Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Академія медичних наук України
Інститут гематології та трансфузіологї
Костюченко
Лариса Василівна
УДК 612.419.014.24+612.014.464
Зміни морфофункціональних та імунологічних властивостей клітин і біохімічного складу плазми крові
під впливом озонування
14.01.31 —гематологія та трансфузіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ —
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України
Науковий керівник —доктор медичних наук
Новак Василь Леонідович,
директор Інституту патології крові
та трансфузійної медицини АМН України
Офіційні опоненти —доктор медичних наук
Овсяннікова Людмила Михайлівна
провідний науковий співробітник лабораторії молекулярної біології
Інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України
—доктор медичних наук
Тимченко Анатолій Сергійович,
завідувач лабораторії плазмових
препаратів крові Інституту гематології
і трансфузіології АМН України
Провідна установа —Інститут експериментальної патології, онкології і радіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ
Захист дисертації відбудеться 13.11.2002 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої Ради Д 26.612.01. в Інституті гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12).
Автореферат розісланий 11.10.2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Коміссаренко В.Г.Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Озонотерапія –новий напрямок лікування низки захворювань, який почав впроваджуватись в останні роки у багатьох галузях медицини. Метод озонотерапії з 2001 р. офіційно зареєстрований в Україні.
Як потужний окисник з дезинфікуючими властивостями озон використовується для лікування захворювань інфекційної етіології, переважно локально. При застосуванні озону внутрішньосудинно (озонування крові, інфузії озонованих розчинів) чи в порожнини тіла, окрім інактивації збудників, відзначають відновлення кисневого гомеостазу, дезінтоксикаційний, імуномодулюючий, протипухлинний ефекти (Viebahn R., 1994; Конторщикова К.Н., 2001; Щербатюк Т.Г., 2001). Разом з тим, описано також негативну дію озону, ускладнення в умовах експерименту та при проведенні лікувальних сеансів пацієнтам (Schmitt H., 1982; Jacobs M., 1982).
Найбільш дієвим і агресивним вважається внутрішньосудинний шлях введення озону, при якому ця високоактивна сполука в першу чергу контактує з клітинами крові і плазмою. На сьогоднішній день практично відсутні дані про зміни біохімічних показників, функціональної активності та життєздатності клітин в озонованій крові, яка при подальшому введенні пацієнту зумовлює певні ефекти в організмі в цілому. В зв'язку з цим актуальним є вивчення впливу озону на показники гомеостазу в експерименті.
Неоднозначні підходи різних дослідників щодо дозування озону. У Західній Європі використовують концентрації озону від 1 до 75 мкг/мл в киснево-озоновій суміші (Antoszewski Z., 1997; Viebahn R., 1994). Російська школа застосовує концентрації на порядок нижчі —до 5-6 мг/л (Конторщикова К.Н., 1992). Обговорюється необхідність чіткого обліку доз та оцінки дозозалежності отриманих терапевтичних ефектів при озонотерапії (Перетягин С.П., 1998).
Таким чином, вивчення впливу різних концентрацій і режимів озонування крові в експериментальних умовах in vitro є необхідним щодо виявлення можливої побічної дії озону на клітини крові, обгрунтування допустимих доз для її обробки і вибору параметрів контролю за безпекою озонотерапії в клінічній практиці.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі екстракорпоральної гематології у рамках науково-дослідної роботи Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України: "Значення цитокінового профілю у хворих злоякісними лімфопроліферативними захворюваннями для діагностики та прогнозування перебігу процесу з урахуванням імунофенотипічних, цитогенетичних особливостей і епідеміологічних аспектів диференційованого лікування із застосуванням методів еферентної терапії" (шифр 04.97, № держреєстрації: 0 197 U 000 988).
Мета роботи. Визначити оптимальні режими озонування крові і дати рекомендації щодо його можливого застосування в клінічній практиці на основі оцінки впливу різних доз киснево-озонової суміші на морфофункціональні, імунологічні та біохімічні показники периферичної крові in vitro.
Основні задачі дослідження.
1. Вивчити в експерименті in vitro дію різних концентрацій озону на морфофункціональні показники еритроцитів та рівень гемолізу.
. З'ясувати вплив озону in vitro на деякі показники неспецифічної резистетності, гуморального імунітету і склад основних популяцій та субпопуляцій лімфоцитів, продукцію IL-1.
. Вияснити результат дії різних концентрацій озону in vitro на показники системи гемостазу та функцію тромбоцитів.
. Дослідити особливості впливу різних концентрацій озону на біохімічний склад крові (ферменти, електроліти, білковий і ліпідний склад, глюкозу) та кислотно-лужну рівновагу.
. На основі отриманих експериментальних даних визначити оптимальні можливі режими обробки крові озоном для клінічного застосування.
Об'єкт дослідження –кров здорових осіб (донорів), оброблена киснево-озоновою сумішшю.
Предмет дослідження –морфофункціональні показники клітин крові та біохімічні параметри плазми під дією різних концентрацій озону.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено вплив озону in vitro на основні морфофункціональні властивості клітин периферичної крові. Доведено, що обробка крові киснево-озоновою сумішшю веде до окисної деструкції еритроцитів (гемолізу), ступінь вираженості якої знаходиться у лінійній залежності від концентрації озону в суміші. Встановлено безпечні щодо гемолізу концентрації озону для різних режимів озонування крові. Показано, що в безпечному діапазоні концентрацій (при 10 мкг/мл) озонування in vitro стимулює фагоцитарну активність та окисні процеси в нейтрофілах, приводить до зниження компонентів системи комплементу С3 і С4. Високі дози озону (50-60 мкг/мл) приводять до окисної деструкції лейкоцитів і лімфоцитів. Вперше виявлено дозозалежний ефект стимуляції озоном продукції IL-1 в культурі лейкоцитів. З'ясовано механізми впливу озону in vitro на показники системи гемостазу, який полягає у зниженні кількості тромбоцитів та дозозалежному пригніченні їх АДФ- і рістоцетин-індукованої агрегації. Вияснено характер і ступінь зрушень кислотно-лужного стану крові при різних методиках і дозах озонування. Встановлено, що внаслідок гемолізу в озонованій крові зростає вміст внутрішньоклітинних ферментів (LD, ALT, AST), калію, заліза, непрямого білірубіну та знижується рівень лужної фосфатази.
