего раствора Б.
В пробирку № 3 вносят 5 мл рабочего раствора В.
В пробирку № 4 вносят 5 мл рабочего раствора Г.
В пробирку № 5 (контроль) вносят 5 мл воды.
Осторожно чтобы не образовалась пена, перемешать содержимое пробирок (перевернуть 5-6 раз) и оставить стоять при комнатной температуре на 15 минут.
Через 15 минут колориметрировать на ФЭКе пробирки № 1,2,3 и 4 против контроля в кювете 1 см при красном светофильтре.

Расчет количества белковых фракций проводят по формулам:

А = Е1 – Е2) / Е1 * 100%

А2 = Е2 – Е3) / Е1 *100%

В2 = Е3 – Е4) / Е1 *100%

Г = Е4 / Е1 * 100%

Где:

Е1 - экстинция пробирки № 1, указывает на содержание всех белковых фракций.

Е2, Е3, Е4 – экстинции соответственно 2, 3 и 4 пробирок.

А – содержание альбуминов, %.

А2 – содержание альфа-глобулинов, %.

В2 – содержание бетта-глобулинов, %.

Г – содержание гамма-глобулинов, %.

Норма белковых фракций в крови:

Альбумины - 52-76.7 % или 35-55 г/л.
Глобулины а1 - 3.5-6.0 % .

а2 - 6.9-10.5 %.

вся фракция альфа-глобулинов 10.4-16.5 % или 8-12 г/л.
бетта-глобулины - 7.3-12.5 % или 3-11 г/л.
гамма-глобулины 12.8-19 % или 11-13 г/л.

Клинико-диагностическое значение определения белковых фракций в сыворотке крови.

При многих заболеваниях на фоне нормальной картины общего белка крови, наблюдаются изменения в уровне концентрации отдельных белковых фракций, т.е. диспротеинемии. По изменению содержания отдельных фракций можно судить о направленности сдвигов входящих в их состав индивидуальных белков, а также о заболевании и ходе его лечения.

Альфа-1- и альфа-2-глобулины включают в себя белки «острой фазы» (они повышаются при острых воспалительных процессах, травмах, аллергических и стрессовых состояниях). Их количество в крови возрастает при многих острых, подострых и хронических воспалительных процессах, в том числе:

пневмонии;

туберкулезе легких (эксудативном);

острых инфекциях;

остром ревматизме;

остром полиартрите;

сепсисе;

злокачественных опухолях;

острых некрозах.

Бетта-глобулины увеличиваются в крови при:

злокачественных новообразованиях;

тяжелой форме туберкулеза легких;

инфекционном, токсическом гепатите, желтухе.

Гамма-глобулины увеличиваются при хронических воспалительных процессах:

в суставах (ревматоидный артрит);

лоханках почек (пиелит);

почках (нефрит);

желчном и мочевом пузыре (холецистит, цистит);

инфекционном гепатите, токсическом поражении печени, механической желтухе;

тяжелых формах туберкулеза легких и ряде др. заболеваний.

Протеинограммы.

Заболевания.	Альбумины.	Альфа-глобулины.	Бетта-глобулины.	Гамма-глобулины.
Острые инфекционные процессы.	Снижение.	Сильно увеличены.	Норма.	Повышение.
Хронические воспалительные процессы.	Снижение.	Норма.	Норма.	Сильно увеличены.
Нефриты, нефрозы.	Сильное снижение.	Повышение.	Повышение.	Снижение.
Гепатиты, гемолит-е процессы.	Снижение.	Норма.	Сильно увеличены.	Повышение.
Механическая желтуха.	Снижение.	Повышение.	Сильно увеличены.	Повышение.

Ответьте на вопросы:

на основе чего белки крови разделены на фракции?

Какие функции выполняют фракции белков крови? Приведите конкретные примеры.

Почему альфа-глобулины называют белками острой фазы?

При каких заболеваниях происходит возрастание количества гамма-глобулинов?

Что такое диспротеинемии и парапротеинемии?

Почему белковые фракции можно разделить методом электрофореза?

На каком свойстве белков основано определение белковых фракций экспресс-методом?

4.6. Практическая работа

«Определение С-реактивного белка (СРБ)».

Цели практической работы:

закрепить знания о белках острой фазы и их клиническом значении;
научиться исследовать содержание СРБ в крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип.

Для определения СРБ используется антисыворотка, которая в присутствии СРБ образует преципитат.

Реактивы:

Антисыворотка к СРБ.
Исследуемая сыворотка или серозная жидкость.

Оборудование:

Капилляры Панченкова.
Штатив (брусок пластилина).

Ход определения:

Капилляр Панченкова опустить в флакон с антисывороткой к СРБ и заполнить на 1/3 высоты.
Протереть конец капилляра ватой.
Опустить капилляр в исследуемый материал и заполнить на 1/3 высоты (между реагентами не должно быть воздуха).
Тщательно перемешать содержимое капилляра, покачивая его 10-12 раз и перемещая жидкость из одного конца к другому.
Погрузить конец капилляра в штатив (брусок пластилина) таким образом, чтобы конец капилляра был на 10-15 мм свободен от жидкости. Погружать следует, осторожно поддерживая капилляр в горизонтальном положении, а штатив – вертикально.
Оставляют стоять штатив при комнатной температуре.
Предварительный учет результатов проводят через 4 часа, окончательно учитывая через 24 ч.

Учет результатов:

Выпадение преципитата (хлопьев, осадок) в капилляре указывает на наличие СРБ в исследуемом материале.
Преципитат высотой 1 мм оценивается как (+) – реакция слабо положительная; 2 мм (++) и 3 мм (+++) – реакция положительная; 4 мм и более (++++) – реакция резко положительная.
Количество преципитата учитывают по всему капилляру.
Реакция не специфична, но может служить признаком активности воспалительного процесса.

Клинико-диагностическое значение определения С-реактивного белка.

СРБ в сыворотке здоровых людей обычными методами не обнаруживается. Проба на СРБ становиться положительной в остром периоде многих воспалительных заболеваний, при злокачественных новообразованиях. Так положительные результаты наблюдаются при инфаркте миокарда, ревматизме, системной красной волчанке, инфекционном неспецифическом полиартрите, нефрите, лимфогранулематозе.

Ответьте на вопросы:

Какие белки относятся к белкам острой фазы?
Почему белки острой фазы так называются?
В чем заключается клинико-диагностическое значение белков острой фазы?
На каком принципе основано определение СРБ в сыворотке крови?

4.7. Практическая работа

«Определение мочевины в биологических жидкостях».

Цели практической работы:

закрепить знания о превращениях и конечных продуктах распада белков в организме;
получить представления об азотистом балансе, остаточном азоте, азотемии;
научиться исследовать содержание мочевины в биологических жидкостях.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Опыт № 1. Определение мочевины в биологических жидкостях неферментативным методом.

Принцип метода.

Метод основан на том, что мочевина образует с диацетилмоноксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс, который фотометрируют.

Реактивы.

Эталон мочевины.
Диацетилмоноксим (яд!)

Состав реакционной смеси:

-диацетилмоноксим 5,0 ммоль/л;

-тиосемикарбазид 0,9 ммоль/л;

-кислота серная 0,9 ммоль/л;

-соль железа трехвалентного 25,0 мкмоль/л.

Дистиллированная вода.
Сыворотка крови.

Оборудование.

Пробирки - 3шт.
Пипетки на 0,01 мл и 2,00 мл.
Фольга.
Кювета на 1 см.
ФЭК.
Водяная баня.

Ход определения:

В пробирки вносят необходимые реактивы в следующих соотношениях.

Реактивы.	Проба, мл.	Эталон, мл.	Контрольный раствор, мл.
1. Сыворотка или разведенная моча.	0,01	-	-
2. Реактив 1.	-	0,01	-
3. Дист. вода.	-	-	0,01
4. Реактив 2.	2,00	2,00	2,00

Смеси перемешивают.
Отверстие пробирки закрываю алюминиевой фольгой, и нагревают на кипящей водяной бане точно 10 минут.
Содержимое пробирок быстро охлаждают в токе холодной воды.
До 15 минут измеряют оптическую плотность пробы (А1) и эталона (А2) против контрольного раствора. Измерения проводят при длине волны 490-540 нм в кювете 1 см.

Расчет количества мочевины проводят по формуле:

С мочевина = 16,65 * А1 / А2 (ммоль/л)

Опыт № 2. Определение мочевины в биологических жидкостях ферментативным методом.

Принцип:

Метод основан на том, что уреаза специфично гидролизует мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. Выделенный аммиак определяют фотометрически по окрашенному продукту реакции.

Реактивы:

Раствор 1 (уреаза).
Раствор 2 (хромоген).
Раствор 3 (натрия гипохлорит).
Стандарт мочевины 10,0 ммоль/л.
Биологическая жидкость.

Оборудование:

ФЭК с кюветой на 5 мм.

Термостат.

Штатив с пробирками.

Фильтровальная бумага.

Ход определения:

Проведите исследование количества мочевины в соответствии с таблицей.

Реактивы.	Опыт, мл.	Стандарт, мл.	Контроль, мл.
Сыворотка или моча.	0,02	-	-
Стандарт мочевины.	-	0,02	-
Раствор 1.	0,50	0,50	0,50
Смеси перемешиваю и инкубируют 10 минут при 37С в термостате.
Раствор 2.	1,00	1,00	1,00
Раствор 3.	1,00	1,00	1,00
Смеси перемешать и инкубировать 5 минут при 37С.

Измеряют оптическую плотность опытной (Ео) и стандартной (Ес) проб против контроля при длине волны 590 нм в кювете на 5 мм. Окраска стабильна несколько часов.

Расчет количества мочевины проводят по формуле:

С мочевины = Ео / Ес * Сст (ммоль/л)

Нормальные величины содержание мочевины.

В сыворотке крови 2,5-8,3 ммоль/л.

В моче 333-583 ммоль/л.

Предупреждение.

Мочу перед анализом разводят дист. водой в соотношении от 1:50 до 1:100 (результат умножают на разведение).
При содержании мочевины свыше 23 ммоль/л пробу разводят дист. водой и анализ проводят повторно, а результат умножают на разведение.
При определении мочевины в гемолитических или липемических сыворотках пробу необходимо депротеинировать, например 5 % раствором трихлоруксусной кислоты. В пробирке смешивают 0,10 мл пробы с 1,00 мл раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют. Точно также разбавляют и эталонный раствор мочевины. Для собственно анализа отмеривают 0,10 мл надосадочной жидкости. Далее определение проводят как при анализе без депротеинизирования. Таким же способом можно анализировать цельную кровь.
Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница нормальных величин содержания мочевины в сыворотке крови может быть повышена даже до 10 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения мочевины.

Увеличение содержания мочевины в крови наблюдается при:

усиленном её образовании в результате богатого белками рациона питания, чрезмерного катаболизма белка, лейкозов, желтухи, тяжелых инфекционных заболеваний, непроходимости кишечника, ожогов, дизентерии, шока;

уменьшении выведения с мочой при ретенционной почечной азотемии, ретенционной внепочечной азотемии (острой почечной недостаточности, опухолях мочевыводящих путей, предстательной железы, почечно-каменной болезни, недостаточности деятельности сердца);

кровотечении из верхних отделов желудочно-кишечного тракта;

приеме некоторых лекарств - сульфаниламидов, левомецитина, тетрациклина и других.

Снижение содержания мочевины в крови наблюдается при:

особенно тяжелых поражениях печени, в частности при отравлении фосфором, мышьяком, декомпенсированном циррозе;

голодании;

пониженном катаболизме белков;

после введения глюкозы;

после гемодиализа.

Увеличение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:

злокачественной анемии (вследствие отрицательного азотистого баланса);

лихорадке;

после приема лекарственных препаратов (салицилатов, хинина и др.);

гиперпротеиновой диете;

гиперфункции щитовидной железы;

в послеоперационный период.

Уменьшение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:

нефрите, уремии;

нарушении функции почек;

нефропатии беременных;

паренхиматозной желтухе (вследствие нарушения образования мочевины);

острой дистрофии печени;

прогрессирующем циррозе печени;

приеме анаболитических гормонов (положительный азотистый баланс).

Ответьте на вопросы:

Дайте определение понятиям азотистый баланс, остаточный азот, резидуальный азот, азотемии.
Назовите причины и виды азотемии.
Почему при поражениях ССС концентрация мочевины в крови увеличивается? К какому виду азотемии относиться это изменение?
Для диагностике каких заболеваний чаще всего исследуют уровень мочевины в крови и моче?
Что такое выделительная способность почек?
Как уровень мочевины может служить диагностике нарушений выделительной способности почек?

4.8. Практическая работа

«Определение креатинина в сыворотке крови методом Яффе».

Цели практической работы:

закрепить знания об остаточном азоте крови, азотемии;
научиться исследовать содержание креатинина в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

В щелочной среде креатинин образует с пикриновой кислотой комплексное соединение желто-красного цвета (реакция Яффе). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина в исследуемой пробе.

Реактивы:

Дистиллированная вода.
Реагент 1. Вольфрамат натрия, 10 % раствор.
Реагент 2. Серная кислота, 0,33 моль/л,
Реагент 3. Пикриновая кислота, 0,04 моль/л.
Реагент 4. Гидроксид натрия, 0,75 моль/л.
Реагент 5. Калибровочный раствор креатинина, 10 мг/л (88,4 мкмоль/л).
Сыворотка или моча.

Оборудование:

Центрифужные пробирки – 1 шт.
Химические пробирки – 3 шт.
Пипетки на 0,5 мл; 1,0 мл; 2,0 мл.
ФЭК с кюветой на 5 мм.
Термостат.
Центрифуга.
Секундомер.
Штатив.

Ход определения:

Проведите депротеинизацию (в центрифужной пробирке).

Реактивы.	Количество, мл.
Анализируемая проба.	1,0
Дистиллированная вода.	1,5
Реагент 1.	0,5
Реагент 2.	1,0

Смесь тщательно перемешать и центрифугировать при 1500 об/мин в течении 15 минут.
Центрифугат анализировать по реакции Яффе согласно таблице.

Реактивы.	Опыт, мл.	Стандарт (калибровочная проба), мл	Контроль, мл.
Центрифугат.	1,5	-	-
Реагент 5.	-	1,5	-
Дистиллированная вода.	-	-	1,5
Реагент 3.	0,5	0,5	0,5
Реагент 4.	0,5	0,5	0,5

Смеси тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре в течение 20 минут.
Измерить оптическую плотность опытной пробы (Е1) и калибровочной пробы (Е2) относительно контрольной пробы при длине волны 520 нм (500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 5 см.

Расчет количества креатинина проводят по формуле:

С= Е1 / Е2 * 353,6 мкмоль/л

С= Е1 / Е2 * 40 мг/л.

Норма:

В сыворотке крови: у мужчин 44-100 мкмоль/л,

у женщин 44-88 мкмоль/л.

В суточной моче: 4,4-17,7 ммоль.

Примечания:

При использовании в качестве образца мочи, её предварительно разводят 1:100, а результат умножают на 100.
При необходимости количества исследуемого материала и реагентов могут быть пропорционально изменены.
К каждой серии анализов калибровочную пробу ставить обязательно.

Клинико-диагностическое значение

определения креатинина в крови и моче.

Повышение уровня кретинина в крови может наблюдаться при:

Усиленном его образовании во время голодания, усиленной мышечной работе, резко выраженном нарушении функции печени и сердечно-сосудистой системы, воспалительных заболеваниях легких, лихорадочных состояниях, кишечной непроходимости.
Задержке в организме вследствие нарушения клубочковой фильтрации почек (что расценивается как ранний признак почечной недостаточности), закупорке мочевых путей.
Нарушением гормонального баланса, например, у больных сахарным диабетом.

Повышенное выведение креатинина с мочой происходит при острых инфекционных заболеваниях, большой физической работе, снижение – при лейкозах, хронических заболеваниях (амилоидозе) почек, атрофии мышц, некоторых формах анемии, после назначения кортикотропина (АКТГ).

Наиболее широко используемая для определения креатинина реакция Яффе недостаточно специфична, т.к. дает подобную окраску с глюкозой, ацетоном, бета-оксимасляной кислотой, альфа-кетоглутаратом, пируватом, билирубином, гемоглобином, мочевиной и мочевой кислотой (псевдокреатиновые хромогены). В результате может быть получен ложноположительный результат. Поскольку псевдокреатиновые хромогены в мочу здоровых людей практически не попадают, то в клинике часто определяют клиренс креатинина.

Определение клиренса креатинина.

Почти все вещества в организме подвергаются реабсорбции в почках, но креатинин относится к числу тех веществ, которые полностью выводятся из организма.

При проведении пробы на очищение (депурацию) от креатинина определяют очистительную способность, или клиренс, клубочков почек, рассчитывая её по формуле:

С кл. = (U*V) / Р

Где:

С – объем плазмы, прошедший за 1 минуту через клубочки почек,

Р – концентрация креатинина в плазме крови

U - концентрация креатинина в моче

V – объем мочи (в мл), выделившейся за 1 минуту(минутный диурез).

Таким образом, клубочковый клиренс соответствует количеству выделенной первичной мочи (вмл) за 1 минуту.

Исследование провотят в утренние часы, натощак. Для увеличения объема выводимой мочи испытуемому предварительно дают 400-600 мл “жидкого” (некрепкого) чая или воды. Желатедльно, чтобы во время проведения пробы пациент пребывал в положении лежа (большая физическая нагрузка недопустима). Сбор мочи проводят зв два часовых периода. Взятие крови осуществляют в середине часовых промежутков.

Полученные данные оценивают с учетом поверхности тела пациента.

Норма: у мужчин 97-137 мл/(мин*1,73м2) или 0,93-1,32 мл/(с*м2),

У женщин 88-128 мл/(мин*1,73м2) или 0,85-1,23 мл/(с*м2).

Уменьшение клубочковой фильтрации происходит при заболевании почек (остром и хроническом нефрите, хронической почечной недостаточности, нефротическом синдроме и др.) и нарушении кровообращения в почках ( втом числе из-за нарушения деятельности сердечно-сосудистой системы, большой кровопотери, щока).

