Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
PAGE 36
ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН ІМ. В.П.КОМІСАРЕНКА АМН УКРАЇНИ
Пушкарьов Володимир Михайлович
УДК 612.453: 612.453.018: 612.014.3
БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ СТЕРОЇДОГЕНЕЗУ В КОРІ НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ ІОНАМИ КАЛІЮ
14.01.14 – ендокринологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
КИЇВ
2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин
ім. В.П. Комісаренка АМН України
Науковий консультант – доктор медичних наук, професор, чл.-кор. АМН і НАН України ТРОНЬКО Микола Дмитрович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу патофізіології ендокринної системи
Офіційні опоненти:
Доктор медичних наук, професор, чл.-кор. АМН та НАН України Резніков Олександр Григорович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу ендокринної репродукції та адаптації
Доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Кучеренко Микола Євдокимович, Київський Національний університет імені Тараса Шевченка, головний науковий співробітник кафедри біохімії
Доктор медичних наук Хомінська Зінаїда Борисівна, Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, завідувач лабораторії ендокринології
Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, м.Київ, лабораторія радіобіології
Захист відбудеться 24 січня 2006 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ-114, вул.. Вишгородська, 69).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка (м. Київ-114, вул.. Вишгородська, 69).
Автореферат розісланий 22 грудня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
Доктор біологічних наук Калинська Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Аналіз досягнень ендокринології за останні 20 років свідчить про те, що, окрім інтенсивного розвитку клінічних напрямів, пов’язаних з профілактикою, діагностикою та лікуванням ендокринних захворювань, вона поступово перетворюється на загально-біологічну науку з акцентом на клітинні механізми дії різноманітних гормонів та агоністів.
Однією з найважливіших є проблема ендокринної регуляції водно-сольового гомеостазу. Мінеральний гомеостаз є запорукою життєдіяльності багатоклітинних організмів. Зміни кількості води в організмі та порушення спів відношення солей в плазмі крові призводить до важких наслідків, часто несумісних із життям. Одним із головних центрів регуляції гомеостазу є кора надниркових залоз, клітини якої секретують альдостерон – життєво важливий гормон, що посилює виведення з організму К+ і затримку Na+. Утворення цього гормону регулюється складною, недостатньо вивченою, системою чинників, одним із яких є іони К+.
Донедавна вважалося, що основними агоністами, які регулюють утворення альдостерону, є ангіотензин ІІ (АІІ) та кортикотропін [Gallo-Payet, Payet, 2003; Mulrow, 1999]. Проте, дослідження 80-х та першої половини 90-х років XX ст. показали, що в регуляції стероїдогенезу беруть участь численні модулятори, функція та механізм дії яких значно менше вивчені, порівняно з АІІ та АКТГ. Незважаючи на те, що вплив іонів калію щодо синтезу альдостерону був встановлений ще в 60-х роках минулого сторіччя, механізми його дії вивчені недостатньо. Залишається незрозумілим значення різноманітних калієвих іонних каналів в опосередкуванні ефектів К+ щодо стероїдогенезу. Хоча участь Са2+ та кальцієвих каналів у цих ефектах була доведена, до цього часу нез’ясований конкретний механізм передачі регуляторного сигналу К+, роль Са2+, що надходять через канали Т- та L-типу, позаклітинної концентрації іона, не визначений напрямок руху іона. Практично не вивчалося значення білкового синтезу в К+–залежній регуляції альдостерону, в той час, як у випадку АІІ та, особливо, АКТГ це питання глибоко і всебічно досліджено.
Погляди на участь месенджерних систем в регуляції стероїдогенезу калієм також значною мірою розходяться. Хоча є докази на користь участі Са2+/кальмодулінової системи [Condon et al., 2002; Gambaryan et al., 2003; Ganguly et al., 1995]., деякі дослідники вважають основною месенджерною системою, що опосередковує ефект К+, каскад цАМФ/ПКА [Tait, Tait, 1999].
До цього часу зусилля дослідників були зосереджені на механізмах стимуляції іонами К+ біосинтезу альдостерону. В той же час, процеси гальмування стероїдогенезу при зниженні вмісту іона в плазмі крові, біохімічні механізми цих процесів залишаються практично недослідженими. Актуальність вивчення цієї проблеми пов’язана з існуванням патологій, що супроводжуються зниженням рівня калію в крові. Вивчення механізмів регуляції секреції альдостерону К+ має важливе значення і для розробки терапевтичних підходів при лікуванні хвороб, пов’язаних із серцево-судинною системою. З регуляцією вмісту К+ в плазмі крові та секреції альдостерону прямо пов’язані порушення тонусу судин організму, що призводить до гіпертензії. Актуальною є проблема пухлин кори надниркових залоз, що продукують гормони, альдостером. Неконтрольована продукція гормонів обумовлює глибокі порушення обміну речовин. Але ні причини, ні патогенетичні механізми розвитку гіперальдостеронізму при альдостеромах практично не досліджені.
Зв’язок дисертаційної роботи з науковими програмами та темами. Робота виконувалась у відділі патофізіології ендокринної системи Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України згідно з планом науково-дослідної роботи відділу за загальним напрямом: Аналіз біохімічних механізмів перенесення регуляторних сигналів у клітинах кори надниркових залоз тварин та пухлин надниркових залоз людини (1986-2004). Номери держреєстрації тем: 1986-1990 – 01.86.0028685; 1990-1992 – 019.0.000.3796; 1991-1995 – 01910047859; 1992-1994 – UA01003067Р та UA01003076Р; 1994 – 1995 – 0194 U017385; 1995-1997 – 0195 U006848; 1998-2000 – 0198 U001283; 2001-2004 – 0101 U000618.
Мета роботи. Вивчити роль К+ в регуляції стероїдогенезу, метаболічних та апоптичних процесів у клітинах кори надниркових залоз людини і лабораторних тварин. Охарактеризувати основні механізми передачі та посилення регуляторного сигналу іонів калію всередині адренокортикоцита, впливу на ці процеси деяких модуляторів.
Основні завдання дослідження.
1. Вивчити вплив різних концентрацій К+ на стероїдогенез в корі надниркових залоз людини та тварин.
2. Вивчити вплив різних концентрацій К+ на фундаментальні метаболічні процеси – біосинтез білка, РНК та ДНК.
3. Визначити шляхи передачі регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах та охарактеризувати основні етапи і механізми такої передачі.
4. Вивчити роль деяких природних та штучних модуляторів функції надниркових залоз (дигідропіридини, о,п’-ДДД, Li+, N-ацилетаноламіни) на залежні від К+ процеси регуляції стероїдогенезу та метаболізму.
5. Дослідити вплив К+ та деяких модуляторів на апоптичні процеси в корі надниркових залоз морських свинок, умовно нормальній та пухлинній адренокортикальній тканині людини.
Об’єкт дослідження: біохімічні процеси в адренокортикоцитах, які забезпечують регуляцію стероїдогенезу, їх зміни в умовах активації та пригнічення функції залози.
Предмет дослідження: регуляція стероїдогенезу та метаболічних процесів в корі надниркових залоз іонами К+ та деякими природними і штучними модуляторами.
Методи дослідження: біохімічні, молекулярно-біологічні, статистичні.
Наукова новизна досліджень. В дисертаційній роботі вперше:
1. Запропоновано концепцію, що характеризує значення іонів К+ в регуляції стероїдогенезу та підтриманні фізіологічного рівня іонів калію в плазмі крові. Сформульовано новий погляд на сукупність сигнальних механізмів, що опосередковують ефекти К+, АІІ та АКТГ в адренокортикоцитах.
2. Продемонстровано вплив К+ на розпад поліфосфоінозитидів, утворення інозитолфосфатів та показана роль внутрішньоклітинного, депонованого Са2+ в регуляції стероїдогенезу іонами калію.
3. Доведена участь протеїнкінази С в опосередкуванні дії К+ на стероїдогенез.
4. Вивчено значення білкового синтезу в реалізації ефекту іонів калію щодо стероїдогенезу.
5. Вивчений вплив К+ на мічення ДНК, сумарної РНК та РНК цитоплазматичних рибонуклеопротеїдів, синтез яких є основою трофічних, проліферативних процесів у тканині кори надниркових залоз.
7. Встановлено факт стимуляції іонами К+ залежного від Са2+ та кальмодуліну фосфорилювання білку, який за своєю масою (37-38 кДа) близький до StAR.
8. Вивчено фосфорилювання білків у різних компартментах адренокортикоцитів під впливом К+ та визначено роль різних кіназних систем у цих процесах.
9. Охарактеризований модулюючий вплив Li+, о,п’-ДДД, NAE та ДГП на залежні від К+ метаболічні процеси та стероїдогенез. Вивчений вплив К+ та деяких модуляторів (ДГП, NAE) на мічення основних глюкокортикоїдів.
10. Виявлені гальмівні процеси, що відбуваються в клітинах кори надниркових залоз при зниженому, порівняно з фізіологічним, вмістом К+ в середовищі.
11. Продемонстровані зміни в апоптичній фрагментації ДНК в умовно нормальній та пухлинній тканинах кори надниркової залози людини при підвищенні концентрації К+.
Науково-практичне значення роботи. Одержані в роботі дані дозволяють стверджувати, що іони К+ і кора надниркових залоз утворюють ефективну регуляторну систему зі зворотним зв’язком. Функціонування цієї системи забезпечує нормальний іонний гомеостаз. Встановлені найважливіші молекулярні механізми роботи такої системи. Вивчення тонких механізмів регуляції біосинтезу альдостерону іонами калію, крім теоретичного, має і суто практичне значення, як фундамент для розробки терапевтичних засобів при лікуванні різноманітних захворювань надниркової залози, гіпертензії, хвороб серцево-судинної системи.
Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Представлена дисертація є завершеним дослідженням, виконаним автором відповідно до програми наукових робіт, проведених протягом 1985 – 2004 років. Дисертант особисто обґрунтував концепцію роботи, підібрав методи досліджень, здійснив пошук та аналіз даних наукової літератури з питань, що вивчалися, сформулював основні положення та висновки. Робота виконана у межах держбюджетних тематик, які виконувалися у відділі патофізіології ендокринної системи Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Співучасть співробітників відділу патофізіології ендокринної системи та співробітників інших відділів Інституту відображена у спільних публікаціях.
Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи були представлені на: IV (Київ, 1987), V (Київ, 1994) та VІ (Київ, 2001) Українських ендокринологічних з’їздах; V (Київ, 1987), VI (Київ, 1992), VII (Київ, 1997), VIII (Чернівці, 2002) Українських біохімічних з’їздах; ІІІ Всесоюзному з’їзді ендокринологів (Ташкент, 1989); Міжнародній конференції „Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology” (Alma-Ata, 1989); XIII з'iзді Українського фiзiологічного товариства iм. I.П.Павлова (Київ, 1990); ІІ Всеросійському з’їзді ендокринологів (Челябинск, 1991); 9-му Міжнародному ендокринологічному конгресі (Nice, 1992); ІІІ Європейському ендокринологічному конгресі (Amsterdam, 1994); інститутських та лабораторних конференціях.
