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~dire que les 2 prents sont forc~ment porteurs sins

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Behr Julien                                                               MED 302                                                             08/10/2013

Lajoinie Louis Pr. CLAVEL

Mucoviscidose : diagnostic et thérapeutique

  1.  Introduction

Rappels :

  1.  Le terme mucoviscidose (CF : cystic fibrosis) provient de la fibrose kystique du pancréas 
  2.  La mucoviscidose est une maladie autosomale récessive. C’est-à-dire que les 2 parents sont forcément porteurs sains.

Il est porté sur le chromosome 7. C’est la plus fréquente maladie létale.

Elle touche principalement la population caucasienne : ce sont des populations de races blanches (terme vaste) : Europe de l’ouest, du nord et Amérique du nord.

  1.  C’est une anomalie qui entraîne des anomies des électrolytes au niveau cellulaire épithélial et surtout du chlorure au niveau pancréatique et pulmonaire.

Epidémiologies :

  1.  Porteur sain : 1/25 (1/30 pour la moyenne nationale) est hétérozygote.

Il y a également des spécificités par région.

  1.  Environ 1/2500 à la naissance
  2.  Environ 5000 à 6000 patients atteints de mucoviscidose en France

C’est une maladie connue depuis longtemps

Au tout début du siècle, les cliniciens disaient : «  Qui embrasse l’enfant salé doit penser à la mucoviscidose », en effet il y a un tel déséquilibre des électrolytes que la peau est salée

  1.  Dans les années 1950, beaucoup mouraient très jeunes ; le diagnostic était un taux anormalement élevé de sodium et bas de chlore dans la sueur
  2.  Dans les années 1980 : défaut de conductance du chlore AMPc dépendant, dans les glandes sudoripares et les voies aériennes des patients CF

Découverte du gène CFTR en 1989 sur le chromosome 7 par clonage positionnel :

Quand on faisait une prise de sang à un enfant muco et que l’on cherchait des protéines anormales, on ne trouvait rien. Quand on ne trouve pas de protéines qui puissent évoquer une maladie, il faut faire du clonage positionnel. C’est à dire que l’on part du gène pour trouver la où il y a une différence entre un enfant muco et enfant non muco.

Les symptômes cliniques sont gastro-intestinaux et surtout pulmonaires, respiratoires.

Environ 25% des jeunes atteints de la mucoviscidose atteignent 25-30ans.

II)  Base moléculaire de la mucoviscidose

a) Le gène CFTR

Le gène CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)  est en 7q 31-32

C’est un grand gène : 250 kilobases, 27 exons (partie codante)

Près de 1800 mutations et polymorphismes du gène :

  1.  Certaines mutations sont relativement fréquentes
  2.  La plus fréquente : F508del qui est une délétion de la phénylalanine sur le codon 508 (70% des chromosomes CF et jusqu'à 90% dans les pays nordique)
  3.  D’autres sont rares (<1%, voir <0.1%, voire uniques, on retrouve plus de mutation rare dans le sud)
  4.  Différences en fonction des pays (nordiques, méditerranéens)

b) La protéine CFTR

C’est un gène codant pour une protéine transmembranaire CFTR fonctionnant comme un canal chloré régulé par l’AMP cyclique, au niveau apical des cellules épithéliales respiratoires, pancréatiques, intestinales, du tractus génital et des glandes salivaires et sudoripares.

Autre rôles du CFTR au niveau du pH intracellulaire, sulfatation et glycosylation des mucines…

C’est une protéine de 1480 AA faisant 168 kDa :

Elle possède 5 domaines protéiques :

  1.  NBF1 et NBF2 : (Nucléotid Binding Fold : nucléotide qui va se lier à un feuillet  et c’est un site de liaison à l’ATP) ce sont les domaines qui sont fréquemment recherchés car ils entraînent des conséquences plus importantes.
  2.  TM 1 et TM2 (transmembranaire)
  3.  R (Regulator)

Sur ce schéma on observe les 12 domaines TM (6 sur TM1 et 6 sur TM2) qui traversent la membrane plasmique

Si le bouchon R monte le canal se ferme et si R descend il laisse passer le chlore

TM1 sont codés par les exons de 1 à 8 et TM2 par ce de 14 à 18

Mutations classées en fonction de leur conséquence protéique CFTR avec défaut de :

  1.  Production
  2.  Maturation
  3.  Conduction
  4.  Régulation

Par exemple conséquence de la F508 del  (important !)  :

  1.  Délétion (del) de 3 paires de bases supprimées, un acide aminé F (ph) en moins sur le codon 508
  2.  Maturation anormale de la protéine CFTR, bloquée au niveau de l’appareil de Golgi, ne parvient pas à la membrane apicale de la cellule elle est directement détruite dans les lysosomes.