Повышение клубочковой фильтрации встречается весьма редко: оно обычно наблюдается при снижении содержания альбумина в плазме (гипоальбуминемии) в условиях сохранения числа функционирующих структурных единиц почек (нефронов). В этом случае усилению клубочковой фильтрации способствует уменьшение онкотического давления плазмы.

Показатели клиренса подвергаются колебаниям в течении суток: наиболее высокие величины отмечаются утром, самые низкие – ночью. Увеличивают фильтрацию водная нагрузка и прием мясных продуктов (в большом количестве), снижают - ограничение приема натрия и калия. В горизонтальном положении пациента показатели клиренса выше, чем в вертикальном.

Ответьте на вопросы:

1. Напишите схему образования креатинина.

2. Почему при поражениях мышц концентрация креатинина в крови изменяется? К какому виду азотемии относиться это изменение?

Для диагностики каких заболеваний, чаще всего исследуют уровень креатинина в крови и моче?
Что такое выделительная способность почек?
Как уровень креатинина может служить диагностике нарушений выделительной способности почек?
Что такое клиренс?
В чем заключается преаналитический этап исследования клиренса.

4.9. Практическая работа

«Определение мочевой кислоты в сыворотке крови».

Цели практической работы:

закрепить знания о превращениях нуклеопротеидов в организме;
научиться исследовать содержание мочевой кислоты в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевой кислоты в исследуемой пробе.

Реактивы:

Вода дистиллированная.
Серная кислота конц.
Натрий фольфрамовокислый.
Карбонат натрия.
Фосфорно-вольфрамовый реактив.
Калибровочный раствор мочевой кислоты.
Сыворотка крови.

Оборудование:

ФЭК с кюветой 1 см.
Центрифуга.
Центрифужные пробирки.
Штатив с пробирками.
Пипетки на 1, 2, 5 мл.
Фильтровальная бумага.
Стеклянная палочка.

Ход определения:

Проведите исследование мочевой кислоты в сыворотке крови в соответствии с таблицей.

Реактивы.	Опыт, мл.	Калибровка, мл.	Контроль, мл.
Вода дистиллированная	4,0	-	-
Сыворотка крови.	0,50	-	-
Серная кислота.	0,25	-	-
Смесь перемешивают стеклянной палочкой и добавляют.
Натрий вольфрамовокислый.	0,25
Смесь тщательно перемешивают и через 5 минут центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин.
Надосадочная жидкость.	2,00	-	-
Калибровочный раствор.	-	2,00	-
Вода дистиллированная.	-	-	2,00
Карбонат натрия.	1,00	1,00	1,00
Фосфорновольфрамовый реактив.	0,60	0,60	0,60

Смеси тщательно перемешать стеклянной палочкой.
Пробирки оставить на 30 минут.
Определить экстинцию опытной (Ео) и калибровочной (Ек) проб против контроля.

Расчет результатов проводим по формуле:

Скреат = Ео / Ек * 300 (мкмоль/л).

Норма в плазме крови:

- у мужчин 0,24-0,5 ммоль/л;

- у женщин 0,16-0,44 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения мочевой кислоты.

Мочевая кислота - главный продукт распада основного компонента нуклеиновых кислот пуриновых оснований. Поскольку она не используется далее в обменных процессах, то выделяется почками с мочой.

Исследование содержания мочевой кислоты представляет особый интерес для диагностики подагры, т.к. это заболевание тесно связано с нарушением обмена пуриновых оснований. Оно характеризуется отложением солей мочевой кислоты в суставах и других тканях, а также увеличение мочевой кислоты в крови.

Гиперурикемия - повышение уровня мочевой кислоты в крови - наблюдается при:

заболеваниях , которые сопровождаются распадом клеточных элементов (лейкозах, эритроцитозах, злокачественных новообразованиях, инфаркте миокарда, голодании);

нарушении выделительной функции почек (гломерулонефрит);

подагре;

употребление пищи богатой пуриновыми основаниями и жирами.

Гипоурекемия - понижение уровня мочевой кислоты в крови - отмечается при лечении препаратами пиперазинового ряда, иногда при гепатите, анемиях.

Урикозурия - увеличение уровня мочевой кислоты в моче обнаруживается в 25-30 % случаев подагры, некоторых наследственных заболеваниях (синдром Леша-Найхана) и нарушениях накопления гликогена.

Уменьшение уровня мочевой кислоты в моче обычно отражает развитие почечной недостаточности, прием салицилатов в дозе 2-3 г в сутки.

Ответьте на вопросы:

Напишите схематично процесс переваривания и распада нуклеопротеидов.
Нарисуйте схему образования нуклеопротеидов в клетках.
В чем заключается основное клиническое значение мочевой кислоты?
Расскажите о причинах, течении, диагностике, лечении и профилактике подагры.
О какой патологии может идти речь, если уровень мочевой кислоты в крови повышен, а в моче понижен? Почему вы так считаете? К какому виду азотемии можно отнести данный случай?

4.10. Практическая работа

«Определение билирубина в сыворотке крови».

Цели практической работы:

закрепить знания о видах, функциях и превращениях гемоглобина;
изучить основные виды, причины и лабораторную диагностику желтух;
научиться исследовать содержание билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

2. Оборудуйте рабочее место для практической работы.

3. Выполните практическую работу.

4. Сделайте необходимые расчеты.

Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Связанный (прямой) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а свободный (непрямой) – в присутствии кофеинового реактива с образованием окрашенного азобилирубина, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию билирубина.

Реактивы:

Кофеиновая смесь.
Калибровочный раствор билирубина.
Диазореактив (сульфаниловая кислота+нитрит натрия).
Дистиллированная вода.
Физиологический раствор.
Сыворотка крови.

Оборудование:

ФЭК с кюветой на 5 мм.
Штатив с пробирками.
Фильтровальная бумага.
Стеклограф.

Ход работы:

1. Определение коэффициента пересчета.

Измерьте оптическую плотность калибровочного раствора билирубина против дистиллированной воды при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 5 мм.
Произведите расчет по формуле:

К = Ск / Ек

Где:

К – коэффициент пересчета.

Ск – концентрация билирубина в калибровочном растворе.

Ек – оптическая плотность калибровочного раствора.

2.Определение количества билирубина.

Приготовьте пробы согласно таблице.

Реактивы.	Общий билирубин, мл.	Связанный билирубин, мл.	Раствор сравнения, мл.
Сыворотка крови.	0,25	0,25	0,25
Кофеиновый реактив.	2,00	-	2,00
Физиологический раствор.	-	2,00	-
Диазореактив.	0,25	0,25	0,25

Смеси аккуратно перемешать.
Оставить стоять связанный билирубин на 10 минут, общий билирубин на 20 минут.
Измерить оптическую плотность общего (Еобщ) и связанного (Есвяз) билирубина против раствора сравнения при длине волны 540 нм в кювете на 5 мм.

Расчет результатов проводим по формулам:

Собщ = К * Еобщ (мкмоль/л).

Ссвяз = К * Есвяз (мкмоль/л).

Ссвоб = Собщ – Ссвяз (мкмоль/л).

Норма билирубина в плазме крови:

общий - 3,4-20,5 мкмоль/л.

непрямой 1,7-17,1 мкмоль/ л.

прямой 0,86-5,3 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение

определения уровня билирубина в крови.

Одним из важнейших пигментов и продуктов распада гемоглобина является билирубин. Уровень общего, прямого и связанного билирубина показывает работу печени и почек, а также уровень распада эритроцитов в крови. Определение общего билирубина и его производных в крови, моче и кале производят для дифференциальной диагностики различных видов желтух.

Общий билирубин состоит из 2 фракций:

Непрямой (свободный, комплекс с альбуминами).

Прямой (конъюгированный, связанный с глюкуроновой кислотой).

Увеличение содержания билирубина сопровождается желтушной окраской слизистых оболочек и кожных покровов. Легкая форма желтухи до 86 мкмоль/л, среднетяжелая 87-159 мкмоль/л, тяжелая 160 мкмоль/л.

Содержание непрямого (свободного) и общего билирубина в крови возрастает при:

повышенном распаде эритроцитов (гемолитическая анемия);

физиологической желтухе новорожденных;

врожденных и приобретенных нарушениях превращения свободного билирубина в связанный в печени (синдром Жильберта).

Концентрация прямого (связанного) билирубина в крови увеличивается при воспалительных процессах в печени (гепатит).

Содержание прямого и общего билирубина в крови увеличивается при механической желтухе.

Содержание общего билирубина увеличивается также при приеме лекарств, увеличивающих гемолиз (н-р аспирин, тетрациклин).

Уровень прямого билирубина может увеличиваться под действием лекарств, задерживающих желчь в печени (холестаз) н-р пиницилин, эритромицин, пероральных контрацептивов, никотиновой кислоты.

Ответьте на вопросы:

Нарисуйте схему распада и синтеза гемоглобина.
Расскажите о причинах и лабораторной диагностике гемолитической желтухи.
Расскажите о причинах и лабораторной диагностике паренхиматозной желтухи.
Расскажите о причинах и лабораторной диагностике механической желтухи.
Какие заболевания могут сопровождаться желтухами? Почему?

4.11. Практическая работа

«Тимоловая проба».

Цели практической работы:

закрепить знания о функциях печени;
изучить понятие о функциональных пробах печени;
научиться проводить и анализировать тимоловою пробу.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

При взаимодействии сыворотки с тимоловым буфером появляется мутность вследствие образования комплекса «глобулин-тимол-липоид». Интенсивность помутнения зависит от количества взаимного соотношения отдельных белковых фракций.

Реактивы:

Тимоловый реактив.

Физиологический раствор.

Сыворотка крови.

Раствор сульфата бария.

Раствор серной кислоты 0,2М.

Оборудование:

1. ФЭК с кюветой на 1 см.

2. Штатив с пробирками.

3.Пипетки на 1, 5 мл.

4.Стеклограф.

5.Фильтровальная бумага.

Ход работы:

Провести исследование согласно таблице.

Реактивы.	Опыт, мл.	Контроль 1, мл.	Контроль 2, мл.
Сыворотка крови.	0,05	-	0,05
Тимоловый реактив.	3,00	3,00	-
Физраствор.	-	0,05	3,00

Смеси перемешать и оставить стоять на 30 минут.
Смеси вновь перемешать и измерить оптическую плотность опытно пробы против контроля 1.
Если сыворотка хилезная измерить оптическую плотность пробы против контроля 2.
Измерение проводить при длине волны 620-690 нм в кювете на 5 мм.

Расчет:

Расчет проводят по калибровочному графику, для постороения которого готовят серию растворов согласно таблице.

№ пробы.	Раствор серной кислоты, мл.	Раствор сульфата бария, мл.	Единицы помутнения, S – Н.
1	4,5	1,5	5
2	3,0	3,0	10
3	1,5	4,5	15
4	-	6,0	20

Растворы смешивают и ровно через 30 минут измеряют оптическую плотность против дистиллированной воды при длине волны 620-690 нм в кювете на 1 см. Перед измерением пробы еще раз перемешивают.

Норма тимоловой пробы 0 – 4 единиц SН (единиц помутнения Shank-Hoagland). Предельные величины – 4-5 ед.SН, патология – свыше 5 ед. SН.

Примечание:

Для получения правильных результатов необходимо исключить алиментарную гиперлипидемию.
Сыворотку хранят при температуре 21 – 27 С – несколько дней.
При охлаждении сыворотки крови получают завышенные результаты, при более высоких температурах – заниженные.
Результаты пробы завышаются при употреблении минеральных сульфатных вод, гемолизе, липемии, высокой билирубинемии, приеме лекарственных средств (цефалотин, индометацин, линкомицин идр.).
Результаты пробы завышаются при анализе оксалатной плазмы, употреблении глицина, гепарина, желчные кислоты.

Клинико-диагностическое значение тимоловой пробы.

Проба положительна при:

Паренхиматозном (инфекционном, вирусном, токсическом гепатите);
Септическом эндокардите;
Циррозе печени;
Коллагенозах;
Миеломах.

Проба отрицательна при:

Механической желтухе (становиться положительной, если процесс осложняется паренхиматозным гепатитом!);
Ревматизм.

Ответьте на вопросы:

На каком принципе основана постановка функциональных проб печени?
Что такое коллоидная устойчивость белков?
Почему при поражениях печени изменяется коллоидная устойчивость белков?
Как с помощью тимоловой пробы дифференцировать механическую и паренхиматозную желтухи?
Какие еще пробы коллоидоустойчивости вы знаете?

Раздел 3. Ферменты.

Значение изучаемой темы:

3.1. Преаналитический этап ферментативных исследований.

Забор крови проводится с 7 до 9 ч утра, натощак;
Перед анализом обследуемый должен исключить прием алкоголя, курение, физические нагрузки, прием лекарств;
Сдавливание сосудов при наложении жгута должно быть минимальным и не превышать 30 с;
В качестве антикоагулянта используют гепарин и его соли;
Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме проводят в день взятия биоматериала, гепаринизированную кровь исследуют в течение 1 часа, свежую кровь – в течение 3 минут;
Следует помнить, что на активность ферментов влияет температура, наличие активаторов и ингибиторов, рН среды, поэтому все исследования проводят в сухих чистых пробирках, при 370С, строго соблюдая оптимальную рН исследуемого фермента;
Повторное оттаивание и замораживание сыворотки крови не допустимо.

3.2. Использование ферментов в медицине.

Использование ферментов в медицине возможно по трем направлениям:

1. Энзимопатология – изучает нарушения активности ферментов в развитии заболевания.

Наследственные, связанные с полным нарушением биосинтеза какого-либо фермента;
Токсические, связанные с избирательным угнетением активности отдельных ферментов;
Алиментарные, вызванные дефицитом витаминов, белка, микроэлементов;

Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях:

Органоспецифичность;
Низкая активность в крови в норме;
Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа;
Высокая стабильность в крови;
Доступная методика определения активности фермента.

3. Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных средств.

Использование пищеварительных ферментов (фестал, мезим) при лечении нарушений пищеварения.
Фибринолизин применяют при лечении незаживающих ран, пролежней, для рассасывания тромбов.
Лидаза используется после операций для предотвращения образования грубых рубцов.
Трасилол, будучи ингибитором протеолитических ферментов, эффективен при лечении острых панкреатитов.

Практическая работа

3.3. Обнаружение действия и специфичности ферментов.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения ферментов;

- Знать о биологической роли ферментов, строении, основных свойствах, внутриклеточной локализации, особенности ферментативного катализа, механизме действия ферментов.

- Уметь обнаруживать действие и специфичность амилазы слюны.

Принцип: фермент слюны амилаза при определенных условиях производит гидролиз крахмала до мальтозы.

амилаза амилаза мальтаза

(С6Н10О5)у-----------(С6Н10О5)х-------------уС12Н22О11-----------nС6Н12О6

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

Реактивы:

1% раствор крахмала;
2% раствор сахарозы;
1% раствор йода;
5% раствор сульфата меди;
10% раствор гидрооксида натрия;
амилаза слюны;
дистиллированная вода.

Оборудование:

штатив с пробирками (7 шт);
пипетки глазные;
воронка;
стаканчик;
термостат;
спиртовка;
фильтры.

Ход работы (обнаружение действия ферментов):

Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);
В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контроль и опыт;
В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;
Перемешайте и поставьте в термостат при 370С на 15 мин;
Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;
В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);
Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Ход работы (специфичность действия):

В две пробирки налейте по 10 капель раствора слюны, в первую добавьте 10 капель раствора крахмала, во вторую – 10 капель сахарозы;
Пробы перемешайте и поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем первую пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку, и проделайте две реакции: пробу Троммера и реакцию с йодом;
Со второй пробиркой проделайте реакцию Троммера;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение действия и специфичности амилазы слюны;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Напишите реакцию, которую катализирует амилаза слюны.
1. Назовите субстраты амилазы.
2. Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?
3. Какой специфичностью обладает амилаза слюны?
4. Как можно измерить активность амилазы?
5. Дайте определения следующим понятиям: фермент, активный центр, аллостерический центр, простые ферменты, сложные ферменты, апофермент, кофермент, холофермент, обратимость действия, термолабильность, специфичность.

Практическая работа

3.4. Зависимость активности ферментов от рН среды.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

-Знать свойства ферментов, кинетику ферментативных реакций, классификацию ферментов по сложности строения;

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от рН среды.

Принцип: для амилазы слюны оптимальное значение рН лежит в пределах слабощелочной среды, в кислой и сильно щелочной среде активность фермента снижается, и расщепление крахмала происходит не полностью, до стадии декстринов, которые с йодом дают красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.

Реактивы:

1% раствор крахмала;
1% раствор йода;
фосфатно-цитратный буфер с рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;
амилаза слюны.

Оборудование:

штатив с пробирками (5 шт)
пипетки на 1 мл, глазные пипетки;
термостат

Ход работы:

В 5 пронумерованных пробирок налейте по 1 мл фосфатно-цитратного буфера со значением рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;
Во все пробирки добавьте по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора амилазы;
Затем во все пробирки добавьте по 3 капли раствора йода, тщательно перемешайте;
Все пробирки поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем пробирки охладите под холодной водой и сравнит окраску во всех 5 пробирках;
Сделайте вывод о зависимости активности амилазы от рН среды.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от рН среды.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Приведите примеры простых ферментов.
Приведите примеры сложных ферментов.
Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
Назовите оптимальную рН для следующих ферментов: пепсин, химозин, гастриксин, амилаза слюны, трипсин, липаза, химотрипсин.

Практическая работа

3. 5. Зависимость активности ферментов от температуры.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать кинетику ферментативной реакции.

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от температуры.

Принцип: все ферменты являются термолабильными веществами и проявляют свою максимальную активность при 370С. При снижении или повышении температуры активность ферментов падает, что приводит к образованию промежуточных продуктов или к полной остановке реакции. Так, нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, а декстрины (промежуточные продукты распада крахмала) в зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску. Таким образом, по окраске раствора йодом можно судить о степени гидролиза крахмала.

Реактивы:

1% раствор крахмала
1% раствор йода
раствор амилазы
дистиллированная вода.

Оборудование:

штатив с пробирками (4 шт);
пипетки на 1 и 2 мл, глазные пипетки;
термостат;
водяная баня;
ледяная баня;
спиртовка.