Публікації. Згідно з темою дисертації опубліковано 46 робіт, з яких 28 статей - у фахових наукових журналах та збірниках, 18 – тези доповідей у матеріалах наукових зібрань.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методичної частини, результатів досліджень, викладених у 3 розділах, аналізу і узагальнення одержаних даних, висновків та списку процитованої літератури. Обсяг дисертації 329 стор., ілюстрацій - 98, таблиць - 8, список використаних джерел складає 602 найменування.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Дані дисертаційної роботи базуються на експериментах, проведених на надниркових залозах 720 тварин (морські свинки, собаки, новонароджені поросята) та наднирковій тканині 62 хворих. У роботі використовували післяопераційну тканину надниркових залоз людини, яку одержували з хірургічного відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Досліджували пухлини (альдостерома, феохромоцитома, аденома, адренокарцинома, фіброма, тканина хворих Іценка-Кушінга) та тканини, що межують з ними. Такі ділянки тканини, що зберігають візуально нормальну будову, позначені в роботі як „умовно нормальна тканина” (УНТ). На проведення досліджень був одержаний дозвіл етичного комітету Інституту.
Зрізи та клітини інкубувались у буфері для інкубації (БІ), що містив 130 мМ NaCl; 1,27 мМ MgSO4; 1,8 мМ CaCl2; 10 мМ Na2HPO4; 1 мМ KH2PO4; 20 мМ HEPES, рН 7,4; БСА (2 мг/мл) при 37 оС протягом вказаного у конкретному досліді часу при легкому струшуванні.
Визначення альдостерону і циклічних нуклеотидів. Альдостерон визначали у гомогенаті за допомогою радіоімунологічних наборів AldoCTK-2 або SB-Aldo-H фірми „Sorin Biomedica” (Італія), згідно з методикою, що рекомендована фірмою. Вміст цАMФ та цГMФ визначали за допомогою радіоімунологічних наборів відповідно TRK 432 та TRK 500 фірми „Amersham Life Science” (Велика Британія) за методикою, що рекомендована фірмою.
Досліди з радіоактивною міткою. На пробу (1 мл) вносили 2,5 МБк 3H-холестерину або 0,01 МБк 14C-кортикостерону, 0,2-0,8 MБк 3H-лейцину, 0,04-0,2 МБк/мл зH-урідину, 0,04 МБк/мл 3Н-тимідину, 0,02 МБк/мл г-32Р-АТФ, 0,05 МБк/мл г-33Р-АТФ, 0,1 МБк/мл неорганічного 32Р. Для одержання радіоавтографів білків, мічених по вуглецю, зрізи (біля 10 мг) або клітини (5 х 104 – 2 х 106/мл) кори надниркових залоз інкубували протягом 20 хв з 14С-амінокислотами (0,1 МБк/мл). Для отримання радіоавтографів білків, помічених фосфором, зрізи інкубували протягом 20 хв, гомогенізували в 1 мл буферу для інкубації, і гомогенат інкубували з 0,4 МБк/мл г-32Р-АТФ або 0,5 МБк/мл г-33Р-АТФ протягом 10 хв. Потім проводили електрофорез білка по Леммлі [Laemmly, 1970]. Висушені гелі експонували на плівці „Hyperfilm MP” („Amersham Life Science”) та сканували за допомогою лазерного денситометра.
Задля мічення внутрішньоклітинного пулу, стероїдні попередники передінкубували з тканиною 30 хв при 37 0С, після чого в середовище вносили необхідні добавки, і інкубація продовжувалась ще 25 хв. Для вивчення транспорту міченого кальцію, дисперговані адренокортикоцити (8-11 х 106) передінкубували протягом 30 хв при 37 оС з 0,02-0,12 МБк/мл 45Са2+ для насичення клітин радіоактивним кальцієм. Потім клітини розділяли на декілька проб, в дослідні проби додавали чинники, що вивчались. Після закінчення інкубації вміст проб переносили на фільтри GF/C (Whatman, Велика Британія), тричі промивали буфером для інкубації, що містив 5 мМ Са2+, і вимірювали радіоактивність клітин.
Для вимірювання радіоактивності білків, РНК, ДНК, їх осаджували 7 % ТХО, переносили на фільтри GF/C, які промивали розчином 7 % ТХО, етанолом, після чого визначали радіоактивність фільтрів у стандартному толуольному сцинтиляторі в лічильнику радіоактивності Beckman LS 5000ТА. В аліквотах суспензій визначали білок [Bradford, 1976] і розраховували питому радіоактивність. Мічення, екстракція і хроматографічне розділення фосфоліпідів, що містять інозитол, та їх похідних описано в роботі Пушкарьова та співав. [Пушкарьов та ін., 2005]
Одержання субклітинних фракцій. Зрізи кори надниркових залоз після інкубації, гомогенізували в гомогенізаторі з тефлоновим товкачиком в буфері (2 °С), який містив 0,25 М сахарози, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4), 3 мМ MgCl2, 2 мМ ЕГТА, 0,1 мМ спермідину, 0,1% тритону Х-100, 0,1 мМ ФМСФ. Гомогенат, після осадження дебрісу і ядер, центрифугували при 10000 g протягом 10 хв і отримували мітохондріальну фракцію. Одержаний супернатант нашаровували на 0,8 мл 0,5 М розчину сахарози і центрифугували при 105000 g протягом 60 хв для отримання цитозольної фракції та осаду мікросом. Ядра осаджували з гомогенату при 1000 g протягом 10 хв і надалі очищували за методом, описаним у роботі Buckley і співавт. [Buckley et al., 1988].
Виділення та аналіз рибонуклеопротеїдів. РНП виділяли, як описано раніше [Пушкарев, 1983]. Плавучу густину РНП визначали в градієнті густини CsCl 1.3 - 1.6 г/см3 за методом Овчинникова [Овчинников и др., 1975]. Седиментаційні властивості РНП, оброблених ЕДТА для дисоціації рибосом, вивчали за допомогою лінійного градієнту сахарози 15-40 %.
Виділення та аналіз ДНК. Тканину гомогенізували в буфері, що містив 10 мМ трис-HCl (pН 7,5), 10 мМ ЕДТА, 0,1 М NaCl і послідовно інкубували з протеїназою К та РНКазою. Потім додавали NaCl до концентрації 0,5 М, і препарат депротеїнізували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом протягом ночі при -18 оС. Осад підсушували і розчиняли в буфері для гомогенізації без NaCl (ТЕ-буфер).
Дослідження апоптичної фрагментації ДНК. Тканину надниркових залоз інкубували протягом 3 годин при 37 0С в 1 мл БІ. У проби додавали KCl, LiCl, о,п’-ДДД, та інші чинники. Після 3 годин інкубації проби швидко охолоджували, гомогенізували, виділяли ДНК і аналізували її в 2,25 % агарозному гелі.
Детекція ПКСб та каспаз методом імуноблотингу. Білки, розділені методом електрофорезу, переносили на нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Мембрани блокували у буфері TBS-T (50 мМ Трис-HCl 0,2 М NaCl, рН 7,5), з 5% лактальбуміну та 0,1% Tween 20, протягом 1 год при кімнатній температурі. Потім промиту у TBS-T мембрану інкубували у розчині первинних антитіл протягом 1 год. Комплекси антиген-антитіло виявляли після інкубації мембрани з вторинними антитілами, міченими пероксидазою, протягом ще 1 год. Візуалізацію здійснювали за допомогою набору ECL™.
Визначення активності ПКС та ПКА. Активність ПКА визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі субстрату кемптиду внаслідок його фосфорилювання кіназою [Кеmp et al., 1977]. Активність ПКС визначали за включенням фосфатної мітки в гістони [Pushkarev, Mikosha, 1991] та по міграції нейрограніну, пептидного субстрату ПКС, в агарозному гелі [Uchida et al., 2000].
Тонкошарова хроматографія. Стероїди розділяли за допомогою методу двовимірної тонкошарової хроматографії на силікагелі КСК або на пластинах Silufol UV254 [Челнакова и др., 1990].
Матеріали. Усі солі, HCl, NaOH (кваліфікації о.с.ч.), тритон Х-100, формальдегід фірми „Merk” (ФРН); БСА, цитохалазин В, колхіцин, гепарін, SDS, ТЕА, ЕГТА, ЕДТА, ФМСФ - фірми „Serva” (ФРН); Агароза, трис – фірми „Sigma” (США); HEPES, ЦГИ, гістони, 2-меркаптоетанол, сахароза - „Bio-Rad” (США); Коллагеназа – „Fluka” (Швейцарія); CsCl – „Koch-Light” (Велика Британія); о,п’-ДДД був синтезований Я.Г.Бальоном в лабораторії органічного синтезу та хімреактивів Інституту ендокринології і обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Препарат суміші N-ацилетаноламінів був синтезований в лабораторії В.Е.Васьковського (Інститут біології моря РАН, Владивосток, Росія). Усі розчинники додатково очищували перегонкою.
Ізотопи. 3H-холестерин,14С-кортикостерон, 3Н-інозитол - „Amersham Life Science”. 45Са2+, 32P, 32P-ATФ і 33P-ATФ – „Ізотоп”; 14С-гідролізат білку (Чехія).
Статистичну обробку даних проводили із застосуванням t-критерію Стьюдента, дисперсійного аналізу з наступною оцінкою вірогідності відмін за критерієм Фішера (F), регресійного аналізу [Плохинский, 1980], а також за непараметричним тестом U Вілкоксона [Гублер, Генкин, 1969]. Вірогідній ефекти іонів калію, інгібіторів, іонофорів та модуляторів позначаються на рисунках зірочкою, або хрестиком.
Результати досліджень та їх обговорення
Вплив К+ на стероїдогенез. Роль іонних каналів. Внаслідок особливої чутливості клітин кори надниркових залоз до калію [Spat, 2004] навіть незначне підвищення концентрації К+ в інкубаційному середовищі спричиняє відчутні зміни у швидкості біосинтезу альдостерону в тканині надниркових залоз морських свинок (рис.1А). Максимум синтезу гормону спостерігається в діапазоні концентрацій калію від 5 до 9 мМ, і при подальшому зростанні вмісту іона в середовищі, зазвичай знижується. Останній факт свідчить про те, що клітини кори надниркових залоз реагують посиленням стероїдогенезу на динаміку змін концентрації К+ тільки в досить вузьких межах концентрацій, в яких реально може коливатися вміст іона в живому організмі. Очевидно, в основі регуляторної дії калію лежать не тільки електрофізіологічні явища, пов’язані з деполяризацією клітинної мембрани, а й інші, більш складні процеси, які ініціюються тільки в певних концентраційних межах іона. З рис. 1Б видно, що включення мітки зН-холестерину в альдостерон, як і кількість останнього (рис. 1А), вірогідно зростає при підвищенні концентрації К+. Важливо відмітити той факт, що при низькому вмісті іона в інкубаційному середовищі швидкість мічення альдостерону вірогідно знижується. Це вказує на можливість існування гальмівних механізмів щодо стероїдогенезу при концентраціях калію, нижчих від фізіологічного (3-4 мМ) рівня іона в плазмі крові.
