Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 10
ТЕМА: Экологическая микробиология. Нормальная микрофлора организма человека. Генетика и изменчивость микроорганизмов, ее формы, генная инженерия, практическое использование. Плазмиды и их выявление. Семинар с демонстрационным обеспечением.
МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА двояка. Она предполагает, с одной стороны, знакомство с микробами - обитателями организма человека (нормальная микрофлора) и окружающей среды (экология), оказывающими взаимное влияние друг на друга. С другой стороны, необходимость познания наследственной основы микробов с формированием различных вариантов изменчивости и роли последней для медицинской науки.
Важное фундаментальное и прикладное значение имеет изучение управляемости наследственной основой микроорганизмов и вопросы генной инженерии.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ: знакомство с экологической микробиологией, особенностями наследственности и видами изменчивости микробов, их теоретическим и практическим значением, использованием в современной медицинской науке и практике.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ
Конъюгация, роль F - фактора, особенности Hfr- клеток.
Сходство и различия хромосом и плазмид.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОВ ПРОТОКОЛА
|
№ п/п |
Наименование учебного элемента |
Методическое решение |
Регламент протокола |
|
1. |
Нормальная микрофлора человека |
Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2005. С. 137-146 |
Составить список основных микробиоценозов организма человека |
|
2. |
Микрофлора окружающей среды (экология) |
С.131-136 |
Составить перечень основных видов микрофлоры воды, воздуха, почвы и пр. |
|
3. |
Генетический аппарат микробов |
С.93-99 |
Зарисовать, подписать элементы |
|
4. |
Классификация форм изменчивости микробов |
С.100-114 |
Составить схему |
|
5. |
Перечень основных достижений генной инженерии в микробиологии |
Приложение 1 |
Вписать в протокол и составить схему |
|
6. |
Модификационная изменчивость (временная и длительная) |
Приложение 2, 2а |
Записать в протокол |
|
7. |
Фильтрующиеся формы и их реверсия |
Приложение 3 |
Записать в протокол, зарисовать |
|
8. |
Генотипическая изменчивость |
Приложение 4 |
Записать в протокол и заполнить |
|
9. |
Рекомбинационная изменчивость |
Приложение5 |
Записать в протокол и заполнить |
|
10. |
Плазмиды бактерий |
Приложение 6 |
Заполнить таблицу в протоколе |
|
11. |
Применение методов генетики микроорганизмов в медицине |
Домашнее задание |
Составить перечень в протоколе |
|
12. |
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) |
Приложение 7 |
Переписать в протокол |
|
13. |
Определение мутагенной активности химических веществ |
Приложение 8 |
Записать в протокол |
|
14. |
Итоговый тест-контроль усвоения темы |
Приложение 9 |
Сложное записать в протокол. |
Приложение 1
ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В МИКРОБИОЛОГИИ
|
Бактериальный объект |
Донорный ген-материал |
Достигнутый эффект 1 |
|
Е. coli |
Ген инсулиносинтеза человека |
Синтез человеческого инсулина эшерихиями |
|
Е. соli |
Ген синтеза интерферонов человеческими лейкоцитами |
Синтез человеческого интерферона эшерихиями (реаферон) |
|
Е. coli |
Ген синтеза прочих гормонов человека |
Синтез человеческих гормонов эшерихиями |
Приложение 2
МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ (ВРЕМЕННАЯ)
|
Объект - бактерии |
Изменяющий фактор и контроль |
Получаемый эффект изменчивости |
|
Vibrio cholerae |
10% р-р NaCl |
Полиморфизм: шарообразные клетки в контроле извитые, в виде «запятой» |
|
Proteus vulgaris |
МПБ с 0,2% карболовой кислоты, посев в конденсат |
Потеря подвижности, ползучего роста нет (в отличие oт контроля) |
|
Serratia marcescens |
Рост при разных температурах: 22, 37 С0 |
Пигментообразование только при низкой температуре +22 С0 |
При переводе в оптимальные условия наступает реверсия - полное восстановление исходных характеристик.