Ход работы:

В четыре пронумерованной пробирки налейте по 0,5 мл раствора амилазы;
Пробирку №1 поставьте в лед, №2 – оставьте при комнатной температуре, №3 – в термостат, №4 – в кипящую водяную баню;
Через 5 мин, когда содержимое пробирок примет нужную температуру, в пробирку №1 добавьте 2 мл крахмала, охлажденного до температуры тающего льда.
Во 2-ю,3-ю и 4-ю пробирки добавьте по 2 мл раствора крахмала комнатной температуры;
Во все пробирки добавьте по 2 капли йода;
Перемешайте содержимое и поместите пробирки в те же самые условия на 15 мин;
Затем пробирки достаньте, охладите, и оцените активность амилазы по интенсивности и цвету окраски;
Результаты занесите в таблицу:

№	Субстрат	Фермент	t	Реакция с йодом
1.
2.
3.
4.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от температуры;
Сделайте выводы по работе, по полученным результатам построить график зависимости активности амилазы от температуры;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Перечислите основные свойства ферментов.
Как влияет температура на активность ферментов?
К какому классу ферментов относится амилаза слюны?
Перечислите классы ферментов с примерами.

5*. Нарисуйте графики зависимости активности ферментов от температуры, рН, концентрации S и Р.

Практическая работа

3.6. Зависимость активности ферментов от влияния активаторов и ингибиторов.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать кинетику ферментативной реакции, активаторы и ингибиторы, виды ингибирования, классификацию ферментов по типу катализируемой реакции.

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.

Принцип: активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его активации или ингибированию.

Реактивы:

1% раствор крахмала;
1% раствор йода;
1% раствор сульфата меди;
1% раствор хлорида натрия;
амилаза слюны;
дистиллированная вода.

Оборудование:

штатив с пробирками (3);
пипетки глазные;
стаканчики;
воронка.

Ход работы:

В 3 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель раствора амилазы;
Затем по одной капле добавьте в 1-ю – хлорид натрия, во 2-ю – сульфат меди, в 3-ю – воды (контроль);
Перемешайте, внесите в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставьте стоять на 3 мин при комнатной температуре;
Затем добавьте по 1 капле йода, перемешайте, наблюдайте за окраской растворов и определите, в какой пробирке действовал активатор или ингибитор;
Результаты оформите в виде таблицы:

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом в присутствии
			СuSO4	NaCI	H2O

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов;
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Дайте определения и характеристику изоферментам на примере ЛДГ и КК.
Дайте определение следующим терминам: активаторы, ингибиторы, денатурация, ингибирование.
Перечислите основные виды ингибирования.
Объясните принцип конкурентного ингибирования.

5*. Ингибитор снижает активность фермента до 30% от исходного уровня. Повышение концентрации субстрата катализируемой реакции восстанавливает 80% активности фермента. К какому типу относится данный ингибитор?

Практическая работа

3.7. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать клинико-диагностическое значение определения амилазы в сыворотке крови и моче.

- Уметь определять активность панкреатической альфа-амилазы в сыворотке крови.

Принцип: альфа-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы:

крахмал-субстрат;
фосфатный буфер рН=7;
раствор йода 0,01н;
вода дистиллированная;
сыворотка крови.

Оборудование:

штатив с пробирками (2 шт);
пипетки на 1 мл, 5 мл;
дозатор на 0,01 мл и на 0,5 мл;
термостат;
ФЭК.

Ход работы:

Реактивы	Опытная проба, мл	Холостая проба, мл
Рабочий реактив	0.5	0.5
Выдержать в термостате при 370С в течение 5 мин.
Сыворотка крови	0.01	-
Вода дистиллированная	-	0.01
Выдержать в термостате при 37 С в течение 7,5 мин. Время инкубации строго отсчитывать по секундомеру от момента внесения образца и затем сразу добавить:
Раствор йода	0.5	0.5
Объем проб довести дистиллированной водой до 5 мл, перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и холостой пробы (А2) против дистиллированной воды, при 630-690 нм в кювете на 10 мм.

Расчет: активность амилазы в мг крахмала, гидролизованного 1л биологической жидкости за 1с при 37 С. расчет проводим по формуле:

Активность амилазы = (А2 – А1)* 44.4/А2, мг/с*л

Нормальные величины: сыворотка крови – 3.3 –8.9 мг/с*л

моча - до 44 мг/с*л

Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы

Активность амилазы в сыворотке крови повышается (гиперамилаземия) при:

остром панкреатите (в 10-30 раз, приходя к норме на 6-7 сутки, если активность сохраняется увеличенной более 5 суток, это говорит о развитии хронического процесса);
Обострении хронического панкреатита;
Паротите (воспалении слюнных желез);
Почечной недостаточности;
Может быть вызвана приемом алкоголя, адреналина, наркотических веществ.

Снижение активности амилазы в сыворотке крови (гипоамилаземия) наблюдается при:

Заболеваниях печени (гепатитах, механической желтухе, циррозе);
Сахарном диабете;
Гипотереозе;

Повышение активности в моче (гиперамилазурия) наблюдается при:

Остром панкреатите (имеет большее диагностическое значение, чем определение в сыворотке, так как держится более 7 суток);
Паротите;

Снижение активности фермента в моче (гипоамилазурия) наблюдается при:

почечной недостаточности .

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение активности амилазы в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Назовите место локализации, оптимальное рН и биологическое значение амилазы.
Напишите реакцию, которую катализирует амилаза.
Назовите основные заболевания, характеризующиеся повышением активности амилазы. Объясните причину.
К какому классу ферментов относится амилаза?

Практическая работа

3.8. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать клинико-диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови;

- Уметь определять активность аминотрансфераз в сыворотке крови.

Принцип: в результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуются щавеливоуксусная и пировиноградные кислоты. При добавлении раствора 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается, и возникают гидразоны пировиноградной кислоты. В щелочной среде они дают окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоте.

Реактивы:

1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый – 2 ммоль/л

2. 2,4 – динитрофенилгидразин – 1 ммоль/л

3. Гидрооксид натрия - 0,4 н.

4. Субстрат АсАТ/АлАТ.

5. Сыворотка

6.Физиологический раствор

Оборудование:

1. Термостат.

2. ФЭК, кюветы на 1 см.

3. 2 пробирки,

4. Штатив для пробирок

5. Пипетки на 1 и 5 мл

6. Дозатор на 0.05 мл

Ход определения.

Реактивы.	Опытная проба.	Контроль.
Субстрат	0.25 мл	0.25 мл
Физ. раствор	-	0.05 мл
Прогреть 5 минут в термостате при 37оС
Сыворотка	0.05 мл	-
Инкубировать в термостате на 30 минут при 37оС
Динитрофенилгидразин	0.25 мл	0.25 мл
Оставить стоять при комнатной температуре 20 минут
Гидрооксид натрия	2.5 мл	2.5 мл
Оставить стоять при комнатной температуре 5 минут

Оптическую плотность измеряем на ФЭКе при длине волны 500-530 нм(зеленый светофильтр), в кювете на 1 см и проводим расчеты по калибровочному графику.

Нормальные величины АлАТ и АсАТ:

0.1 – 0.68 мкмоль/мл, 0.1 – 0.75 мкмоль/мл

Клинико-диагностическое значение определения аминотрансфераз в крови.

Активность АсАТ преобладает в мышечной ткани, а АлАТ – в печени.

Пределы колебаний активности ферментов в сыворотке крови у взрослых составляет: АсАТ – 0.1 – 0.45 мкмоль/л*ч,

АлАТ – 0.1 – 0.68 мкмоль/л*ч

Наиболее часто активность аминотрансфераз исследуют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда. Увеличение активности аминотрансфераз наблюдается при:

Инфаркте миокарда активность АсАТ в 95% случаев повышается (активность КК, ЛДГ при этом повышена). Возрастание происходит на 4-6 ч. с момента приступа. Оно четко выражено спустя 24-36 ч. (увеличивается в 4-5 раз выше нормы) и лишь на 3-7 сутки снижается до нормы. Отношение показателей активностей КК/АсАТ имеет высокую значимость при дифференциальной диагностике инфаркта миокарда(отношение около 5) и поражениях скелетных мышц(около 27). Коэффициент де Ритиса АсАТ/АлАТ более 1.
Остром вирусном гепатите (АлАТ и АсАТ более чем в 100 раз). Коэффициент де Ритиса менее 1,33.

Хроническом гепатите;
Циррозе печени (активность повышается в 5-8 раз);
Механической желтухе (АлАТ повышается в 50 раз долго остается повышенной, сопровождаясь возрастанием активности ЩФ, ГГТП и содержанием билирубина);
Токсическом поражении печени;
Легочной эмболии (активность КК при этом не повышена);
Поражениях мышц (мышечной дистрофии, дерматоитозит);

Снижение активности АсАТ и АлАТ наблюдаются при:

Снижении содержания в организме витамина В6
Почечной недостаточности.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение активности аминотрансфераз в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

К какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2*. Напишите уравнение реакции, которую катализирует АлАТ.

3. Назовите место локализации АлАТ и АсАТ.

4. Что такое коэффициент де Ритиса, как его рассчитывают, что он характеризует.

Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность аминотрансфераз. Объясните причину.

6*.Назовите, какие еще ферменты изменяют свою активность при заболеваниях сердца; печени?

Практическая работа.

3.9. Определение активности кислой и щелочной фосфатаз в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать изоферменты, клинико-диагностическое значение определения фосфатаз в сыворотке крови;

- Уметь определять активность кислой щелочной фосфатазы в сыворотке крови;

Принцип метода: принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов, отщеплять неорганический фосфат от нитрофенил-фосфата в щелочной среде.

Реактивы.

Буфер, рН=10,4.
4-нитрофенилфосфат.
NaOH 0.4 ммоль/л
Сыворотка.

Оборудование.

ФЭК, кювета на 10 мм.
Термостат.
Пробирки – 2 шт.
Пипетки на 1 и 5 мл.
Дозатор 0,02 мл.

Ход определения.

Реактив.	Опыт.	Контроль.
Рабочий реактив.	1,0	1,0
Сыворотка.	0,02	-
Перемешать, проинкубировать в течение 20 минут при 300С в термостате.
NaOH	5,0	5,0

Перемешать и измерить оптическую плотность опыта (Д) против контроля в кюветах на 10 мм, при длине волны 405 нм.

Расчет результатов:

ЩФ, МЕ/л = Д * 812.

Нормальные величины: 30 –90 МЕ/л.

Диагностическое значение определения активности фосфатаз.

N составляет 0.5 – 1.3 ммоль/ч*л.

Увеличение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

механической желтуху
циррозе печени, холецистите, холестазе
рахите у детей
остеомаляции
болезни Педжета
миеломной болезни

Уменьшение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

гипотиреозе
старческий остеопороз
замедленном росте у детей
гиповитаминозе С
гипервитаминозе Д

КФ – представлена тремя разновидностями изоферментов:

1. простатический изофермент (локалзован в предстательной железе)

печеночный изофермент
эритроцитарный изофермент.

Наибольшее диагностическое значение имеет простатическая форма КФ.

N составляет 0.05-0.13 ммоль/ч*л.

Увеличение активности КФ в сыворотке крови наблюдается при:

простатите
раке предстательной железы
аденоме предстательной железы.
Метастазах
Множественной миеломе

Уменьшается активность сыворотке КФ при:

тромбоцитопениях

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение активности щелочной фосфатазы в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

К какому классу ферментов относятся фосфатазы?
Дайте определение понятию – изоферменты.
Назовите сколько изоферментов существует у кислой фосфатазы, чем они отличаются друг от друга.
Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность кислой; щелочной фосфатаз. Почему?
Какие еще ферменты изменяют свою активность при этих заболеваниях?

Раздел 6. Обмен липидов в норме и при патологии.

Значение изучаемой темы:

Липиды – это вещества, которые объединены в единый класс одним их свойством. Они не растворимы в воде. Роль липидов в организме весьма разнообразна. Одни из них служат формой депонирования (ТАГ) и транспорта (СЖК) веществ, при распаде которых высвобождается большое количество энергии, другие представляют собой важнейшие структурные компоненты клеточных мембран (Хс и ФЛ). Липиды участвуют в процессах терморегуляции, предохранении жизненно важных органов (почек) от механически воздействий (травм), потери белка, в создании эластичности кожных покровов, защите их от избыточного удаления влаги. Некоторые из липидов являются биологическими активными веществами, обладающими свойствами модуляторов гормонального влияния (простогландины) и витаминов (полиненасыщенные ЖК). Из холестерина образуются такие биологические вещества как стероидные гормоны, желчные кислоты, витамин Д. Именно с нарушением обмена холестерина связано такое распространенное заболевание как атеросклероз. Атеросклероз сопутствует ряду других патологий организма. Ожирение, желчно-каменная болезнь, липидозы являются заболеваниями, связанными с нарушением обмена липидов.

6.1. Методы исследования липидного обмена.

Методы определения холестерина и ТАГ, ЛП в сыворотке крови многочисленны; можно выделить химические, ферментативные и физико-химические методы.

Для оценки содержания ТАГ определяют глицерин, освободившийся после гидролиза ТАГ. Существуют два способа определения ТАГ в сыворотке крови – химический и ферментативный.

Химический метод – осуществляется в несколько этапов:

экстракция ТАГ, с использованием органических растворителей (метанол, этанол, изопропанол);
гидролиз ТАГ с образованием глицерина и жирных кислот, осуществляют с помощью этанольного раствора КОН;
окисление глицерина в формальдегид;
измерение образованного формальдегида.

Ферментативный метод – при этом не происходит освобождения глицерина из ФЛ и глюкозы, а только гидролиз ТАГ под действием специфических липаз. По сравнению с химическими ферментативный метод определения ТАГ обладает более высокой специфичностью и точностью, удобен для автоматизации.

Для определения ЛП обычно используют метод электрофореза, основанный на электрофоретической подвижности ЛП, он является наиболее достоверным. Электрофорез ЛП проводится на одной из поддерживающих сред: геле агарозы или бумаге. При электрофорезе ЛП сыворотки крови натощак, на электрофореграмме обнаруживают, как правило, три основных полосы с последовательно увеличивающейся подвижностью, соответствующие ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, если в сыворотке присутствовали хиломикроны они остаются на старте.

ЛП могут быть выделены путем метода ультрацентрифунирования в солевых растворах, который базируется на оценке плотности ЛП.

Для обнаружения ХМ и ЛПОНП существует метод наблюдения, основанный на том, что при 00 С в течение 18-24 ч ХМ поднимаются на поверхность образуя сливкообразный слой, ЛПОНП остаются во взвешенном состояние, что делает пробу мутной во всем объеме плазмы.

Широко используется турбидиметрический метод определения ЛПНП, основанный на образовании гепаринлипопротеинового комплекса, способного осаждаться без денатурации в присутствии хлорида кальция.

6.2. Преаналитический этап исследований обмена липидов.

Для исследования содержания фракций липидов обычно используют сыворотку крови.

Подготовка пациента:

взятие материала для исследования липидов проводится натощак, не менее чем через 12-14 часов после приема пищи;
время взятия биологического материала с 7 до 9 ч утра, доставка в лабораторию не позднее 10 ч утра;
исключение алкоголя должно быть не менее, чем за 24 часа до взятия биоматериала, что особенно важно для таких показателей как ТАГ, Хс, ЛПВП;
за неделю до взятия крови из диеты следует исключить жиры, за две недели – препараты, снижающие уровень липидов;
сдавливание сосудов при наложении жгута должно быть минимальным и не превышать 1 мин;
физическая и мышечная нагрузка, тренировки должны быть исключены как минимум за 3 дня до взятия крови;
для исключения влияния положения тела, обследуемый должен находится в покое, сидеть или лежать не менее 5 мин, в связи с изменением концентрации ряда компонентов при переходе пациента из горизонтального положения в вертикальное;
в качестве антикоагулянта при получении плазмы рекомендуется использовать ЭДТА;
отделение полученной плазмы проводят не позднее чем через 2 ч;
сыворотку и плазму можно хранить в закрытом сосуде в холодильнике в течение 5 дней, при –200С в течение 3 месяцев, повторное оттаивание и замораживание сыворотки не допускается.

Практическая работа

6.3. Определение ЛПНП в сыворотке крови

методом Бурштейна и Самая.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения содержания липидов и их фракций;

- Знать классификацию липопротеидов, диагностическое значение определения липопротеидов в сыворотке крови;

- Уметь определять содержание ЛПНП в предложенной сыворотке крови.

определения ферментов;

Принцип: раствор гепарина в присутствии ионов Са избирательно осаждает ЛПНП. Степень образования помутнения раствора, определяемая нефелометриески (ФЭКе), прямопропорциональна содержанию ЛПНП в сыворотке крови.

Реактивы:

0.02М раствор СаСI2.
Раствор гепарина (1000 ед/мл).
Сыворотка крови.
Дистиллированная вода

Оборудование:

Фотоколориметр.
Пипетки на 2 мл, 0.2 мл.
Дозаторы на 0.02 мл
Кюветы на 5 мм.
Стеклянная палочка.
Фильтровальная бумага.
Секундомер.

Ход определения:

В кювету ФЭКа с длиной оптического пути 5 мм поместите 2 мл СаСI2 и 0.2 мл сыворотки крови;
1. Перемешайте стеклянной палочкой;
2. Измерьте на ФЭКе, используя красный светофильтр, против дистиллированной воды, запишите показания ФЭКа - (Е1);
3. Затем в ту же кювету добавьте 0.04 мл раствора гепарина;
4. Одновременно включите секундомер и тщательно перемешайте раствор стеклянной палочкой;
5. Ровно через 4 минуты повторно проколориметрируйте - (Е2).

Расчет:

Расчет проводят по формуле: Х = (Е2 – Е1) * 10, где

Х – содержание ЛПНП в г/л.

Нормальные величины: 3.0 – 4.5 г/л.

Диагностическое значение определения ЛПНП:

Увеличение показателей пробы отмечается при: атеросклерозе, ожирении, сахарном диабете, гипотиреозе, липоидном нефрозе.

Характеристика липопротеидов.