Щоб визначити значення транспорту іонів калію через клітинну мембрану в К+-залежній регуляції стероїдогенезу, були проведені досліди з використанням ряду блокаторів калієвих каналів та сполук, що полегшують транспорт іона (іонофорів К+). Відомо, що в транспортуванні катіонів через мембрану проти градієнта концентрації важливу роль відіграє Na+/K+-ATФаза. На рис. 2А представлені дані досліду щодо вивчення впливу строфантину К на залежний від калію біосинтез альдостерону в корі надниркових залоз. Рівень утворення гормону у присутності інгібітора Na+/K+-ATФази був дещо вищим. Очевидно, цей фермент не відіграє ключової ролі в регуляції стероїдогенезу, хоча його модулюючий вплив цілком імовірний. Іони Сs+, які є інгібітором калієвих каналів, в наших дослідах помітно пригнічували утворення альдостерону (рис. 2Б). Інший інгібітор К+ каналів, апамін, пригнічував синтез альдостерону та кортизону меншою мірою. Іонофор К+, валіноміцин, посилював стероїдогенез при низьких концентраціях іона і пригнічував при високих, що підкреслює факт стимуляції синтезу альдостерону тільки певними концентраціями іона.
Наявні дані не дають можливості однозначно оцінити значення транспорту іонів калію через клітинну мембрану для регуляції стероїдогенезу. Деякі інгібітори каналів стимулюють стероїдогенез, інші, навпаки, його пригнічують. Це, напевно, пояснюється існуванням у мембранах адренокортикоцитів калієвих каналів кількох типів [Matsunaga et al., 1987; Spat, Hunyady, 2004; Vassilev et al., 1992], які відрізняються як за своїми електрофізіологічними та фармакологічними показниками, так і за своїм значенням в регуляції стероїдогенезу.
Багато які процеси трансдукції сигналів в клітинах залежать від Са2+. Тому ми досліджували можливу участь Са2+ в регуляції К+ стероїдогенезу. Підви-
щення концентрації калію в середовищі до 8 мМ призводить до швидкого зростання кількості 45Са2+ в адренокортикоцитах (рис. 3). Інгібітор кальцієвих каналів - лантан пригнічує активований калієм стероїдогенез (рис. 4), що підтверджують і дані літератури. Пригнічення транспорту іона в адренокортикоцити спостерігалось також в присутності ДГП. Інший інгібітор кальцієвих каналів - Ni2+, на відміну від лантану, підвищував швидкість включення мітки холестерину в альдостерон. Стимуляція іонами нікелю секреції альдостерону спостерігалася також при дії ангіотензину [Spat et al., 1990]. Цікаво, що посилення стероїдогенезу спостерігалось також у присутності ЕГТА – хелатора Са2+ [Kigoshi et al., 1997]. В наших дослідах ЕГТА посилював біосинтез альдостерону при знижених концентраціях калію, але пригнічував його при високих.
Ці дані підкреслюють факт існування кількох типів кальцієвих каналів з різними функціями. Кальцій, що потрапив в адренокортикоцити, може мати різне походження (транспорт через певні типи каналів, звільнення з внутрішньоклітинних депо) і неоднакове значення в регуляції стероїдогенезу. Очевидно, для передачі регуляторного сигналу К+ потрібні, по-перше, оптимальні концентрації Са2+, а, по-друге, зосередження кальцію в певних компартментах, пов’язаних з мітохондріями [Cherradi et al., 1996; Python et al., 1995; Rossier et
al., 1998]. Автори підкреслюють можливість проникнення іона в мітохондрії, а також ймовірність безпосереднього впливу Са2+ на транспорт холестерину до внутрішньої мембрани мітохондрій. Недавно була запропонована модель транспортування Са2+ в мітохондрії через люмени ендоплазматичного ретикулюму [Lalevee et al., 2003; Rossier et al., 1998]. У формуванні такого кальцієвого «трубопроводу», що зв’язує клітинну мембрану з мітохондріальною, беруть участь елементи цитоскелету. Можливо, саме цим пояснюється пригнічення К+-залежного стероїдогенезу у присутності сполук, що дестабілізують мікротрубочки та мікрофіламенти [Пушкарьов, Костюченко, 2003].
Значення білкового синтезу в К+-залежній регуляції стероїдогенезу. Білковий синтез є одним із основних метаболічних процесів. В регуляцію швидкості стероїдогенезу в корі надниркових залоз можуть бути залучені як регулятор-ні білки (гостра відповідь на дію агоніста), так і ферменти, що беруть участь у багатоступінчастому процесі утворення альдостерону з холестерину.
Іони калію посилюють включення мітки зН-лейцину в білки кори надниркових залоз в концентраціях, вищих та нижчих від фізіологічної (рис. 5). Посилення мічення білків при низьких концентраціях калію, можливо, відображає активацію якихось гальмівних процесів щодо утворення альдостерону, рівень мічення якого знижується при цих концентраціях іона (рис. 1Б). Вивчення кінетики включення мітки в білки тканини надниркової залози показало, що починаючи з 15-ї хвилини різниця між міченням при концентрації 3 та 11 мМ калію стає значущою. Імпульсне мічення полірибосом та ультрацентрифугування їх в градієнті густини CsCl показало, що включення Н3-лейцину відбувається саме внаслідок трансляції.
Для визначення ролі білкового синтезу в утворенні альдостерону, вивчали вплив інгібітора трансляції циглогексиміду (ЦГИ) на мічення кортикостероїдів. ЦГИ знімає ефект підвищених концентрацій калію щодо мічення стероїдів. Оскільки ЦГИ може здійснювати вплив на стероїдогенез безпосередньо, був поставлений дослід з аналогом аргініну, канаваніном, включення якого в білки призводить до порушення їх функцій, але не впливає на інші процеси в клітині [Krueger, Orme-Johnson, 1988]. Канаванін повністю знімав стимульований калієм біосинтез альдостерону, але підвищував рівень секреції гормону при низьких концентраціях іона (рис. 6). Останній факт вказує на необхідність білкового синтезу для гальмівних процесів щодо гормонопоезу в адренокортикоцитах. Інгібітор РНК-полімерази II - б-аманітин також пригнічував секрецію альдостерону при високих, стимулюючих стероїдогенез концентраціях К+. Можливо, це пов’язано з транскрипцією мРНК і подальшим синтезом лабільного білка-регулятора (StAR), який транспортує холестерин на внутрішню мембрану мітохондрій, де він стає доступним для цитохрому Р450scc. Про це свідчать і дані дослідів з іншим інгібітором транскрипції, актиноміцином Д, одержані на клітинах Лейдига [Clark et al., 1997].
Отже, активність білок-синтетичного апарату адренокортикоцитів є необхідною умовою для стимуляції утворення альдостерону та інших кортикостероїдів під впливом підвищених концентрацій калію. К+, крім гострого ефекту щодо стероїдогенезу, може, особливо при тривалій дії іону, впливати на такі фундаментальні метаболічні процеси, як транскрипція та реплікація. Дослідження, проведені на початку 90-х років та останнім часом, показали посилення іонами калію експресії ряду генів, продукти яких беруть участь у стероїдогенезі [Tremblay et al., 1991; 1992]. Причому, калій стимулює не тільки експресію мРНК, але й її трансляцію, про що свідчить збільшення кількості білкових продуктів цих генів. Показана, зокрема, стимуляція гена CYP11B2, який кодує альдостеронсинтазу [Muller, 1995, 1998], а також посилення транскрипції мРНК чинника NURR1, який, в свою чергу, активує експресію hCYP11B2 [Bassett et al., 2004]. Цікаво, що стимуляція транскрипції ряду генів контролюється і К+, і системою ренін-ангіотензин, в той час, як регуляція транскрипції гену, що кодує Р450scc, здійснюється виключно К+ [Tremblay, Lehoux,1992].
Месенджерні механізми, що опосередковують ефекти К+ в адренокортикоцитах. Аналіз літератури свідчить про недостатню вивченість та суперечливість даних щодо внутрішньоклітинних механізмів передачі та посилення регуляторного сигналу К+, розуміння яких є необхідним для створення цілісної картини механізмів регуляції утворення мінералокортикоїдів. Процеси регуляції синтезу мінералокортикоїдів іонами калію досліджені значно гірше, порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є система, ядром якої є Са2+/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Ganguly et al., 1992; Condon et al., 2002]. Накопичені, однак, дані, що вказують на участь системи цАМФ-залежної протеїнкінази в реалізації цих ефектів [Tait, Tait, 1999]. З іншого боку, К+, так само, як і ангіотензин, викликає прискорення транспорту кальцію в клітину та активацію протеїнкінази С [Betancourt-Calle et al., 2001].
Щоб оцінити можливу роль цАМФ/ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К+ в клітинах надниркових залоз морських свинок, визначали вміст нуклеотида в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі. З рис. 7, крива 1 видно, що по мірі росту концентрації К+ кількість цАМФ в тканині надниркової залози поступово зростає. У присутності хелатора кальцієвих іонів, ЕГТА (крива 2), кількість цАМФ була помітно вищою від контрольних значень при цих же концентраціях К+. Ефект ЕГТА щодо вмісту цАМФ легко пояснити пригніченням Са2+-залежної фосфодіестерази [Tremblay et al., 1988]. В той же час, ЕГТА підвищував тільки базальний рівень альдостерону та утворення гормону при знижених концентраціях К+, повністю знімаючи ефект високих концентрацій іона. Визначення активності ПКА в мікросомальній фракції показало, що калій активує цю кіназу (рис. 8). Крім того, у присутності інгібітора ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМ К+ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах морських свинок. При концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА знижується (рис. 8).
Той факт, що на тлі високого рівня цАМФ у присутності ЕГТА при підвищених концентраціях К+ спостерігається пригнічення синтезу альдостерону, свідчить, що месенджерна система цАМФ/ПКА не відіграє ключової ролі в опосередкуванні ефекту К+ в адренокортикоцитах. Можливо, цей каскад здійснює модулюючий вплив на залежний від К+ стероїдогенез, або, що імовірніше, опосередковує трофічні ефекти К+, особливо при тривалій дії іона.
Щоб визначити роль Са2+/кальмодулін-залежних процесів у регуляції біосинтезу альдостерону іонами К+ в корі надниркових залоз, проводили досліди з інгібітором кальмодуліну хлорпромазином. Як видно з рис. 9, передінкубація тканини хлорпромазином знижує стимульований калієм біосинтез гормону, починаючи з 5 мМ К+. Утворення альдостерону дещо підвищується у присутності інгібітора при низьких концентраціях іонів калію. Хлорпромазин також пригнічував К+-залежне фосфорилювання клітинних білків та білків, масою близько 75 кДа, в мітохондріях, і близько 40 кДа - в цитозолі.
Дані літератури щодо участі ПКС в К+–залежній регуляції стероїдогенезу дуже суперечливі. Спочатку вважалося, що К+ взагалі не впливає на активність цієї кінази [Lang, Vallotton, 1987; Nakano et al., 1990], потім факт активації був стверджений, але пов’язували це з пригніченням стероїдогенезу [Hajnoczky et al., 1992]. Останнім часом одержані нові дані, які свідчать про участь ПКС в опосередкуванні ефекту К+ в адренокортикоцитах [Betancourt-Calle et al., 2001]. Нами одержані дані, які вказують на участь внутрішньоклітинного депонованого кальцію, фосфоліпідів, що містять інозитом, та пов’язаної з ними активації ПКС, в посиленні регуляторних сигналів іонів К+ [Pushkarev, Mikosha, 1991].