Практичне значення одержаних результатів. Вперше науково обгрунтовано максимально допустимі дози/концентрації озону для обробки крові в різних режимах. Доведено необхідність проведення моніторингу параметрів гемолізу (вільного гемоглобіну, відсотку гемолізу), показників зсідання крові і функції тромбоцитів при парентеральних способах застосування озону для своєчасної профілактики можливих ускладнень. Розроблено рекомендації щодо допустимих режимів озонування крові для використання у клінічній практиці. Врахування результатів експериментальних досліджень в практичній медицині дозволить підвищити безпеку озонотерапії та ефективність її застосування.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто визначила актуальність і ступінь вивчення проблеми, вибрала і опрацювала методики досліджень, сформулювала мету і завдання роботи, спланувала і виконала представлені в дисертації дослідження. Вивчення морфофункціональних властивостей клітин крові, показників системи зсідання і функції тромбоцитів проведено на базі Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України. Визначення імунологічних та біохімічних показників виконано у клінічній лабораторії Львівської обласної дитячої спеціалізованої клінічної лікарні (завідувач лабораторії –
к.мед.н. Петрух А.В.). Імунологічні дослідження проведено спільно з Петрухом А.В., Глинською О.В.
Здобувач критично проаналізувала використану літературу, провела статистичну обробку отриманих даних, розробила таблиці і рисунки. Представлені у дисертації результати досліджень, їх аналіз та інтерпретація, а також наукові висновки належать авторові.
Висловлюю щиру вдячність за сприяння у виконанні роботи лікарям реанімаційного відділення, клінічної лабораторії ОДСКЛ та лабораторії технології трансфузійних препаратів Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України, а також завідувачу кафедри імунології та алергології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця проф. Дранніку Г.М.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи представлено і обговорено на I Національному конгресі України з імунології, алергології та імунореабілітації (Алушта, 1998р.), IV Українській науково-практичній конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології (Київ, 1999 р.).
Публікації
Всього за матеріалами лосліджень опубліковано 6 наукових праць, з них 4 у провідних фахових журналах та збірниках наукових праць, дві —в збірнику тез конгресу та матеріалах конференції.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 120 сторінках машинопису, містить 19 таблиць, ілюстративний матеріал займає 12 сторінок і містить 39 рисунків. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів і матеріалів, розділу власних досліджень, що складається з чотирьох підрозділів, розділу аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та практичних рекомендацій, списку використаної літератури, що включає 141 джерело.
Основний зміст роботи.
У вступі обгрунтовується актуальність теми, визначається мета і завдання роботи, її наукова новизна, практична цінність, а також подано інформацію про апробацію роботи, впровадження її результатів, публікації автора.
У першому розділі представлено відомості про біохімічні властивості озону та механізми його впливу на організм при застосуванні з лікувальною метою. Наведено літературні дані про терапевтичне застосування озону і його ефективність при різних захворюваннях. Вказано на неодностайність підходу різних шкіл озонотерапії до дозування і способів застосування озону. Відзначено існування різних точок зору щодо безпеки методу озонотерапії та проаналізовано роботи, в яких вивчалась побічна дія озону в експерименті та клінічній практиці. При парентеральному шляху введення озону і прямому контакті його з клітинними елементами крові та плазмою можна очікувати значних змін морфофункціональних властивостей клітин та біохімічного складу плазми крові. Ці аспекти дії озону залишаються мало вивченими. В літературі відсутні дані про методи та параметри контролю за безпекою озонотерапії, зокрема при озонуванні крові.
Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені in vitro з цільною донорською кров'ю (табл. 1), яку обробляли киснево-озоновою сумішшю (КОС) на апараті для озонотерапії АТО-1 ("Kriometrum", Польща).
Застосовувались два способи озонування крові, відомі в літературі як велика та мала озонотерапія. При першому способі (велика озонотерапія) об'єктом досліджень була консервована цільна донорська кров, заготовлена на стабілізаторі “Глюгіцир”у співвідношенні 1:4 (стабілізатор : кров) з терміном зберігання до трьох діб. Взяту від одного донора кров в кількості 400 мл переводили у стерильні флакони по 100 мл. Отримані таким чином 4 проби крові обробляли КОС з концентрацією озону 40, 50, 60 та 75 мкг/мл в режимі "озонування крові". Такі концентрації озону були обрані згідно існуючих рекомендацій щодо проведення великої автогемоозонотерапії (від 1 до 50 мкг/мл), а вищі від рекомендованих (60 та 75 мкг/мл) –у зв'язку з можливістю виявити побічні ефекти озону при підвищенні його концентрації та відповідно до можливостей апарату АТО-1. Особливістю обробки крові даним методом є те, що в процесі проходження через систему озонування кров підлягає дії робочого розрідження (від'ємного, стосовно атмосферного, тиску до -0,05 МПа). КОС в об'ємі 400 мл подається у флакон, де і відбувається озонування. Таким чином, об'ємне співвідношення між кров'ю і КОС при цьому методі озонування складало 1:4 і дози озону на 1 мл крові становили 160, 200, 240 та 300 мкг.
Таблиця 1
Характеристика проведених досліджень
Метод озонування Кількість донорів Кількість зразків крові Стабілізатори Виконані дослідження
Велика озонотерапія 1:4 "Глюгіцир" гематологічні, біохімічні, показники гемолізу та кислотно-лужного стану, вміст 2,3-ДФГ та АТФ в еритроцитах
Гепарин гематологічні, показники гемолізу, 2,3-ДФГ, АТФ та ЕФР в еритроцитах
Мала Гепарин імунологічні
озонотерапія Гепарин продукція IL-1b
1:4 Цитрат натрію агрегація тромбоцитів
Цитрат натрію АПТЧ, толерантність плазми до гепарину
Мала озонотерапія 1:1 Гепарин гематологічні, показники гемолізу та кислотно-лужного стану
При другому способі озонування використовували свіжу гепаринізовану або стабілізовану цитратом натрію венозну кров, взяту в здорових осіб в кількості 8 мл або 20 мл у шприци об'ємом 20 мл по 4 мл у кожний. Таким чином від одного донора отримували від 2-х до 5-ти проб крові для досліджень. Обробка отриманих таким чином проб проводилась киснево-озоновою сумішшю з концентрацією озону 1,10, 40 та 75 мкг/мл в режимі "обколювання озоном" шляхом змішування їх у шприці в об'ємному співвідношенні 1:4 або 1:1 (кров: КОС). Дози озону на 1 мл крові при цьому складали 4, 40, 160 та 300 мкг (для співвідношення крові і КОС 1:4) і 1, 10, 40 та 75 мкг (для співвідношення крові і КОС 1:1).
