Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН
СМОЛЯНІНОВА ОКСАНА ОЛЕКСІЇВНА
УДК 636.32/.38:591.876:637.612:577.1
ОСОБЛИВОСТІ МЕЛАНОГЕНЕЗУ В ГІРСЬКОКАРПАТСЬКИХ ОВЕЦЬ
З КОЛЬОРОВОЮ ВОВНОЮ
03.00.04 –біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
Львів –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН,
заслужений діяч науки і техніки України
Макар Іван Арсентійович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії фізіолого-
біохімічних основ вовноутворення
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Розгоні Іван Іванович,
Інститут біології тварин УААН, головний науковий
співробітник лабораторії клітинної інженерії
кандидат сільськогосподарських наук, заслужений
працівник сільського господарства України
Чепур Валентина Кузьмівна,
Одеський державний аграрний університет,
професор кафедри генетики і розведення сільсько-
господарських тварин
Провідна установа –Державний науково-дослідний контрольний інститут
ветеринарних препаратів і кормових добавок
Міністерства аграрної політики України,
відділ фармакології і імунології, м. Львів
Захист дисертації відбудеться 11.04.2006 р. о__12___ годині на
засіданні вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою:
, Львів, вул. В. Стуса, 38
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН (79034, Львів, вул. Стуса, 38)
Автореферат розісланий 09.03. 2006 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради __________________________________________________Віщур О.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Серед актуальних проблем сучасної біології проблема меланогенезу займає одне з провідних положень, що зовсім закономірно, позаяк з’ясування питань, пов’язаних з пігментацією організмів, має не лише наукове, а й чимале прикладне значення, особливо для медицини та тваринництва.
Упродовж останніх десятиліть розведення овець у Карпатському регіоні виключно спрямовувалось на виробництво вовни лише білого кольору, що, природно, не могло не призвести до різкого зменшення популяції овець з кольоровою вовною. Між тим, саме кольорова вовна (особливо чорна та сіра) тут завжди була і надалі залишається ідеальною та екологічно чистою сировиною для виготовлення декоративно-художніх виробів –ліжників, килимів, технічних тканин і навіть витворів мистецтв.
У даний час в отарах овець гірських господарств народжується від 5 до 8% ягнят з кольоровою вовною. Кон’юнктура світового та внутрішнього ринку диктує доцільність розведення овець з пігментованою вовною, доказом чого є навіть той факт, що в масиві австралійських мериносів створено популяцію овець з вовною природного забарвлення.
Усе це закономірно спонукає до розгортання наукових досліджень, пов’язаних з вивченням питань меланогенезу в овець з пігментною вовною, механізмів регуляції цих процесів, прийомів селекції і розведення тварин, розроблення шляхів раціонального використання кольорової вовни. Логічно, що в даний час ця проблематика вважається актуальною, про що свідчить доволі численна бібліографія, особливо з питань регуляції біохімічних процесів у організмі овець (Moll I., 1995; Hynd P. I., 1999; Чепур В. К., 2003; Розгоні І. І., 2005), і меланогенезу зокрема, на генетичному рівні (Ильина Е. Д., Кузнецов Г. А., 1983; Алиев Г. А., Рачковский М. Л., 1984; Конюхов Б. В., 1990; Jackson I. J., 1994; Gunn T. M., 1999). Однак, є окремі відомості і про меланогенез у гірськокарпатських овець (Мартищук М. В., Гуменюк В. В., Макар І. А., 1993; Макар І. А., Гуменюк В. В., Мартищук М. В. та ін., 2004).
І все ж, найбільш вузьким місцем у цій проблематиці є брак інформації з питань кінетики меланогенезу в шкірі та вовноутворювальних структурах, тобто волосяних фолікулах, зв’язок його з активністю ключового ферменту цього процесу –тирозиназою. Ось чому це питання стало предметом наших досліджень.
З усього сказаного випливає актуальність даної теми, пошук шляхів і методів її реалізації. Отже, постановка і проведення досліджень такого роду –обґрунтовані і на часі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом наукової теми 02.04 № ДР. 0101U 003435. “Вивчити механізми вовноутворення і розробити генетико-біохімічні способи підвищення вовнової продуктивності і поліпшення якості вовни”, яка виконувалась у лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення Інституту біології тварин УААН, де автор досліджувала особливості структури хімічного складу, фізичні показники та їх взаємозв’язок а також питання регуляції цих процесів.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити зв’язок тирозиназної активності в шкірі та нагромадженням меланіну у вовні гірськокарпатських овець з руном природного забарвлення, що дало б можливість цілеспрямовано впливати на ці процеси.
Для реалізації поставленої мети вирішувались такі завдання:
1. Вивчити локалізацію та активність тирозинази в шкірі і волосяних фолікулах і нагромадження меланіну у вовні.
. З’ясувати взаємозв’язок активності тирозинази в шкірі з накопиченням пігменту у вовноутворювальних структурах − волосяних фолікулах.
. З’ясувати вплив екзогенного тирозину на перебіг меланогенезу в шкірі та накопичення пігменту у вовні.
. Дослідити вплив солемінеральної суміші, зокрема, міді, сірки та йоду на тирозиназну активність у шкірі та вміст меланіну у вовні.
. Встановити вплив пасовищного утримування, особливо полонинного літування, на активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною (білою, сірою, чорною та коричневою).
. Вивчити морфоструктуру вовни з природним забарвленням, її хімічний склад та фізичні параметри.
Об’єкт дослідження − процес меланогенезу і механізми його регуляції.
Предмет дослідження − вплив паратипових факторів на активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною, кількісне співвідношення у ній кератоз, вміст меланіну, тирозину, цистину, гексозамінів, азоту та сірки, а також на міцність та істинну довжину волокна.