На рис. 10 представлені результати вивчення впливу різних концентрацій іонів калію на вміст мічених 3Н-інозитолом поліфосфоінозитидів в клітинах надниркових залоз людини у присутності іонів літію, який пригнічує фосфатазу інозитол-фосфату і, таким чином, гальмує процес ресинтезу поліфосфоінозитидів. Кількість мічених фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату, фосфатидилінозитол-4-фосфату та фосфатидил-інозитолу при підвищеній концентрації іонів калію (8,5 мМ) помітно зменшується вже на першій хвилині інкубації (рис. 10, криві 1’ – 3’). При концентрації калію 3,5 мМ рівень ФІ та поліфосфоінозитидів протягом 20 хв інкубації майже не змінювався (рис. 10, криві 1 – 3). Розділення інозитолфосфатів на колонці з аніонообмінником показало, що через 20 хв інкубації клітин при підвищеній концентрації іонів калію (8,5 мМ) в середовищі відбувається накопичення інозитолмоно-, ди- і трифосфатів.
Відомо, що дія ангіотензину опосередковується розпадом поліфосфоінозитидів та підвищенням концентрації Са2+ в клітині, як за рахунок транспорту з позаклітинного середовища, так і в результаті звільнення з внутрішньоклітинного депо [Aptel et al., 1999; Rossier et al., 1997]. Однак, дослідження впливу калію на мобілізацію іонів кальцію з внутрішньоклітинних депо дало негативний результат [Kojima et al., 1985; Nakano et al., 1990]. Як вже згадувалось (рис. 3), додавання в інкубаційне середовище КСІ підсилює вхід кальцію в адрено-кортикальні клітини. Попередня інкубація клітин з рутенієвим червоним, який блокує вивільнення іонів кальцію з внутрішньоклітинного пулу [Antoniu et al., 1985], при підвищеній концентрації К+ (8 мМ) знижувала транспорт Са2+ до рівня, що спостерігався у присутності 3 мМ К+ (точка 0 хв). Отримані дані добре узгоджуються з моделлю Putney, згідно з якою швидкість надходження Са2+ у клітину із позаклітинного простору визначається швидкістю вивільнення іону із внутрішньоклітинних депо [Putney, 1986]. У присутності рутенієвого червоного знижувався до базального рівня і стимульований калієм синтез альдостерону. Отже, дія іонів калію, як і ангіотензину, потребує вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо. Оскільки вивільнення внутрішньоклітинного кальцію у клітині відбувається внаслідок агоніст-залежного утворення інозитолтрифосфату, цей факт можна розглядати, як ще одне підтвердження участі поліфосфоінозитидів у реалізації ефектів іонів калію в адренокортикоцитах.
Зміни рівня інозитолфосфатів та поліфосфоінозитидів внаслідок інкубації тканини у середовищі з різним вмістом іонів К+ вказують на можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іону в адренокортикоцитах людини. Розподіл ізоформи ПКСб в субклітинних фракціях, одержаних з умовно нормальної тканини надниркових залоз людини, після інкубації зрізів у середовищі з різним вмістом К+, вивчали за допомогою імуноблотингу. Встановлено, що кількість ферменту зростає в мікросомах і знижується в цитозолі при підвищенні концентрації К+ до 8,5 мМ (рис. 11). Таке накопичення ПКСб у мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. Щоб переконатися у цьому, визначали активність ПКС в цитозолі і мікросомах, одержа-
них з надниркових залоз людини (УНТ). Максимальна активність фермента в УНТ також спостерігається при концентрації калію 8,5 мМ. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію, активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К+. Можливо, цей факт якось пов’язаний з гальмуванням синтезу альдостерону при низьких концентраціях калію. Оскільки УНТ людей із хворобою Іценка-Кушинга могла нести певний відбиток хвороби і не відображати повною мірою характер процесу в нормальній тканині, був поставлений ряд дослідів на надниркових залозах морських свинок. При цьому, для встановлення залежності процесу активації ПКС від обміну фосфоінозитидів та стану внутрішньоклітинного депо Са2+, в дослідах використовувались іони літію та барвник рутенієвий червоний. Активність ферменту визначали в безклітинній системі після інкубації тканини надниркової залози в середовищі з різним вмістом К+. З рис. 12 видно, що зі збільшенням концентрації калію в середовищі, активність ПКС в мікросомах значно зростає, досягаючи свого максимуму при 5-8 мМ іона. В той же час, активність ферменту в цитозолі майже не змінювалась, а при 8 мМ К+ навіть знижувалась, порівняно з контролем (1 мМ К+). Фракціонування білків мікросом та цитозолю на хроматографічній колонці з ДЕАЕ-целюлозою підтвердило факт транслокації ПКС з цитозолю в мікросоми. У присутності 10 мМ літію, інгібітора обміну фосфоліпідів, що містять інозитол, та блокатора кальцієвих внутрішньоклітинних депо, рутенієвого червоного, активність ПКС в мікросомах не змінювалась, залишаючись на низькому рівні. У присутності барвника знижується також стимульоване підвищеними концентраціями калію фосфорилювання білків [Pushkarev et al., 1991; Пушкарев, Тронько, 1992б]. Очевидно, для активації фермента іонами калію необхідно вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного пулу. Пригнічення стимульованої К+ секреції альдостерону та кальцієвого сигналу у присутності рутенієвого червоного пізніше спостерігали і в ізольованих адренокортикоцитах щурів [Szabadkai et al., 1999]. Зважаючи на те, що в присутності рутенієвого червоного та інгібітора ПКС, стауроспорину, К+-залежний синтез альдостерону значною мірою пригнічується, можна дійти висновку, що активація цієї кінази є важливим етапом у залежній від К+ регуляції стероїдогенезу.
Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах показало значне посилення її активності, що, можливо, пов’язано з фосфорилюванням транскрипційних чинників, а через них - посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та регуляторні білки.
Таким чином, активація ПКС спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок, які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну поліфосфоінозитидів та мобілізації Са2+ з внутрішньоклітинних депо.
Останнім часом з’являються нові дані щодо участі інших месенджерних систем в регуляції біосинтезу альдостерону, в тому числі і цГМФ-залежної протеїнкінази [Gambaryan et al., 2003]. Ми вивчали вплив концентрації іонів калію в інкубаційному середовищі на вміст нуклеотиду в тканині надниркових залоз. Підвищення концентрації калію призводить до поступового зниження вмісту цГМФ у клітині. Не виключено, що гальмування мічення альдостерону при низьких концентраціях іонів калію пов’язано з високим рівнем цГМФ в адренокортикоцитах. Підтвердженням цього припущення може слугувати факт стимуляції утворення цГМФ інгібітором стероїдогенезу, атріальними натрійуретичними пептидами [Barrett, Isales, 1988].
Фосфорилювання і дефосфорилювання білків визначають направленість та інтенсивність багатьох біохімічних процесів, в тому числі і в надниркових залозах [Микоша, Тронько, 2004]. Як було показано вище, ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. В результаті активації протеїнкіназ відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.
Викликане підвищенням концент-рації калію в середовищі посилення біосинтезу альдостерону (див. рис. 1А) супроводжується посиленням фосфори-лювання білків (рис. 13). Радіоавтограф поліпептидів мітохондрій і цитозолю, після їх розділення в поліакриламідному гелі, також свідчить про більш інтенсивне включення мітки в білки зрізів, передінкубованих у середовищі, що містить 8 мМ К+, порівняно зі зрізами, інкубованими з 3 мМ калію. При підвищенні рівня калію в середовищі, у мітохондріях найбільш інтенсивно мітиться білок з молекулярною масою близько 75 кДа та, меншою мірою – 37 кДа. В цитозолі – білки з масою біля 37 і 75 кДа. Стосовно поліпептиду, масою близько 37 кДа, можна говорити про якісні зміни в його фосфорилюванні при підвищенні концентрації калію, як в мітохондріях, так і, особливо, в цитозолі. Цілком імовірно, що цей білок є незрілою формою білка StAR. За деякими даними, StAR є субстратом як ПКА, так і ПКС [Clark et al., 1995; Hartigan et al., 1995]. Його фосфорилювання передує процесингу, внаслідок чого білок зменшується до 30 та 29 кДа [Hartigan et al., 1995]. В основному він зосереджується в мітохондріях [Lehoux et al., 1999], але, як видно з наших даних, незріла форма цього білка міститься у значній кількості в цитозолі. Очевидно, синтез і фосфорилювання StAR відбувається в цитозолі, після чого білок потрапляє до мітохондрій, де й відбувається його процесинг.
У присутності хлорпромазину та стауроспорину стимульоване підвищеними (5 - 11 мМ) концентраціями калію фосфорилювання клітинних білків знижується (рис. 13), що свідчить про участь ПКС та Са2+/кальмодулін-залежної протеїнкінази в цьому процесі.
На відміну від підвищених концентрацій К+, практично не вивчалась регуляція секреції альдостерону при зниженні концентрації калію у крові та інкубаційному середовищі. При низьких концентраціях калію в інкубаційному середовищі включення міченого фосфату у білки також значною мірою зростає, причому амплітуда зростання навіть більша, ніж при підвищених концентраціях калію (рис. 13, контроль). Інгібітор протеїнкінази С, стауроспорин та рутенієвий червоний знижують фосфорилювання білків як при низьких, так і при високих концентраціях калію. Інгібітор кальмодуліну хлорпромазин пригнічує мічення білків фосфором тільки при високих концентраціях калію (рис. 13). Цей факт може свідчити про те, що посилення фосфорилювання білків при низьких та високих концентраціях калію здійснюється різними механізмами. Ефект високих концентрацій калію опосередковується Са2+ та кальмодулін-залежною протеїнкіназою, тоді як при низькій концентрації К+ активація фосфорилювання не потребує участі цієї кінази. Активація фосфорилювання при низькій концентрації калію та її гальмування стауроспорином може свідчити про участь протеїнкінази С у пригніченні синтезу альдостерону в цих умовах. Деякі дослідники вважають, що ця кіназа знижує продукцію гормону при її активації агоністами [Hajnoczky et al., 1992; Nakano et al., 1990]. Отже, інтенсивне фосфорилювання білків при низьких концентраціях калію, ймовірно, відображає активацію гальмівних механізмів щодо синтезу альдостерону.
Синтез білка здійснюється за участю цитоплазматичних РНП різних класів, тому нами була зроблена спроба дослідити фосфорилювання білків, пов'язаних з матричною і рибосомальною РНК. Оскільки стимуляція трансляції через транскрипцію займає значний проміжок часу, можна припустити, що синтез білків, які швидко мітяться, регулюється калієм на рівні трансляції. Одним із таких механізмів може бути фосфорилювання або дефосфорилювання компонентів апарату трансляції, у тому числі рибосом і мРНП. В результаті такої модифікації рибонуклопротеїдів мРНК, яка знаходиться у складі неактивних інформосом, може активуватися шляхом взаємодії з рибосомами і утворенням полірибосом.