Липопротеиды – это транспортные формы липидов и других гидрофобных соединений. ЛП – это сферические частицы с гидрофильной оболочкой, образованной фосфолипидным монослоем, апобелками и свободным холестерином, гидрофобным ядром, состоящим из эфиров холестерина и ТАГ. В крови присутствует 4 основных класса ЛП: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности и множество промежуточных форм.

Хиломикроны – наиболее крупные липопротеиды. Содержат 98-99 % липидов и 1-2 % белка. Они образуются в клетках слизистой оболочки кишечника и обеспечивают транспорт липидов из кишечника в лимфу, а затем в кровь. Хиломикроны распадаются под действием фермента липопротеидлипазы. Кровь содержащая большое количество хиломикронов называется хилезной.
Липопротеиды очень низкой плотности ЛПОНП (бетта-липопротеины)– 7 - 10 % белка, 90-93 % липидов. Они синтезируются в печени и содержат 56 % ТАГ и 15 % холестерина от общего количества липидов. Основное назначение – транспорт ТАГ из печени в кровь.
Липопротеиды низкой плотности ЛПНП (бетта-липопротеины) – количество белка 9-20 %, липидов 91-80 %. Среди липидов преобладают холестерин и ТАГ (до 40 %). Образуются в кровотоке из ЛПОНП под действием липопротеидлипазы. Основное их назначение – транспорт холестерина в клетки органов и тканей. Разрушаются в лизосомах клетки.
Липопротеиды высокой плотности ЛПВП (альфа-липопротеины) – белка 35-50 %, липидов 65-50 %. Липиды представлены холестерином и фосфолипидами. Это самые мелкие из липопротеидов. Образуются в печени в «незрелом виде» и содержат только фосфолипиды, затем поступают в клетки тканей и «забирают» холестерин из клетки. В «зрелом» виде поступают в печень, где разрушаются. Основное назначение – удаление избытка холестерина с поверхности клеток.

Изменение содержания липидов в крови называется дислипидемией. Эти изменения чаще всего выражаются в увеличении количества липопротеидов – гиперлипопротеидемия. Существует классификация гипрелипопротеинемий, согласно которой различают 5 классов ГЛП:

I тип – гиперхиломикронемия (ХМ)

IIа тип - гипер –в- липопротеинемия (ЛПНП)

IIб тип – гипер-в и гиперпре-в-липопротеинемия (ЛПНП) и (ЛПОНП)

III тип – дис-в-липопротеинемия (измененных ЛПНП)

IV тип – гипер-пре-в-липопротеинемия (ЛПОНП)

V тип - гипер-пре-в-липопротеинемия и гиперхиломикронемия - (ЛПОНП), (ХМ). Наиболее атерогенными являются II и III типы, так как приводят к накоплению в плазме крови холестеринсодержащих ЛП.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания липопротеидов в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Какая основная функция липопротеидов?

2* Каким методом можно разделить липопротеиды на фракции и по какому принципу? Приведите их классификацию.

Что такое хиломикроны? Где и как они образуются?
Что обозначает термин «хилезная» кровь?
Какие липопротеиды крови являются атерогенными (антиатерогенными)? Почему?

6*. Назовите биохимические причины и факторы риска для развития атеросклероза.

Практическая работа

6.4. Определение содержания ТАГ в сыворотке крови ферментативным методом.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать строение, синтез и распад ТАГ, диагностическое значение определения ТАГ в сыворотке крови;

- Уметь проводить определение ТАГ в предложенной сыворотке крови.

Принцип: триацилглицериды при воздействии ряда ферментов дают образование хинонимина. Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации ТАГ в пробе.

Реактивы:

Буферный раствор рН=7.5
Лиофилизат.
Стандартный раствор-2.85ммоль/л
Вода дистиллированная.
Сыворотка или плазма

Оборудование:

Пробирки – 3 шт.
Фотоколориметр.
Кюветы на 5 мм.
Пипетки на 2 мл,
Дозаторы на 0.02 мл.

Подготовка реактивов:

Растворите содержимое флакона 2 (лиофилизат) в 50 мл раствора 1 (буфер), выдержите при комнатной температуре 20-30 минут. Полученный реагент стабилен 30 дней при 2 - 4оС. реагент 3 готов к работе. Плотно закрывать флаконы сразу же после использования!

Ход определения:

Реактивы.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль. Мл
Сыворотка	0.02	-	-
Вода дист.	-	-	0.02
Рабочий реагент	2.0	2.0	2.0
Стандартный раствор	-	0.02	-

Реакционную смесь тщательно перемешивайте и инкубируйте при комнатной температуре не менее 5 минут. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против контрольной в кюветах с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 505 нм. Окраска стабильна не менее 1 часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет:

С = (Ео/Ест* 2.85) – 0.11 ммоль/л

Нормальные величины: 0.55 – 1.65 ммоль/л

Диагностическое значение определения ТАГ.

Триацилглицериды – сложные эфиры глицерина и высших жирных кислот. Нейтральный жир, поступающий с пищей, гидролизуются в просвете тонкого кишечника; продукты распада (глицерин и ВЖК) используются в клетках слизистой оболочки тонкого кишечника для ресинтеза ТАГ, которые включаются в состав хиломикронов.

Образующиеся в процессе липолиза жировой ткани свободные жирные кислоты используются в печени для биосинтеза триацилглицеридов, которые секретируются в кровяное русло в составе ЛПОНП. Если содержание ТАГ оказывается больше 5.6 ммоль/л, сыворотка становится мутной.

Для исследования используется сыворотка крови. Определение ТАГ в плазме крови необходимо проводить немедленно натощак (желательно не принимать пищу не менее 16 часов). Однако если сыворотку отделить от сгустка и заморозить, то исследование можно отсрочить.

Показатели нормы содержания ТАГ в плазме - 0.55 –1.65 ммоль/л. следует стремиться к тому, чтобы концентрация ТАГ в плазме крови была меньше 2.3 ммоль/л. Слабо выраженная гипертриглицеридемия отмечается при содержании ТАГ в крови 2.3 –5.6 ммоль/л, выраженная – при уровне ТАГ больше 5.6 ммоль/л.

Увеличение концентрации ТАГ отмечается при:

Хронической ишемической болезни сердца (вызванной атеросклеротическими изменениями в организме).
Вирусном гепатите.
Заболеваниях связанных с застоем желчи в печени, обтурацией желчных ходов и общего желчного протока.
Панкреатите.
Хронической почечной недостаточности, нефротическом
синдроме.
Подагре.
Снижении функции щитовидной железы.
Хроническом алкоголизме.
Лечении кортикостероидами, мочегонными, бета-блокаторами.

Снижение концентрации ТАГ отмечается при:

Гипертиреозе.
Синдроме мальабсорбции.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания ТАГ в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

ТАГ - строение, свойства, функции, локализация в организме.
Каковы особенности синтеза ТАГ в печени, мышцах, жировой ткани.
Каким образом ТАГ используется организмом человека.
Методы исследования ТАГ в организме человека.
Охарактеризуйте все этапы переваривания липидов в ЖКТ.
Дайте характеристику преаналитической стадии подготовки биоматериала для исследования липидов.

Практическая работа

6.5. Определение общего холестерина в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать строение, свойства, синтез, распад холестерина; клинико-диагностическое значение определения общего холестерина;

- Уметь определять содержание общего холестерина в предложенной сыворотке крови.

Принцип: при гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Реактивы:

Буферный раствор.
Лиофилизат.
Стандартный раствор холестерина – 5. 17 ммоль/л.
Сыворотка или плазма.
Дистиллированная вода.

Оборудование:

Фотоколориметр.
Кюветы с длиной оптического пути 5 мм.
Пробирки – 3 шт.
Пипетки на 2,0 мл
Дозатор на 0,02 мл

Подготовка реагентов:

Содержимое флакона 2, аккуратно перемешайте, растворите во флаконе 1. Выдержите рабочий реагент при комнатной температуре 20 минут. Реагент стабилен не менее 6 месяцев при 2 – 4оС.

Ход определения:

Реагенты.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0.02	-	-
Вода дист.	-	-	0.02
Реактив для определения холестерина	2.0	2.0	2.0
Раствор холестерина.	-	0.02	-

Реакционную смесь тщательно перемешайте и инкубируйте не менее 5 минут при комнатной температуре и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контроля в кюветах с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 500нм.

Расчет концентрации холестерина проводят по формуле:

С = Ео/Ест * 5.17 ммоль/л.

Нормальные величины:

идеальное содержание менее 5.2 ммоль/л.

допустимое 5.2 – 6.5 ммоль/л.

патологическое содержание более 6.5 ммоль/л.

Диагностическое значение определения общего холестерина.

Холестерин - это вторичный одноатомный ароматический спирт. Он обнаруживается во всех тканях и жидкостях человеческого организма, как в свободном состоянии, так и в виде сложных эфиров. У практически здоровых людей 2/3 холестерина плазмы содержится в составе атерогенных , 1/3 – антиатерогенных липопротеидов. Не менее 10% населения страдает гиперхолестеринемией. Это может привести к серьезным патологическим изменениям сосудистой стенки. Уровни содержания Хс и ТАГ в крови являются наиболее важными показателями липидного обмена. Существует прямая зависимость между увеличением концентрации Хс в плазме и появлением риска атеросклеротического поражения коронарных сосудов.

В норме уровень общего Хс колеблется в широких пределах – 3.6 – 6.7 ммоль/л, рекомендуемые значения – меньше 5.2 ммоль/л, повышенные – более 6.5 ммоль/л. Материалом для исследования является служит сыворотка или плазма.

Увеличение концентрации Хс в сыворотке отмечается при:

Первичных гиперлипопротеинемий (наследственно обусловленных нарушениях метаболизма)
Вторичных гиперлипопротеинемий – ишемическая болезнь, заболевания печени, поражения почек, снижение функции щитовидной железы, заболевания поджелудочной железы, сахарный диабетбеременность, алкоголизм, прием лекарств.

Уменьшение концентрации Хс в сыворотке отмечается при:

Голодании.
Злокачественных новообразований.
Болезнях печени (цирроз в позней стадии заболевания, острая дистрофия, инфекции).
Повышенной функции щитовидной железы.
Анемии

Использование теста целесообразно для исследования пациентов с ранними факторами риска атеросклероза, с заболеваниями сосудов и сердца, ксантомами, гиперурекемией, ожирением, людей, злоупотребляющих курением.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания общего холестерина в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Холестерин - строение, свойства, формы нахождения в организме.
Перечислите основные функции холестерина.
Напишите схему синтеза Хс в организме человека, укажите локализацию и ферменты процесса.
Роль Хс в развитии атеросклероза, ИБС.
Перечислите методы исследования Хс.
Диагностическое значение определения Хс в сыворотке крови

Практическая работа

6.6. Определение фракций холестерина в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать фракции холестерина их клинико-диагностическое значение, роль холестерина в развитии атеросклероза;

- Уметь определять содержание фракций холестерина в сыворотке крови.

Принцип: хиломикроны, ЛПОНП и ЛПНП осаждаются при добавлении к образцу фосфорно-вольфрамовой кислоты и ионов магния. После центрифугирования в супернатанте остаются только ЛПВП, концентрация которых определяется так же, как концентрация общего холестерина.

Реактивы:

Осаждающий реагент.
Сыворотка или плазма.
Дистиллированная вода.
Реагент для определения общего холестерина.

Оборудование:

Фотоколориметр.
Кюветы на 5 мм.
Центрифуга.
Пробирки – 6 шт.

5. Пипетки на 1 и 0.2 мл

Подготовка реактивов:

Реактивы готовы к работе. Если набор для определения концентрации общего холестерина используется для определения только ЛПВП-холестерина стандарт, входящий в состав набора лучше развести 0.9% хлоридом натрия в 4 раза. Концентрация холестерина в полученном растворе будет равна – 1.29 ммоль/л.

Ход определения:

Преципитация:

Реагенты	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0.15	-	-
Вода дист.	-	-	0.15
Осаждающий реагент	0.3	0.3	0.3
Раствор холестерина	-	0.15	-

Хорошо перемешайте и оставьте на 10 минут при комнатной температуре. Опытную пробу центрифугируйте 10 минут при 4000 об/мин. Прозрачный супернатант используйте для определения концентрации ЛПВП. Определите концентрацию холестерина во всех пробах в течение 1 часа.

Определение концентрации ЛПВП-холестерина:

Реагенты	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Супернатант	0.2	-	-
Вода+реагент 1	-	-	0.2
Рабочий реагент для определения холестерина	2.0	2.0	2.0
Раствор холестерина + реагент 1	-	0.2	-

Реакционную смесь перемешайте и инкубируйте 15 минут при комнатной температуре или 10 мин при 37о С и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной в кюветах на 5 мм при длине волны 500 нм.

Расчет концентрации ЛПВП:

С = Ео/Ест * 1.29, при разведении стандартного раствора, или

С = Ео/Ест * 5.17, при использовании исходного стандарта.

Нормальные величины:

Мужчины более 1.42 ммоль/л, женщины более 1.68 ммоль/л.

Расчет концентрации ЛПНП

С = (Общий холестерин)- (ЛПВП-холестерин)- (ТАГ/2.2)ммоль/л

Нормальные величины:

Менее 3.9 ммоль/л, патология более 4.9 ммоль/л.

Диагностическое значение определения фракций холестерина.

Хс – ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности, или альфа – холестерин. В организме осуществляет защитную, антиатерогенную функцию. Является критерием, отражающим состояние липидного обмена.

Уровень Хс-ЛПВП определяется как содержание холестерина сыворотки, оставшееся в сыворотке после осаждения из нее ЛПНП и ЛПОНП. Особенностью функционирования ЛПВП является то, что они осуществляют транспорт Хс от клеток сосудистой стенки, периферических органов в печень, где Хс превращается в желчные кислоты и выводится из организма.

Показатели нормы содержания Хс-ЛПВП в плазме крови составляют 0.9 –1.9 ммоль/л. Снижение концентрации Хс-ЛПВП до уровня 0.9 ммоль/л вызывает повышенный риск атеросклероза (уменьшение концентрации Хс-ЛПВП с 0.91 до 0.78 ммоль/л – сопровождается трехкратным повышением риска развития ИБС). Увеличение концентрации Хс-ЛПВП плазмы сопровождается усилением антиатерогенного влияния ЛПВП.

Повышение концентрации Хс-ЛПВП в плазме отмечается при:

большой регулярной физической активности;
влиянии некоторых лекарств, понижающих содержание общих липидов;
циррозе печени;
алкоголизме;
раке кишечника;

Снижение концентрации Хс-ЛПВП отмечается при:

атеросклерозе;
инфаркте миокарда;
сахарном диабете;
туберкулезе легких;
нефротическом синдроме;

Снижение уровня Хс-ЛПВП сопровождает факторы риска ИБС, к числу которых относят:

курение;
ожирение;
малоподвижный образ жизни;
гипертензию.

Хс-ЛПНП – холестерин липопротеинов низкой плотности или бета-холестерин. ЛПНП – основная транспортная форма Хс, переносящая его главным образом в виде эфиров Хс из печени в клетки органов и тканей.

В норме содержание Хс-ЛПНП в плазме ниже 3.5 ммоль/л, повышенные – 3.5 –4.0 ммоль/л, высокие - более 4.0 ммоль/л.

Увеличение концентрации Хс-ЛПНП в плазме отмечается при:

Ппрвичных гиперлипопротеинемий (наследственно обусловленных нарушениях метаболизма);
ожирении;
ишемической болезни сердца;
заболеваниях печени;
нефротическом синдроме
сахарном диабете;
гипотиреозе.

Уменьшение концентрации Хс-ЛПНП в сыворотке отмечается при:

голодании;
злокачественных новообразованиях;
гипертиреозе;
поражении ЦНС;
лихорадочных состояниях;
анемии;
заболевания легких;
обширных ожогах.

Для оценки фракций холестерина используют формулу Фривальда:

Хс-ЛПНП = общий Хс – (Хс-ЛПВП = ТАГ/2.2)

Для оценки соотношения атерогенных и антиатерогенных ЛП используют холестериновый коэффициент атерогенности (индекс атерогенности, ИА), рассчитываемый на основании формулы:

ИА = (Общий Хс – Хс-ЛПВП) / (Хс-ЛПВП)

Индекс атерогенности является идеальным у младенцев (не более 1), достигает примерно 2.5 у здоровых мужчин и 2.2 у здоровых женщин. У мужчин 40-60 лет без клинических проявлений атеросклероза этот коэффициент составляет 3-3.5, у лиц с ИБС – более 4, достигая нередко 5-6 единиц.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания фракций холестерина в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;

Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Хс- ЛПНП: строение, место образования, функции в организме.
Хс-ЛПВП: строение, место образования, функции в организме.
Метод определения Хс-ЛПВП.

4*Рассчитайте содержание Хс-ЛПНП и индекс атерогенности для исследуемого образца.

5. Перечислите клинические признаки гиперлипопротеидемии.

Раздел 7. Водно-минеральный обмен.

Значение изучаемой темы:

Вода обязательный спутник жизни: нет ни одного известного нам организма, который мог бы обходится без нее. Большое количество воды внутри и вне клеток указывает на необходимость ее для процессов жизнедеятельности организма. Функции клеток зависит от общего количества внутриклеточной и внеклеточной воды, от обводнения субклеточных структур, от водного микроокружения макромолекул. Нарушение водного баланса клеток организма приводит к тяжелым последствиям, вплоть до гибели организма.

С обменом воды тесно связан минеральный обмен. Минеральные вещества вместе с водой создают среду, в которой протекают все обменные процессы в клетках. С минеральными веществами связаны все биоэлектрические и электрофизиологические явления в организме. Минеральные вещества обеспечивают осмотическое давление. Нарушение минерального обмена приводит к тяжелым последствиям.

7.1. Методы исследования водно-минерального обмена.

Для определения натрия и калия в плазме и эритроцитах крови используют два основных метода, это:

1. Пламенная фотометрия.