До і після обробки озоном різних концентрацій в зразках крові визначали низку лабораторних показників (див. табл.1). Для досліджень, в яких озонування крові проводилось методом великої озонотерапії, крім тестування крові контрольної групи І, взятої із герметично закритих флаконів до обробки, були проведені дослідження крові після пропускання її через систему озонування, але без застосування КОС. Таким чином оброблена кров зазнавала впливу від'ємного тиску та повітря, що знаходилось в системі. Ці дослідження склали контрольну групу ІІ.
Кількісний аналіз клітин периферичної крові, визначення рівня гемоглобіну, гематокриту проводились на гематологічному аналізаторі Coulter YT (США) методом кондуктометрії. Морфологію клітин крові аналізували шляхом мікроскопії після пофарбування по Романовському –Гімзе. Для оцінки впливу озону на еритроцити (гемоліз) досліджували концентрацію вільного гемоглобіну в плазмі крові та надосадовій рідині кількісним колориметричним методом, відсоток гемолізу –за Дервізом (1966). З морфофункціональних властивостей еритроцитів визначали їх елекрофоретичну рухливість (ЕФР) на цитоферометрі фірми "Оптон" (Німеччина), концентрацію 2,3–ДФГ –за методом Раппопорта в модифікації Н.П. Мєшкової і Н.В. Алексахіної (1954), вміст в еритроцитах АТФ –за методом визначення фосфору з утворенням комплексу малахітового зеленого з фосфорномолібденовою кислотою (А.А. Покровский, 1969) .
Для дослідження впливу озонування на показники імунної відповіді здійснювали кількісне визначення Т-лімфоцитів (СD3+), Т-гелперів (СD4+), Т-суперсорів (СD8+), NK-клітин (СD16+/56+), В-клітин (СD19+) методом проточної цитометрії за допомогою моноклональних антитіл ("Becton Dickinson", США). Вміст імуноглобінів A, M, G в плазмі крові визначали методом кінетичної нефелометрії на аналізаторі ICS –("Beckman", США), а вміст імуноглобуліну Е —методом твердофазного імуноферментного аналізу за допомогою тест-систем Labodia-Xema (Швейцарія). Кількісне визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводилось за допомогою ПЕГІКЕМ –тесту. Фагоцитарна активність нейтрофілів (ФАН), фагоцитарне число (ФЧ) визначали після 30- і 120-хвилинної інкубації лейкоцитів з культурою St. аureus, підраховували індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ), проводили спонтанний тест з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест). Рівень компонентів системи комплементу С3 та С4 визначали імунохімічним методом на аналізаторі ІCS –("Beckman", США) з використанням моноспецифічних сироваток фірми "Elitech". Продукцію IL-1b визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу в культуральній рідині після 48-годинної інкубації лейкоцитів з пірогеналом, а в частині досліджень —без пірогеналу. Використовували набір реагентів ProCon IL-1b ("Протеїновий контур", С.-Петербург).
Біохімічні дослідження плазми крові (загальний білок, альбумін, холестерин, тригліцериди, загальний і прямий білірубін, сечовина, креатинін, сечова кислота, ALT, AST, GGTP, лужна фосфатаза, LD, кальцій, фосфор, хлориди, магній, залізо) проводили на біохімічному аналізаторі RA – ТМ System фірми Technikon (США) згідно стандартів IFCC (Міжнародна федерація клінічної хімії). Білкові фракції визначали електрофоретичним методом на ацетатцелюльозі. Кількість калію, натрію досліджували методом полум'яної фотометрії на аналізаторі "Lytetek" ("Bio- Dynamiks", США), а показники кислотно-лужної рівноваги —на газовому аналізаторі pH/Blood Gas Analyzer 1306 ("Instrumentation Laboratory", США).
Для оцінки впливу озону на систему зсідання крові досліджували кількість тромбоцитів і їх агрегацію з АДФ та рістоцетином, визначали час рекальцифікації, протромбіновий час плазми, активований парціальний тромбопластиновий час (АПТЧ), загальний фібриноген, етаноловий тест, фібриноген В, час фібринолізу за стандартними методиками. Толерантність плазми до гепарину визначали однопробірочним методом по Sigg (1952).
Для статистичної обробки результатів було створено бази даних і статистично їх оброблено за допомогою пакету програм "Statistica for Windows 4.0". В зв'язку з невеликою кількістю результатів досліджень у виборці і негаусівським розподілом параметрів для оцінки динаміки величин після обробки озоном було застосовано парний тест Вілкоксона.
Основні результати дослідження.
Вплив різних режимів озонування на кількість еритроцитів та їх морфофункціональні показники. Перша серія дослідів була проведена з консервованою кров'ю донорів методом великої озонотерапії. Отримані результати представлені у табл.2 . Встановлено, що при озонуванні консервованої крові методом великої озонотерапії при концентраціях озону 40-75 мкг/мл відмічається гемоліз з вірогідним зниженням числа еритроцитів, різким зростанням відсотку гемолізу та концентрації вільного гемоглобіну при всіх застосованих дозах озону. Цей негативний вплив озону посилюється також за рахунок дії від'ємного тиску, що зазнає кров під час проходження через систему для озонування. Найбільш чутливими при цьому є визначення відсотку гемолізу та концентрації вільного гемоглобіну, які зростають прямо пропорційно до збільшення концентрації озону в КОС. Вміст 2,3–ДФГ та АТФ в еритроцитах після озонування збільшується, проте це зростання не є дозозалежним та не є вірогідним порівняно з контролем ІІ. Можливо, цей ефект спостерігається за рахунок збагачення киснем консервованої крові в процесі пропускання її через систему для озонування та дещо посилюється при озонуванні внаслідок дії КОС.