Підвищення концентрації іонів калію в інкубаційному середовищі призводить до дефосфорилювання сумарних, вільних від мембран, рибонуклеопротеїдів. Порівняльне вивчення мічення вільних і мембранно-зв'язаних полірибосом у тканині, інкубованій при різних концентрація К+, показало, що фосфорилювання мембранно-зв'язаних полірибосом достовірно зростає при підвищенні концентрації калію в інкубаційному середовищі до 8,5 мМ. Обробка РНП тритоном Х-100 призводить до значного пониження включення мітки при 8,5 мМ К+ [Puskarev et al., 1996]. Отже, зростання мічення мембранно-зв'язаних полірибосом при 8,5 мМ К+ відбувається за рахунок фосфорилювання мембранних білків. Можливо, при цьому фосфорилюється пов'язана з мембранами фосфатаза, активація якої призводить до дефосфорилювання полірибосом при підвищеній концентрації калію в інкубаційному середовищі.
Таким чином, стимуляція калієм біосинтезу білка може бути обумовлена дефосфорилюванням РНП, опосередкованим фосфорилюванням зв'язаних з РНП мембран, яке, ймовірно, залежить від активності ПКС. Таке дефосфорилювання РНП і фосфорилювання пов'язаних з ними мембран могло б бути механізмом, відповідальним і за селективне посилення трансляції, обумовлюючи синтез поліпептидів, необхідних для здійснення стероїдогенезу в адренокортикальній клітині. Неясним, проте, залишається спосіб відбору мРНП, які фосфорилюються і дефосфорилюються в присутності К+. Можливо, такий відбір відбувається на рівні транскрипції або транспорту мРНП із ядра у цитоплазму.
Схема основних месенджерних механізмів, що опосередковують регуляторний сигнал К+ в адренокортикоцитах.
Умовні позначення: L, T – кальцієві канали; AC - аденілатциклаза; PLC – фосфоліпаза С; GP – G білки; DAG - диацилгліцерол; cAMP – циклічний АМФ; PKA – протеїнкіназа А; PKC – протеїнкіназа С; IP3 - інозитолтрифосфат; pStAR – непроцесована форма StAR; CaMPK – Са2+/кальмодулін-залежна протеїнкіназа ; fos – транскрипційний чинник, протоонкоген; CYP11B2 – ген альдостеронсинтази; CYPscc – ген десмолази; M - мітохондрії; “PL” – кальцієвий „трубопровід”; MM – клітинна мембрана. Решта позначень – в списку скорочень. Різна штриховка при позначенні іонів кальцію відображає їх різні джерела.
Базуючись на одержаних нами та літературних даних, можна стверджувати, що регуляція синтезу альдостерону іонами калію є значно складнішою, ніж вважалось до цього часу. Вище наведена підсумкова схема, що характеризує можливі месенджерні механізми, які опосередковують ефекти К+ в адренокортикоцитах.
К+, вочевидь, активує всі три основні месенджерні системи, що беруть участь у проведенні регуляторних сигналів агоністів, які впливають на стероїдогенез у надниркових залозах: цАМФ/ПКА [Пушкарев и др., 1989; Hyatt et al., 1986; Pushkarev, Mikosha 1991; Пушкарев и др., 1988; Tait, Tait, 1999], Са2+-кальмодулін/кальмодулін-залежну протеїнкіназу [Пушкарев, Тронько, 1992а; Condon et al., 2002; Ganguly et al., 1992; 1994; 1995] та Са2+-фосфоліпід-залежну ПКС [Пушкарев, Тронько, 1992б; Betancourt-Calle et al., 2001; Pushkariov et al., 1991; Pushkarev, Mikosha 1991]. А якщо врахувати, що регуляція утворення альдостерону кортикотропіном також залежить від Са2+, і АКТГ може викликати розпад поліфосфоінозитидів з утворенням ДАГ і транслокацією ПКС в мікросоми [Cozza et al., 1990], а ефект ангіотензину пов’язаний зі збільшенням вмісту сАМР [Bird et al., 1993], посиленням синтезу білка [Otis et al., 2004] та активаці єю білка-активатора стероїдогенезу, StAR [Betancourt-Calle et al., 2001], то можна вважати, що прості схеми регуляції стероїдогенезу залишились у минулому. Напевно, всі три основні фізіологічні агоністи – АКТГ, ангіотензин та К+ активують декілька месенджерних систем водночас, і зараз доцільно говорити тільки про місце кожної з них у проведенні регуляторного сигналу конкретного агоніста. Важливими завданнями, що стоять перед дослідниками, є вивчення значення кожної із систем месенджерів для цих агоністів, послідовності їх активації у часі та взаємодії між ними.
Модуляція ефектів К+ іонами літію, похідними 1,4-ДГП, о,п'-ДДД і NAE. Хоча літій давно використовується у психіатрії для лікування маніакальних станів, а також в ендокринології [Johnson, 1988], механізм його дії на молекулярному рівні залишається недостатньо дослідженим. Вважається, що літій впливає на систему вторинних месенджерів. Ці ефекти можуть призводити до зміни активності відповідних протеїнкіназ і фосфорилювання білків [Casebolt, Jope, 1991; Jope, Williams, 1994]. У попередньому розділі роботи вказувалось, що літій пригнічував активацію ПКС у клітинах кори надниркових залоз in vitro при підвищенні концентрації К+ в середовищі.
Стосовно ефекту іонів літію щодо стероїдогенезу у корі надниркових залоз були одержані суперечливі дані. Так, Balla і співавтори показали, що 10 мМ Li+ пригнічують стимуляцію ангіотензином II біосинтезу альдостерону [Balla et al., 1984]. З іншого боку, разова ін'єкція LiCl і тривале введення літію викликали підвищення рівня кортикостерону у щурів [Jacobs, 1978].
З даних, представлених на рис. 14, видно, що додавання в інкубаційну систему 10 мМ літію повністю знімає стимулюючий ефект калію при високих (5-11 мМ) концентраціях калію і водночас активує стероїдогенез при низьких. Подібні дані були одержані і при вивченні дії літію на мічення білка і РНК. Причиною пригнічення літієм стимульованого калієм стероїдогенезу може бути гальмування літієм ресинтезу фосфоінозитидів та активності протеїнкінази С внаслідок інгібування інозитолфосфатази. Крім того, спровоковане підвищенням концентрації калію в інкубаційному середовищі посилення транспорту кальцію в адренокортикоцити пригнічується у присутності літію, що може додатково впливати на активність протеїнкінази С і стероїдогенез.
Найбільш просте пояснення активації літієм синтезу альдостерону та мічення РНК і білків при низькій концентрації К+ полягає в тому, що іони літію можуть підмінювати іони калію, імітуючи дію останніх на процеси, що відбуваються в адренокортикальних клітинах. При підвищених концентраціях К+ сумарна концентрація двох іонів зростає до значень, які викликають інгібіторний ефект. Як уже зазначалося, оптимум стимуляції калієм стероїдогенезу та білку спостерігається при 5-8 мМ іону, і подальше її зростання зазвичай призводить до пригнічення цих процесів.
Відомо, що інгібітори кальцієвих каналів, похідні ДГП - нітрендіпін і ніфедіпін, гальмують К+-залежну активацію біосинтезу альдостерону [Aguilera, Catt, 1986; Finkel et al., 1984]. Таким чином, використання агоністів і антагоністів кальцієвих каналів дозволяє одержати цінні відомості про значення іонів Са2+ в регуляції секреції кортикостероїдних гормонів.
Метою даного фрагмента роботи було вивчення змін біосинтезу кортикостероїдних гормонів при варіюванні рівня К+ і модуляції функції кальцієвих каналів різними ДГП. У попередніх дослідах нами досліджувалася можливість застосування новосинтезованих ДГП для модуляції відповіді кори надниркових залоз на К+. В Інституті біоорганічної хімії НАН України і в лабораторії органічного синтезу та хімреактивів Інституту ендокринології були синтезовані 7 сполук дигідропірідинового ряду. Найактивнішою сполукою щодо стероїдогенезу виявився 2,6-диметил-3,5-ди-(етоксикарбоніл)-4-(м-,п-диметокси-феніл)-1,4-дигідропірідин, який одержав робочу назву ДГП-51. Додавання в інкубаційне середовище 50 нМ ДГП-51 повністю знімало стимуляцію синтезу альдостерону зрізами надниркових залоз морських свинок. Досліди з 3Н-холестерином підтвердили, що ДГП-51 впливає на мічення і синтез альдостерону тільки при підвищеній концентрації К+ в середовищі. Крім альдостерону, нами досліджено мічення кортикостерону, який може виконувати роль проміжного продукту при перетворенні холестерину в альдостерон [Юдаев и др., 1976, Vinson, 1992]. Мічення кортикостерону при підвищенні рівня К+ в інкубаційному середовищі змінюється більш виразно, ніж альдостерону, що можна пояснити коротшим ланцюгом хімічних перетворень при утворенні цього гормону. ДГП-51 пригнічує включення мітки 3Н-холестерину, порівняно з контролем, якщо утворення кортикостерону (як і альдостерону) стимулювалося високим рівнем К+. Оскільки утворення альдостерону починається з реакції відщеплення бічного ланцюга холестерину, і ця реакція є загальною для біосинтезу всіх стероїдних гормонів, ми досліджували вплив ДГП-51 на включення мітки холестерину в гідрокортизон і кортизон. Мічення гідрокортизону і кортизону змінюється таким же чином, що і мічення альдостерону і кортикостерону. Підвищення концентрації К+ в середовищі до 11 мМ збільшує включення 3Н в гормони. ДГП-51 за цих умов знижує використання 3Н-холестерину.
Схожість змін мічення мінерало- і глюкокортикоїдів, що спричиняють іони К+ і ДГП-51, дозволяє вважати, що К+ і ДГП-51 впливають на спільні для стероїдів етапи стероїдогенезу, до розділення шляхів їх біосинтезу. Найбільш вірогідно, цей спільний етап - десмолазна реакція, яка забезпечує утворення з холестерину прегненолону.
Нашу увагу привернули дані, що свідчать про властивість NAE змінювати швидкість переносу катіонів через мембрани, а саме: іонів кальцію, натрію та рубідію [Berdyshev et al., 1996; Gulaya et al., 1993]. Зокрема, анандамід є селективним блокатором фонових калієвих каналів в нейронах [Maingret et al., 2001], які забезпечують високу чутливість адренокортикоцитів до іона. NAE є ліпотропними сполуками й тому досить добре поглинаються збагаченими на ліпіди тканинами. Результати дослідів з міченим N-пальмітоїлетаноламіном, свідчать, що найбільша кількість мітки включається в надниркові залози [Жуков та ін., 2000]. Тому становило значний інтерес вивчення впливу NAE на залежний від калію синтез стероїдів і, в першу чергу, мінералокортикоїдів у корі надниркових залоз.
У першій серії дослідів вивчали вплив NAE, до складу якого входить ацил стеаринової кислоти (18:0). Виявилось, що в адренокортикоцитах морських свинок NAE посилює включення мітки до альдостерону та кортикостерону при 0,5 та 3,5 мМ К+. Натомість, при високих концентраціях калію, які стимулюють утворення альдостерону, спостерігається пригнічення мічення гормону. В той же час, в УНТ надниркових залоз людини NAE стимулював мічення альдостерону і при підвищених концентраціях К+ (рис. 15).