Пламенная фотометрия представляет собой один из видов эмиссионного спектрального анализа, основанного на фотометрировании излучения элементов в пламени и позволяет определять их концентрацию с точностью до 2-4 %. Принцип метода заключается на способности ряда элементов испускать лучи света определенной длины волны в пламени газовой горелки. Натрий и калий способны интенсивно излучать свет в низкотемпературном пламени. Возникающее в пламени излучение определяемого элемента определяется посредством светофильтров от излучения других элементов и, попадая на фотоэлемент, вызывая фототок, интенсивность которого измеряется гальванометром. Натрий окрашивает пламя в ярко-желтый цвет. Калий – слабый красно-фиолетовый.

2. Ионометрический метод.

Метод ионометрического определения натрия и калия, состоит в измерении электрохимического потенциала ионоселективного электрода, погруженного в исследуемый раствор. Электрическая схема потенциометра включает в себя электрод сравнения (потенциал которого известен) и индикаторный (ионоселективный) электрод, потенциал которого измеряется. Значение потенциала индикаторного электрода позволяет судить об активности присутствующих в растворе ионов: калия, натрия, кальция.

Для определения других электролитов (кальция, хлоридов, магния, железа) обычно используют методы:

3. Колориметрический метод: основан на образовании цветных соединений электролитов с различными реактивами.

4. Титриметрический метод. Данный метод имеет основной недостаток - индикаторный переход не всегда удается зафиксировать точно.

5. Ферментативный колориметрический метод.

7.2. Преаналитический этап исследований водно-минерального обмена.

При исследовании минерального обмена необходимо соблюдать следующие условия:

Предпочтительным материалом для исследования является сыворотка крови, негемолизированная и не желтушная;
Кровь берется натощак, последний прием пищи перед взятием крови не менее, чем за 12 ч. Следует исключить физические нагрузки, прием алкоголя, продукты, содержащие исследуемые минеральные вещества;
Не менее, чем за 5 дней следует исключить препараты, содержащие железо, кальций и т.д.;
При заборе крови пациент находится в положении сидя или лежа, при повторных исследованиях следует соблюдать одно и то же положение тела;
Кровь собирают в неметаллическую и не стеклянную посуду, пластмассовые пробирки, избегая венозного стаза и гемолиза;
При транспортировки биоматериала следует избегать вибрации пробирок, длительное хранение цельной крови недопустимо;
При получении сыворотки кровь следует как можно быстрее отцентрифугировать, и отделить ее от сгустка и клеток крови;
В программе срочных анализов определение натрия и калия должно быть выполнено не позднее 30 мин с момента поступления.

Практическая работа.

7.3. Определение калия в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать функции и распределение минеральных веществ в организме, регуляцию натрия и калия в организме, клинико-диагностическое значение определения калия в сыворотке крови;

- Уметь определять содержание калия в сыворотке крови.

Принцип метода: ионы К+ в присутствии ионов свинца меди и нитрита образуют нерастворимый в воде осадок, который растворяют в смеси риванола и уксусной кислоты.

Оптическая плотность полученного раствора, прямопропорциональна количеству нитрит-ионов. Содержание калия находят используя постоянный коэффициент, рассчитанный исходя из соотношения нитрит-ионов и К+ в образовавшемся соединении.

Реактивы:

5% раствор ацетат натрия.
Смесь растворов 5% ацетат кальция и 5% ацетат свинца.
Нитрит натрия в смеси растворов ацетата меди и ацетата свинца.
0,5% раствор риванола
Ледяная уксусная кислота.
Дистиллированная вода.
сыворотка крови.

Оборудование:

Пробирки центрифужные
Стеклянные палочки.
Центрифуга.
ФЭК.
Кюветы на 10 мм.
Колба на 25 мл.
пипетки на1 мл, 2 мл.
Дозатор на 0,1 мл.

Ход определения:

В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл раствора ацетата натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,5 мл раствора №3. Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой, потирая о внутренние стенки пробирки в течение 5 минут. Оставляют на 1 час, после чего центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 1 мл ацетата натрия, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Аналогичное промывание осадка ацетатом натрия проводят до исчезновения голубизны осадка. Затем к осадку приливают 1 мл риванола и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь перемешивают и количественно переносят в колбу на 25 мл, и доводят до метки дистиллированной водой.

Колориметрируют при 540 нм в кювете на 10 мм против воды. Рассчитывают результат по формуле:

С, мг/% = Е * 36

Нормальные величины: в сыворотке – 14 – 24 мг/%

в эритроцитах – 310 – 440 мг/%

Клинико-диагностическое значение определения калия в сыворотке крови.

Калий – основной внутриклеточный катион. 98% калия находится в клетках. В основном калий содержится в мышцах и печени.

Суточная потребность составляет – 2.5 – 5.0 г. В течение суток поступает с пищей до 6г. Физиологическое значение:

Необходим для синтеза протеинов, АТФ, гликогена.
Принимает участие в формировании потенциала покоя, действия.
Активирует ряд ферментов.
Участвует в регуляции сердца, нервной системы, скелетной и гладкой мускулатуры (повышает тонус и силу сокращений).

В регуляции обмена калия участвует альдостерон, усиливающий его выделение с мочой.

В норме содержание калия в плазме крови составляет 3,6 – 5,4 ммоль/л. Снижение ее до уровня 3,5 ммоль/л приводит к тяжелым нарушениям в организме человека: слабости мышц, появлению вялых параличей, прекращению перистальтики кишечника, вздутию живота.

Увеличение концентрации калия в плазме выше 5,6 ммоль/л сопровождается ощущением «ползания мурашек», «одеревенения конечностей», нарушением ритма сердца. Может наступить остановка деятельности сердца, паралич дыхательных мышц.

Гиперкалиемия наблюдается при:

заболеваниях, сопровождающихся распадом клеточных элементов и чрезмерным высвобождением калия из клеток (обширный некроз, внутрисосудистый гемолиз, ожогах, опухолях, голодании, шоке);
уменьшении выделения калия почками (почечная недостаточность, болезнь Аддисона);

Гипокалиемия наблюдается при:

недостаточном поступлении этого элемента в организм (голодание, после хирургического вмешательства);
усиленном выведении с мочой, вследствие нарушения эндокринной системы (синдром Конна, Иценко-Кушинга);
усиленном выделении через кишечник при поражении ЖКТ (неукротимая рвота, понос).

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания калия в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Дайте определение понятиям: водно-минеральный обмен, минеральный обмен, гомеостаз.
Перечислите основные функции воды в организме.
Локализация натрия, калия в организме, их биологическое значение для организма.
Патология обмена калия и натрия.
Перечислите методы определения калия и натрия в организме.
Преаналитический этап исследования водно-минерального обмена.

Практическая работа

7.4. Определение хлоридов в сыворотке крови.

Цели занятия

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать классификацию минеральных веществ организма, клинико-диагностическое значение определения хлоридов в сыворотке крови;

- Уметь определять содержание хлоридов в сыворотке крови.

Принцип метода: в присутствии ионов хлора в кислой среде тиоцианат образует тиоцианат-ионы, образующие окрашенный комплекс с железом (+3). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации хлоид-ионов в пробе.

Реактивы.

Монореагент.
Стандартный раствор хлорид-ионов – 100 ммоль/л.
Сыворотка крови.

Оборудование.

ФЭК.
Кюветы на 5 мм.
Пипетки на 2,0 мл.
Дозатор 0,1 мл
Пробирки 3 шт.

Ход определения.

Реактивы.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка.	0,01	-	-
Монореагент.	2,0	2,0	2,0
Стандарт.	-	0,01	-

Реакционную смесь тщательно перемешивают и через 5 минут опытную и калибровочную пробу фотометрируют против контрольной в кюветах на 5 мм при длине волны 460 – 490 нм.

Расчет концентрации хлоридов проводят по формуле:

Хлорид (ммоль/л) = 100 * Еопыт/Екалибровки

Нормальные величины (сыворотка крови): 97 – 108 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение определения хлоридов в сыворотке крови.

Хлрид-ион – основной внеклеточный анион плазмы крови, компенсирующий влияние катионов. Присутствует в виде солей калия, натрия, кальция и магния. Вместе с перечисленными катионами анионы хлора являются наиболее важными осмотически активными ионами плазмы крови, лимфы, спиномозговой жидкости, клеточного содержимого.

Показатели нормы содержания хлорид-ионов в плазме крови составляют

95,0 – 110,0 ммоль/л.

Гиперхлоремия отмечается при:

Нарушении водного баланса (обезвоживании, гипервентиляции);
Заболеваниях почек (острая почечная недостаточность, нефропатия, воспалительные заболевания почек);
Нарушении функции сердечно-сосудистой системы.

Гипохлоремия отмечается при:

Пневмонии;
Тяжелых инфекционных заболеваниях;
Заболеваниях надпочечников (надпочечники продуцируют гормоны, которые контролируют баланс жидкости и электролитов в организме);
Усиленном потреблении воды, задержке ее в организме вследствие нарушения выделительной функции почек;
Повышенном выделении ионов хлора из организма (при избыточном потоотделении, поносе, длительной рвоте).

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания хлора в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Распределения воды в организме.
Суточная потребность в воде, источники, пути выведения.
Роль минеральных веществ в организме.
Характеристика хлоридов: локализация, биологическая роль.
Патология обмена хлора.

6*.Регуляция обмена натрия, калия, хлора.

Практическая работа

7.5. Определение кальция в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать функции кальция в организме, регуляцию кальция в организме, клинико-диагностическое значение определения кальция в сыворотке крови;

- Уметь определение содержания кальция в сыворотке крови.

Принцип метода: ионы кальция в кислой среде образуют с индикаторным реактивом Арсеназо-III комплекс синего цвета. Степень изменения окраски пропорциональна содержанию кальция и определяется фотометрически.

Реактивы.

Рабочий реактив с Арсеназо-III
Калибровочный раствор кальция 2,5 ммоль/л.
Сыворотка крови

Оборудование.

Пробирки 2 шт.
Пипетки на 2 мл.
Дозатор на 0.02 мл.
ФЭК.

Ход определения.

Реактивы	Проба, мл	Стандарт, мл
Сыворотка	0.02	-
Рабочий раствор	2,0	2,0
Стандартный раствор	-	0,02

Перемешивают и оставляют стоять на 2 минуты при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность пробы (Е1) и стандарта (Е2) против рабочего раствора, при длине волны 620 - 660 нм, в кювете на 5 мм.

Расчет проводят по формуле:

Кальций (ммоль/л)= 2.5 * Еопыта/Естандарта

Нормальные величины (сыворотка крови) – 2.25 – 2.75 ммоль/л

Предупреждение:

Лабораторная посуда, применяемая при определении кальция, должна быть совершенно чистой. После обычного мытья посуду следует поместить на ночь в 2% раствор Комплексона 3 в аммиачной воде, потом тщательно промыть дистиллированной водой и высушить.

Клинико-диагностическое значение определение кальция в сыворотке крови.

Кальций является внутриклеточным катионом, около 99% Са содержится в костях. Физиологически активным является ионизированный кальций, постоянно обнаруживаемый в плазме крови. Ионы кальция необходимы для передачи нервного импульса, поддержания мышечного сокращения, свертывания крови, контроля за протеканием некоторых ферментативных реакций.

В норме концентрация общего кальция в сыворотке крови составляет 2,0 – 2,8 ммоль/л.

Исследование сыворотки крови: посуда, используемая для выполнения анализа, должна быть изготовлена из материала, не содержащего ионов кальция. Взятие пробы необходимо производить натощак, а сыворотку быстро отделять от сгустка.

Гиперкальциемия наблюдается при:

Злокачественных новообразованиях;
Миеломе;
Гиперфункции паращитовидных желез;
Акромегалии, гигантизме (гиперсекреция в кровь соматотропина);
Передозировке витамина Д;
Остеолизе в результате метастазов, новообразований в костной ткани;

Гипокальциемия наблюдается при:

Гипофункции паращитовидных желез;
Хирургическом вмешательстве;
Недостатке витамины Д;
Переливании большого количества цитратной крови;
Хронической почечной недостаточности, нефрите;
Нарушении всасывания кальция в кишечнике;
Гипоальбуминемии.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания кальция в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Классификация минеральных веществ. Примеры.
К какой группе элементов относится кальций?
Какова биологическая роль кальция в организме?
Дайте характеристику гормонам, регулирующим обмен кальция в организме.

5*. Назовите основные заболевания, связанные с нарушением обмена кальция, объясните механизм.

Практическая работа

7.6. Определение фосфора в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать функции фосфора в организме, регуляцию фосфора в организме, клинико-диагностическое значение определения фосфора;

- Уметь определять содержание фосфора в сыворотке крови.

Принцип метода: неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую кислоту, которая реагирует с малахитовым зеленым с образованием комплекса зеленого цвета, стабилизированного в растворе наличием детергента. Оптическая плотность комплекса при 630 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в обазце.

Реактивы.

Детергент.
Краситель.
Калибровочный раствор фосфора – 3 ммоль/л
Сыворотка крови.

Оборудование.

Пробирки – 6 шт.
Пипетки 1, 2, 5 мл
Дозатор 0.2 и 0.5 мл
ФЭК, кюветы на 5 мм.

Ход анализа.

Реактивы.	Опытная проба, мл	Холостая проба, мл
Сывотротка	0.02	-
Детергент.	2,0	2,0
Краситель.	2,0	2,0

Пробы тщательно перемешивают и через 10 минут определяют оптическую плотность при длине волны 630 нм против холостой пробы в кювете с толщиной 5 мм. Окраска устойчива в течении 2 часов.

Расчет проводят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика:

Для построения калибровочного графика из калибровочного раствора и дистиллированной воды готовят следующие разведения:

№ пробирки	Калибровочный раствор фосфора,мл	Дистиллированная вода	Концентрация фосфора,мл
1	0.5	2.5	0.5
2	0.5	1.0	1.0
3	0.5	0.5	1.5
4	0.5	0	3.0

Нормальные величины: 0.8 – 1.6 ммоль/л (в плазме).

Клинико-диагностическое значение определения фосфора в сыворотке крови.

Фосфор – элемент, обмен которого тесно связан с метаболизмом кальция. Встречается главным образом в виде анионы РО-34. Принимает участие в обеспечении организма энергией. 80 – 85% фосфора входит в состав скелета, остальное количество распределено между тканями и жидкостями организма. Фосфор участвует в образовании нуклеиновых кислот, нуклеотидов, фосфолипидов.

В норме содержание неорганического фосфора в сыворотке крови составляет 0,65 – 1,3 ммоль/л.

Повышение концентрации неорганического фосфора – гиперфосфоемия - наблюдается при:

почечной недостаточности;
гипопаратиреозе;
гипервитаминозе Д;
опухоли костей, остеолизисе;
болезни Педжета.

Снижение концентрации неорганического фосфора – гипофосфоемия - наблюдается при:

гиперпаратиреозе;
гипотиреозе;
гиповитаминозе Д;
рахите;
голодании, хроническом алкоголизме;
использовании мочегонных средств

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания фосфора в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

К какой группе элементов относится фосфор?
Какова биологическая роль фосфора в организме?
Дайте характеристику гормонам, регулирующим обмен фосфора в организме.

4*. Дайте характеристику основным заболеваниям, связанным с нарушением обмена фосфора (болезнь Педжета, остеопороз, остеомаляция, рахит).

Практическая работа

7.7. Определение магния в сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать функции магния в организме, клинико-диагностическое значение определения магния в сыворотке крови;

- Уметь определить содержание магния в сыворотке крови.

Принцип метода: в щелочной среде Магон реагирует с ионами магния с образованием комплекса красного цвета оптическая плотность которого прямопропорциональна содержанию ионов магния в исследуемом материале.

Реактивы.

Магон – 3,5 ммоль/л.
Буфер.
Эталонный раствор магния – 8,23 ммоль/л
Сыворотка.
Дистиллированная вода.

Оборудование.

Пробирки – 3 шт.
Пипетки на 2 мл
Дозатор на 0.02 мл
ФЭК.
Кюветы на 5мм.

Подготовка реактивов:

Раствор 1 – содержимое одной ампулы с реактивом 1 количественно растворяют в 50 мл реактива 2. раствор можно употреблять лишь через 30 минут после приготовления. Реактив устойчив при 2-8 0С 1 неделю.

Раствор 2 – реактив 3 точно разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 9, раствор содержит 0,823 ммоль/л. реактив устойчив 1 месяц при комнатной температуре.

Ход определения.

Реактивы.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка.	0,02	-	-
Раствор 1	2,0	2,0	2,0
Раствор 2	-	0,02	-
Дистиллированная вода	-	-	0,02

Перемешиваем и оставляем при комнатной температуре на 15 минут. Затем измеряем оптическую плотность опыта (Д1) и калибровки (Д2) против контрольного раствора при 490-520 нм в кюветах на 5 мм. Расчет результатов:

С магния, ммоль/л = 0,823 * Д1 / Д2.

Нормальные величины: 0,7 – 1,07 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения магния в сыворотке крови.

Магний – внутриклеточный катион, 1/3 его сосредоточена в костях, зубах, мышцах. Среднесуточное поступление с пищей составляет 300 – 400 мг.

Физиологическое значение:

Входит в состав почти 300 ферментных комплексов.
Способствует синтезу протеинов.
В комплексе с фосфолипидами входит в состав клеточных мембран, фиксирует их, снижает проницаемость.
Регулирует нервно-мышечную возбудимость и работу сердца

Концентрация в плазме в норме составляет – 0.8 – 1.5 ммоль/л.

Гипермагнемия сопровождается появлением сонливости, угнетением дыхательного центра, нарушения проводимости миокарда, блокады и остановки сердца; отмечается при:

Почечной недостаточнсоти;
Гипотиреозе.;
Остром диабетическом ацидозе;
Бронхиальной астме.болезни Аддисона;
Обезвоживании.

Гипомагнемия проявляется обезвоживанием артерий, нарушением свертываемости крови, повышению артериального давления, снижению микроциркуляции в капиллярах. Дефицит магния вызывает нарушение всех энергозависимых процессов, уменьшение синтеза белков; отмечается при:

Голодании;
Беременности (2 и 3 триместры);
Онкологических заболеваниях;
Остром и хроническом панкреатитах;
Циррозе печени;
Сердечно-сосудистой недостаточности;
Рахите;
Гастроэнтерите;
Эндокринных нарушениях (гиперфункции щитовидной железы, гипофункции паращитовидных желез, сахарном диабете).