Методи дослідження − для досягнення поставленої мети використовували біохімічні, гістологічні, спектрофотометричні, фізичні та статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше на поголів’ї гірськокарпатських овець з вовною природного забарвлення встановлено прямий зв’язок меланогенезу з активністю ключового ферменту цього процесу –тирозиназою і з’ясовано вплив на нього паратипових факторів. У процесі росту вовни досліджено локалізацію і активність ключового ферменту –тирозинази в шкірі та в її вовноутворювальних структурах –волосяних фолікулах.
Отримано нові дані про стимулюючий вплив мінеральних елементів, зокрема міді, сірки та йоду, а також амінокислоти тирозину на активність тирозинази і перебіг меланогенезу в шкірі. З’ясовано вплив полонинного літування овець на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та деяких інших компонентів у вовні, її фізичні параметри. Доказано, що меланогенез в шкірі є доволі лабільним процесом, свідченням чого є висока мінливість активності в ній тирозинази, яка може зазнавати помітних змін за відносно короткий проміжок часу, що пов’язано з нерівномірним надходженням у волосяні фолікули основного субстрату − тирозину.
В цілому отримано нові дані, які розкривають механізми впливу різноманітних факторів (субстратних, зовнішнього середовища та ін.) на перебіг меланоутворення в гірськокарпатських овець з кольоровою вовною, що дає можливість більш предметно підійти до розробки науково обґрунтованих заходів з їх розведення та утримання.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані можуть бути використані в селекційно-племінній роботі з гірськокарпатськими вівцями з природним забарвленням руна, а також при розробці науково обґрунтованих заходів їх годівлі та утримання, а окрім того технології використання кольорової вовни в Карпатському регіоні та в господарствах, в яких практикується розведення каракульських овець.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував наукову літературу за темою дисертації і виконав експериментальну частину, опрацював та провів статистичну обробку результатів, приймав участь у написанні публікацій та дисертаційної роботи. Аналіз і обговорення отриманих даних проведено спільно з науковим керівником.
Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на: Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених та спеціалістів “Молоді учені у вирішенні проблеми аграрної науки і практики”, Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С. З. Гжицького, Львів, 2003; звітних сесіях Інституту біології тварин УААН Львів, 2002–рр.; конференції молодих учених, Львів, 2003, 2004 рр.; Міжнародній науковій конференції Інституту біології тварин УААН, присвяченій 80-річчю від дня народження професора П. З. Лагодюка, Львів, 2004; І Міжнародній науково-практичній конференції Буковинського інституту агропромислового виробництва УААН, присвяченій стану та розвитку агропромислового виробництва в межах єврорегіону “Верхній Прут”, Чернівці, 2003.
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 7 наукових праць, монографія (у співавторстві)., 6 статей у фахових виданнях (з них –одноосібні), тези.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках комп’ютерного набору і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури - 252 джерела, з них 179 − латиною. Робота містить 17 таблиць, 5 діаграм і 9 фото, які розташовані на 30 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. За темою дисертаційної роботи виконано чотири серії дослідів на гірськокарпатських вівцях з кольоровою (природного забарвлення) вовною, які утримувались у приватному господарстві села Річка Косівського району Івано-Франківської області. Дослідження проводились у лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення Інституту біології тварин УААН.
Перша серія дослідів присвячена питанням локалізації та активності тирозинази у шкірі, накопиченню меланіну у вовні, а також дослідженню її макроструктури, хімічного складу та фізичних показників. Досліди проведено на 6-місячних ярках з вовною чорного та темно-коричневого забарвлення. Об’єктом досліджень слугували шкіра і вовна, зразки яких відбирали при постановці овець на дослід та в час його закінчення.
Друга серія дослідів була присвячена вивченню впливу тирозину, як основного субстрату тирозинази, на процес меланогенезу і накопичення меланіну у вовні. Для цього за принципом аналогів було підібрано дві групи 12-місячних ярок (по три голови в кожній) чорного окрасу, які упродовж 60-ти днів перебували за однакових умов утримання. Вівці контрольної групи отримували раціон, збалансований за поживними речовинами та енергією згідно з існуючими нормами годівлі (Калашников А.П., 1985), а дослідної − додатково до основного раціону в складі комбікорму одержували тирозин із розрахунку 500мг на голову на добу. У шкірі (зразки одержували методом біопсії) визначали активність тирозинази, а у вовні –вміст меланіну, тирозину, сірки, цистину та гексозамінів; з фізичних показників досліджували справжню довжину і міцність волокон.
У третій серії дослідів вивчали вплив аліментарних факторів, зокрема згодовування добавки мінеральних елементів, на активність тирозинази в шкірі овець, накопичення пігменту в їх вовновому покриві, а ще вміст тирозину, сірки цистину, гексозамінів, співвідношення кератоз, а також параметри фізичних показників вовнових волокон. За принципом аналогів було сформовано дві групи 6-місячних ярок з кольоровою вовною. У кожній групі перебувало по три голови тварин чорного і три –темно-коричневого забарвлення. Дослідна група, додатково до основного раціону, збалансованого за поживними речовинами, одержувала суміш солей (сірчанокислий натрій, вуглекисла мідь та йодистий калій) у кількості відповідно 4 г, 1,5 мг та 1 мг на голову на добу. Добавку мінеральних речовин тваринам згодовували у складі комбікорму з розрахунку 100 г на голову на добу. Вибір саме таких мінеральних елементів обумовлений важливістю їх для процесів вовноутворення, в тому числі і меланогенезу. Дослід тривав 120 днів, а об’єктом досліджень слугували шкіра та вовна, зразки яких відбирали у тварин на початку та в кінці досліду.