Одержані нами результати стосовно мічення альдостерону узгоджуються з літературними даними, за якими NAE пригнічує проникнення кальцію через мембрани, а, отже, перериває ланцюг передачі та посилення регуляторного сигналу агоніста в клітині. Є також дані, що свідчать про пригнічення анандамідом кальцієвих каналів L- і Т-типу та калієвих Kv 1.2 і TASK каналів [Chemin et al., 2001; Di Marzo et al., 2002; Maingret et al., 2001; Oz et al., 2000; Poling et al., 1996]. Важче пояснити посилення мічення альдостерону та кортикостерону у присутності NAE при низьких концентраціях калію. Можливо, процеси гальмування стероїдогенезу також потребують переносу кальцію через клітинну мембрану. Цілком імовірно, що NAE прямо впливає на транспорт К+ всередину адренокортикоцита, по аналогії з рубідієм [Gulaya et al., 1993].
У другій серії дослідів використовували суміш NAE, що містила похідні етаноламіну як з насиченими, так і з ненасиченими залишками жирних кислот. Вплив суміші NAE на мічення альдостерону був більш потужний, ніж у випадку з NAE (18 : 0), причому стимуляція мічення спостерігалась як при високих, так і при низьких концентраціях калію. Очевидно, властивості залишків жирної кислоти, що входять у склад NAE, мають значення у визначенні реакції адренокортикоциту. Не виключено, що продукти ліпоксі-геназного перетворення залишків жирних кислот, що входять до складу NAE, відіграють певну роль у проведенні регуляторного сигналу іонів калію.
Застосування о,п'-ДДД при хворобі та синдромі Іценка-Кушінга значно підвищило ефективність терапії цієї тяжкої патології. Реалізація ефектів хлодитану в клітинах кори надниркових залоз припускає, з однієї сторони, його втручання у біохімічні процеси, а з другої - існування захисних внутрішньоклітинних механізмів, що забезпечують знешкодження ксенобіотиків. Вважається, що механізм дії хлодитану на молекулярному рівні пов’язаний зі змінами складу, структури і функції мембран [Микоша, 1984].
Пошук механізмів, що забезпечують стійкість до хлодитану, та шляхів її подолання, ми проводили у різних напрямках. Враховуючи значення Са2+ для переносу сигналів агоністів і в життєдіяльності адренокортикоцитів, були досліджені ефекти о,п’-ДДД на перенесення 45Са2+ через мембрани адренокортикоцитів. Крім того, вивчали вплив хлодитану на основні метаболічні процеси надниркових залоз: мічення РНК, ДНК, білків та стероїдогенез.
Вище зазначалось (рис. 1Б), що підвищення вмісту калію до 8,5 мМ викликає вірогідне зростання включення мітки в альдостерон. о,п'-ДДД пригнічував мічення гормону, стимульоване високою концентрацією К+.
Попередня інкубація адренокортикоцитів з о,п’-ДДД повністю знімає ефект високої концентрації К+ щодо транспорту 45Са2+, знижуючи вхід кальцію в клітини до рівня, що спостерігався при 3,5 мМ калію.
Очікувалося, що о,п’-ДДД, деструктивна дія якого на клітини кори надниркових залоз добре відома, буде помітно впливати на рівень синтезу білка - одного з найважливіших біохімічних процесів у клітині. Однак, у присутності 5 мкМ о,п’-ДДД спостерігалися незначні зміни мічення білків. Інкубація зрізів з 50 мкМ о,п’-ДДД призводила до пригнічення мічення при високих та низьких концентраціях калію. Отже, апарат трансляції у клітинах надниркових залоз морських свинок виявляє певну стійкість проти дії о,п'-ДДД.
Мічення РНК також посилюється при відхиленнях концентрації К+ від фізіологічних значень в бік її збільшення або зменшення. У присутності о,п’-ДДД (5 мкМ) рівень транскрипції дещо знижується, а при підвищеній концентрації сполуки пригнічення мічення РНК сягає 90% щодо контролю.
Дослідження мічення ДНК свідчать, що підвищення концентрації калію в середовищі, порівняно з фізіологічною концентрацією іону, веде до незначного, але вірогідного посилення мічення ДНК в адренокортикоцитах (рис. 16). У присутності о,п'-ДДД мічення ДНК в цілому пригнічувалось, особливо при 8,5 мМ К+. Найбільш виразним цей ефект був за вищої концентрації о,п'-ДДД (50 мкМ), коли спостерігалось пригнічення включення тимідину практично для всіх досліджених концентрацій калію. Оскільки ефект хлодитану пов’язаний з дією на мембрани [Mikosha et al., 1999], можна припустити, що при цьому порушується механізм взаємодії або перенесення іонів калію через мембрану і, як наслідок, гальмуються всі процеси, які ініціюються при зміні концентрації калію в середовищі.
Таким чином, на клітинному рівні тканина надниркових залоз морських свинок не виявляє помітної стійкості до о,п'-ДДД. Всі біохімічні процеси, які досліджувалися, у тому числі і стероїдогенез, зазнають значного пригнічення, особливо при концентрації сполуки 50 мкМ. Можливо, захисні механізми щодо о,п'-ДДД у морських свинок спрацьовують на рівні організму, знешкоджуючи сполуку на шляху до надниркових залоз.
Цікавими виявилися результати, одержані при вивченні комбінованої дії о,п’-ДДД і NAE на мічення кортикостероїдів в УНТ від хворих з різними захворюваннями надниркових залоз - Іценка-Кушінга, альдостеромою і андростеромою. Як вже вказувалося, підвищення концентрації іонів калію достовірно стимулює включення мітки 3Н-холестерину в альдостерон (рис. 15). При всіх вивчених концентраціях К+ NAE достовірно підвищує включення мітки в гормон. Так само достовірно о,п’-ДДД знижує мічення альдостерону при 3,5 і 5,5 мМ К+. Порівняння ефектів сумісного введення NAE і о,п’-ДДД в систему з їх індивідуальними ефектами показало, що рівень мічення у цьому випадку наближався до контрольного значення і достовірно відрізнявся від ефектів NAE і о,п’-ДДД окремо. Відбувається немов би взаємна «нейтралізація» дії о,п’-ДДД і NAE. Можливо, що певні мембранні структури є їх спільними мішенями і захищаються NAE від дії о,п’-ДДД. Варто також відмітити, що вплив калію був вираженим на фоні додавання NAE, о,п’-ДДД, а також при їх сумісному введенні в інкубаційну суміш. Очевидно, дані сполуки впливають на базальний, а не на стимульований калієм стероїдогенез.
Включення мітки 3Н-холестерину в глюкокортикоїди істотно відрізняється від мічення мінералокортикоїдів. Спільним для всіх вивчених нами стероїдів є посилення їх мічення у відповідь на підвищення вмісту калію в середовищі. Це, мабуть, пов'язано з тим, що іони калію стимулюють не тільки кінцеві стадії утворення мінералокортикоїдів, але й початкові етапи перетворення холестерину, спільні для всіх стероїдів, а також впливають на швидкість його перенесення в мітохондрії. Що ж до ефекту о,п’-ДДД і NAE на мічення кортизолу і гідрокортизону в надниркових залозах людини, то він був практично відсутній. Цей факт підкреслює наше припущення про переважний вплив зазначених сполук на дистальні реакції стероїдогенезу, що призводять до утворення мінералокортикоїдів взагалі і альдостерону, зокрема.
Питання про те, за допомогою яких механізмів реалізується ефект о,п’-ДДД і NAE в клітині, практично не вивчене. Відомо, що мішенню обох сполук в адренокортикоцитах є клітинна мембрана [Gulaya et al., 1993; Mikosha et al., 1999]. Яким чином відбувається передача сигналу від клітинної мембрани до мітохондрій, залишається неясним. Відмічено пригнічення аденілатциклазної системи у присутності NAE [Childers, et al., 1994; Felder et al., 1993] та проникливості мітохондріальних мембран для Са2+ [Epps et al., 1982]. Щодо інших месенджерних систем, ефект NAE поки не з'ясований, проте, враховуючи істотну роль протеїнкінази C в посиленні регуляторного сигналу К+ [Pushkarev, Mikosha, 1991], можна припустити, що NAE може здійснювати стимулюючу дію на месенджерні системи, пов'язані з цією кіназою.
Іншим питанням, яке вивчалося, було дослідження залежності інтенсивності фрагментації ДНК під впливом о,п'-ДДД. Апоптоз відіграє важливу роль у елімінації пухлинних клітин і посилюється в останніх при дії деяких протипухлинних препаратів [Мохорт, 2000; Kerr e.a., 1994]. Оскільки при лікування певних випадків злоякісних перетворень у надниркових залозах використовується о,п-ДДД, метою нашої роботи було вивчення впливу о,п'-ДДД та взаємного впливу іонів калію та о,п'-ДДД на апоптоз у пухлинних тканинах надниркової залози людини. Очікувалося, що за присутності о,п-ДДД буде спостерігатися інтенсифікація апоптичних процесів у пухлинах кори надниркових залоз.
Передінкубація тканини з о,п-ДДД помітно прискорює апоптичні процеси в тканині. В пухлинах кори надниркових залоз людини ефект підвищеної концентрації іонів калію щодо апоптозу не дуже помітний. Передінкубація зрізів кори надниркових залоз з о,п'-ДДД при 8,5 мМ К+, як і у випадку з 3,5 мМ К+, призводить до значного посилення фрагментації ДНК.
Отже, як видно з наведених даних, передінкубація зрізів кори надниркових залоз з о,п'-ДДД призводить до значного посилення фрагментації ДНК. Можливо, протипухлинна дія цього препарату пов’язана саме з індукцією апоптозу в пухлинних клітинах кори надниркових залоз.
При аналізі впливу калію на основні метаболічні процеси потрібно враховувати, що адренокортикоцити клубочкової зони є високоспеціалізованими клітинами, основною функцією яких є синтез та секреція альдостерону. Виконанню цієї функції підкорені практично всі метаболічні процеси, за винятком тих, які спрямовані на підтримання життєдіяльності самих клітин. Тому навіть незначні зміни іонного складу в позаклітинному середовищі і, в першу чергу, концентрації К+, напевно, можуть викликати серйозну перебудову основних метаболічних процесів.
Виходячи із залежності синтезу і мічення стероїдів, білків та РНК від концентрації калію в середовищі, можна виділити 3 основних стани, в яких може перебувати адренокортикоцит. 1 – базальний стан, який спостерігається при фізіологічних концентраціях К+ і характеризується базальним, таким, що підтримує необхідну концентрацію гормону в крові, синтезом альдостерону і максимально спокійним, урівноваженим метаболізмом. 2 – стан збудження клітин, який виникає при підвищенні вмісту К+ і пов’язаний з активацією процесів, що забезпечують посилення біосинтезу та секреції альдостерону. Тривале знаходження адренокортикоцитів в цьому стані, можливо, викликає більш глибокі зміни метаболізму, які призводять до переходу клітин в S-фазу клітинного циклу і можуть бути основою проліферативних ефектів іона. 3 - стан збудження, який виникає при зниженні вмісту К+ і може бути пов’язаний з активацією процесів, що пригнічують утворення альдостерону.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети роботи одержані нові дані щодо значення найменш вивченого агоніста - іонів калію в системі регуляції біосинтезу альдостерону. Іони К+ є основним та універсальним регулятором секреції альдостерону в корі надниркових залоз. Іони К+ є головним регулятором калієвого гомеостазу в організмі. Участь інших агоністів та систем в регуляції концентрації К+ в плазмі крові, очевидно, є допоміжною, резервною.