III) Diagnostic

Diagnostic et traitement

Au total : mécanismes génétiques et pathologiques variés

  1.  Diagnostic clinique confirmé par un diagnostic moléculaire
  2.  Il existe un dépistage néonatal obligatoire depuis 2002 : on prend une goutte de sang sur le talon et on mesure la trypsine
  3.  Thérapie actuelle symptomatique
  4.  Thérapies envisageables définitives impliquent ainsi que la cible devrait être au niveau génétique : thérapie génique (TG) mais toujours en cours de développement… on peut rajouter des copies normales de CFTR mais on ne peut pas retirer les CFTR anormaux

  1.  En effet, les canaux Cl- sont des transporteurs si efficaces (107 ions/sec) qu’une très petite quantité de CFTR totalement ou partiellement fonctionnelle, mais correctement insérée dans la membrane cellulaire pourrait suffire pour améliorer le pronostic vital des patients.

  1.  Clinique

Conséquences des mutations CFTR :

  1.  Fonction CFTR insuffisante dans la membrane apicale des cellules épithéliales
  2.  Conséquences cliniques surtout au niveau de l’épithélium
  3.  Formes cliniques classiques (grave : pulmonaires + insuffisance pancréatique)
  4.  Formes frustres de type mono-symptomatique (« relative disorders » CFR-RD)
  5.  Agénésie déférentielle congénitale bilatérale dite azoospermie obstructive (CBAVD)
  6.  Pancréatites idiopathiques
  7.  Bronchiectasies disséminées
  8.  Aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA)
  9.  

30 à 40% des couples consultant :

  1.  Azoo-, oligoazoo-, asthénozoo-, teratozoo-, spermies.

  1.  Azoospermie :
  2.  Azoospermie sécrétoire : problème hormonaux… délétion du gène AZF
  3.  Azoospermie excrétoire : obstacle, CBAVD… CBAVD (Agénésie Congénital Bilatéral des Canaux Déférents)

  1.  Dans les azoospermies obstructives : 25% sont

Incidence CBAVD chez les hommes stériles : 2 à 5%

  1.  Examens cliniques, échographiques (absence de canaux déférentiels palpables)
  2.  Examens biochimiques (spermatogénèse normale ou non, FSH normale, effondrement du fructose, test de sueur (TS) limite)
  3.  Examens génétiques CFTR : souvent F508del / R117H

  1.  Biochimique

Le test de la sueur : il mesure la concentration en chlorures sur un échantillon de sueur

  1.  Normalement la sueur contient moins de 40mmol/L de Cl-
  2.  Pathologique si > 60mmol/L de Cl-
  3.  Deux tests positifs sont nécessaires
  4.  Facile à réaliser à partir de 4-6semaines

Le dosage de la trypsine immuno-réactive (TIR) :

  1.  TIR : enzyme pancréatique secrétée par le pancréas  sang
  2.  Utilisé pour le dépistage néonatal (DNN) obligatoire
  3.  Effectué sur une goutte de sang séché (test Guthrie), environ 3ème jour de vie
  4.  Si TIR élevée (>65µg/L), il faut associer le test à la recherche des 30 mutations courantes CFTR, afin d’éliminer les faux positifs (test très sensible mais moins spécifique)

  1.  Moléculaire

  1.  Diagnostic direct par biologie moléculaire à partir de différents prélèvements possibles :
  2.  Sang (+EDTA)
  3.  Tissus biopsies, autopsies…
  4.  Villosités choriales (avant 13 SA)
  5.  Liquide amniotique

  1.  Via un conseil génétique :
  2.  Analyse du contexte clinique grave ou modéré
  3.  Grossesse ? un diagnostic prénatal peut être proposé
  4.  Prescription pour rechercher des mutations courantes CFTR ou rares, familiales si connues

  1.  Une fois les mutations trouvées :
  2.  Une étude familiale est toujours proposée
  3.  Vérification des mutations trouvées chez le propositus (atteint) avec une étude parentale (si possible)