У четвертій серії дослідів вивчали вплив пасовищного утримання (полонинного літування) на меланогенез в організмі повновікових вівцематок. Дослід, тривалістю 200 днів, було проведено на матках з білим (контроль), чорним, сірим і коричневим окрасами руна.
Зразки шкіри та вовни для досліджень відбирали під час весняної стрижки овець та перед вигоном їх на пасовища (початок травня), а також під час постановки їх на зимово-стійлове утримання (жовтень). У шкірі досліджували активність тирозинази, у вовні − накопичення меланіну, вміст тирозину, загальної сірки, цистину та гексозамінів. Із фізичних показників досліджували справжню довжину та міцність волокон.
Локалізацію ключового ферменту меланогенезу –тирозинази (КФ 1.14.18.1) в шкірі досліджували гістохімічно за методом Б. Беккера та ін. (1935), а меланін за методом Н. А. Діамідової (1957) використовуючи при цьому мікроскоп ЛОМО з вмонтованою відеокамерою і програмним забезпеченням “Меd. Can.”. Загальну активність ферменту визначали за методом Лоурі (1951) у нашій частковій модифікації. Вміст меланіну в вовні визначали ваговим методом, тирозин − колориметрично за Л. А. Гольдшмідтом (1957), сірки кількісним методом Макара та співавт. (1984), цистину за методом Фоліна-Марензі в модифікації Н. Цана і К. Траумана (1954), вміст гексозамінів за Н. П. Боасом (1953), а макроструктуру (кількісне співвідношення кератоз) вовни за методом Макара та співавторів (1968), в основу якого покладено метод М. С. Корфілда (1958). Фізичні показники вовни, зокрема справжню довжину та міцність (розривне зусилля) визначали за методом В. В. Калініна та ін. (1970). Статистичну обробку цифрових даних здійснювали за І. А. Ойвіним (1960).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Локалізація тирозинази в шкірі та волосяних фолікулах. Про локалізацію цього ензиму в шкірі ми судимо за інтенсивністю та місцем розташування меланіну, який, як відомо, є продуктом функціональної діяльності меланоцитів. На підставі одержаних даних констатуємо, що активність тирозинази завжди фіксується рівномірно по усьому епідермісу, − від його базального до рогового шару що, зрозуміло, забезпечує достатню рівномірність розподілу пігменту в середині кожного кератиноциту. З цього випливає, що епідермальні меланоцити базального шару через свої відростки ніби “вприскують” темні зернята меланіну у верхні шари шкіри, допоки вся кількість пігменту не виявиться у зроговілому шарі. При цьому важливо зауважити, що число меланоцитів на одиницю поверхні шкіри в різних її ділянках може бути неоднаковим, хоч завжди на одній і тій же зоні незалежно від кольору шкіри воно, як правило, є однаковим. Це в принципі підтверджує загальновизнане положення про те, що відмінності в кольорі шкіри залежать не від числа меланоцитів, а від вмісту в них меланіну. І справді, у чорній шкірі гранул меланіну більше, до того ж вони порівняно більші за розміром. У результаті епідермальний шар зафарбований в інтенсивний чорний колір (рис.1).
111
Рис. 1. Поперечний зріз волосяного фолікула вівці з руном чорного кольору. 400х.
Встановлено, також, що ключовий фермент меланогенезу − тирозиназа локалізована в усіх структурних компонентах волосяного фолікула: його цибулині, зовнішній та внутрішній кореневих піхвах, а також у сполучнотканинній сумці. В інтактній шкірі вона розташована рівномірно по усьому епідермісу –від його базального до зроговілого шарів. Гранули пігменту розташовані безпосередньо як у шкірі, так і у волосяних фолікулах.
Локалізація меланіну в стержні волоса. Меланінові гранули, які визначають колір волокон, слід розглядати як результат взаємодії меланоцитів волосяного фолікула з кератиноцитами. Гранули меланіну в стержні зрілого вовнового волокна розподіляються в будь-якому з трьох його шарів: лускатому (кутикулі), корковому (кортексі) і серцевинному (мозковому). І все ж, судячи з локалізації пігментних зерен, найбільша кількість його міститься в корковому та серцевинному шарах, що створює враження суцільного чорного (темного) фону. Можна стверджувати, що в процесі диференціювання клітини кортексу дозріваючого волоса ущільнюються, фіксуючи при цьому гранули меланіну між його філаментами, тобто макро- і мікрофібрилами. Паракортикальні клітини, на відміну від ортокортикальних, коркового шару, містять більше гранул, які, до речі, є і в темних і чорних шерстинках, як правило, овальної форми, а сама поверхність їх − дрібнозерниста і покрита тонкою мембраноподібною осміофільною речовиною. Це і є еумеланін. Гранули світлих шерстинок значно менші, еліпсоподібної, або паличкоподібної форми. Поверхня їх їз своєрідними заглиблиннями. Очевидно, це можуть бути феомеланіни.
Колір вовни в залежності від активності тирозинази в шкірі. Встановлено прямолінійну залежність між цими показниками: в міру підвищення активності ферменту в шкірі процес накопичення пігменту в вовні зростає (рис.2).
Рис. 2. Взаємозв’язок активності тирозинази в шкірі з вмістом меланіну в вовні (n=3)
Примітка. Статистично вірогідні різниці між вівцями з білим і кольоровим руном: * р<0,05;
***р<0,001; статистично вірогідні різниці між чорними і кольоровими вівцями:*/ р<0,05.
Отже, найвищою активністю тирозинази відзначається шкіра овець з вовною чорного забарвлення (р<0,05); порівняно найнижчою – сірого (р<0,001). Тварини з вовновим покривом коричневого кольору займають проміжне положення (р<0,001). У шкірі білих овець тирозиназа також проявляє свою активність, проте вона є на порядок нижчою, до того ж локалізована лише в епідермальних меланоцитах. Найбільша кількість меланіну − у чорній вовні (7,5%, на суху речовину), дещо менша − у коричневій (6,8%) і найменша − у сірій (3,2%) (р<0,05). У білій вовні меланін відсутній.