1. Дія іонів К+ на адренокортикоцити людини і тварин супроводжується активацією трьох основних месенджерних систем, а саме: цАМФ-залежної, Са2+/кальмодулін-залежної та Са2+/фосфоліпід-залежної.
2. Активація фосфоліпід-залежного месенджерного каскаду іонами К+ в адренокортикоцитах людини та морських свинок включає розпад поліфосфоінозитидів, накопичення інозитолфосфатів та мобілізацію Са2+ з внутрішньоклітинних депо.
3. Стимулюючий ефект калію щодо стероїдогенезу в корі надниркових залоз значною мірою опосередковується Са2+/фосфоліпід-залежною ПКС. ПКС також бере участь у гальмуванні стероїдогенезу в корі надниркових залоз при концентраціях К+ в середовищі, що нижчі від фізіологічних.
4. Іони К+ стимулюють в корі надниркових залоз фосфорилювання білка, близького за масою до білка-регулятора гострої фази стероїдогенезу (StAR), і цей процес залежить від Са2+ та кальмодуліну.
5. Іони К+ активують в тканині кори надниркових залоз цАМФ/ПКА-залежний сигнальний каскад. Зростання концентрації К+ у середовищі призводить до підвищення вмісту цАМФ та активності ПКА в мікросомах і цитозолі адренокортикоцитів.
6. Субстратами протеїнкіназ, активність яких зростає при підвищенні концентрації іонів калію в інкубаційному середовищі, крім білка, близького за масою до StAR і мітохондріальних білків, є рибонуклеопротеїди та білки асоційованих з ними мембран. Таким чином може здійснюватися залежна від іонів К+ модуляція трансляції.
7. Активований іонами К+ в корі надниркових залоз стероїдогенез залежить від білкового синтезу. Зменшення або збільшення концентрації іонів калію в інкубаційному середовищі відносно фізіологічної концентрації іона спричиняє посилення мічення різних білків в тканині кори надниркових залоз.
8. В регуляції біосинтезу альдостерону калієм в корі надниркових залоз беруть участь такі елементи цитоскелету, як мікрофіламенти та мікротрубочки.
9. Відхилення концентрації іонів калію від фізіологічних значень спричиняє посилення мічення РНК в тканині кори надниркових залоз. Інгібітор синтезу мРНК б-аманітин пригнічує стероїдогенез, стимульований підвищенням концентрації іонів калію в середовищі.
10. Підвищення вмісту іонів К+ в інкубаційному середовищі стимулює мічення ДНК, що свідчить про можливі мітогенні та проліферативні ефекти іона в корі надниркових залоз.
11. Підвищення вмісту К+ в інкубаційному середовищі здійснює різні ефекти щодо апоптозу в умовно нормальній і пухлинній тканинах надниркових залоз людини: прискорює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині і не впливає, або уповільнює апоптичні процеси в пухлинній тканині надниркових залоз людини.
12. В клітинах кори надниркових залоз морських свинок N-ацилетаноламіни послаблюють ефект калію щодо мічення кортикостероїдів. В пухлинних тканинах кори надниркових залоз людини NAE посилює стероїдогенез та послаблює дію о,п'-ДДД.
13. Процеси, що стимулюються іонами К+ в тканині надниркових залоз (синтез альдостерону, мічення білків, РНК, ДНК, транспорт кальцію в адренокортикоцити) пригнічуються о,п'-ДДД. Стійкість тканини надниркових залоз морської свинки до хлодитану не проявляється на клітинному рівні. о,п'-ДДД прискорює фрагментацію ДНК у пухлинах кори надниркових залоз людини.
14. Іони літію здійснюють модулюючий вплив на залежні від К+ біохімічні процеси в корі надниркових залоз. При низьких концентраціях іонів калію, Li+ часто посилює ефекти К+, імітуючи його дію. За високих концентрацій К+, літій пригнічує його ефект.
15. Інгібіторний вплив ДГП на К+-залежні процеси в адренокортикоцитах опосередковується через зміни транспорту Са2+ в клітини.
CПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С., Комиссаренко В.П Влияние ионов калия на синтез быстрометящихся белков в срезах надпочечников морских свинок // Докл. АН УССР. – 1987. - Сер. Б, №2. - C.61-63.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
2. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Влияние концентрации К+ на скорость синтеза быстрометящихся белков в коре надпочечников // Биохимия. - 1987. – Т.52, №7. – С.1174-1179.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
3. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Фосфорилирование цитоплазматических рибонуклеопротеидов в клетках надпочечников морских свинок. Эффект АКТГ // Укр. биохим. журн. – 1987. - T.59, №5. - C.75-77.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
4. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Биохимические механизмы регуляции минералокортикоидной функции надпочечников ионами калия // Пробл. эндокринологии. – 1988. - Т.34, № 5. - С.78-83.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, узагальнення літературних та власних даних, участь у написанні статті.
5. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Участие сАМР в регуляции минералокортикоидной функции надпочечников ионами калия // Биохимия. - 1989. - T.54, №2. - C.323-327.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
6. Тронько Н.Д., Пушкарев В.М., Богданова Т.И., Саутин Ю.Ю., Микоша А.С. Получение и фракционирование в градиенте перколла клеток коры надпочечников морских свинок и характеристика их функционального состояния // Физиол. журн. – 1989. - T.35, №4. - C.52-61.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, участь у планування дослідів, проведенні досліджень, узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
7. Тронько Н.Д., Пушкарев В.М., Ременников Г. Бальон Я.Г. Микоша А.С. 1,4-Дигидропиридины - возможные модуляторы секреции альдостерона корой надпочечных желез // Докл. АН УССР. – 1989. - Сер. Б, №11. - C.77-80.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, участь у плануванні дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
8. Челнакова И.С., Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Участие белкового синтеза в К+-зависимой активации биосинтеза гормонов в коре надпочечников морских свинок // Пробл. эндокринологии. – 1990. - Т.36, №6. - С.64-68.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, участь у плануванні дослідів, проведенні досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
9. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д. Стимуляция ионами калия биосинтеза РНК в диспергированных клетках коры надпочечных желез // Докл. АН СССР. - 1990. - Т.311, №2. - С.504-505.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написання статті.
10. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д., Микоша А.С. Зависимость регуляторного воздействия ионов К+ на образование альдостерона в коре надпочечников от белкового синтеза // Докл. АН СССР. – 1991. - Т.318, №1. - С.241- 244.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.
11. Pushkarev V.M., Mikosha A.S. The participation of cAMP and protein kinase C in the regulation of aldosterone biosynthesis by potassium // Biomed. Sci. – 1991. - V.2. – P.135-139.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
12. Тронько Н.Д., Пушкарев В.М., Челнакова И.С., Яровая Л.В., Микоша А.С. Регуляция биосинтеза гормонов в надпочечных железах морских свинок иона-ми калия при действии дигидропиридинов. 1. Анализ изменений стероидогенеза, вызываемых дигидропиридинами //Физиол. журн. – 1991. - Т.37, №6. - С.55-60.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
13. Микоша А.С., Пушкарев В.М., Челнакова И.С., Ременников Г. Регуляция биосинтеза гормонов в надпочечных железах морских свинок ионами калия при действии дигидропиридинов. 2. Возможные механизмы изменений стероидогенеза, вызываемых 1,4-дигидроридинами, в диспергированных адренокортикоцитах // Физиол. журн. – 1991. - Т.37, №6, С.60-65.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
14. Pushkarev V.M., Tronko N.D., Mikosha A.S. Inhibition of K+-dependent stimulation of aldosterone production by lithium // Lithium. – 1991. – V. 2. – P.235-239.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
15. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д. Роль внутриклеточного связанного кальция и протеинкиназы С в К+-зависимой регуляции биосинтеза альдостерона // Биол. мембраны. – 1992. - Т.9, №6, C.56-61.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написання статті.
16. Пушкарев В.М., Тронько Н.Д. Влияние хлорпромазина на К+ -зависимую регуляцию биосинтеза альдостерона в коре надпочечников морских свинок // Пробл. эндокринологии. – 1992. – Т.38. - С.45-49.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, проведення досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написання статті.
17. Тронько Н.Д., Пушкарев В.М., Челнакова И.С., Саутин Ю.Ю. Микоша А.С. Некоторые итоги и перспективы изучения механизмов регуляции биосинтеза кортикостероидных гормонов // Эндокринология. – Киев: "Здоров’я", 1991. - С. 3-9.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, узагальнення літературних та власних даних, участь у написанні розділу статті.
18. Pushkarev V.M., Mikosha A.S., Tronko N.D., Yarovaya L.V. Lithium ions effect in vitro on K+-dependent stimulation of RNA and protein biosynthesis in adrenal cortex of guinea pig // Lithium. – 1994. - V.5. – P.47-52.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
19. Pushkarev V.M., Mikosha A.S., Prudiev D.P., Tronko N.D. Effect of K+ on the phosphorylation of ribonucleoproteins in the adrenocortical tissue // Endocrine regulations. - 1996. – V.30. – P.73-81.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
20. Тронько Н.Д., Саутин Ю.Ю., Пушкарев В.М., Челнакова І.С, Ковзун О.І. Мїкоша О.С. Шляхи внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів пролактину та іонів калію у клітинах кори надниркових залоз // Ендокринологія. - 1996. – Т.1, №1, C.5-13.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, узагальнення літературних та власних даних, участь у написанні розділу статті.
21. Mikosha A.S.,Kostyuchenko N.N., Pushkarev V.M. In vitro effects of adrenocorticolytic drug, mitotane on the responses of guinea pig adrenal tissue to different K+ concentrations // Эксп. онкология. – 1999. – Т.21. - C.64-69.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
22. Пушкарьов В.М. Вплив різних концентрацій К+ на синтез білка та РНК у корі надниркових залоз морських свинок. Ефект низьких концентрацій // Ендокринологія. – 1999. – Т.4, №1, С.55-60.
23. Пушкарьов В.М., Тронько М.Д., Костюченко Н.М., Микоша О.С. Залежність мічення альдостерону та фосфорилювання білків в корі надниркових залоз морських свинок від концентрації К+ у середовищі. Ефект низьких концентрацій // Ендокринологія. – 2000. – Т.5, №1. – С.123-126.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
24. Pushkarev V.M., Tronko N.D., Kostiuchenko N.N., Kovalenko A.E., Mikosha A.S. Modulation by N-stearoylethanolamine of K+ and Mitotane Effects on Steroid Hormones Labeling in Human Adrenocortical Tissue // Biomedical Res. – 2001. – V.22, №4. - Р.191-195.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
25. Пушкарьов В.М., Костюченко Н.М.. Вплив деяких антимітотичних агентів на залежну від калію стимуляцію мічення альдостерону // Ендокринологія. - 2003. - 8, №2. - С. 286-290.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів, написання статті.
26. Пушкарьов В.М.. Вплив К+ на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканині надниркових залоз людини // Ендокринологія. – 2005. – Т.10, №1. - С.57-62.