Приложение 2а
МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ (ДЛИТЕЛЬНАЯ)
|
Вид изменчивости |
Действующий фактор |
Возможность реверсии |
|
Лекарственная резистентность. Фильтрующаяся форма Диссоциация на S-и R- формы L- формы бактерий |
Лекарственный препарат (антибиотик). Массивная антибиотикотерапия. Экстремальные условия. Антибиотики и прочие |
После многократных пересевов на оптимальную среду. - « - После прекращения действия индуцирующего фактора (не всегда) |
Приложение 3
ЭКСПЕРИМЕНТ ПО ВОССТАНОВЛЕНИЮ (РЕВЕРСИИ) ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ БАКТЕРИЙ
- Приготовить фильтрат патологического материала (например, мочи), использовав бактериологический фильтр Зейтца,
засеять чашки с МПА культурой Sarcina lutea,
- нанести фильтрат пипеткой или петлей на посев сарцины. Поставить в термостaт на 1-3 суток при +39 С0,
- учесть готовые результаты посева. Зарисовать колонии ревертанты на сарциновом газоне.
Приложение 4
ВИДЫ ГЕНОТИПИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ
|
Вид изменчивости |
Микробная модель компонента |
Результат |
|
Трансформация |
Пневмококки в голодной среде: серотип I - живой, III- убитый ДНК пневмококка серотип III и живой пневмококк I серотипа |
Выделены из среды живые серотипы I и III - « - |
|
Трансдукция с лизогенной конверсией |
Бактерии нетоксичные, бактериофаг из токсичных |
Выделены токсичные бактерии |
|
Генетическая половая рекомбинация (межвидовая) |
Донор F+ E.coli селективные признаки Lac+, Str 5. Реципиент F- S. flexneri признаки Lac-, Str7 |
Генетические рекомбинанты Lac+, Str2 |
Приложение №5
СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОВЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАНТ
дизентерийные бактерии F- - реципиент с главными селективными признаками: Lac-, Str(r);
кишечные палочки F+ -донор с главными селективными признаками Lac+, Str(s);
минимальная среда (голодная, солевая);
стрептомицин в порошке;
1% раствор лактозы;
эозин - метиленовый индикатор.
Этапы проведения эксперимента:
- стандартизация скрещиваемых культур по Пехову А. и Абидову А.
Реципиент F- - I млрд. мт/1 мл.
Донор - 250 млн. мт/мл,
скрещивание культур путем приготовления бактериального кросса F+ : F- в соотношении 4:1,
инкубация в термостате для конъюгации, 1 час при +37С0,
готовят минимальную среду с селективными добавками и индикатором: расплавить, остудить до +45С0, добавить 150 ЕД/мл стрептомицина, 1% лактозы и индикатор эозин 0,4 мг/мл +метиленовая синь 0,065 мг/мл,
высевают на среду бактериальную смесь кросса и отдельно - исходные культуры на селективные среды,
инкубировать в термостате при +37С0 1-5 суток,
учет-обнаружение и изучение половых гибридов. На селективной среде они вырастают только в виде цветных колоний, поскольку рекомбинанты унаследовали от донора признак Lact +, а от реципиента – Str(r).
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ УЧАСТНИКОВ ЭКСПЕРИМЕНТА
|
Свойства селективные |
Дизентерийные бактерии (реципиент) |
Кишечная палочка (донор) |
Половой рекомбинант |
|
Отношение к лактозе |
Lac - не разлагают |
Lac+ |
Lac+ |
|
Отношение к стрептомицину |
Str(r) резистентны |
Str(s) чувствительны |
Str(r) резистентны |
|
Наличие фактора фертильности |
F- - отсутствует |
F+ - имеется |
F+ или F- вариабельно |
Реципиент на селективной среде не растет по причине признака Lac-, неспособности утилизировать единственного источника питания на голодной среде, а донор - из-за присутствия стрептомицина и Str(s).
Приложение 6
ОСНОВНЫЕ ПЛАЗМИДЫ БАКТЕРИЙ
Плазмиды - это автономно воспроизводящиеся, функционирующие и самостоятельно передаваемые гены, расположенные либо в цитоплазме (эписомы), либо интегрированы в хромосоме, кодирующие и реализующие определенные признаки.
|
Название плазмиды |
Функции плазмид |
|
Lis+ /Let+/ лизогении |
Профаг, ген потенциальной летальности бактерии |
|
tох+ токсигенности |
Определяет токсигенность |
|
Со1+ колициногении |
Бактериоциногения у E.coli |
|
Pest+ пестициногении |
Бактериоциногения у Y.pestis |
|
Наеm+ гемолитичности |
Гемотоксичность |
Приложение 7
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
ПЦР - вариант рекомбинационной (гибридологической) диагностики, основанный на биосинтезе специфических локусов, повторяющих присутствующий в субстрате геном.