Щодо кількісних величин цього пігменту в макроструктурах вовнового волокна, то нам вдалось розділити його на окремі компоненти, за допомогою методу фракціонування вовни, на так звані кератози. Виявлено, що найбільше меланіну спостерігається в альфа-кератозі, до того ж в остьових волокнах. Що стосується бета-кератози, то її пігмент, очевидно, перейшов у розчин під час фракціонування вовнового волокна, У гамма-кератозі меланіну значно менше, ніж в альфа, причому однаково, як в ості, так і в пуху.
Структура і фізико-хімічні показники кольорової вовни. Встановлено відмінності між білою та кольоровою вовною за її структурною організацією та фізико-хімічними параметрами (табл.1).
Таблиця 1
Порівняльна характеристика макроструктури, хімічного складу та фізичних показників білої і чорної вовни (М±m, n = 3)
|
Досліджувані показники |
Колір вовни |
|
|
білий |
чорний |
|
|
Альфа-кератоза, % |
59,7±0,51 |
56,9±1,92 |
|
Бета-кератоза, % |
10,9±0,69 |
12,8±0,65 |
|
Гамма-кератоза, % |
29,7±0,78 |
30,1±1,28 |
|
Загальний азот, % |
15,4±0,13 |
15,1±0,21 |
|
Загальна сірка, % |
2,88±0,03 |
2,0±0,02*** |
|
Цистин, % |
8,97±0,75 |
8,0±0,02 |
|
Гексозаміни, мг% |
226,3±13,1 |
201,9±26,9 |
|
Довжина, см |
21,1±0,96 |
21,0±1,45 |
|
Міцність, км |
8,9±0,11 |
8,2±0,29 |
|
Товщина, мкм |
33,4±0,43 |
33,6±0,62 |
Примітка. Статистично вірогідні різниці між білою і чорною вовною:***р<0,001.
Як видно з наведених даних, інтактне волокно овець чорного забарвлення, насамперед характеризується порівняно більшим розміром кутикулярного шару, тобто кутикули, що загалом є закономірним явищем. Біла вовна характеризується вищими показниками кристалічної частини, альфа-кератози. З інших змін досліджуваних показників на увагу заслуговує порівняно більший вміст сірки (р<0,001), цистину та гексозамінів у білій вовні. Саме ці показники і визначають фізичні параметри вовни, зокрема, її міцність, а отже і якість. І справді, міцність вовни у тварин цієї групи виявилась більшою (8,9 км проти 8,2 км). З цього випливає, що наявність пігменту у вовновому волокні не впливає на його міцність. Що до таких показників, як справжня довжина та товщина волокон, то вони практично виявились однаковими в овець обох порівнювальних груп.
Вплив екзогенного тирозину на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та тирозину у вовні. З’ясувалось, що меланогенез у шкірі овець є доволі лабільним процесом, свідченням чого є висока мінливість у ній активності тирозинази. Вона може зазнавати досить помітних змін за відносно короткий проміжок часу (60 днів), що, очевидно, пов’язано з нерівномірним надходженням у волосяні фолікули основного субстрату − тирозину. З наведених даних випливає, що тирозиназна активність у шкірі усіх тварин за період досліду знизилась, проте у тварин дослідної групи цей спад був набагато меншим, ніж у тварин контрольної групи (р<0,001). Що стосується меланіну вовни, то його вміст змінювався дещо інакше: подібно тирозиназі він зменшився у контролі, і суттєво зріс (майже у два рази) у дослідних овець (р<0,01). Вважаємо, що таке збільшення пігменту в вовні овець дослідної групи відбувається виключно за рахунок впливу тирозину (табл.2).
Таблиця 2
Активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та тирозину в вовні
з облікової площі шкіри (М±m, n = 3)
|
Групи тварин |
Досліджувані показники |
Початок досліду |
Кінець досліду |
|
Контрольна |
активність тирозинази мкм/г Ч с |
3,3 Ч 10-6 ±0,405 Ч 10-6 |
* 2,1 Ч 10–6 ± 0,015 Ч 10-6 |
|
меланін, % |
6,4 ± 0,26 |
5,7 ± 0,28 |
|
|
тирозин, % |
4,0 ± 0,25 |
1,9 ± 0,23 ** |
|
|
Дослідна |
активність тирозинази мкм/г Ч с |
3,0 Ч 10 –6 ± 0,066 Ч 10-6 |
†††* 2,8 Ч 10–6 ± 0,025 Ч 10-6 |
|
меланін, % |
6,8 ± 0,33 |
9,9 ± 0,74 ††* |
|
|
тирозин, % |
3,6 ± 0,06 |
2,7 ± 0,07 †*** |
Примітка. Статистична вірогідність різниць між початком і кінцем досліду:*р<0,05; р<0,025; **р<0,01; ***р<0,001; статистична вірогідність у кінці досліду між тваринами контрольної і дослідної груп: †р<0,05; ††р<0,01; †††р<0,001.
Вплив тирозину на вміст сірки, цистину, гексозамінів вовни та фізичні показники. На фоні практично однакового рівня загальної сірки вміст цистину в вовні овець по ходу досліду, особливо з наближенням весни, а отже і весняної стрижки, різко впав (з 13,8% на початку до 10,4% − під кінець досліду; р<0,05). А ось, вміст гексозамінів у вовні в процесі її росту збільшувався (р<0,05).