27. Пушкарьов В.М., Ковзун О.І., Тронько М.Д., Костюченко Н.М., Микоша О.С. Шляхи передачі регуляторного сигналу К+ в адренокортикальних клітинах людини // Укр. біохім. журн. – 2005. - Т.77, №1. - С.61-67.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
28. Kostyuchenko N., Pushkarev V., Kashevarov G., Tronko M., Komisarenko I., Mikosha O. Effects of N-acylethanolamines and various antimitotic agents on apoptotic DNA fragmentation in conventionally normal and tumor tissue of human adrenals // Exp. Oncol. – 2005. – V. 27, N 3. – P. 215-219.
Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, планування дослідів, участь у проведенні досліджень, статистична обробка та участь в узагальненні отриманих результатів, написанні статті.
АНОТАЦІЯ
Пушкарьов В.М. Біохімічні механізми регуляції стероїдогенезу в корі надниркових залоз іонами калію. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.01.14 – ендокринологія. - Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка, АМН України, Київ, 2005.
Дисертація присвячена дослідженню біохімічних механізмів регуляції стероїдогенезу в корі надниркових залоз найменш вивченим агоністом – іонами калію. Показано, що іони К+ стимулюють синтез і мічення альдостерону, посилюють фундаментальні метаболічні процеси – синтез білка, РНК, ДНК. Продемонстрована участь калієвих та кальцієвих каналів в регуляції біосинтезу альдостерону калієм. Досліджена роль білкового синтезу в залежній від іонів калію регуляції стероїдогенезу. Вивчені основні месенджерні системи, що беруть участь в опосередкуванні ефектів К+ в адренокортикоцитах. Доведена участь фосфоліпідів, внутрішньоклітинних кальцієвих депо і протеїнкінази С в К+-залежній регуляції біосинтезу альдостерону. Показана стимуляція іонами калію цАМФ/ПКА месенджерної системи. Продемонстрована можливість гальмування стероїдогенезу при зниженні концентрації калію в середовищі. Сформульовані гіпотези щодо значення К+ в системі регуляції стероїдогенезу в корі надниркових залоз; участі основних месенджерних систем в механізмах регуляції стероїдогенезу головними агоністами.
Ключові слова: кора надниркових залоз, іони К+, альдостерон, стероїдогенез, біосинтез білку, Са2+, цАМФ, кальмодулін, фосфоліпіди, протеїнкінази.
АННОТАЦИЯ
Пушкарев В.М. Биохимические механизмы регуляции стероидогенеза в коре надпочечних желез ионами калия. Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.01.14 – эндокринология. - Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П.Комиссаренко, АМН Украины, Киев, 2005.
Диссертация посвящена исследованию биохимических механизмов регуляции стероидогенеза в коре надпочечных желез наименее изученным агонистом – ионами калия.
Показано, что повышение концентрации ионов калия в среде приводит к существенной перестройке метаболизма адренокортикоцитов. Происходит стимуляция синтеза и мечения альдостерона, усиливаются фундаментальные метаболические процессы – синтез белка, РНК, ДНК. Активируются различные киназные системы, результатом чего является фосфорилирование белков в различных компартментах адренокортикальной клетки.
При помощи ряда ингибиторов ионных каналов и ионофоров продемонстрировано участие различных калиевых и кальциевых каналов в регуляции биосинтеза альдостерона ионами калия.
Исследована роль белкового синтеза в зависимой от ионов калия регуляции стероидогенеза. Доказана зависимость регулируемых калием стероидогенных процессов от трансляции, а также показано усиление мечения белков при отклонении концентрации иона в большую или меньшую сторону от физиологического уровня. Предложен возможный механизм модуляции калием трансляции путем фосфорилирования и дефосфорилирования белков, связанных с рибонуклеопротеидами и ассоциированными с ними мембранами. Стимуляция мечения РНК и ДНК при повышении содержания калия в инкубационной среде может свидетельствовать о пролиферативных эффектах иона в коре надпочечных желез.
Изучены основные мессенджерные системы, участвующие в опосредовании эфектов К+ в адренокортикоцитах. Доказано участие фосфолипидов, внутриклеточных кальциевых депо и протеинкиназы С в К+-зависимой регуляции биосинтеза альдостерона. Показана стимуляция ионами калия цАМФ/ПКА мессенджерной системы. Исследовано фосфорилирование белков в различных компартментах адренокортикоцитов.
Доказано участие Са2+ та Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы в фосфорилировании белка близкого по массе к белку-регулятору острой фазы стероидогенеза (StAR).
Опыты с колхицином и цитохалазином В показали, что в регуляции стероидогенеза ионами калия принимают участие такие элементы цитоскелета, как микротрубочки и микрофиламенты.
Продемонстрирована возможность торможения стероидогенеза в коре надпочечников при снижении концентрации калия в среде и установлены основные факторы, опосредующие такое торможение.
Показан стимулирующий эффект ионов калия на мечение основных глюкокортикоидных гормонов надпочечников, что свидетельствует о влиянии калия на начальные стадии стероидогенеза, общие для всех кортикостероидов.
Изучено влияние ряда естественных и синтетических модуляторов на стероидогенную функцию надпоченых желез в условиях ее стимуляции ионами калия – ионов лития, о,п’-ДДД, производных 1,4-дигидропиридина, N-ацилэтаноламинов. Полученные результати могут быть использованы в дальнейших доклиничных испытаниях, направленных на поиск гипотензивних и антиаритмических препаратов. Особый интерес в этом плане вызывает протестированный автором новосинтезированный препарат ДГП-51, заметно снижающий биосинтез альдостерона в коре надпочечных желез в условиях ее стимуляции ионами калия.
Показано влияние ионов калия и других соединений (ионы лития, о,п’-ДДД) на интенсивность апоптических процессов в условно нормальной и опухолевой ткани коры надпочечников человека. Оказалось, что ионы калия усиливают фрагментацию ДНК в условно нормальной ткани, соседствующей с опухолью, и не влияют или даже ослабляют апоптоз в опухолевой ткани.
Сформулирована концепция, согласно которой регуляция стероидогенеза ионами К+ занимает важнейшее, центральное место в общей системе регуляции стероидогенеза в коре надпочечников, а поддержание на физиологическом уровне концентрации К+ в плазме крови регулируются, главным образом, самим калием. Предполагается, что в механизмах регуляции стероидогенеза ионами К+, АКТГ и АІІ принимают участия все три основных мессенджерные системы - цАМФ-зависимая, Са2+/кальмодулин- зависимая и Са2+/фосфолипид- зависимая.
Ключевые слова: кора надпочечников, ионы К+, альдостерон, стероидогенез, биосинтез белка, Са2+, цАМФ, кальмодулин, фосфолипиды, протеинкиназы.
SUMMARY
Pushkarev V.M. Biochemical mechanisms of steroidogenesis regulation by potassium ions in the adrenal cortex. ??????????.
????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 14.01.14???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????, 2005.
???????????????????????????????????????????????????????????????????????????o??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????К+ ions stimulated synthesis and labeling of aldosterone, enhanced the fundamental metabolic processes – synthesis of proteins, RNA, DNA. The participation of potassium and calcium ion channels in the control of aldosterone biosynthesis was demonstrated. The role of protein synthesis in potassium-dependent regulation of steroidogenesis was studied. The main messenger systems participating in К+ effects mediation in adrenocorticocytes were estimated. The involvement of phospholipids, intracellular calcium stores and protein kinase C in К+-dependent control of aldosterone synthesis was proved. The stimulation of cAMP/PKA signaling system by potassium ions was shown. The possibility of steroidogenesis inhibition by low potassium concentrations was demonstrated. The concepts on the role of К+ ions in the system of steroidogenesis control in the adrenal cortex, the involvement of the messenger systems in the mechanisms of steroidogenesis regulation by main agonists are suggested.
Key words: adrenal cortex, К+ ions, aldosterone, steroidogenesis, protein biosynthesis, Са2+, cAMP, calmodulin, phospholipids, protein kinases.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ
|
АII |
– ангіотензин II |
|
АКТГ |
адренокортикотропний гормон |
|
Анандамід |
N-арахідоноїлетаноламін |
|
АТФ |
аденозинтрифосфат |
|
БСА |
бичачий сироватковий альбумін |
|
ДАГ |
диацилгліцерол |
|
ДГП |
– 1,4-дигідропіридини |
|
о,п’-ДДД |
– 2-о-хлорфеніл-2-п-хлорфеніл-1,1-дихлоретан |
|
ЕГТА |
етиленгліколь-біс(2-аміноетил)-тетраацетат |
|
ЕДТА |
етилендіамінтетраацетат |
|
ІФ |
– інозитолмонофосфат |
|
ІФ2 |
– інозитолдифосфат |
|
ІФ3 |
– інозитолтрифосфат |
|
НАДФH |
– нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат, відновлений |
|
ПААГ |
- поліакриламідний гель |
|
ПКА |
протеїнкіназа А |
|
ПКС |
протеїнкіназа С |
|
РАС |
– система ренін-ангіотензин |
|
РНП |
– рибонуклеопротеїди |
|
УНТ |
- умовно нормальна тканина |
|
ФМСФ |
– фенілметилсульфонілфторид |
|
цАМФ |
циклічний аденозинмонофосфат |
|
цГМФ |
циклічний гуанозинмонофосфат |
|
CRE |
– цАМФ-респонсивний елемент |
|
CREB |
– білок, що зв’язується з цАМФ-респонсивним елементом |
|
HEPES |
– N-(2-гідроксиетил)піперазин-N-2-етансульфонова кислота |
|
MAPK |
– протеїнкінази, що активуються мітогенами |
|
NAE |
N-ацилпохідні етаноламіну |
|
SDS |
– додецилсульфат натрію |
|
StAR |
- білок-регулятор стероїдогенезу (steroidogenic acute regulatory protein) |
М Ц М Ц М Ц
К+ - - 3,5 3,5 8,5 8,5
EMBED Unknown
Рис. 12. Активність протеїнкінази С в мікросомальній фракції та цитозолі, одержаних з тканини кори надниркових залоз морських свинок, в залежності від концентрації К+ в інкубаційному середовищі.
EMBED Unknown
Рис. 13. Залежність інтенсивності включення міченого фосфату у білки адренокортикоцитів морських свинок від концентрації К+ та присутності стауроспорину і хлорпромазину у інкубаційному середовищі.
К+, мМ
MM
Цитоплазма
K+
CYPSCC
Ядро
CYP11B2
CREB
CaMPK
“PL”
Ca2+
PKC
PKA
cAMP
AC
PLC
L
T
K+
Ca2+
MT
GP
K+
K+
Ca2+
IP3
DAG
fos
CRE
pStAR
37
StAR
30
Рис. 14. Вплив іонів калію та літію на утворення альдостерону тканиною кори надниркових залоз морських свинок. 1- контроль; 2 – Li+, 10 мМ.
%
2
1
К+, мМ
Рис. 15. Зміни мічення альдостерону в зрізах надниркових залоз людини при різних концентраціях К+, та в присутності модуляторів.
EMBED Unknown
EMBED Unknown
Рис. 16. Вплив о,п’-ДДД на мічення ДНК в надниркових залозах морських свинок.