Друга серія дослідів виконана з свіжою донорською кров'ю після обробки її методом малої озонотерапії при співвідношенні крові і КОС 1:4. Спостерігали різке підвищення відсотку гемолізу та вмісту вільного гемоглобіну вже при концентрації озону 1 мкг/мл (р “,001) та прямо пропорційне зростання цих показників при збільшенні концентрації озону в КОС. Вміст АТФ та 2,3–ДФГ в еритроцитах свіжої крові майже втричі вищий, порівняно з консервованою кров'ю. Після озонування рівень АТФ в еритроцитах вірогідно зменшується при всіх застосованих концентраціях озону, а 2,3-ДФГ —при концентраціях озону 10 мкг/мл і вище. Найнижчі показники АТФ та 2,3-ДФГ отримано після застосування максимальної концентрації озону —мкг/мл. ЕФР еритроцитів має тенденцію до зниження лише при високих концентраціях озону (40 і 75 мкг/мл), проте отримані результати не є статистично вірогідними.
Таблиця 2
Вплив різних концентрацій озону на кількісні та морфофункціональні показники еритроцитів (метод великої озонотерапії)
Концентрація О3, мкг/мл
Контроль І Контроль ІІ
Показники n=13 n=7 n=13 n=13 n=13 n=13
M±m M±m Р M±m PI/PII M±m PI/PII M±m PI/PII M±m PI/PII
RBC, х1012/л ,32±0,07 ,37±0,10 >0,05 ,04±0,04 <0,005 <0,05 ,06±0,07 <0,05 <0,05 ,03±0,03 <0,01 <0,05 ,07±0,05 <0,01 >0,05
Hb, г/л ,5±1,1 ,4±2,3 >0,05 ,8±1,3 <0,005 >0,05 ,2±2,4 >0,05 >0,05 ,6±1,4 <0,05 >0,05 ,0±1,6 >0,05 >0,05
HCT, % ,8±0,5 ,7±0,9 >0,05 ,6±0,6 >0,05 >0,05 ,0±1,0 >0,05 >0,05 ,5±0,6 >0,05 >0,05 ,7±0,3 >0,05 >0,05
2,3-ДФГК, мкмоль/гHb ,57±0,39 ,05±0,60 >0,05 ,99±0,17 <0,005 >0,05 ,30±0,37 >0,05 >0,05 ,97±0,44 <0,001 >0,05 ,62±0,41 >0,05 >0,05
АТФ, мкмоль/гHb ,13±0,14 ,76±0,30 <0,05 ,54±0,16 >0,05 >0,05 ,51±0,19 >0,05 >0,05 ,41±0,18 >0,05 >0,05 ,81±0,18 >0,05 >0,05
Гемоліз, % ,055±0,006 ,143±0,013 <0,0001 ,405±0,019 <0,0001 <0,0001 ,596±0,031 <0,0001 <0,0001 ,779±0,035 <0,0001 <0,0001 ,806±0,045 <0,0001 <0,0001
Вільний Hb, г/л ,081±0,008 ,276±0,012 <0,0001 ,586±0,042 <0,0001 <0,001 ,542±0,041 <0,0001 <0,005 ,020±0,038 <0,0001 <0,0001 ,982±0,034 <0,0001 <0,0001
Примітка: р —вірогідність порівняно з даними контрольної групи за парним тестом Вілкоксона
В наступній, третій серії дослідів, виконаних методом малої озонотерапії, зроблена спроба зменшити негативні впливи озонування, змінивши співвідношення між кров'ю і КОС на 1:1. Як і у попередніх серіях дослідів, найбільш суттєво змінюється після озонування відсоток гемолізу та вільний гемоглобін, наростаючи статистично вірогідно із збільшенням концентрації озону в КОС. При цьому абсолютні цифри показників гемолізу залишаються невисокими (до 0,4% гемолізу і 0,15 г/л вільного гемоглобіну) навіть після обробки крові озоном в концентрації 75 мкг/мл.
Для узагальнення отриманих результатів та порівняння застосованих методів озонування крові було використано математичну обробку експериментальних даних методом найменших квадратів з метою отримання емпіричних залежностей показників гемолізу та вільного гемоглобіну від застосованих концентрацій озону, які б дозволили мінімізувати середньоквадратичне відхилення (експериментальних даних від результатів, отриманих за емпіричними залежностями). Показники обробляли методом найменших квадратів з використанням комп'ютерної програми GID. При цьому отримано графічні зображення емпіричних залежностей (рис. 1 ) та математичні формули, що їх описують.
Рис. 1. Вплив озону на вміст вільного гемоглобіну при різних методах озонування крові:
- велика озонотерапія; 2 –мала озонотерапія (співвідношення 1:4); 3 –мала озонотерапія (співвідношення 1:1)
Отже, обробка крові озоном викликає гемоліз, ступінь вираженості якого залежить від дози/концентрації озону, об'ємного співвідношення між кров'ю і КОС та методу озонування. Окрім прямої деструктивної дії на мембрану еритроцитів, озон впливає на їх функціональні властивості: тенденція до сповільнення ЕФР, зниження вмісту АТФ та 2,3-ДФГ при озонуванні свіжої крові. У консервованій крові, де початковий вміст АТФ та 2,3-ДФГ в еритроцитах був знижений, озонування дещо покращує ці показники.
Дія озону на лейкоцити, основні популяції та субпопуляції лімфоцитів, показники імунітету. Після озонування крові методом великої озонотерапії (співвідношення крові і КОС 1:4) відмічається зниження загальної кількості лейкоцитів при концентрації озону 50, 60 та 75 мкг/мл. При концентрації озону 60 та 75 мкг/мл вірогідно знижується також кількість лімфоцитів. Спостерігається тенденція до зниження кількості моноцитів та гранулоцитів, яка не досягає статистичної вірогідності при застосованих концентраціях озону. При обробці крові методом малої озонотерапії (співвідношення між кров'ю і КОС 1:1) з'ясовано, що в дозі 1, 10, 40 та 75 мкг на 1 мл крові озон не впливає на загальну кількість лейкоцитів. Лейкоцитарна формула також не зазнає статистично вірогідних змін.
Озонування крові донорів для вивчення імунотропного ефекту озону проводили методом малої озонотерапії при концентрації озону 10 мкг/мл і співвідношенні між кров'ю і КОС 1:4, тобто доза озону на 1 мл крові становила 40 мкг.