Справжня довжина та міцність усіх категорій вовнових волокон з часом змінювались, що безумовно, є закономірним явищем, однак темпи приростання їх у дослідних овець були порівняно вищими (р<0,01). Загалом же згодовування тирозину кольоровим вівцям справляло досить помітний вплив як на меланогенез, так і процеси вовноутворення в цілому.
Вплив мінеральної підгодівлі овець на процес меланогенезу, макроструктуру та фізико-хімічні параметри вовни. У цій серії дослідів встановлено, що згодовування тваринам солемінеральної суміші, у складі якої були сірка, мідь та йод, позитивно вплинуло на активність тирозинази, а отже і на меланогенез у цілому (табл.3). Так, в овець з вовною чорного кольору вона становила 7,1 Ч 10-6 мкм/гЧс (р<0,001), а в тварин з темно-коричневим руном 4,7 Ч 10-6 мкм/гЧс.
Як і в попередніх дослідах, так і у цій серії, насамперед, вимальовується доволі чітка закономірність взаємозв’язку між тирозиназною активністю в шкірі та накопиченням меланіну в вовні. І все ж, однозначно яскравіше вона проявляється у дослідних овець.
Таблиця 3
Вплив мінеральної підгодівлі на тирозиназну активність у шкірі
(M±m, мкм/гЧс, n = 3)
|
Групи тварин |
Колір вовни |
|||
|
чорний |
темно-коричневий |
|||
|
початок досліду |
кінець досліду |
початок досліду |
кінець досліду |
|
|
Контрольна |
3,2Ч10-6±0,129Ч106 |
** 4,1Ч106±0,088Ч106 |
2,7Ч106±0,234Ч106 |
3,2Ч106±0,303Ч10-6 |
|
Дослідна |
†† 3,8Ч106±0,008Ч10-6 |
***††† 7,1Ч106±0,173Ч106 |
3,2Ч106±0,425Ч106 |
4,7Ч106±0,759Ч10-6 |
Примітка. Статистично вірогідна різниця між початком і кінцем досліду: **р<0,01; ***р<0,001; статистично вірогідна різниця між тваринами контрольної та дослідної груп: †† р<0,01; ††† р<0,001.
Далі було встановлено, що згодовування вівцям солемінеральної суміші справляло доволі помітний вплив на хімічний склад вовни, причому, знову ж таки незалежно від фенотипу їхнього руна. Як видно з даних наведених у таблиці 4, цей вплив зумовив зростання всіх показників, про що особливо переконливо свідчить аналіз вовни, яка приросла за обліковий період. Зрозуміло, зміни наведених показників цієї ділянки косиці не могли не позначитись і на аналогічних показниках вовни, ріст якої тривав аж до самої стрижки.
Підгодівля овець мінеральною сумішшю справляла вплив і на кількісне співвідношення кератоз у вовні, тобто її макроструктуру. Важливо зауважити, що виявлена тут закономірність однаково була спільною для тварин обох груп. Зміна макроструктури вовнового волокна виражалась у кількісному перерозподілі білкових фракцій і, головним чином, альфа і гамма-кератоз. В обох випадках спостерігалось зменшення у вовні білка макро- і мікрофібрил і відповідно зростання гамма-фракції, тобто цементуючої речовини. На підставі одержаних даних можна стверджувати, що згадані елементи у вигляді солемінеральної суміші, справляли помітний, до того ж досить специфічний вплив на макроструктуру вовнового волокна, що виражалось у зменшенні в ньому кристалічної речовини, і відповідно збільшенні аморфної, яка, як відомо, відзначається високим вмістом сірки та цистину.
Згодовування вівцям мінеральної суміші справляло також суттєвий вплив на фізичні показники вовни. Усі вони за період досліду зросли, причому в однаковій мірі, як у пухові, так і остьові волокна, до того ж однаково, як у тварин чорного, так і темно-коричневого окрасу (р<0,01; р<0,002). Найперше це стосується розривного зусилля, особливо ості, величина якого була більшою у волокнах чорного забарвлення (10,5 км проти 9,5 км – темно-коричневого).
Таблиця 4
Вплив сірки, міді та йоду на вміст меланіну та тирозину в вовні чорного кольору
(M±m, %, на суху речовину, n = 3)
|
Досліджувані показники |
Групи тварин |
Початок досліду |
Кінець досліду |
Вовна з облікової площі |
|
Меланін |
Контрольна |
7,3±0,60 |
7,5±0,40 |
7,6±0,23 |
|
Тирозин |
3,1±0,29 |
1,9±0,17 * |
2,7±0,27 |
|
|
Меланін |
Дослідна |
7,2±0,14 |
8,1±0,18* |
8,5±0,11**† |
|
Тирозин |
3,2 ±0,08 |
2,1±0,13** |
1,9±0,13*** |
Примітка. Статистично вірогідна різниця між початком і кінцем досліду: *р<0,05; р<0,025; **р<0,01; ***р<0,001; статистично вірогідна різниця між контрольною і дослідною групами:† р<0,025.
Що стосується пуху, то він виявився довшим у руні овець темно-коричневого кольору. На показнику міцності вовни слід зробити особливий наголос, позаяк він перебуває у прямій залежності від вмісту в ній сірки, цистину та гексозамінів. Саме цей показник за умов наших дослідів проявляв найбільшу чутливість до додаткового згодовування вівцям мінеральних солей.