étude de ségrégation familiale

  1.  En laboratoire de Biologie moléculaire (avec agréments en Dépistage prénatal (DPN)) :

  1.  Extraction de l’ADN à partir de sang le plus souvent
  2.  Amplification génique de différents exons du gène CFTR par PCR (polymérase chain reaction)
  3.  Analyse biomoléculaire d’une trentaine de mutations courantes (couvertures d’environ 85% du gène CFTR
  4.  Analyse moléculaire de mutations rares (plus longue)

IV) Techniques moléculaires du gène CFTR :

  1.  Techniques moléculaire mutations courantes :
  2.  Ligation d’oligonucléotiques (OLA)  analyse des fragments
  3.  Hybridation reverse
  4.  Amplification spécifique d’allèles (ARMS)  gel d’agarose

 

Chaque pic dans une zone grise correspond à l’intervention normale du gène. Si il y a une mutation, on a par exemple le F508 normale et en rose uniquement le F508 délété

Si on a 30 fragments (30 pics) on a 30 PCR de 30 zones à risque tout de suite balayées par le séquenceur qui reconnaît l’allèle normale ou muté.

  1.  Techniques moléculaires mutations rares :
  2.  DHPLC
  3.  DGGE (électrophorèse en gradient d’agents dénaturant)
  4.  Recherche de remaniements par PCR multiplex fluorescente
  5.  Puces (micro-arrays)
  6.  

On a 4 pics, 4 colonnes, les bandes s’allument en fonction de l’allèle normale ou anormal

Cela se fait sur électrophorèse, on le fait pour le dépistage néonatal.

  1.  Nature des mutations CF

  1.  Mutation non sens :
  2.  G 542X (codon stop) : origine phénicienne
  3.  W1282 X : origine ashkénaze

  1.  Mutations faux sens :
  2.  N1303K : origine celte
  3.  G551D : origine ibère

  1.  Mutation d’épissage :
  2.  1717-1G > A

  1.  Délétion : F508L
  2.  La plus fréquente dans le monde, avec un gradient décroissant entre le Nord (87%) et le Sud (Turquie 30%)
  3.  Origine caucasienne

  1.  Insertion : 435 insA

Del ou ins  décalage de la phase de lecture (POL ou ORF-Open Reading Frame-)

  1.  Grands réarrangements… 

Il y a des bornes 5’ et en 3’, si l’excision est bien faite , on a un raboutage entre les exons      Si il y a une mutation sur un site d’épissage , on a des raccords entre le mauvais exons , on peut même perdre un exon . Sur le 1717e nucléotide, -1 après le G devient A, sur le 1811e nucléotides, +1 le G devient C

Fréquence des mutations CF (vraiment intéressant..)

  1.  G542X : environ 3% (1 à 6,6%)
  2.  N1303K : environ 2% (0,75% à 4,5%)
  3.  1717-1G>A : environ 1,5% (0 à 2,7%)
  4.  2789+5G>A : environ 1% (0 à 2,8%)
  5.  9 autres mutations ont une fréquence > 0,4% :

G551D, W1282X, R553X, I507del, 2183 AA>G, 1078 delT, 711+1G>T, R1162X, Y1092X

Classification des mutations par régions CFTR

  1.  NBF 1 :
  2.  Exon 10 : F508 del
  3.  Exon 11 : G542X, R553X, G551D, 1717-1G>A

exons 10/11 représente 75% des mutations en France

  1.  NBF 2
  2.  Exon 19 : R1162X
  3.  Exon 20 : W1282X
  4.  Exon 21 : N1303K

  1.  TM 1 :
  2.  Exon 4 : R117H, 621+1G>T

  1.  TM 2 :
  2.  Intron 14b : 2789+5G>A

Si on a un défaut majeur, on n’aura jamais de production protéique suffisante. La protéine est morte née et les chlorures ne sortent pas de la membrane plasmique

  1.  Classe I : défaut de production protéique avec un codon stop => pas de protéine ou protéine tronquée, elle est détruite
  2.  Classe II : défaut de maturation ; les protéines sont détruites aussi dans les lysosomes
  3.  Classe III : défaut de régulation, de conduction ; régulation des chlorure très limités, l’ATP a du mal à accroché le NBF
  4.  Classe IV : défaut de conduction, la protéines a réussi à être synthétisée, elle a été envoyée dans la membrane plasmique mais le canal ne marche pas bien. Cependant il y a suffisamment de chlorure pour vivre.