З'ясовано, що популяції та субпопуляції лімфоцитів в абсолютних показниках та в процентному співвідношенні між ними не зазнають істотних змін.
Після дії озону вірогідно знижується концентрація в плазмі ІgA, IgG та IgM, а вміст IgE не зазнає вірогідних змін (рис. 2). Рівень ЦІК не змінюється. Найбільш ймовірно, зниження ІgA, IgM, IgG пов'язано з гемолізом еритроцитів під впливом озону та нефелометричним методом визначення цих параметрів за умов гемолізу. Руйнування молекул імуноглобулінів класів А, М, G під дією озону можна вважати малоймовірним, оскільки концентрація IgE, що визначалася методом ІФА, після озонування вірогідно не змінилась і, навпаки, має тенденцію до підвищення. Відмічається суттєве зниження компонентів системи комплементу С3 та С4. Можлива активація системи комплементу з споживанням С3 та С4 внаслідок озонування, а також за рахунок гемолізу після дії озону.
Рис. 2. Вплив озонування на показники фагоцитозу та вміст імуноглобулінів в плазмі
(метод малої озонотерапії, співвідношення крові і КОС 1:4)
Вірогідних змін після озонування зазнають показники фагоцитозу (рис. 2): збільшується фагоцитарна активність нейтрофілів (ФАН) та фагоцитарне число (ФЧ) при 30-хвилинній інкубації, а також зростають показники спонтанного НСТ-тесту. Через 120 хвилин інкубації ФАН і ФЧ вірогідно не відрізняються від контрольних показників. Індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ) також суттєво не змінюється. Таким чином, на основі проведених експериментальних досліджень встановлено, що після озонування активується поглинаюча функція та окисні процеси в нейтрофілах.
В наступній серії досліджень визначали продукцію IL-1b в культурі лейкоцитів. Озонування проводили методом малої озонотерапії при концентрації озону 1, 10, 40, та 75 мкг/мл, в співвідношенні крові і КОС 1:4. Частина досліджень проведена в присутності в культурі лейкоцитів пірогеналу як стимулятора продукції IL-1 (n=10), а інші (n=8) –без пірогеналу.
Встановлено, що в присутності пірогеналу озонування стимулює продукцію IL-1b. Вірогідного збільшення значень досягнуто при концентраціях озону 40 та 75 мкг/мл, на основі чого можна стверджувати про дозозалежний вплив озону. У серії досліджень, де єдиним стимулятором продукції IL-1b був озон, вірогідного збільшення досліджуваного показника не виявлено. Отже, озон посилює дію природнього антигенного стимулятора продукції IL-1b.
Клініко-біохімічні показники та кислотно-лужна рівновага крові після обробки киснево-озоновою сумішшю. Для досліджень використовували консервовану донорську кров. Її озонування проводили методом великої озонотерапії при концентраціях озону 40, 50, 60 та 75 мкг/мл та співвідношенні крові і КОС 1:4.
Рівень глюкози в досліджуваній крові підвищений за рахунок змішування з консервантом, в склад якого входить глюкоза. Після обробки в застосованих режимах озонування вміст глюкози не змінюється. Показники жирового обміну –холестерин та тригліцериди –при обробці крові озоном не зазнають істотних змін. Близьких до статистично вірогідних значень (р = 0,058) досягає лише рівень зниження тригліцеридів при концентрації озону 75 мкг/мл. Під впливом озонування спостерігається зниження рівня сечовини (UN) та креатиніну (Creа). Однак, виявлені зміни не мали залежності від дози озону. Так, після озонування при концентрації 40 мкг/мл вміст UN в плазмі навіть вищий від контрольних показників (р>0,1), а при подальшому збільшенні концетрації озону знижується, з вірогідною різницею у порівнянні з контрольною групою І лише при концентрації 60 мкг/мл (р<0,01). При цьому різниця з контролем ІІ при застосованих концентраціях не є вірогідною. Зниження рівня Crea більш суттєве і вірогідно відрізняється від обох контрольних груп при концентраціях озону 50 та 60 мкг/мл. Рівень сечової кислоти (URAC) навпаки має тенденцію до зростання, при концентрації озону 75 мкг/мл різниця з контрольною групою І стає вірогідною. У порівнянні з контролем ІІ зростання рівня URAC статистично невірогідне.
Після обробки крові озоном відмічається поступове, прямо пропорційно залежне від концентрації озону в КОС збільшення вмісту в плазмі аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST), з вірогідною різницею показників з групами контролю при концентраціях озону 60 та 75 мкг/мл. Різко зростає після озонування також вміст в плазмі крові лактатдегідрогенази (LD), що корелює із зростанням концентрації озону в КОС. Слід відзначити вірогідне збільшення цього показника вже у групі контролю ІІ, очевидно, за рахунок гемолізуючої дії від'ємного тиску. При концентрації озону 60 та 75 мкг/мл наступає статистично вірогідне, але без чіткої кореляції з концентрацією озону, зниження рівня лужної фосфатази (ALP). Можна припустити руйнування цього ферменту під дією озону. Збільшується після дії високих концентрацій озону рівень загального білірубіну за рахунок непрямого (гемоліз) із статичною вірогідністю тільки при концентрації озону 60 та 75 мкг/мл.
З показників електролітного обміну відмічається дозозалежне від концентрації озону наростання вмісту калію та заліза в плазмі крові. Причому незначне зростання цих показників спостерігається вже в контрольній групі ІІ, а надалі збільшення калію досягає статистично вірогідної різниці з контролем І при концентрації озону 50 мкг/мл і вище, а заліза –при концентрації 40 мкг/мл і вище.
Таким чином, внаслідок обробки КОС в плазмі крові зростає рівень внутрішньоклітинних ферментів –LD, ALT, AST, а також вміст калію, заліза, непрямого білірубіну. Зростання більшості цих показників прямо пропорційне концентрації озону в КОС і вказує на деструкцію мембран клітин крові під впливом окислення озоном. Зниження рівня ALP, ймовірно, відбувається за рахунок окислення цього ферменту або хімічної взаємодії з стабілізатором цитратом натрію в присутності озону. Зниження рівня сечовини та креатиніну і підвищення сечової кислоти виявлене лише при деяких із застосованих концентрацій озону. Можливо, це пов'язано з індивідуальними коливаннями цих параметрів в донорській крові. Інші показники білкового, жирового обмінів, електролітів, рівень глюкози під дією озону не змінюється.