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания магния в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

К какой группе элементов относится магний?
Перечислите основные функции, которые выполняет магний в организме.
Патология обмена магния, как она проявляется, чем сопровождается?

Практическая работа

7.8. Определение железа в сыворотке крови.

Цели занятия

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать функции железа в организме, клинико-диагностическое значение определения железа в сыворотке крови;

- Уметь определять содержание железа в сыворотке крови.

Принцип метода: железо освобождается из железо-связывающих белков сыворотки крови и восстанавливается при действии кислого рабочего раствора, содержащего восстановитель и детергент. Затем, после добавления буфера для создания в реакционной смеси необходимого рН (4,5 –4,8) и феррозина, образуется устойчивый окрашенный комплекс, оптическая плотность которого при 570 нм пропорциональна концентрации железа.

Реакивы.

Рабочий раствор.
Буфер.
Раствор феррозина 30 г/л
Калибровочный раствор железа – 89 мкмоль/л
Сыворотка

Оборудование.

Пробирки – 3 шт.
Пипетки 5 и 1 мл
Дозатор на 0.02 мл
ФЭК.
Кюветы на 10 мм.

Ход определения.

Реактивы.	Холостая проба, мл	Калибровочная проба, мл	Опытная проба. мл
Калибровочный раствор железа	-	0.2	-
Рабочий раствор	2.5	2,5	2,5
Сыворотка	-	-	0,5
Вода дистиллированная	0,5	0,3	-
Содержимое пробирок перемешиваем и выдерживаем 25 минут.
Буфер	0,5	0,5	0,5
Перемешиваем и измеряем оптическую плотность опытной пробы против воды при 560 нм, (Д1)
Раствор феррозина	0,02	0,02	0,02

Перемешивают и выдерживают 10 минут, измеряют оптическую плотность опытной (Д2) и калибровочной проб (Дк) при 560 нм против холостой в кювете на 1 см.

Расчет колическтва железа проводят по формуле:

С = 35,8 * (Д2 – Д1) / Дкалибровки.

Нормальные величины: 10 – 27 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения железа в сыворотке крови.

Железо относится к внутриклеточным микроэлементам. Является постоянной составной частью гема гемоглобина и окислительно-восстановительных ферментов. Некоторое количество железа постоянно обнаруживается в плазме крови в виде комплекса с белком – трансферрином. Входит в состав ферритина.

В норме концентрация сывороточного железа у мужчин составляет 14,3 – 25,1 мкмоль/л, у женщин – 10,7 – 21,5 мкмоль/л.

Увеличение содержания сывороточного железа происходит при:

Гемолитических анемиях;
Гипопластических и апопластических анемиях, талассемиях, В12-дефицитных анемиях;
Передозировке препаратов железа
Вирусном непатите и других поражениях печени (остром гепатите, остром некрозе печени – повышение концентрации пропорционально степени некроза, хроническом холецистите).

Уменьшение концентрации железа в сыворотке крови отмечается при:

Железодефицитных анемиях вследствие недостатка поступления железа в организм или заболеваний ЖКТ;
Анемиях, связанных с перераспределением железа в организме (при воспалении, гнойной инфекции, ревматизме, инфаркте миокарда);
Хронической почечной недостаточности;
Нефротическом синдроме;
Беременности;
Кровотечении;
Дефиците витамина С.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение содержания железа в предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

К какой группе элементов относится железо?
1. Какие функции выполняет железо в организме?
2. Перечислите основные ферменты и белки, в которые входит железо.

4*. Опишите основной обмен железа в организме.

5*. Патология обмена железа, как она проявляется, чем сопровождается?

Практическая работа

Определение железо-связывающей способности сыворотке крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови;

- Знать транспорт железа в организме, клинико-диагностическое значение определения ОЖСС сыворотки крови.

- Уметь определять железо-связывающую способность сыворотки крови .

Принцип метода: в щелочных условиях к сыворотке добавляется избыток ионов железа, которые специфически связываются с белками сыворотки. При добавлении феррозина образуется окрашенный комплекс, с максимумом поглощения при 560 нм, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации оставшегося несвязанного железа. Разница между добавленным к сыворотке известным количеством железа и определенным в виде железоферрозинового комплекса соответствует железосвязывающей способности сыворотки (ЖСС).

Общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) определяется как сумма ЖСС и количество железа в сыворотке.

Реактивы.

Калибровочный раствор железа – 89,5 мкмоль/л
Буфер
Раствор феррозина.
Сыворотка.

Оборудование.

Пробирки – 2 шт.
Пипетки 5 и 1 мл
Дозатор на 0.02 мл
ФЭК, кюветы на 1 см.
Термостат.

Ход определения.

Реактивы.	Калибровка, мл	Опыт, мл
Буфер.	2,5	2,5
Сыворотка.	-	0,5
Вода дистиллированная	0,5	-
Калибровочный раствор железа	0,5	0,5
Перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (Д1) при 560 нм против воды.
Раствор феррозина	0,02	0,02
Тщательно перемешивают, выдерживают 10 мин при 370 С и измеряют оптическую плотность опытной (Д2) и калибровочной (Дкалибр) пробы при 560 нм против воды в кюветах на 10 мм.

Расчет ЖСС проводят по формуле:

ЖСС = 89,5 *(Дкалиб – Д2 + Д1) / Дкалиб

Нормальные величины:

Мужчины – 45 – 75 мкмоль/л

Женщины – 40 – 67 мкмоль/л

Клинико-диагностическое значение определения ЖСС.

Железо транспортируется в виде комплекса с металлсвязывающим глобулином – трансферрином. Обычно этот белок переносит такое количество железа, которое соответствует 1/4 -1/3 максимальной способности трансферрина к связыванию этого иона. Поэтому в норме процент насыщения железом трансферрина составляет 25 –30%.

ОЖСС повышается при:

железодефицитной анемии;
приеме контрацептивов;
в поздние сроки беременности;
нередко у детей;
гепатитах.

ОЖСС снижается при:

уменьшении содержания общего белка в плазме крови (нефротический синдром, голодание, рак);
хронических инфекциях;
талассемии.

О запасах железа в организме можно судить по определению в плазме крови ферритина. Концентрация ферритина плазмы крови 1 мкг/л соответствует содержанию 8 мг железа в организме.

Нормальные величины концентрации ферритина в сыворотке крови (мкг/л):

у новорожденных – 25 –200;

6 месяцев – 12 лет – 7 – 140;

взрослых мужчин – 15- 200;

взрослых женщин – 12 –150.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение ЖСС предложенной сыворотке;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Назовите белок, транспортирующий железо по крови.
1. Где находится депо железа в организме, в каком виде железо депонируется там?
2. Назовите основные патологические состояния, связанные с нарушением ЖСС.

Раздел 8. Кислотно-основное состояние организма.

Значение изучаемой темы:

Среди физико-химических показателей организма важнейшее место принадлежит кислотно-основному равновесию крови. От соотношения концентрации ионов водорода и ионов ОН- крови зависит активность ферментов. Интенсивность окислительно-восстановительных реакций, процессы расщепления и синтеза белка, окисления углеводов и липидов, чувствительность клеточных рецепторов к медиаторам и гормонам, проницаемость клеточных мембран, физико-химические свойства коллоидных систем клеток и межклеточных структур.

Пределы изменения рН крови являются жизненно важными и наиболее жесткими из всех известных гомеостатических показателей. Даже небольшие их отклонение влекут за собой нарушения жизненно важных физиологических процессов.

Методы исследования КОС.

Исследования кислотно-основного равновесия крови проводят на специальных газоанализаторах, которые прямым методом измеряют рН (потенциометрия) и рСО2 (полярография), а также температуру и барометрическое давление. Затем автоматически проводятся расчет остальных показателей КОР.

Для оценки и правильной диагностики нарушений КОР крови существуют специальные номограммы. В номограммах указана область нормальных значений КОР крови, острых или хронических метаболических и респираторных нарушений. При нанесении полученного анализа на такую номограмму можно четко определить, какое нарушение КОР имеется у больного и правильно выбрать метод его коррекции.

8.2. Преаналитический этап исследований КОС.

Для исследования КОР идеальным материалом является артериальная кровь, которую обычно берут из лучевой, локтевой, бедренной артерий стеклянным или пластиковым шприцом.

Время взятия крови с 7 до 9 ч, натощак, исключая физическую активность за 3 дня до исследования;
За 5 минут до взятия крови обследуемый находится в покое, взятие проводят в одном положении – сидя или лежа;
Время наложения жгута не превышает 1 мин;
Основное требование к получению материала – взятие в анаэробных условиях, отсутствие пузырьков воздуха в шприце, выбор адекватного антикоагулянта без его избытка (гепарин);
Исследование крови после забора должно быть выполнено не позднее чем через 5-10 мин, если исследование не может быть выполнено в указанные сроки, закупоренный шприц помещают в воду с кусочками льда, не более чем на 1 час;
Перед исследованием шприц с кровью извлекают из ледяной бани и выдерживают при комнатной температуре не менее 10 мин;
Перед измерением кровь перемешивают путем вращения шприца между ладонями и переворачиванием его вверх и вниз;
У пациентов в критическом состоянии анализ выполняют немедленно.

Практическая работа

8.4. Определение буферной емкости сыворотки крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения кислотно-основного состояния крови;

- Знать буферные системы: определение, типы, механизм действия, значение для организма;

- Уметь определять буферную емкость предложенной сыворотки крови.

Реактивы:

вода дистиллированная;
физиологический раствор;
фосфатный буфер рН-7,4;
гидрооксид натрия рН=9;
сыворотка.

Оборудование:

бюретка для титрования;
колбы –2 шт;
воронка;
химический стакан.

Ход работы.

Возьмите две колбы, в одну налейте 2 мл сыворотки крови, разведенной в 10 раз, во вторую – 2 мл фосфатного буфера рН=7,4, разведенного в 10 раз водой;
Добавьте в обе колбы по 2 капли индикатора фенолофталеина;
Оттитруйте содержимое обеих колб 0,1н NaOH до появления малиновой окраски (рН-9,0).

Расчет проводят по формуле:

Буферная емкость = А*10*н / (рН1 – рН0)*2, где

А – мл щелочи, пошедшей на титрование;

10 – разведение сыворотки;

н – молярная масса эквивалента щелочи;

рН0 – водородный показатель до начала титрования (рН=7.4)

рН1 – водородный показатель после окончании титрования (рН1=9);

2 – объем взятой сыворотки.

Сравните буферную емкость сыворотки крови с буферной емкостью фосфатного буфера и сделайте соответствующие выводы.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение буферной емкости предложенной сыворотки;
Оцените полученные результаты;
Заполните бланки анализа;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Что называют «буферными системами»? их биологическое значение. Примеры.
1. Какие буферные системы находятся в крови человека? Напишите их формулы.
2. Какие показатели характеризуют кислотно-основное состояние в организме человека?
3. Что называют: а) метаболическим ацидозом? б) респираторным ацидозом? в) метаболическим алкалозом? г) респираторным алкалозом? Приведите примеры заболеваний с нарушением КОС.

Раздел 9. Гемостаз.

Значение изучаемой темы:

Данный раздел является актуальным и клинически значимым, так как нарушения свертывания крови наблюдаются довольно часто: при острых лейкозах, некоторых видах анемий, циррозе печени, гемофилиях, недостаточности витамина К и при многих других состояниях и заболеваниях, отягощая их течение. Знание этой темы важно и для лаборантов клинических и биохимических лабораторий, так как именно они проводят основные исследования показателей гемостаза.

9.1. Методы исследования гемостаза.

Методы исследования коагуляционного гемостаза значительно различаются по принципу исследования и возможностям визуальной и автоматизированной оценки результатов. Современная аппаратура для исследования свертывания крови основана, как правило, на 4 основных методах.

1. Турбидиметрический метод.

Образование фибрина под действием тромбина проявляется повышением мутности исследуемого образца, что детектируется фотометром.

2. Кинетический метод.

Конечный результат определяется по скорости изменения оптической плотности. Исследуемая плазма инкубируется с ферментом, и остаточная ферментативная активность определяется в реакции с хромогенными субстратами. Концентрация исследуемого вещества прямо или косвенно пропорциональна скорости гидролиза субстрата и выражается средним изменением плотности в минуту.

3. Метод конечной точки.

В этом методе гидролиз хромогенного субстрата останавливается уксусной кислотой. В момент такой остановки оптическая плотность пропорциональна концентрации исследуемого вещества и выражается в единицах экстинции.

4. Метод фиксированной оптической плотности.

Тромбин, участвуя в реакции гидролиза субстрата, обуславливает изменение цвета исследуемого образца. Результатом является время между началом исследования и моментом, когда оптическая плотность образца достигает 0,1 единицы оптической плотности.

9.2. Преаналитический этап исследований гемостаза.

Для исследования системы гемостаза в биохимических исследованиях используют плазму, получаемую из венозной крови.

Подготовка обследуемых:

Забор крови делают утром с 8 до 10 часов и натощак.
Исключить физическое перенапряжение и эмоциональное возбуждение (дать обследуемому 15 минут отдохнуть).
Исключить курение и прием алкоголя непосредственно перед обследованием.
Первые 5-6 капель выпускают на ватный тампон, т.к. они могут содержать тканевой тромбопластин.
До центрифугирования пробирки ставят в ледяную баню (кроме исследования функции тромбоцитов).
Интервал времени между забором крови и исследованием существенно сказывается на многих параметрах коагулограммы (1-3 часа), поэтому в результатах анализа указываю время забора крови и начала исследования.
Пробирки лучше использовать стеклянные силиконированные (для уменьшения контактной активации гемостаза) или пластиковые.
Если гематокритный показатель близок к нормальному (40 - 45 %), то соотношение крови и антикоагулянта должно составлять 9 : 1. Если гематокрит не в норме, то соотношение расчитываю по формуле:

РX = Р (100 – Н) : (595 – Н), мл.

Р – нужное количество крови.

Н – гематокритный показатель в %.

Взятие крови целесообразно проводить не в одну пробирку, а дробно – в несколько пробирок с соответствующей расфосовкой антикоагулянта – стабилизатора.
В качестве антикоагулянта используют 3,8 % раствор цитрата натрия или тринатрийцитрата, т.к. в цитратной крови (плазме) лучше сохраняются лабильные факторы свертывания крови и тромбоциты.
Ацетилсалициловая кислота, нестероидные противовоспалительные средства, пенициллин, стрептокиназа, урокиназа увеличивают время кровотечения.

Получение биологического материала для гематологических исследований.

Получение стабилизированной крови.

В пробирку набирают антикоагулянт и кровь в рассчитанном соотношении. Немедленно перемешивают, не допуская образования воздушных пузырей. Ставят пробирку до центрифугирования в ледяную баню.

Получение плазмы крови богатой тромбоцитами (тромбоцитарная).

Стабилизированную кровь центрифугируют при 1000 – 1500 об/мин в течении 5-7 минут и собирают супернатант.

Получение плазмы крови бедной тромбоцитами (бестромбоцитарной).

Стабилизированную кровь или тромбоцитарную плазму центрифугируют при 300 – 4000 об/мин в течении 15-20 минут и собирают супернатант.

Тромбоцитарную и бестромбоцитарную плазму отсасывают стеклянными силиконированными или пластиковыми пипетками в стеклянные силиконированные или пластиковые пробирки. До исследования плазму хранят в ледяной бане. Исследования должны быть проведены в течении 1-3 часов после взятия крови. Для исследования функциональной активности тромбоцитов их хранят при комнатной температуре.

Практическая работа

9.3. Определение активности факторов протромбинового комплекса.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать определение гемостаза, виды и структурные компоненты гемостаза.

- Уметь определить активность факторов протромбинового комплекса (протромбиновое время и протромбиновый индекс) в исследуемой плазме.

Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы в присутствии оптимального количества кальция и избытка тромбопластина.

Это вариант определения времени рекальцификации плазмы с добавлением тканевого тромбопластина. В комплексе с фактором VII и Са он непосредственно активирует фактор X, так что результаты теста зависят от активности фактора VII и факторов включающихся в процесс свертывания крови на этапах тромбино- и фибринообразования (факторов II, V, VII).

Реактивы: Оборудование:

Раствор тромбопластина - 1%. 1. Термостат на 37 0С;
Раствор хлорида кальция – 0,025М; 2. Пробирки;
Хлорид натрия – 0,85%; 3. Дозаторы на 0,1 и 0,2 мл;
Плазма крови бедная тромбоцитами. 4. Секундомер.

Ход определения:

Приготовить свежий раствор тромбопластина, для этого 50 мг тромбопластина помещают в центрифужную пробирку тщательно растирают с 5 мл воды до получения однородной суспензии, которую прогревают 30 мин на водяной бане, периодически перемешивая, затем центрифугируют 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой в сухую пробирку и используют для реакции. Суспензию тромбопластина готовят каждый раз перед реакцией;
Плазму разводят 0,85 % хлорида натрия в соотношении 1:1;
В пробирку приливают 0.2 мл CaCI2 и 0.1 мл суспензии тромбопластина;
Помещают пробирку в термостат при 370С на 30 секунд;
Затем добавляют 0.1 мл разведенной плазмы, немедленно включают секундомер;
Через каждые 15 секунд наклоняют пробирку на 45 градусов и отмечают появление нитей или сгустка фибрина.

Протромбиновая активность может выражаться в процентах по отношению к здоровому человеку-донору, тогда называется – протромбиновым индексом.

Протромбиновый индекс = (протромбиновое время здорового человека / протромбиновое время обследуемого) * 100%

В норме протромбиновое время 12-20 с;

протромбиновый индекс - 80-100%.

Клиническое значение:

Протромбиновое время характеризует механизм образования тромбокиназы (II фазу свертывания).

Удлинение протромбинового времени (снижение протромбинового индекса) наблюдается при врожденной или приобретенной недостаточности факторов, отражающих функционирование внешнего механизма образования протромбокиназы, ее действие на протромбин и посдующее образование фибрина (I, II, V, VII, X). Обычно оно отмечается у больных принимающих антикоагулянты, при тяжелых поражениях паренхимы печени и недостатке витамина К(механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, кишечный дисбактериоз).