Принцип метода: Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток возбудителя с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь свободных мононуклеотидов, ДНК - полимеразу, праймер - уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры (30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного гена возбудителя ин витро. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агарозном геле.
Приложение 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ЭЙМСА
Принцип метода: на чашку с минимальным агаром засевают газоном ауксотрофный штамм S.typhimurium (штамм Эймса). На газон накладывают стерильные диски из фильтрованной бумаги, пропитанные испытуемыми веществами и контрольными растворами мутагенов (этидиумбромид, нитрозогуанидин). Рост колоний ревертантов вокруг дисков будут наблюдаться только в том случае, если нанесенное на них вещество обладает мутагенной активностью.
Приложение 9
ТЕСТЫ ИТОГОВОГО КОНТРОЛЯ УСВОЕНИЯ ТЕМЫ
Сделать выборку правильного ответа
1. Материальной основой наследственности большинства микроорганизмов является:
а) ДНК
б) РНК
в) обе НК
2. В основной генетический аппарат микроорганизмов не входит
а) ДНК
б) РНК
в) плазмиды
г) ДНК-полимераза
д) рибосомы
е) лизосомы
3. Бактерии в S - форме образуют на плотных питательных средах колонии:
а) круглые, гладкие, с ровными краями
б) шероховатые, с неровными краями;
в) зернистые
4. Бактерии R-форме образуют на плотных питательных средах колонии:
а) круглые, гладкие, с ровными краями
б) шероховатые, с неровными краями;
в) зернистые
5. Изменение культуральных свойств, сопровождающееся появлением R-форм, называется:
а) мутация
б) рекомбинация
в) диссоциация
г) трансформация
6. Транспозон - это фрагмент ДНК:
а) способный перемещаться из одного участка ДНК на другой или с одного репликона на другой
б) способный к автономной репликации
7. Способность бактерий к конъюгации связана с наличием на их поверхности:
а) жгутиков
б) фимбрий
в) пилей
8. Способность бактерий к конъюгации детерминирована наличием:
а) F- плазм иды
б) оперона любой плазмиды
в) профага
г) хромосомной мутацией.
9. Наиболее крупные фрагменты ДНК или целая хромосома передаются от клетки-донора к клетке-реципиенту в процессе:
а) трансдукции
б) конъюгации
в) трансформации
10. Плазмиды – это:
а) внехромосомные генетические структуры бактерий
б) разновидность включений в цитоплазму
в) аналог плазматического ретикулума
г) плазмиды, интегрированные с хромосомой.
11. Передача плазмид от клетки к клетке возможна при:
а) трансдукции
б) конъюгации
в) трансформации
12. Конъюгация - это
а) перенос генетической информации от донора к реципиенту при помощи умеренного фага
б) половой процесс у бактерий, при котором в результате контакта через секс пили может происходить передача ДНК донора к реципиенту
в) один из способов рекомбинации у бактерий, при котором фрагмент нативной ДНК клетки-донора воспринимается клеткой - реципиентом
13. Трансдукция - это
а) перенос генетической информации от донора к реципиенту при помощи умеренного фага
б) половой процесс у бактерий, при котором в результате контакта через секс пили может происходить передача ДНК донора к реципиенту
в) один из способов рекомбинации у бактерий, при котором фрагмент нативной ДНК клетки-донора воспринимается клеткой - реципиентом
14. Трансформация – это
а) перенос генетической информации от донора к реципиенту при помощи умеренного фага
б) половой процесс у бактерий, при котором в результате контакта через секс пили может происходить передача ДНК донора к реципиенту
в) один из способов рекомбинации у бактерий, при котором фрагмент нативной ДНК клетки-донора воспринимается клеткой - реципиентом
15. Изменчивость микробов используется:
а) в диагностике
б) в генной инженерии
в) в создании вакцин
г) в проверке чувствительности к антибиотикам
д) в идентификации микробного вида
е) во всех перечисленных назначениях
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная.
5. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И. M., 2006. С. 80-88, 137-139.
6. Коротяев А. И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. С-Пб. 2002. С. 84-106, 118-120.
Дополнительная
PAGE 80