Вплив озону на показники кислотно-лужної рівноваги вивчали як у консервованій, так і у свіжій венозній крові донорів, використовуючи при цьому, відповідно, методи обробки –велику і малу озонотерапію.
З'ясовано, що озонування вірогідно змінює вміст газів крові: зменшує загальну концентрацію СО2 і його розчинну фракцію, майже вдвічі збільшує відсоток насичення крові киснем. При цьому на напругу газів в крові рСО2 та рО2 істотно впливають умови проведення озонування, зокрема вплив від'ємного тиску під час переведення крові у флакони для озонування. Подача КОС під позитивним тиском значно збільшує рО2 та зменшує рСО2. В озонованій крові рН на 0,01 –,09 вища від початкового значення, імовірно, у зв'язку із зменшенням в ній розчиненого СО2. Вміст гідрокарбонату та основ зменшується, очевидно за рахунок окисних властивостей озону. Окисна дія озону залишається в межах компенсації буферними системами крові, оскільки не викликає ацидозу. Залежності виявлених змін від концентрації озону в КОС не виявлено. Дія КОС на венозну кров нагадує ефект "артеріалізації" з підвищенням на кілька сотих рівня рН та зміною газового складу з насиченням киснем і зниженням вмісту вуглекислого газу.
Вплив озонування на показники зсідаючої системи крові. Використана у роботі експериментальна модель дала можливість вивчити вплив озонування на тромбоцитарну і коагуляційно- фібринолітичну ланки гемостазу.
Після озонування консервованої крові методом великої озонотерапії з використанням високих концентрацій озону —, 50, 60, 75 мкг/мл виявлено вірогідне зниження кількості тромбоцитів (PLT) при всіх концентраціях. Відсоток зниження кількості PLT не залежить від концентрації озону в КОС. Вплив озонування на кількість PLT вивчали також при обробці свіжої гепаринізованої крові методом малої озонотерапії із застосуванням концентрацій озону 1, 10, 40, 75 мкг/мл і співвідношенні крові і КОС 1:1. Дослідження показали, що озонування крові навіть малими дозами знижує кількість тромбоцитів. Як і у першій серії дослідів, не спостерігається залежності ступеня зниження PLT від дози озону.
Для вивчення впливу КОС на агрегацію тромбоцитів використали метод малої озонотерапії. Обробляли свіжу цитратну кров донорів у співвідношенні 1:4 (кров: КОС) при концентраціях озону 1, 10, 40 мкг/мл. Дослідження агрегації тромбоцитів показали, що після озонування відповідь на АДФ та рістоцетин змінюється однотипно: відмічається вірогідне зростання часу утворення агрегатів тромбоцитів при всіх застосованих дозах озону з чітко вираженою залежністю від концентрації озону в КОС.
Зміни показників коагулограми вивчали в донорській консервованій крові після застосування методу великої озонотерапії. Виявлено вірогідне здовження часу рекальцифікації при концентраціях озону 50 мкг/мл і вище. Має тенденцію до підвищення вміст загального фібриногену, вірогідна різниця з контролем відмічається при концентрації озону 60 мкг/мл. Здовжується також час фібринолізу, вірогідні відхилення зафіксовані при концентрації озону 75 мкг/мл. Не зазнає змін після озонування протромбіновий час плазми. Залишаються від'ємними етаноловий тест та фібриноген В.
АПТЧ визначали у цитратній крові донорів, яку обробляли методом малої озонотерапії із співвідношенням 1:4 (кров: КОС). Встановлено, що озонування в застосованому діапазоні концентрацій озону істотно не вплинуло на АПТЧ.
Толерантність плазми до гепарину визначали до і після озонування свіжої цитратної крові донорів методом малої озонотерапії із співвідношенням 1:4 (кров: КОС). Виявлено, що гепариновий час не змінюється після озонування з концентрацією озону 1 мкг/мл та значно зростає при застосуванні його у вищих концентраціях —та 40 мкг/мл.
Отже, озонування крові приводить до зміни показників системи гемостазу, впливаючи в першу чергу на тромбоцитарну ланку гемостазу за рахунок зменшення числа тромбоцитів та пригнічення їх агрегації. Здовження часу агрегації тромбоцитів корелює з нарощуванням концентрації озону в КОС. Очевидно, за рахунок цих впливів відмічається здовження часу рекальцифікації плазми та толерантності плазми до гепарину. Застосовані методи досліджень не виявили впливу озонування на плазмові фактори зсідання. Деяке підвищення вмісту загального фібриногену слід пов'язувати з імовірним збільшенням маси фібринового згустку за рахунок домішок агрегатів, очевидно, за рахунок гемолізу. Відповідно здовжується і час фібринолізу такого згустку.
В И С Н О В К И
1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у з'ясуванні характеру дозозалежної окисної деструкції клітин крові та змін їх функціональної активності під дією озону і опрацюванні клінічно допустимого його дозування під час озонотерапії.
Озонотерапія, яка набуває щораз ширшого застосування у клінічній практиці, немає достатнього обгрунтування механізму дії та доз/концентрацій озону у хворих, не враховується можливий негативний її вплив на клітини крові та білкові системи.
. Встановлено, що серед клітинних елементів крові найбільш чутливими до дії озону є еритроцити. Киснево-озонова суміш (КОС) викликає гемоліз еритроцитів, ступінь вираженості якого знаходиться в лінійній залежності від концентрації озону.
. Озонування свіжої крові приводить до зниження вмісту 2,3-ДФГ та АТФ в еритроцитах, які однак залишаються вищими, ніж в консервованій цільній крові. Обробка озоном консервованої крові викликає підвищення цих показників.
. Озон в концентрації 10 мкг/мл (40 мкг на 1 мл крові) суттєво не впливає на кількість лейкоцитів і лімфоцитів та імунофенотиповий профіль їх популяцій; активує фагоцитарну функцію та окисні процеси в нейтрофілах. Збільшення концентрації озону (50 мкг/мл в КОС, 200 мкг на 1 мл крові і вище) викликає окисну деструкцію лейкоцитів і лімфоцитів. В концентрації 40 та 75 мкг/мл (160 та 300 мкг на 1 мл крові) озон стимулює лейкоцити in vitro до продукції інтерлейкіну 1b.