Задание для самостоятельной работы:

Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения активности факторов протромбинового комплекса.
Выполните практическую работу.
Заполните бланк анализа.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Кто является основоположником теории гемостаза?
Дать определение термину – гемостаз.
Назовите структурные компоненты системы гемостаза.
Дать характеристику первичному гемостазу.
Дать характеристику вторичному гемостазу.

6*. При участии, какого типа гемостаза происходит остановка кровотечения после прокола пальца скарификатором?

7. Сравните первичный и вторичный гемостаз, найдите основные отличия, оформите их в виде таблицы.

8. Опишите преаналитический этап исследования системы гемостаза.

Практическая работа

9.4. Определение содержание фибриногена гравиметрическим методом.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать характеристику коагуляционного гемостаза, классификацию и характеристика факторов свертывания, фазы свертывания крови.

- Уметь определять содержание фибриногена в исследуемой плазме.

Принцип: количество образовавшегося фибрина эквивалентно содержанию фибриногена в плазме.

Реактивы:

1. Раствор хлорида кальция – 5 %

2. Раствор тромбопластина – 1%

3. Плазма крови.

Оборудование:

Серологические пробирки.
Стеклянная палочка.
Секундомер.
Пипетки на 1 мл.
Дозатор на 0,1 мл.
Фильтры.
Весы торсионные.

Ход определения:

1 мл плазмы без признаков гемолиза помещают в серологическую пробирку,
- Прибавляют 0.1 мл хлорида кальция и 0,1 мл тромбопластина.
- Содержимое перемешивают стеклянной палочкой, которую оставляют в плазме, включают секундомер и регистрируют время свертывания крови. В норме оно составляет 7-15 минут.
- Образовавшийся фибрин наматывают на стеклянную палочку при помощи фильтра. Фибрин снимают со стеклянной палочки и отжимают сыворотку, перемещая сгусток по фильтру при помощи стеклянной палочки. Так делают до тех пор, пока в проходящем свете на бумаге не исчезнут следы влаги.
- Высушенный фибрин немедленно взвешивают на торсионных весах.

В норме вес сгустка 9 - 15 мг или 2-4 г/л.

Для пересчета фибриногена в г/л вес сгустка умножают на 0.25

Клиническое значение:

Увеличение содержания фибриногена наблюдается при

воспалительных процессах;
злокачественных новообразованиях;
туберкулезе.

Уменьшение содержания фибриногена наблюдается при

паренхиматозных состояниях печени;
после оперативного вмешательства;
при ДВС-синдроме.

Задание для самостоятельной работы:

Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения фибриногена в плазме крови.
Выполните практическую работу.
Заполните бланк анализа.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Назовите основные структурные компоненты вторичного гемостаза.
Что такое факторы свертывания крови, их классификация?
Дайте характеристику плазменным факторам свертывания крови.
Дайте характеристику клеточным факторам свертывания крови.
Дайте характеристику тканевым факторам свертывания крови.
Дайте подробную характеристику Ф.I, II, IV, X, XII, XIII, Ф. 3, 8.

4*. Поэтапно опишите образование фибрина из фибриногена.

Практическая работа №

9.5. Определение времени рекальцификации плазмы крови.

Цели занятия

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать внутренний и внешний механизмы свертывания крови, фазы свертывания крови.

- Уметь определять время рекальцификации плазмы крови.

Принцип: определяют время свертывания плазмы при добавлении к ней оптимального количества хлорида кальция.

Реактивы:

0.025М раствор хлорида кальция
0.85% раствор хлорида натрия
Плазма крови тромбоцитарная.

Оборудование:

Серологические пробирки.
Секундомер.
Термостат водяной на 37 0С.
Дозаторы на 0,1 мл и 0,2 мл

Ход определения:

В чистую пробирку вносят 0.2 мл хлорида кальция и 0.1 мл хлорида натрия;
- Пробирку помещают в термостат при 37 градусах на 60 секунд;
- Затем добавляют 0.1 мл плазмы, одновременно включая секундомер;
- Определяют время свертывания плазмы.
- Определение проводят 3 раза.

В норме свертывание плазмы происходит на 60-120 с.

Клиническое значение:

Удлииение времени рекальцификации указывает на гипокоагуляцию, наблюдается при

тромбоцитопении.
Тромбоцитопатия с недостаточностью ф.3
Наличии в крови ингибиторов свертывания крови
ДВС-синдроме (III фаза)
Врожденной недостаточностью плазменных факторов свертывания

Укорочение времени рекальцификации плазмы указывает на гиперкоагуляцию.

Задание для самостоятельной работы:

Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения времени рекальцификации плазмы крови.
Выполните практическую работу.
Заполните бланк анализа.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

1. Дайте характеристику внутреннему механизму свертывания крови (с чего начинается, длительность и конечные продукты каждой фазы, для каких повреждений характерно).

2. Дайте характеристику внешнему механизму свертывания крови (с чего начинается, длительность и конечные продукты каждой фазы, для каких повреждений характерно).

3. Сравните сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, внешний и внутренний механизм свертывания крови, найдите основные отличия, оформите их в виде таблицы.

4. Дайте определение следующим понятиям: гемостаз, адгезия, агрегация, факторы свертывания крови, гемокоагуляция, фибриноген, ретракция, фибриназа, прокоагулянты, тромбин.

Практическая работа

9.6. Определение толерантности плазмы к гепарину.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать характеристику противосвертывающей системы крови, виды и структурные компоненты, фибринолиз.

- Уметь проводить определение толерантности плазмы к гепарину.

Принцип: внесение в плазму определенной концентрации гепарина изменяет ее рекальцификацию в зависимости от коагуляционной и антикоагуляционной активности крови. Если после введения гепарина резко увеличивается время образования сгустка, значит, толерантность плазмы к гепарину резко понижена, и наоборот, если гепарин после его внесения в исследуемую плазму замедляет свертывание плазмы незначительно, толерантность плазмы к гепарину повышена.

Реактивы:

1. 0.025 М раствор хлорида кальция

2. раствор гепарина 5000 МЕ в 1 мл

3. гепарин-кальцевая смесь

4. цитратная плазма без следов гемолиза

Оборудование:

Серологические пробирки.
Секундомер.
Термостат водяной.
Дозаторы на 0,1 мл, 0,2 мл, 0,05 мл
Колба на 250 мл

Ход определения:

Приготовление гепарин-кальциевой смеси – 0,05 мл раствора гепарина добавляют к 250 мл 0,025М хлорида кальция (устойчивость 14 дней, при – 4 0С);
В агглютинационную пробирку помещают 0.2 мл исследуемой плазмы;
Пробирку помещают в водяную баню при 37 С, на 60 с;
Затем добавляют 0.2 мл гепарин-кальциевой смеси, одновременно включают секундомер.
По истечении 2 минут через каждые 30 секунд проверяют, произошло ли свертывание путем наклона пробирок на 50-60 градусов. В момент появления сгустка секундомер выключают и определяют время свертывания.

В норме толерантность плазмы к гепарину составляет 11-16 мин.

Клиническое значение:

Изменения показателей теста ценны для суждения о взаимодействии коагуляционного и антикоагуляционного механизмов свертывания крови.

Снижение толерантности плазмы к гепарину до 20 мин отмечается при:

любом дефиците факторов коагуляции
тромбоцитопении
повышении антикоагуляционной активности при введении гепарина

Повышение толерантности плазмы к гепарину до 1-9 мин отмечается при:

циркуляции в крови тканевого тромбопластина связывающего гепарин (вследсвии оперативных вмешательств, токсикозов беременных, патологических родах, гемолиза)
ДВС-синдроме;
Врожденном недостатке антитромбина III.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение толерантности плазмы к гепарину ;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Дать характеристику противосвертывающей системе.
Какие виды противосвертывающей системы существуют?
Что такое антикоагулянты, их значение в организме?
Классификация антикоагулянтов, примеры.
Фибринолиз – определение, структурные компоненты, механизм действия.

6*. Дать подробную характеристику следующим веществам и укажите их значение в системе гемостаза: гепарин, антитромбин III, витамин К, Са2+.

7*. Каковы механизмы антикоагуляционного действия: гепарина, антивитамина К.

Практическая работа

9.7. Определение АЧТВ плазмы крови.

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать патологию сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, коагулопатии (причины, виды, лабораторная диагностика).

- Уметь определять АЧТВ предложенной плазмы крови.

Принцип: определяется время свертывания бедной тромбоцитами плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса свертывания в присутствии ионов кальция.

Реактивы:

Кефалин.
1. Каолин
2. Буфер трис-НСI
3. Хлорид кальция
4. Дистиллированная вода.
5. Плазма крови бедная тромбоцитами

Оборудование:

Водяной термостат
Секундомер
Пипетки 0.1; 5.0 мл (дозатор 0,1 мл)
Пробирки
Цилиндр на 200 мл

Ход определения:

Приготовление реагентов к работе:

Разведение кефалина.

Во флакон с кефалином внести 2,0 мл дистиллированной воды и растворить при энергичном покачивании, раствор кефалина можно использовать через 60 минут.

Приготовление АПТВ-реагента.

Концентрированный буфер трис-НСI и каолин количественно переносят в мерный цилиндр и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл, для приготовления АПТВ-реагента смешивают в пробирке 0,1 мл кефалина и 3,0 мл рабочей взвеси каолина. Перед применением необходимо встряхивать.

Приготовление рабочего раствора хлориа кальция.

Концентрированный раствор хлорида кальция развести дистиллированной водой в 20 раз.

Проведение анализа – определение АПТВ:

В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,1 мл АПТВ-реагента.
Пробирку встряхивают и помещают в водяной термостат при 370С.
Через 3 мин к смеси добавляют 0,1 мл хлорида кальция (имеющего температуру 37 С) и включают секундомер.
Отметить время свертывания (образования фибрина) при периодическом покачивании пробирки.
определение проводят 2-3 раза и берут средний результат

Нормальные величины: АПТВ в нормальной плазме составляет 27-35 с.

Определение каолинового времени свертывания плазмы:

В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и прогревают в водяном термостате 1 мин.
Добавляют 0,1 мл каолина, имеющего комнатную температуру.
Инкубируют в термостате в течение 3 мин.
Затем вносят 0,1 мл хлорида кальция, включают секундомер и определяют время свертывания.

Клинико-диагностическое значение:

Определение АПТВ используется для выявления гипер- и гипокоагуляционного сдвига, контроля за гепаринотерапией при тромбозах, тромоэмболиях и ДВС-синдромах различной этиологии, для диагностики гемофилии, болезни Вилленберга.

Удлинение АЧТВ наблюдается при:

дефиците факторов свертывания крови
избытке антикоагулянтов
гепаринотерапии

Укорочение АЧТВ отмечается при:

тромбофилических состояниях.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение АЧТВ в предложенной плазме;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Классификация нарушений гемостаза.
Тромбоцитопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
Тромбоцитопении: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
Наследственные коагулопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
Приобретенные коагулопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.

6*. Почему при гемофилии время кровотечения по Дуке будет в норме?

7*. Какой тип гемостаза будет нарушен при заболеваниях гепатитом, почему?

Практическая работа

9. 8.Этаноловый тест

Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать показатели гемостаза в норме, методы исследования системы гемостаза, патология гемостаза.

- Уметь проводить этаноловый тест в исследуемой плазме крови.

Принцип: образование геля в плазме после добавления 50% раствора этанола. При наличие в плазме комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибриногеном происходит высвобождение фибрин-мономера, который затем полимеризуется с образованием геля.

Реактивы:

Этанол – 50%
1. Плазма крови

Оборудование:

Пробирки
Пипетки на 0,2 мл, 1 мл.
Секундомер

Ход определения:

В пробирку вносят 0,15 мл этанола и 0,5 мл плазмы;
- Пробирку встряхивают и помещают в штатив при комнатной температуре;
- Отмечают в течение 10 мин отсутствие или образование в пробирке геля

Если через 1-10 мин в пробирке образуется гель, то проба считается положительной «1».

Нормальные показатели: помутнение или появление небольшой зернистости – отрицательный результат «0».

Клинико-диагностическое значение:

Положительная проба указывает на присутствие в плазме комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибрином, что рассматривается как лабороторный критерий ДВС-свертывания крови или массового тромбоза, сопровождающихся активацией системы фибринолиза.

Задание для самостоятельной работы:

Законспектируйте методику;
Подготовьте рабочее место для исследования;
Проведите определение этанолового теста в предложенной плазме крови;
Оцените полученные результаты;
Сделайте выводы по работе и рисунки;
Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

Какие методы применяют при исследовании системы гемостаза?
Особенности преаналитического этапа исследования системы гемостаза?
Дайте определение следующим понятиям: фибринолиз, ретракция, антикоагулянты, плазмин, коагулограмма, адгезия, фибрин, гемофилия, ДВС-синдром, тромбоцитопатии, вазопатии.

Принятые сокращения:

АДФ – аденозиндифосфат.

АКТГ – адренокортикотропный гормон.

АлАТ – аланинаминотрансфераза.

АсАТ – аспартатаминотрансфераза.

АМФ – аденозинмонофосфат.

АТФ– аденозинтрифосфат.

ВЖК – высшие жирные кислоты.

ГАМК – гамма-аминомаслянная кислота.

ГГТ – гаммаглутамилтранспептидаза.

ГЛП – гиперлипопротеидемии.

ГТТ – глюкозотолерантный тест.

ГТФ – гуанозинтрифосфат.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота.

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт.

КДЛ – клинико-диагностическая лаборатория.

КК – креатинкиназа.

КОС – кислотно-основное равновесие.

ЛДГ – лактатдегидрогеназа.

ЛПВП – липопротеиды высокой плотности.

ЛПОНП– липопротеиды низкой плотности.

ЛПНП– липопротеиды очень низкой плотности.

НАД – никотинамидадениндинуклеотид.

НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты.

ПВК – пировиноградная кислота.

РНК – рибонуклеиновая кислота.

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота.

рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота.

тТРНК – транспортная рибонуклеиновая кислота.

РЭС – ретикулоэндотелиальная система.

СТГ – соматотропный гормон.

ТАГ – триацилглицериды.

ТТГ – тиреотропный гормон.

УДФГК – уридиндифосфоглюкуроновая кислота.

УТФ – уридинтрифосфат.

ФАД – флавинадениндинуклеотид.

ФЛ – фосфолипиды.

ФЭК – фотоэлектроколориметр.

ХС – холестерин.

ХЭ – холинэстераза.

ЦНС – центральная нервная система.

ЦПЭ – цепь переноса электоронов.

ЦТК – цикл трикарбоновых кислот.

ЦТФ – цитидинтрифосфат.

Список терминов:

Авитаминоз - результат полного длительного отсутствия витаминов с развитием симптомов, специфичных для каждого витамина.

Адгезия – способность тромбоцитов приклеиваться к эндотелию в месте его повреждения.

Азотемия – повышение содержания компонентов остаточного азота в крови.

Азотистое равновесие - количество азота, поступившего с пищей, равно количеству азота выделившегося из него.

Активаторы – вещества, активирующие действие ферментов.

Активный центр – участок в молекуле фермента, ответственный за взаимодействие фермента с субстратом и сам процесс катализа.

Алколоз – сдвиг рН в щелочную сторону.

Аллостерический центр (регуляторный) – участок в молекуле фермента, ответственный за регуляцию действия фермента.

Альдозы - углеводы, содержащие альдегидную группу.

Альдостерон – гормон коркового слоя надпочечников, усиливает реабсорбцию ионов натрия и хлора из первичной мочи.

Амины биогенные – биологически активные вещества, образующиеся при декарбоксилировании аминокислот.

Аминокислоты – карбоновые кислоты, альфа-углеродный атом водорода которых замещен на аминогруппу.

Аминосахара – углеводы, содержащие в своем составе аминогруппу.

Анаболизм (ассимиляция или биосинтез) – это процесс образования соединений необходимых для организма (более крупных молекул из менее крупных), протекающий с потреблением энергии.

Анемии - клинические состояния, обусловленные снижением количества гемоглобина, эритроцитов или снижением их функций.

Антикоагулянты – вещества, тормозящие процессы свертывания крови.

Антитела – специфические белки, «узнающие» и обезвреживающие чужеродные соединения.

Антивитамины - это вещества, затрудняющие использование витаминов клеткой путем их разрушения, связывания в неактивные формы, замещения соединениями близкими по структуре, но не обладающими их свойствами.

Антигормоны – это вещества, которые препятствуют связыванию гормонов с белками-рецепторами. Они могут обладать собственной активностью и действовать на обмен веществ в клетке.

Апофермент – белковая часть фермента.

Ацидоз – сдвиг рН в кислую сторону.

Белки – это высокомолекулярные органические, азотсодержащие соединения, состоящие из аминокислот.

Белки-рецепторы – это специальные белки на поверхности клетки, на мембране или в цитозоле, которые могут связываться с гормонами.

Биологическая химия – наука, которая изучает химический состав и химические процессы, лежащие в основе жизнедеятельности организма.

Буферная система – смесь слабого основания и его соли или смесь слабой кислоты и её соли, которые могут поддерживать рН раствора на постоянном уровне.

Вазопрессин – антидиуретический гормон гипоталамуса, усиливает реабсорбцию воды из первичной мочи, что приводит к задержке воды в организме и снижению диуреза

Витамины - это низкомолекулярные органические вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности организма.

Витаминоподобные вещества - это соединения, которые отвечают основным свойствам витаминов, отличающиеся тем, что их дефицит не вызывает специфического симптомокомплекса, и тем, что они не строго обязательно должны входит в пищевой рацион человека.

Волюморегуляция - система, реагирующая на изменение объема жидкостей в организме.

Воски – сложные эфиры высших одноатомных или двухатомных длинноцепочечных спиртов (число атомов углерода от 16 до 22) и высокомолекулярных жирных кислот.

Внешний обмен – поступление питательных веществ и выделение конечных продуктов распада из организма.

Всасывание – прохождение мономеров через слизистую ЖКТ во внутреннюю среду организма.

Воспроизводимость метода - разброс показателей, полученных при анализе нескольких проб одного и того же образца биоматериала.