Вплив пасовищного утримання овець на тирозиназну активність шкіри, вміст меланіну, тирозину, цистину та гексозамінів у вовні. Із даних, одержаних на початку досліду, видно (табл. 5), що найвищою активністю тирозинази характеризується шкіра чорних овець (3,8 Ч 10-6±0,876 Ч 10-6 мкм/г Ч с), найнижчою – сірих (1,6Ч10-6±0,049Ч10-6 ; р<0,001). Тварини з вовновим покривом коричневого кольору в цьому відношенні займають проміжне положення. Характерно, що в шкірі білих овець тирозиназа також проявляє свою активність, проте вона у 2−2,5 рази нижча, ніж у тварин інших фенотипів (р<0,025). Про зміни цього показника, які наступили під час пасовищного утримання овець на високогірних пасовищах, свідчать дані тієї ж самої таблиці. Найперше, що кидається у вічі, так це значне (на 43,4%; р<0,025) зниження активності тирозинази в шкірі білих овець .
Подібна закономірність змін виявилась і стосовно меланіну – кінцевого продукту меланогенезу. Так, найбільша кількість його була в чорній вовні (7,5% на суху речовину), а найменша − у сірій (3,2% на суху речовину; р<0,01). Вовна коричневого забарвлення займає проміжне положення (6,8%). Дослідами встановлено, що вміст меланіну в вовні, яка приросла за пасовищний період, хоч і незначно, але зменшився в усіх тварин. Проте, в овець сірого окрасу цей спад мав найяскравіший вираз. Вміст тирозину в вовні овець з руном різного забарвлення був також неоднаковим. А загалом вміст цієї амінокислоти в вовні коливається в межах 3−5% на суху речовину, і що важливо відмітити, що коричнева, а особливо вовна чорного забарвлення, містять більше тирозину (р<0,01), ніж, наприклад, біла або сіра.
Таблиця 5
Активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною
(M±m, мкм/г Ч с, n = 3)
|
Колір вовни |
Активність тирозинази |
|
|
періоди досліду |
||
|
початок |
кінець |
|
|
Білий |
0,8 Ч 10-6±0,095 Ч 10-6 |
0,4 Ч 10-6±0,026 Ч 10-6* |
|
Чорний |
† 3,8 Ч 10-6±0,876 Ч 10-6 |
††† 3,5 Ч 10-6±0,425 Ч 10-6 |
|
Коричневий |
††† 2,5 Ч 10-6±0,081 Ч 10-6 |
††† 2,3 х 10-6±0,152 Ч 10-6 |
|
Сірий |
††† 1,6 Ч 10-6±0,049 Ч 10-6 |
††† 1,5 Ч 10-6±0,023 Ч 10-6 |
Примітка. Статистично вірогідні різниці між початком і кінцем досліду: *р<0,025;статистично вірогідні різниці між початком і кінцем досліду білих і кольорових овець: † р<0,05; ††† р<0,001; р<0,002.
Погодні умови, які особливо виразно проявляються в період полонинного літування овець, справляють помітний вплив на вміст тирозину в вовні овець, вміст якої в ній за цей час суттєво зменшився, що особливо яскраво проявилось у тварин чорного кольору (з 5,2 до 3,4%; р<0,001)
Подібно тирозину вовни певних змін зазнавав вміст сірки, цистину та гексозамінів. З’ясувалось, що під час відростання її в умовах пасовищного утримання ці показники зросли (р<0,05; р<0,01). Особливо виразно це простежувалось з боку загальної сірки та гексозамінів. Щодо цистину, то така закономірність найяскравіше проявилась у групі тварин з чорною вовною.
За час полонинного літування овець фізичні показники підпадали кількісним змінам, причому змінювались лише в бік збільшення. Однаково це стосується, як справжньої довжини, так і міцності − як пухових, так і остьових волокон у всіх піддослідних тварин (р<0,05; р<0,01; (р<0,001).
Загалом, встановлено, що комплексна дія погодних чинників, яка особливо яскраво проявляється в період пасовищного утримання овець, тобто умови, які часто набувають екстремального характеру, мають помітний вплив не лише на процеси вовноутворення, але й на меланогенез. Останній за таких умов пригнічується, особливо в епідермальному шарі шкіри, доказом чого є суттєве зниження активності тирозинази в овець з білою вовною. У тварин з пігментованою вовною такого явища не спостерігалося. Що ж стосується змін у хімічному складі вовни, зокрема, змін вмісту меланіну і тирозину, то їх усеціло можна вважати результатом деструктивного впливу атмосферних факторів на вовнове волокно.
ВИСНОВКИ
У дисертації уперше на поголів’ї гірськокарпатських овець наведено теоретичне обгрунтування і з’ясовано особливості взаємозв’язку меланогенезу в шкірі з інтенсивністю нагромадження кінцевого продукту − меланіну у вовновому покриві з природним забарвленням. У процесі росту вовни досліджено локалізацію і активність ключового ферменту – тирозинази в шкірі та в її вовноутворювальних структурах – волосяних фолікулах. Вивчено вплив на ці процеси аліментарних факторів та умов утримання тварин.
1. Ключовий фермент меланогенезу − тирозиназа локалізована в усіх структурних компонентах волосяного фолікула: його цибулині, зовнішній та внутрішній кореневих піхвах, а також у сполучнотканинній сумці. В інтактній шкірі вона розташована рівномірно по усьому епідермісу – від його базального до зроговілого шарів.
2. Найвищою активністю тирозинази відзначається шкіра овець з вовною чорного забарвлення (3,8 Ч 10-6мкм/г Ч с); порівняно найнижчою – сірого (1,6 Ч 10-6 мкм/г Ч с). Тварини з вовновим покривом коричневого кольору займають проміжне положення.
3. У шкірі білих овець тирозиназа також проявляє свою активність, проте вона у них є на порядок нижчою, до того ж локалізована лише в епідермальних меланоцитах.