5. Озонування крові веде до значних зрушень кислотно-лужного стану за рахунок насичення її киснем і зменшення вмісту вуглекислого газу, гідрокарбонату та основ, зміщує рН крові в лужну сторону.
. В озонованій крові зростає вміст внутрішньоклітинних ферментів (лактатдегідрогенази, аланінамінотранферази, аспартатамінотрансферази), а також калію, заліза, непрямого білірубіну, що зумовлено руйнуванням клітин крові; знижується вміст лужної фосфатази. Інші біохімічні показники жирового, білкового та електролітного обміну не зазнають виражених змін.
. Озонування крові приводить до дозозалежних розладів системи гемостазу, в першу чергу, за рахунок тромбоцитарної ланки гемостазу, які зумовлені зменшенням кількості тромбоцитів та пригніченням їх агрегаційної функції.
. На основі комплексної оцінки результатів проведених досліджень математично розраховано максимальні безпечні концентрації озону для досліджених режимів озонування крові:
Практичні рекомендації
1. При озонуванні крові у співвідношенні з киснево –озоновою сумішшю 1:4 концентрація озону не повинна перевищувати 10 мкг/мл (40 мкг на 1мл крові). Співвідношення
КОС і кров 1:1 дає можливість зменшити негативні ефекти озону і розширити діапазон концентрації до 40-50 мкг/мл.
. Для моніторингу імовірного пошкоджуючого впливу озону на клітини периферичної крові при проведенні озонотерапії системними методами доцільно контролювати параметри гемолізу в озонованій крові (при великій гемоозонотерапії) і/або в крові хворого (при інших способах застосування озону з системними ефектами), а саме –рівень гемолізу та вміст вільного гемоглобіну.
. Виявлений вплив озону на показники тромбоцитарного гемостазу зумовлює необхідність контролю агрегаційної функції тромбоцитів у хворих, яким проводиться озонотерапія. При використанні цього методу лікування одночасно з антиагрегантами існує ризик виникнення геморагічного синдрому.
Основні роботи, які опубліковані за темою дисертації
1. Циганок (Костюченко) Л.В. Вплив озонування на кількісний склад і деякі функціональні властивості імунокомпетентних клітин та форменних елементів крові // Актуальні проблеми клінічної імунології та алергології. —. —№ 2. —С. 161-167.
. Циганок (Костюченко) Л.В., Виговська Л.С. Озонотерапія та її імунотропні властивості. Огляд літератури. // Актуальні проблеми клінічної імунології та алнргології. —. —№ 3. —С. 166-174. —здобувачем проведено вивчення і підбір матеріалів з даної проблеми та підготовлено матеріал до публікації.
. Циганок (Костюченко) Л.В. Кислотно-лужний стан консервованої крові до і після обробки киснево-озоновою сумішшю // Лікарська справа. —. —№ 8. —С. 113-116.
. Циганок (Костюченко) Л.В., Новак В.Л., Виговська Л.С. Вплив обробки киснево-озоновою сумішшю на деякі біохімічні показники крові донорів // Проблеми екології та медицини. —. —№ 5-6. —С. 32-35. —здобувачем виконано експериментальну частину, проведено статистичну обробку результатів та підготовлено матеріал до публікації.
. Циганок (Костюченко) Л.В., Виговська Л.С. Імунотропні ефекти озонування крові // Імунологія та алергологія. —. —№ 3. —С. 56-57. —здобувачем виконано експериментальну частину, проведено статистичну обробку результатів та підготовлено матеріал до публікації.
. Циганок (Костюченко) Л.В. Вплив обробки киснево-озоновою сумішшю на імунологічні показники здорових осіб. —І національний конгрес України з імунології, алергології та імуно-реабілітації. Збірник тез. —Крим, 13-15 травня 1998. —С. 139.
АНОТАЦІЯ
Костюченко Л.В. Зміни морфофункціональних та імунологічних властивостей клітин і біохімічного складу плазми крові під впливом озонування. —Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.31 —гематологія та трансфузіологія. —Інститут гематології та трансфузіології АМН України, Київ, 2002.
Досліджено вплив різних режимів озонування крові в умовах in vitro на морфофункціональні властивості клітин, основні показники імунітету, біохімічні константи плазми, кислотно-основний стан та систему гемостазу. Встановлено, що обробка крові киснево-озоновою сумішшю зумовлює окисну деструкцію клітин крові, в найбільшій мірі еритроцитів. З'ясовано, що ступінь гемолізу знаходиться в лінійній залежності від застосованих доз/концентрацій озону. Показано, що озонування крові веде до змін імунологічних параметрів: активує фагоцитарну активність та окисні процеси в нейтрофілах, веде до зниження вмісту компонентів С3 і С4 системи комплементу; стимулює лейкоцити до продукції IL-1b. Високі концентрації озону (50, 60 мкг/мл) приводять до деструкції лейкоцитів і лімфоцитів. Вияснено характер і ступінь змін кислотно-основного стану крові при різних режимах озонування. Встановлено, що внаслідок гемолізу в плазмі збільшується рівень внутрішньоклітинних ферментів, калію, заліза і прямого білірубіну. Показано дозозалежні розлади системи гемостазу, пов'язані із зменшенням кількості та пригніченням агрегації тромбоцитів. На основі комплексної оцінки результатів встановлено безпечні концентрації озону для досліджених режимів озонування крові і запропоновано контролювати рівень гемолізу, кількість тромбоцитів та агрегаційну їх функцію у хворих, яким проводиться озонотерапія.
Ключові слова: озон, озонотерапія, кров, гемоліз, імунітет.
Аннотация
Костюченко Л.В. Изменения морфофункциональных, иммунологических свойств клеток и биохимического состава плазмы крови под влиянеим озонирования.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.31 —гематология и трансфузиология. —Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины, Киев, 2002.