Вторичная структура – способ укладки полипептидной цепи в альфа-спираль или в-структуру за счет менее прочных водородных связей (Н …О).

Высаливание - обратимое осаждение белков. Обычно происходит при действии на белок солей щелочных, щелочноземельных металлов и иона аммония.

Высшие жирные кислоты ВЖК - алифатические карбоновые кислоты, которые выделены из липидов. Они содержат от 4 до 24 атомов углерода.

Гемокоагуляция – процесс свертывания крови.

Гемостаз - биологическая система, сохраняющая жидкое состояние крови и предупреждающая или тормозящая кровопотери путем поддержания целостности сосудистой стенки и образования тромбов в местах повреждения сосудов.

Гемоглобинопатии - наследственные заболевания, в основе которых лежат нарушения синтеза белковой части НЬ, что и приводит к появлению патологических гемоглобинов.

Гетерополисахариды – сложные углеводы, состоящие из молекул разных моносахаров и содержащие в своем составе неуглеводные компоненты.

Гиповитаминозы - результат недостаточного поступления витаминов с пищей, с развитием симптомов, специфичных для каждого витамина.

Гипербилирубинемия – повышенное содержание билирубина в крови.

Гипервитаминозы - возникают в результате избыточного поступления жирорастворимых витаминов, проявляются в виде токсического воздействия на организм с развитием симптомов, специфичных для каждого витамина.

Гипергидротация - увеличение объема жидкости в организме.

Гипергликемия – повышенное содержание глюкозы в крови.

Гиперглобулинемия – повышенное содержание глобулинов в крови.

Гиперлипемия – повышенное содержание липидов в крови.

Гиперпротеинемия - повышенное содержание белка в крови.

Гиперурикемия – повышенное содержание мочевой кислоты в крови.

Гипобилирубинемия – сниженое содержание билирубина в крови.

Гипогликемия - сниженое содержание глюкозы в крови.

Гиполипемия – сниженое содержание липидов в крови.

Гипопротеинемия – сниженое содержание белков в крови.

Гипоурекемия - сниженое содержание мочевой кислоты в крови.

Гликогенез - процесс образования гликогена.

Гликогенолиз - процесс распада гликогена.

Гликолиз - расщепление глюкозы по дихотомическому пути до ПВК.

Гомополисахариды - сложные углеводы, состоящие из молекул одного моносахарида.

Гормоны - биологически активные органические вещества, вырабатываемые железами внутренней секреции в незначительных количествах, но оказывающие на организм очень сильное действие.

Гликогенозы – заболевания, вызванные отсутствием или снижениенм активности ферментов распада гликогена

Гликопротеиды – сложные белки, простетическая группа которых содержит углеводы (аминосахара, гиалуроновую кислоту).

Гликозидная связь - связь, которая возникает между моносахаридами. Она образуется за счет ОН-группы первого углеродного атома одного моносахарида и ОН-группой четвертого (1,4-гликозидная связь) или шестого углеродного атома (1,6-гликозидная связь) другого моносахарида.

Гликолипиды – это сфинголипиды, не содержащие фосфорную кислоту и азотистое основание, а содержащие углеводы.

Глицерофосфолипиды (глицерофосфатиды) состоят из глицерина, насыщенной и ненасыщенной жирной кислоты (прикреплены к двум атомам углерода) и фосфорной кислотой и азотистым основанием (прикреплены к третьему углеродному атому).

Глюкозурия – содержание глюкозы в моче.

Гниение белков – процесс распада аминокислот под действием микроорганизмов толстой кишки.

Глюконеогенез – синтез глюкозы из неуглеводных компонентов.

Гомеостаз – постоянство внутренней среды организма.

Гормоноиды или гормоноподобные вещества – это вещества, которые действуют только в местах их образования. К ним относят тканевые гормоны, биогенные амины и простагландины.

Дегидротация - уменьшение объема жидкости в организме.

Дезаминироване – процесс отщепления аминной группы от аминокислоты.

Декарбоксилирование – процесс отщепления карбоксильной группы от аминокислоты с помощью декарбоксилаз.

Денатурация - нарушение пространственной структуры белка с потерей всех биологических и физико-химических свойств.

Диагностическая ценность метода - изменения данного вещества или ряда веществ в биоматериале, которое говорит об определенном заболевании.

Диализ – разделение белков и других веществ с помощью полупроницаемых мембран (целлофан, коллоидная пленка, все биологические мембраны).

Дисахариды – углеводы, состоящие из 2 молекул моносахаридов.

Диспротеинемия - изменение процентного соотношения белковых фракций.

Желтухи – заболевания, связанные с нарушением образования, превращения и выведения билирубина, который в избыточном количестве накапливается в крови (гипербилирубинемия) и откладывается в слизистых.

Заменимые вещества – образуются в организме человека.

Изоэлектрическая точка рI - рН раствора, при котором белок имеет нейтральный заряд.

Изоферменты - ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по составу, свойствам, местом локализации.

Инициация – начало.

Ингибиторы – вещества, тормозящие действие ферментов.

Индукция – «включение» процесса транскрипции.

Кальцитонин – гормон щитовидной железы, способствует минерализации костной ткани, снижает содержание кальция и фосфора в плазме крови.

Кальцитриол – гормон, стимулирует мобилизацию кальция и фосфатов из костей, в клетках канальцев почек усиливает реабсорбцию кальция и фосфора из первичной мочи. Повышает уровень кальция и фосфора в плазме, ингибируя секрецию паратгормона.

Катаболизм (диссимиляция или распад) – процесс распада веществ, более крупных молекул в более мелкие с образованием (выделением) энергии.

Катализ - процесс ускорения химических реакций.

Кетозы – углеводы, содержащие в своем составе кетонную группу.

Кетонемия – повышение уровня кетоновых тел в крови.

Кетонурия – появление кетоновых тел в моче.

Комплементарность - дополнительность цепей ДНК друг другу, за счет того, что азотистые основания, соединяясь водородными связями, образуют специфичные пары: А=Т, Г=Ц.

Кофермент – небелковая часть сложного фермента.

Липазы – ферменты, расщеляющие липиды.

Липиды (греч. lipos – жир) - большая группа разнообразных по химическому строению соединений, которые растворимы в неполярных растворителях (эфире, хлороформе, бензоле) и относительно нерастворимы в воде. Они являются настоящими или потенциальными эфирами жирных кислот.

Липопротеиды – сложные белки, простетическая группа которых содержит липиды.

Липотропные факторы – вещества, необходимые для нормального синтеза фосфолипидов (холин, метионин, витамины), несинтезирующиеся в организме, дефицит которых приводит к нарушению синтеза ФЛ, избыточному синтезу жиров в печени.

Макроэргическая связь – фосфорнодиэфирная связь, при разрушении которой выделяется энергии более 40 кДж/моль.

Макроэргические соединениям - а соединения с макроэргической связью.

Метаболизмом - совокупность химических процессов, которым подвергаются различные соединения с момента их поступления в организм до момента их выделения из организма.

Металлопротеиды – это сложные белки, которые содержат в простетической группе металлы.

Мононуклеотиды – мономеры нуклеиновых кислот, состоящие из азотистых оснований, углевода (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты.

Моторинг - контроль за правильностью лечения и излеченностью патологического процесса, т.е. контроль за течением заболевания и результатом лечения.

Муторатация – способность углеводов в водных растворах взаимопревращаться в циклические и линейные формы.

Мыла – это натриевые (твердые) или калиевые (жидкие) соли жирных кислот.

Незаменимые вещества – не образуются в организме человека и должны поступать с пищей.

Нуклеопротеиды – сложные белки, простетическая группа которых представлена ДНК (дезоксирибонуклеопротеиды) или РНК (рибонуклеопротеиды).

Нуклеозид – органическое вещество, состоящее из азотистых оснований и углевода (рибозы или дезоксирибозы).

Обратимость действия – способность фермнтов катализировть как прямую, так и обратную реакции.

Окислительное фосфолирование – освобождение энергии углерод-водородных связей, путем отщепления водорода (электоронов и протонов) и передачи их на кислород, которым мы дышим в цепи переноса электронов ЦПЭ (цепи биологического окисления), в ходе которого образуется вода и макроэргическое соединение АТФ.

Онкотическое давление – составная часть осмотического давления, создаваемое белками крови.

Опалесценция (мутность) – явление, при котором пучек света, проходя через коллоидный раствор, рассеивается до конуса (эффект Тиндаля).

Омыление - процесс образования солей жирных кислот путем щелочного гидролиза.

Осмотическое давление - определяется молярной концентрацией растворенных в жидкости веществ, называемых осмотически активными.

Осморгуляция - система, реагирующая на изменение осмотической концентрации биологических жидкостей.

Остаточный азот - включает в себя все небелковые азотсодержащие вещества.

Парапротеинемия - образование «патологических» белков, которых в организме здорового человека нет.

Патогенез - нарушения, происходящие при заболевании.

Первичная структура белков – последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, образуется за счет пептидных связей, возникающих за счет альфа-аминогруппы одной аминокислоты и альфа-карбоксильной группы другой аминокислоты.

Переаминирование – процесс переноса аминогруппы с аминокислоты на кеокислоту с помощью ферментов – аминотрансфераз.

Переваривание – процесс, происходящий в ЖКТ под действием пищеварительных ферментов, в ходе которого чужеродные биополимеры распадаются до мономеров.

Пентозофосфатный путь ПФП - расщепление глюкозы по апотомическому пути без образования ПВК.

Плазма крови – образуется при отделении от крови форменных элементов, содержит в своем составе факторы свертывания крови.

Пептиды – органические молекулы, в состав которых входит несколько остатков аминокислот, связанных пептидной связью.

Подагра – заболевания, связанные с нарушением обмена пуриновых оснований.

Порфирии – заболевания, возникающие при нарушении процесса синтеза гемоглобина и накоплении побочных промежуточных продуктов.

Прогноз - предсказание возможного исхода заболевания.

Промежуточный обмен – ферментативно обусловленные и регулируемые гормонально и аллостерически внутриклеточные процессы синтеза и распада. Включает в себя переваривание, всасывание питательных веществ, поступление их в клетке, распад до промежуточных и конечных продуктов и синтез из них специфического соединения для каждой клетки, контроль и регуляция всех перечисленных процессов.

Простагландины – это производные жирных кислот с 20 углеродными атомами, имеющие в своем составе циклопентановое (пяти-членное) кольцо.

Простетическая группа – небелковая часть прочно связанная (ковалентно) с белковой частью.

Протеины (от греч. protos - первый, важный) – международное название белков. Обычно так называют простые белки, состоящие только из аминокислот.

Протеиды – сложные белки, которые имеют в своем составе простетические (небелковые) группы.

Профилактика - предупреждение возникновения заболевания.

Репарация – «ремонт» ДНК.

Репликация - удвоение ДНК, образование новых дочерних ДНК при делении клетки.

Репрессия – «выключение» транскрипции.

Сахарный диабет – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом дефектов секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов.

Скрининг - выявление заболевания на доклинической стадии.

Сыворотка крови – образуется при отделении от цельной крови сгустка и форменных элементов.

Специфичность метода - способность метода измерять лишь тот компонент, для определения которого он предназначен.

Сфингофосфолипиды - состоят из двухатомного ненасыщенного спирта сфингозина, насыщенной и ненасыщенной жирной кислоты (прикреплены к двум атомам углерода) и фосфорной кислотой и азотистым основанием (прикреплены к третьему углеродному атому).

Терминальное окисление - полное окисление ацетил КоА в цикле Кребса с образованием СО2, освобождением водорода и АТФ.

Тканевые гормоны - вырабатываются в различных тканях и обладают

местным действием, к тканевым гормонам относят большую группу биогенных аминов.

Точность метода - степень приближения полученного значения к истинному содержанию вещества в биологической жидкости.

Терминация – окончание.

Транскрипция – биосинтез м-РНК, т-РНК, м-РНК.

Трансляция – биосинтез белка.

Третичная структура – пространственная укладка альфа-спирали или в-структуры в определенную конформацию: глобулы (шар) или фибриллы (нить).

Триацилглицериды ТАГ или нейтральные жиры – сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и высокомолекулярных жирных кислот ВЖК.

Тромбоцитопатии – группа заболеваний, при которых наблюдаются качественная неполноценность тромбоцитов или их дисфункцией, приводящих к ослабленной агрегации и адгезии тромбоцитов.

Тромбоцитопении – группа заболеваний, при которых отмечается ускоренное разрушение или недостаточное образование тромбоцитов.

Углеводы – органические соединения, которые являются альдегидами или кетонами многоатомных спиртов.

Урикозурия – повышение мочевой кислоты в моче.

Четвертичная структура – «комплекс субъединиц, способных к диссоциации» (Джон Бернал), или объединение в определенном порядке двух и более количества субъединиц в молекулу олигомерного белка.

Чувствительность метода - способность метода выявлять наименьшие различия между двумя концентрациями веществ.

Холестерин - циклический спирт, содержащий 2 бензольных и одно циклопентановое кольцо, содержит 27 углеродных атомов.

Холофермент – сложный фермент, образованный коферментом и апоферментом.

Хромопротеиды – сложные белки, простетическая группа которых представлена окрашенными соединениями.

Факторы плазменные – факторы свертывания крови, представленные ферментами и белками плазмы крови.

Факторы клеточные – факторы свертывания крови, вырабатываемые форменными элементами крови, в основном тромбоцитами.

Факторы тканевые – факторы свертывания крови, выделяющиеся при повреждении ткани.

Ферменты – биокатализаторы белковой природы.

Фибринолизин – белок свертывающей системы крови.

Фосфопротеиды – сложные белки, простетическая группа которых содержит фосфорную кислоту.

Фосфолипиды (фосфатиды) – это липиды, в состав которых содержится азотистое основание и фосфорная кислота.

Элонгация – удлинение цепи.

Эмульгирование – дробление крупных липидных частиц на более мелкие, благодаря перистальтике кишечника, СО2, желчным кислотам.

Энергия активации – энергия, необходимая для начала химической реакции.

Энзимодиагностика – использование ферментов в медицине, для дифференциальной диагностики заболеваний.

Энзимопатии – группа заболеваний, связанная с недостаточностью ферментов.

Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных средств (фестал).

Этиология - причина заболевания.

Литература.

Алейникова Т. Д., Рубцова Г. В., Павлова Н. А. Руководство к практическим занятиям по биохимии. – М.: Медицина, 2000.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1990.
Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача.- Екатеринбург: «Уральский рабочий», 1994.
Бышевский А.Ш., Галян С.Л. Биохимические сдвиги в диагностике патологических состояний.- Новосибирск: Изд-во НГУ, 1993.
Донсон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика.- М.: «Нир», 1991.
Ермолаев М.В., Ильичева Л.П. Биологическая хими.: Учебник. - М.: «Медицина», 1989.
Камышников В. С. О чем говорят медицинские анализы.- Минск: «Беларуская навука», 1997.
Камышников В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика.- Минск: Интерпрессервис, 2003.
Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я.- Минск: «Беларуская навука», 1999.
Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия.- Минск: «Белорусь», 1976 .
Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия. – М., 1999.
Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика: Справочник для врачей.- СПб.: Гиппократ, 1997.
Обеспечение качества лабораторных исследований: Справочное пособие. Под ред. В. В. Меньшикова. – М., 1999.
Основы биохимии: Учебник/ В.К. Кухта, В. С. Морозкина, А. Д. Таганович, Э.И. Олецкий. - М.: Медицина, 1999.
Основы биохимии. Под редакцией проф. Анисимова А.А.- М.: «Высшая школа», 1986.
Пустовалова Л. М. Основы биохимии для медицинских колледжей.– Ростов н/Д : Феникс, 2003.
Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии.- Ростов-н/Д.: «Феникс», 1999.
Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник под ред. профессора В.В.Меньшикова.- М.- «Медицина», 1987.

1. Семь врат Елена Петровна Блаватская
2. консультантклиент.html
3. филологический факультет
4. тема принципов российского трудового права
5. реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук Хер
6. Економіст де відстоював вільні підприємницькі ідеї індивідуальне самовиявлення особи від обме
7. Особенности формирования корпоративной культуры в японских и американских компаниях.html
8. Стены и башни Московского Кремля
9. Реферат- Электронные вольтметры
10. МОДУЛЬ МЕДИЦИНСКОГО ПРАВА И ОСНОВЫ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВА В ЗДРАВООХРАНЕНИИ СИЛЛАБУС
11. Общая врачебная практика 1 Первый дородовый патронаж проводят в- 1012 недель 2028 недель 3032 недели
12. на тему- Книга А. А
13. Дипломная работа- Система інтегрованих уроків, як засіб розумового розвитку молодших школярів
14. Полнофункциональная система автоматизированного контроля производственных процессов водопроводной станции станции
15. Колумбия ожидание мира
16. Реферат- Двигательная активность
17. А есть ли вопрос на который наш Мастер не смог бы дать ответа Он пошёл на цветущий луг поймал самую красиву
18. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЛАНИРОВКИ ОРГАНИЗАЦИИ И РАБОТЫ РОДИЛЬНЫХ ДОМОВ Роды являются сложным физиологиче
19. Предметом ТВ является модели экспериментов со случайными исходными причем рассматриваются только такие
20. Тема- Разновидности оселкового искусственного мрамора ОИМ ОИМ ~ это затворенное клеевым раствором гипс

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе

Лабораторная диагностика

Поможем написать учебную работу

Выберите тип работы:

Значение изучаемой темы:

2.1. Практическая работа

«Цветные реакции на белки».

Ответьте на вопросы:

2.2. Практическая работа

2.3. Практическая работа

2.5. Практическая работа

«Качественные реакции на углеводы».

2.6. Практическая работа

«Качественные реакции на липиды».

3.3. Практическая работа

3.8. Практическая работа

Ход определения:

Сглюкоза = Еоп/Ест * 10 (ммоль/л)

4.4. Практическая работа

4.7. Практическая работа

«Определение сиаловых кислот в сыворотке крови».

4.8. Практическая работа

Ход определения:

4.5. Практическая работа

Количество, мл.

Анализируемая проба.

Дистиллированная вода.

Реактивы.

Клинико-диагностическое значение

Практическая работа

Практическая работа

Практическая работа

Практическая работа

Практическая работа