Il faut un minimum de protéines correctes pour pouvoir vivre d’ou la thérapie génique (cf. après)

Répartition française des mutations et génotypes :

  1.  5 génotypes environ 58% des cas CF en France :
  2.  F508del / F508del : 47,8%
  3.  F508del / G542X : 3,4%
  4.  F508del / N1303K : 2,7%
  5.  F508del / 1717-1G>A : 2,1%
  6.  F508del / 2789+5G>A : 1,5%

Corrélations des génotypes-phénotypes :

  1.  Mutations S (sévères) et M (modérées)
  2.  Génotype S/S = phénotype S
  3.  Génotype M/M = phénotype M
  4.  Génotype S/M = phénotype M

  1.  Ces corrélations génotypes/phénotypes :
  2.  Sont plus évidentes au niveau du statut pancréatique que pulmonaire
  3.  Influence donc d’autres facteurs génétiques (CF « modifiers ») et environnementaux

Donc les personnes muco ont besoin d’un environnement très sain : pas de tabac, de contact avec les gens grippaux ou les autres muco (pas de colo entre les muco)

Corrélation génotype-phénotype et transcription :

En fonction des anomalies génétiques, l’évaluation des taux de transcrits CFTR normaux persistants dans les tissus permet de mieux comprendre la diversité des phénotypes.

Il n’y a pas de corrélation absolue génotypes/phénotypes mais il y a une corrélation raisonnable entre le % résiduel de la fonction CFTR normale et l’atteinte des différents organes.

Les taux de transcrits CFTR suivants peuvent correspondre à différentes symptomatologiques :

  1.  Les taux de transcrits CFTR suivant corresponde à différentes symptomatologie
  2.  Entre 50% et 100% => aucune symptomatologie
  3.  10% à 50% => stérilité masculine (CBAVD)
  4.  < 5% => test de sueur anormale
  5.  3-4% => apparition d’une maladie pulmonaire
  6.  <1% => Ajout d’une insuffisance pancréatique

On revient à l’importance de la thérapie génique, si on arrive à rajouter environ 5% de protéine normales, les patients restent en vie. Il faut ajouter un minimum de protéines normales pour restaurer la fonction pancréatique.

On ne peut restaurer des capacités pulmonaires normales à un enfant qui a déjà des poumons en carton. L’espoir de la TG se fait donc chez les jeunes personnes qui n’ont pas les poumons trop abimés

VI) Etudes familiales 

Exemple : Pour les familles on réalise des calculs de risque (par la ségrégation familiale)

Dans une famille, on analyse l’enfant malade (le propositus), les parents..

On rend un calcul de risques en fonction de la position familiale (cousin au 1er degré)

Quels sont les risques a priori d’avoir une mutation courante ?

Exemple de calcul de risque (en fonction de la clinique, des origines ethno-géographiques, des antécédents, de la consanguinité)

La zone blanche est la zone normale et la noire celle qui est mutée, on a deux allèles récessifs chez le père et la mère. Malheureusement un de leur enfant sera homozygote.
La sœur de la maman à un frère qui à un enfant hétérozygote. Il faudra rechercher les mutations courantes chez les enfant se celui-ci

Les deux parents sont donc porteurs sains, avec des allèles récessifs  risque de ¼ d’avoir un enfant malade. Dans une population, le risque d’être porteur est de 1/25, il y a a priori un risque de 1%

Si on prend un hétérozygote (la sœur), son mari n’a pas de mutation courante, quel est donc le risque d’avoir une mutation dans la descendance ? On trouve 1 /800

A 1% on se méfie mais avec un risque de 1/1000, on fait juste un suivi échographique

A cette époque, on ne connaissait pas la mutation mais on était sûr qu’il y avait une maladie. On prenait des sondes génétiques différentes et on les plaçait autour du gène, sans savoir vraiment ce qu’on cherchait. L’ADN était coupé par des enzymes, Si c’est pas coupé c’est 1 et si c’est coupé c’est 2, Avec deux allèles on a donc 3 possibilité : 11, 22 et 12.

Les 2 personnes malades étaient 22 et les deux non malades étaient 12, le fœtus est 12 donc pas malade.