Изучается влияние разных режимов озонирования крови в условиях in vitro на морфофункциональные свойства клеток, основные показатели иммунитета, биохимические константы плазмы, кислотно-основное состояние и систему гемостаза. Исследования проводились на цельной донорской крови до и после ее озонирования при помощи аппарата для озонотерапии АТО-1 ("Kriometrum", Польша). Применялись два способа обработки крови, известные в литературе как большая и малая озонотерапия. Большая озонотерапия проводилась при концентрациях озона 40, 50, 60 и 75 мкг/мл в соотношении крови и кислородно-озоновой смеси (КОС) 1:4, а малая —при концентрациях 1, 10, 40 и 75 мкг/мл, соотношениях крови и КОС 1:4 и 1:1.
Установлено, что обработка крови озоном приводит к окислительной деструкции клеток крови, в наибольшей степени эритроцитов. Проведена сравнительная оценка использованных методов озонирования и доз/концентраций озона по степени их гемолизирующего воздействия на эритроциты. Показано, что наиболее агрессивной по отношению к эритроцитам является большая озонотерапия, при которой гемолизирующее действие озона усиливается негативным влиянием изменений давления в системе для озонирования. При всех использованных концентрациях озона в обработанной этим методом крови понижается количество эритроцитов, резко возрастает процент гемолиза и уровень свободного гемоглобина (Hb). При малой озонотерапия в соотношении крови и КОС 1:4 гемолизирующее влияние озона менее выражено, однако достоверно даже при минимальной концентрации озона 1 мкг/мл. При изменении соотношения между кровью и КОС до 1:1 при малой озонотерапии показатели гемолиза возрастают еще менее существенно. Установлено, что при всех изучаемых методах озонирования нарастание процента гемолиза и свободного Hb находится в линейной зависимости от концентраций озона. Отмечено влияние озона на функциональные свойства эритроцитов: тенденция до замедления их электрофоретической подвижности, снижения содержания АТФ и 2,3-ДФГ при озонировании свежей крови и увеличение их исходно низких уровней в концентрированной крови.
Озон в концентрации 10 мкг/мл (40 мкг на 1 мл крови) существенно не влияет на количество лейкоцитов и лимфоцитов крови, а также на иммунофенотипический профиль их популяций; активирует фагоцитарную функцию и окислительные процессы в нейтрофилах. Наблюдали также снижение содержания в плазме Ig A, M, G, при этом уровень Ig E существенно не изменялся. Достоверно понижается концентрация компонентов системы комплемента С3 и С4. Повышение концентрации озона (50 мкг/мл в КОС, 200 мкг на 1 мл крови и выше) вызывает окислительную деструкцию лейкоцитов и лимфоцитов.
В присутствии пирогенала озон in vitro стимулирует продукцию IL-1b, достоверный рост показателя наблюдали при концентрации озона 40 и 75 мкг/мл.
После обработки озоном в плазме крови вследствие гемолиза возрастает уровень внутриклеточных ферментов —лактатдегидрогеназы, ALT, AST, а также калия, железа, непрямого билирубина. Наблюдается снижение содержания щелочной фосфатазы, возможно, в связи с ее окислением озоном. При некоторых из примененных концентраций озона наблюдали снижение мочевины и креатинина. Уровень мочевой кислоты повышается и достоверен при концентрации 75 мкг/мл. Другие показатели белкового, жирового обменов, содержание элетролитов и глюкозы не изменяются.
Установлено, что озонирование достоверно изменяет газовый состав крови: уменьшает общее содержание СО2 и его растворимой фракции, почти в два раза увеличивается процент насыщения крови кислородом. рН озонированной крови на 0,01-0,09 выше исходных значений, очевидно, в связи с уменьшением в ней растворенного СО2. Содержание гидрокарбоната и оснований снижается. Однако окислительное воздействие озона остается в пределах компенсации буферными системами, поскольку не вызывает ацидоза. Зависимости изменений кислотно-щелочного состояния от концентрации озона в КОС не выявлено.
Озонирование крови приводит к изменениям показателей системы гемостаза, влияя в первую очередь на тромбоцитарное звено гемостаза за счет снижения числа тромбоцитов и дозозависимого угнетения их агрегации. Очевидно, в результате этого наблюдается удлинение времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину. Изменений в коагуляционном звене гемостаза не выявлено.
На основании комплексной оценки результатов установлены безопасные концентрации озона для исследуемых режимов озонирования крови:
—для большой озонотерапии при соотношении крови и КОС 1:4 —до 5 мкг/мл;
—для малой озонотерапии при соотношении крови и КОС 1:4 —до 10 мкг/мл;
—для малой озонотерапии при соотношении крови и КОС 1:1 —до 95 мкг/мл.
Предложено контролировать параметры гемолиза и агрегационную функцию тромбоцитов у больных, получающих озонотерапию.
Ключевые слова: озон, озонотерапия, кровь, гемолиз, иммунитет.
SUMMARY
Kostiuchenko L.V. Morphofunctional and immunological features of cells and biochemical composition of plasma under the influence of ozonation. –Manuscript.
Thesis for acquisition of the scientific degree of Candidate of Medical Science majoring in Haematology and Transfusiology. –The Institute of Haematology and Transfusiology, AMS of Ukraine. Kyyiv, 2002.
The influences of different regiments of blood ozonation in vitro on morphofunctional features of cells, main immunological indexes, biochemical constants of plasma, blood gases balance and the system of homeostasis were investigated. It was found that processing the blood with oxygen/ozone gas mixture leads to oxygen destruction of blood cells, mostly – the red blood cells. It was discovered that grade of haemolysis is in linear dependency with doses/concentrations of the ozone used. It was shown that blood ozonation cause changes in immunological parameters: activates the phagocytic activity and oxidizing processes in neutrophils, leads to decrease in C3 and C4 components of complement system, stimulates white blood cells for IL-1b production. High concentrations of ozone (50, 60 mg/ml) result in white blood cells and lymphocytes destruction. Characteristics and degree of changes in blood gases balance under the different regiments of blood ozonation have been determined. Increased levels of plasma intracellular enzymes, potassium, iron, and direct bilirubin, as a result of haemolysis have been discovered. Dose-dependent disturbances in blood homeostasis due to decreased number of platelets and their depressed aggregation have been shown. Safe concentrations of ozone for investigated regiments of blood ozonation, based on complex evaluation of the results, have been determined. Suggested haemolysis parameters and platelets aggregation tests were recommended for control in patients receiving ozone therapy.
MeSH: ozone, ozone therapy, blood, haemolysis, immunity.