Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)
для клеточных мазков
1. Фиксация препарата:
1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4);
1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике);
1.3. удалить остатки формалина с препарата;
1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (если в парах, то достаточно 1 смены);
2. Постфиксация (пермеабилизация) препарата:
2.1. поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1);
2.2. инкубировать препарат 5 минут в морозильнике (-20оС);
2.3. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут.
3. Блокирование сывороткой:
3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;
3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;
3.3. осторожно слить раствор со среза.
4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:
4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-
1:250) в PBS с 1% WGS ;
4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной
камере;
4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):
5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-
1:200) в PBS с 1% WGS;
5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во
влажной камере в темноте;
5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :
6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;
6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;
6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
7. Микроскопия:
7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);
7.2. накрыть покровным стеклом;
7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).
Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)
для замороженных срезов
1. Фиксация препарата:
1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4);
1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике);
1.3. удалить остатки формалина с препарата;
1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (если в парах, то достаточно 1 смены);
2. Постфиксация (пермеабилизация) препарата:
2.1 постфиксация 0,1 % Тритоном Х-100 (по 15 мкл на срез), комнатная температура, 20 минут.
2.2 промывка PBS (2 смены по 5 минут).
3. Блокирование сывороткой:
3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;
3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;
3.3. осторожно слить раствор со среза.
4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:
4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-
1:250) в PBS с 1% WGS ;
4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной
камере;
4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):
5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-
1:200) в PBS с 1% WGS;
5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во
влажной камере в темноте;
5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :
6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;
6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;
6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
7. Микроскопия:
7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);
7.2. накрыть покровным стеклом;
7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).
Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)
для парафиновых срезов
1. Депарафинизация среза:
1.1. 3 смены ксилола по 5 минут;
1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут;
1.3. 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;
1.4. 1 смена PBS по 5 минут.
2. Предобработка среза (демаскирование АГ):
2.1. на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20 мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);
2.2. инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;
2.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
3. Блокирование сывороткой:
3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;
3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;
3.3. осторожно слить раствор со среза.
4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:
4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-
1:250) в PBS с 1% WGS ;
4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной
камере;
4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):
5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-
1:200) в PBS с 1% WGS;
5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во
влажной камере в темноте;
5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :
6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;
6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;
6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
7. Микроскопия:
7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);
7.2. накрыть покровным стеклом;
7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).