Polymorphismes en pratique

  1.  Polymorphisme de restriction, à 2 allèles :
  2.  Polymorphisme de longueur de restriction
  3.  Variations ponctuelles de séquences touchant un site de restriction
  4.  Les fragments obtenus après coupure par des enzymes de restriction donnent des fragments d’ADN de tailles différentes

  1.  Polymorphismes de répétition dits microsatellites (parties répétitives de l’ADN, dans des régions particulières du génome)
  2.  Le nombre de microsatellites varie d’un individu à l’autre
  3.  Identification des individus

Exemple :

ATGCCACACAGCCC : 3 CA                                                       

ATGCCACACACACACACAGCC : 7 CA

  1.  (CA : 3/7)

VII) Traitements

  1.  Symptomatiques

La mucoviscidose : maladie chronique avec des diarrhées mais surtout des complications pulmonaires très fréquemment responsable de décès.

  1.  Améliorer la fonction respiratoire (élimine les sécrétions bronchiques épaisse) et ses complications :
  2.  Avec kinésithérapie respiratoire et drainage postural (vider les segments pulmonaire) ; toilette bronchique biquotidienne (parents) ; gymnastique respiratoire et sport recommandés
  3.  + vaccinations
  4.  + Atb (fluoroquinolones)
  5.  Germes impliqués les plus fréquents : Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa

Pourquoi le mucus est-il si épais (important, tombe souvent !)

Il n’y a plus de pompe chlorure donc le Cl- reste dans la cellule. La cellule a un surplus de charges négatives. Elle compense par une entrée massive de Na+, cela forme du NaCL (sel). L’intérieur de la cellule devient trop salé, elle cherche donc de l’eau pour diluer et la prend à l’extérieur. Comme c’est une cellule épithéliale pulmonaire, elle prend l’eau du mucus, et celui ci deviens très épais et favorise la présence de germes, les cils de la cellule pulmonaire sont englués et ne peuvent pas battre pour éliminer les bactéries.

  1.  Améliorer la fonction digestive : empêcher le déficit de croissance :
  2.  Remplacer les enzymes pancréatiques
  3.  Diminuer les graisses : régime hypercalorique pauvre en graisses enrichis en vitamines (compenser la carence des acides gras essentiels)

L’approche pharmacologique a pour but de libérer la sortie des chlorures…

  1.  Action thérapeutique sur l’inflammation et le mucus :
  2.  Anti-inflammatoires non stéroïdiens (ibuprofène) et stéroïdiens (corticostéroïdes/voie inhalée)
  3.  Aérosols anti-viscosité du mucus
  4.  Vaccin antigrippal
  5.  ATB, en fonction des germes (IV et aérosols)

Ce ne sont que des palliatifs, on maintient l’état mais on ne soigne pas

  1.  Thérapie Génique

Première forme de TG : transplantation pulmonaire, cardio-pulmonaire

La TG tente de corriger le défaut génétique du plus grand nombre de cellules bronchiques.

But TG  introduire un gène médicament (ADN) dans une cellule

Attention on ne sait pas corriger, on ne peut qu’ajouter des protéines normales à côté de protéines anormales. On ne peut pas retirer le CFTR anormal, on ne touche pas aux cellules germinales mais aux cellules somatiques

« La thérapie génique est l’insertion délibérée de matériel génétique dans l’organisme d’un patient pour corriger un défaut précis à l’origine d’une pathologie, que ce soit à titre curatif ou préventif. »

  1.  Pour des maladies sans traitement, létales
  2.  Correction ou addition de copies normales d’un gène au niveau somatique, non germinale
  3.  En général : addition de copies normales du gène

La TG implique nécessairement :

  1.  Un gène-médicament (« transgène »)
  2.  Un vecteur  vecteur recombinant avec le transgène (transport de cellule)
  3.  Une cellule cible (de préférence spécifique, où le transgène puisse s’exprimer)
  4.  Un modèle animal avec la même forme de pathologie humaine afin de vérifier et contrôler les « corrections cellulaires »

L’évolution de la thérapie génique repose essentiellement sur le développement des systèmes de transferts des gènes (vecteurs) :

  1.  Ils doivent être sûrs, efficaces
  2.  Capables d’exercer leur fonction dans des cellules qui ne se divisent pas
  3.  Et d’assurer la stabilité de l’expression du gène thérapeutique

Démonstration du transfert de gène CF normal in vitro dans des cultures d’épithélium de sujets atteints CF et chez des animaux (souris) :

  1.  Anomalie corrigées via une complémentation des gènes endogènes mais ce n’est pas aussi simple avec de nombreux aléas.