4. Між тирозиназною активністю шкіри та вмістом меланіну у вовні існує прямий зв’язок: найбільша кількість меланіну − в чорній вовні (7,5%; на суху речовину), дещо менша − у коричневій (6,8%) і найменша − у сірій (3,2%).
5. Макроструктура (кількісне співвідношення кератоз) у пігментованій вовні, особливо в повновікових тварин, мало чим відрізняється від макроструктури білої вовни. Помітніші відмінності простежуються у молодших овець. Так, біла вовна ярок характеризується вищими показниками кристалічної частини, тобто альфа-кератози, а чорна – аморфної або гамма-фракції. Вовна сірого забарвлення у цьому відношенні займає проміжне положення, хоч загалом, за цим показником ближче стоїть до чорної.
6. Вовна білих овець, на відміну від вовни інших окрасів, характеризується порівняно більшим вмістом загальної сірки (2,8% проти 2,0%), цистину та гексозамінів – показників, які визначають величину розривного зусилля волокон. Наявність пігменту у вовновому волокні не позначається на його міцності.
7. Меланогенез шкіри є доволі лабільним процесом, свідченням чого є висока мінливість активності в ній тирозинази, яка може зазнавати помітних змін за відносно короткий проміжок часу, що можливо пов’язане з нерівномірним поступленням у волосяні фолікули основного субстрату − тирозину.
8. Згодовування кольоровим вівцям тирозину в складі комбікорму справляє помітний вплив як на меланогенез, так і процеси вовноутворення в цілому.
9. Згодовування вівцям сірки, міді та йоду у вигляді мінеральної суміші стимулює ріст вовни, посилює її пігментацію, видозмінює макроструктуру та фізико-хімічні параметри волокон.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
Одержані дані можуть бути використані в селекційно-племінній роботі з гірськокарпатськими кольоровими вівцями, а також при розробці науково обгрунтованих заходів з їх годівлі та утримання, а також у технології використання кольорової вовни в Карпатському регіоні та господарствах, у яких практикують розведення каракульських овець.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Біологічні та господарсько-корисні ознаки гірськокарпатських овець з вовною природного забарвлення / І. А. Макар, В. В. Гуменюк, М. В. Мартищук, Г. М. Седіло, О. О. Федьків. – Львів: Афіша, 2004.- 147с.
2. Федьків О. О. Меланогенез в овець з кольоровою вовною // Науково-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН. - 2002. - Вип. 4, № 1. - С. 14 − 18.
3. Федьків О. О. Локалізація і активність тирозину в шкірі та вміст меланіну у вовні // Науково-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН. − 2004. − Вип.5, № 1−2. − С. 73 − 76.
4. Федьків О. О., Мартищук М. В., Даниш Т. В. Тирозиназна активність у шкірі гірськокарпатських овець з кольоровою вовною // Науковий вісник ЛДАВМ ім. С. З. Гжицького. − Львів, 2003. − Т. 5, Ч. 2. − С.123 − 126. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та визначення активності тирозинази у шкірі).
5. Федьків О. О., Мартищук М. В. Порівняльна характеристика тирозиназної активності в шкірі та рівня меланіну у вовні різнокольорових гірськокарпатських овець // Науково-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН. − 2004. − Вип. 5, № 3. − С. 77 − 79. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення визначення активності тирозинази у шкірі; меланіну у вовні, приймала участь в аналізі результатів та оформленні статті).
6. Вплив тирозину на меланогенез в шкірі овець / О. О. Федьків, І. А. Макар, М. В. Мартищук, Т. В. Даниш // Біологія тварин. − 2004, Т. 6, № 1 − 2. − С. 219 − 221 (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення визначення активності тирозинази у шкірі; вміст меланіну, тирозину у вовні, також участь в аналізі результатів та оформленні статті ).
7. Федьків О. О., Макар І. А., Мартищук М. В. Вплив погодних умов на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та тирозину у вовні гірськокарпатських овець з кольоровою вовною. // Науково-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН. – 2005. − Вип. 6. − № 1. − С. 188−191. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення визначення активності тирозинази у шкірі; меланіну, тирозину у вовні, також участь в аналізі результатів та написанні статті).
8. Макар І. А., Федьків О. О., Мартищук М. В. Тирозиназна активність шкіри – інтегральний показник оцінки пігментації гірськокарпатських овець з кольоровою вовною // Матеріали I міжнародної науково-практичної конференції “Стан та розвиток агропромислового виробництва в межах єврорегіону “Верхній Прут”.- Чернівці: Буковинський інститут агропромислового виробництва УААН.- 2003. −С. 57 − 58. (Дисертанту належить підготовка зразків шкіри до визначення тирозинази, проведення біохімічних досліджень, участь в аналізі результатів та написання тез).
АНОТАЦІЇ
Смолянінова О. О. Особливості меланогенезу в гірськокарпатських овець з кольоровою вовною. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2006.
В дисертації представлені результати вивчення особливостей меланогенезу в овець з кольоровою вовною. Уперше на поголів’ї гірськокарпатських овець з’ясовано локалізацію тирозинази і меланіну в шкірі та її вовноутворювальних структурах; встановлено зв’язок меланогенезу з активністю тирозинази в шкірі з нагромадженням меланіну у вовні, її ростом, морфоструктурою та фізико-хімічними параметрами. Досліджено вплив паратипових факторів на активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною, співвідношення у ній кератоз, вміст меланіну, тирозину, цистину, гексозамінів, азоту та сірки, а також їх вплив на міцність та істинну довжину волокон.
Одержано нову інформацію про вплив мінеральних елементів сірки, міді та йоду, а також тирозину на перебіг меланогенезу в шкірі. З’ясовано вплив пасовищного утримання і передусім полонинного літування овець на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та деяких інших компонентів у вовні, її фізичні параметри.