Méthodologie :

  1.  Impossible de transférer un gène de 250 kb (+ les éléments de régulation) ; 35kb maxi dans un AV
  2.  Transfert d’ADNc normal du gène CFTR (7,5kb) sans élément de régulation (promoteur génique etc.)

Vecteurs viraux ou non viraux : ADNc CFTR délivré au sein des cellules pulmonaires via un « vecteur »

  1.  Problématique
  2.  Définir comment l’ADNc est délivré à la cellule
  3.  A quel endroit du génome (intégré ou épisomal)
  4.  Temps nécessaire pour que le transgène agisse
  5.  Niveau d’expression du transgène
  6.  Réponse de l’hôte au vecteur et au produit d’expression du transgène

Il existe trois méthodes de thérapie génique :

TG ex vivo : prélever sur le patient les cellules cibles, les modifier génétiquement avec le vecteur viral recombinant avec le gène thérapeutique puis à les réintroduire chez le patient (particulièrement utilisé pour les cellules sanguines, faciles à prélever et à réintroduire) 

TG in vivo consiste à injecter le vecteur portant le gène thérapeutique directement dans la circulation sanguine ; le vecteur doit alors atteindre des cellules cibles spécifiques

TG in situ : placer directement au sein du tissu cible le vecteur recombinant

  1.  notamment pour la mucoviscidose (transfert de vecteurs dans la trachée et les bronches)
  2.  pour des cancers (injection dans la tumeur d'un vecteur portant le gène d'une toxine, par exemple)
  3.  ou de dystrophie musculaire (injection dans le muscle d'un vecteur porteur du gène de la dystrophine)

a) Vecteur non-viraux : liposomes

Particules lipidiques associées à de l’ADNc CFTR :

  1.  favorise l’entrée de l’ADNc au-delà de la mbr plasmique
  2.  système non infectieux, pas d’effets secondaires ou de toxicité
  3.  utilisation in vivo en IV chez la souris, en instillation trachéale ou en aérosol
  4.  transfection de nombreuses cellules possibles (pulmonaires, foie, cœur, rate, rein...)
  5.  mais mauvaise stabilité, efficacité plus faible que par les Adénovirus (AV), optimiser le complexe lipidique/ADN

b) Vecteur viraux : adénovirus (AV)

En effet, les virus en général infectent et entrent aisément dans les cellules

AV : vecteur viral le plus utilisé pour la TG de la mucoviscidose et de l’appareil respiratoire en général

AV pour les cellules se divisant peu (comme les cellules pulmonaires) :

  1.  le transgène est incorporé dans le génome viral (vecteur devenu recombinant)
  2.  le vecteur viral recombinant est rendu déficient pour la réplication
  3.  vecteur non intégré, donc épisomal et non transmis aux cellules filles lors des divisions cellulaires

Avantage AV :

  1.  non réplicatif
  2.  non intégré
  3.  encore un très bon vecteur pour l’appareil respiratoire

Inconvénients AV :

  1.  recombinaison possible avec un virus sauvage donc risque de réplication in vivo
  2.  risque d’expression des gènes viraux (inflammation, réaction 
immunitaire)
  3.  administrations répétées nécessaires
  4.  risque de réponse immunitaire anti-AV
  5.  c) vecteur viraux : Adeno-associated virus (AAV)
  6.  AAV naturellement déficient pour la réplication
  7.  peu immunogènes
  8.  sans pathologie humaine associée connue
  9.  intégration génomique possible  expression plus longue
  10.  mais cultures cellulaires AAV difficiles
  11.  transfert de cellules de petite taille
  12.  chez des animaux in vivo, absence d’intégration et dissémination 
d’AAV dans d’autres organes que le poumon



1. Утверждаю Согласовано Проректор по УМР Г2
2. Статья- Культура быта
3. статьями 91 92 и 1 Документ предоставлен КонсультантПлюсДата сохранения- 04
4. Задание- выбрать верные Основными объемами работы
5. Мероприятия направленные на формирование здорового биоценоза наиболее эффективны до рождения ребенка и в.html
6. Стоматолог г Пятигорск
7. истина иногда употребляется не только для оценки знания но и для характеристики какихто вещей и явлений д
8. гуманистическом и профессиональном отношении
9. химические и технологические свойства могут измениться.html
10. Куда ведет дорога очарованного странника