Ключові слова: меланогенез, гірськокарпатські вівці, тирозиназа, меланін, шкіра, вовна, волосяні фолікули.
Смолянинова О. О. Особенности меланогенеза у горнокарпатских овец с разноцветной шерстью. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.04 – биохимия, Институт биологии животных УААН, Львов, 2006.
Диссертация посвящена изучению особенностей меланогенеза и механизмов регуляции этих процессов у горнокарпатских овец с цветной шерстью. Впервые показана локализация тирозиназы (1.14.18.1) в коже и ее шерстеобразующих структурах, и установлена взаимосвязь между активностью этого ключевого фермента меланообразования и накоплением конечного продукта − меланина в шерсти, с интенсивностью её роста, макроструктурой и физико-химическими параметрами шерстного волокна. Исследовано влияние паратипичных факторов на активность тирозиназы в коже, соотношение кератоз в шерсти, содержание в ней меланина, тирозина, цистина, гексозаминов, азота и серы, а также физико-механические свойства. Проведено четыре серии опытов, в которых изучались следующие вопросы: локализация и активность тирозиназы в коже в связи с накоплением меланина в шерсти, влияние на меланогенез экзогенного тирозина − субстрата тирозиназы, минеральных елементов, (серы, меди и йода) а также пастбищного содержания овец. В результате гистологических исследований установлено, что тирозиназа локализуется практически во всех структурных компонентах волосяного фолликула − его луковице, внешнем и внутреннем корневом влагалищах, соединительнотканной сумке. В коже тирозиназа, судя по накоплению гранул меланина, локализована во всех слоях эпидермиса, включая и его базальной слой клеток. В результате биохимических исследований установлено, что сравнительно наивысшей тирозиназной активностью отличается кожа овец с руном черного цвета – (3,8 Ч 10-6±0,876 Ч 10-6 мкм/гЧс, р<0,05); более низкой − коричневого (2,5 Ч 10-6±0,081 Ч 10-6 мкм/гЧс, р<0,001); и самой низкой − серого (1,6 Ч 10-6±0,049 Ч 10-6 мкм/гЧс, р<0,001). В овец с руном белого цвета, тирозиназа также проявляется, однако она здесь в 2−2,5 раза ниже, чем у других группах. Установлено, что между активностью тирозиназы в коже и содержанием меланина в шерсти существует прямолинейная зависимость, то есть, по мере повышения активности тирозиназы в коже, в шерсти увеличивается содержание меланина. В шерстном покрове овец чёрного цвета содержится наибольшее количество меланина (7,5%; на сухое вещество), несколько меньше у овец с коричневой окраской (6,8%) и сравнительно найменьше в шерсти серых овец (3,2%; р<0,01). В коже овец с белой шерстью активность тирозиназы хотя и проявляется, но меланин при этом не синтезируется, что, повидимому, связано с отсутствием указанного фермента в эпидермальных меланоцитах.
Исследованиями установлено, что белая шерсть характеризуется более высокими показателями альфа-кератозы, то есть белка макро- и микрофибрил; черная − гамма-кератозы − основного или цементирующего вещества. Белая шерсть по сравнению с черной отличается и более высокими показателями серы (р<0,001), азота, цистина, гексозаминов. Соответственно она имеет более высокие показатели прочности.
В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии скармливания животным минеральных веществ, в частности, солей серы, меди и йода, а также аминокислоты тирозина на процессы меланогенеза. Показано, что скармливание их в качестве добавок к основному рациону положительно сказывается, как на интенсивности меланогенеза, так и процессах шерстеобразования в целом. Установлено также, что активность тирозиназы в коже овец является способным к изменчивости показателем, изменяется за сравнительно небольшой отрезок времени, что, правдоподобно связано с неравномерным поступлением тирозина, как субстрата в шерстеобразовательные структуры, то есть волосяные фолликулы. Условия пастбищного содержания овец оказывает заметное влияние на активность тирозиназы в коже, а следовательно, и содержание меланина, впрочем, как и других компонентов в шерсти.
В целом же, результаты проведенных исследований раскрывают физиолого-биохимические механизмы воздействия разнообразных факторов на пигментообразование в овец с цветной шерстью, что даёт возможность более предметно подойти к разработке научнообоснованных мероприятий по их разведению и содержанию.
Ключевые слова: меланогенез, горнокарпатские овцы, тирозиназа, меланин, кожа, шерсть, волосяные фолликулы.
Smolianinova O. O. The peculiarities of melanogenesis in Karpathian-Mountain sheep with coloured wool. − The manuscript.
Thesis of candidate for degree agricultural sciences on specialty 03.00.04 – biochemistry, The Institute of Animal Biology of UAAS, Lviv 2006.
Thesis deals with the investigation of peculiarities of melanogenesis in colored sheep. A new data about localization of tyrosinase and melamin in skin and wool formation structures of Karpathian-Mountain sheep with naturally colored wool have been obtained; the interrelation between the intensity of melanogenesis, the activity of tyrosinase in skin and accumulation of melanin in wool, their growth, morphological structure, physical and chemical parameters has been elucidated. The influence of paratypical factors on the activity of tyrosinase activity in skin of sheep with colored wool, ceratoses composition, melanin, tyrosine, cystine, hexoseamines, nitrogen and sulphur levels and also on wool fibers strength and real length has been investigated.
A new data about the influence of minerals (sulphur, cuprum and iodine) and tyrosine on melanogenesis in skin have been obtained. The influence of pasture maintenance on skin tyrosinase activity, melamine levels and physical parameters of wool has been elucidated.
Key words: melanogenesis, Karpathian-Mountain sheep, tyrosinase, melanin, skin, wool, wool follicles.