Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ К КУРСУ «ЭНЗИМОЛОГИЯ»
КРАТИЙ КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ
Лекциия № 1. Краткие исторические сведения о развитии энзимологии.
План лекции.
Возникновение понятия «Ферментация». Открытие Кирхгофом ферментативного распада крахмала. Получение первых фементативных препаратов. Возникновение представления о ферментах как катализаторах жизненных процессов. Дискуссия между Ю.Либихом и Л. Пастером о природе ферментативного действия. Ферменты и энзимы. Опыты М.Манасеиной, братьев Бюхнеров и Л.Лебедева. Последовательные этапы изучения химической природы ферментов, их физико-химических свойств и каталитического действия. Последние достижения в изучении ферментов. Значение работ отечественных учёных в развитии энзимологии.
История изучения ферментов. В 1814 русский химик К. Г. С. Кирхгоф открыл ферментативное действие водных вытяжек из проросшего ячменя, расщеплявших крахмал до сахара. Можно считать, что эти работы положили начало энзимологии (ферментологии) как самостоятельному разделу биологической химии. В 1833 французскими химиками А. Пайеном и Ж. Персо впервые был выделен из солода препарат фермента амилазы, что способствовало развитию препаративной химии Ф. В середины 19 в. разгорелась дискуссия о природе брожения между Л. Пастером, с одной стороны, и Ю. Либихом, П. Э. М. Бертло и К. Бернаром – с другой. Опираясь на свои классические работы, Пастер развивал представление о том, что брожение вызывается лишь живыми микроорганизмами и что процесс брожения неразрывно связан с их жизнедеятельностью. Либих и его сторонники, отстаивая химическую природу брожения, считали, что оно является следствием образования в клетках микроорганизмов растворимых Ф., подобных выделяемой из солода амилазе. Однако все попытки выделить из разрушенных дрожжевых клеток растворимый Ф., способный вызвать брожение, не удавались. Дискуссия Либиха и Пастера о природе брожения была разрешена в 1897 Э. Бухнером, который, растирая дрожжи с инфузорной землёй, выделил из них бесклеточный растворимый ферментный препарат (названный им зимазой), вызывавший спиртовое брожение. Открытие Бухнера утвердило материалистическое понимание природы брожений и имело большое значение для дальнейшего развития как энзимологии, так и всей биохимии.
В начале 20 в. Р. Вильштеттер с сотрудниками стал широко применять для выделения и очистки Ф. метод адсорбции (впервые предложен А. Я. Данилевским для разделения Ф. поджелудочной железы).
Данилевский Александр Яковлевич [10(22).12.1838, Харьков, — 18.7.1923, Петроград], русский биохимик, член-корреспондент Петербургской АН (1898). Окончил медицинский факультет Харьковского университета (1860). С 1863 профессор Казанского университета. В 1871 с группой профессоров подал в отставку в знак протеста против преследований прогрессивного учёного-анатома П. Ф. Лесгафта. В 1872—75 работал в Воронеже, Харькове и Петербурге, затем в Германии и Швейцарии. С 1885 профессор Харьковского университета, с 1892 — Военно-медицинской академии в Петербурге. Основные работы посвящены ферментам, химии белков и вопросам питания. Впервые разработал адсорбционный метод разделения ферментов поджелудочной железы. Предложил теорию строения белковой молекулы, «теорию элементарных рядов». В 1888—91 с братом В. Я. Данилевским издал 2 тома «физиологического сборника» — первого русского физиологического журнала.
Работы Вильштеттера, имевшие большое значение для характеристики свойств отдельных ферментов, привели вместе с тем к принципиально неправильному выводу, что ферменты не принадлежат ни к одному из известных классов органических соединений. Выдающимся успехом в выяснении химической природы ферментов были исследования американских биохимиков Дж. Самнера, выделившего в 1926 в кристаллическом виде фермент уреазу из семян канавалии, и Дж. Нортропа, получившего в 1930 кристаллы протеолитического фермента пепсина. Работы Самнера и Нортропа указали путь получения высокоочищенных кристаллических препаратов ферментов и вместе с тем неопровержимо доказали белковую их природу.
С середине 20 века благодаря развитию методов физико-химического анализа (главным образом хроматографии) и методов белковой химии расшифрована первичная структура многих Ф. Так, работами американских биохимиков С. Мура, У. Стайна и К. Анфинсена показано, что Ф. рибонуклеаза из поджелудочной железы быка представляет собой полипептидную цепочку, состоящую из 124 аминокислотных остатков, соединённых в 4 местах дисульфидными связями.
С помощью рентгеноструктурного анализа расшифрована вторичная и третичная структура ряда Ф. Так, методом рентгеноструктурного анализа английский учёный Д. Филлипс в 1965 установил трёхмерную структуру Ф. лизоцима. Показано, что многие Ф. обладают также четвертичной структурой, т. е. их молекула состоит из нескольких идентичных или различных по составу и структуре белковых субъединиц.
Механизм расшифровали почти одновременно для нескольких ферментов. Среди первых были сериновые протеазы, которые расщепляют белки (сериновыми они называются потому, что в реакции участвует аминокислота серин, а протеазами потому, что их субстрат – белки, или протеины). В 1968 году Блоу с сотрудниками опубликовал трехмерную структуру одной из таких протеаз химотрипсина, – это был решающий момент в их исследовании. В то же время другие группы ученых работали с другими ферментами. В России, например, много занимались аспартатаминотрансферазами. Установили структуру, изучили кинетику и тоже во всем разобрались. Перелом произошел в 60 – 70-е годы.
Под механизмом действия фермента понимают последовательность превращений молекул в его активном центре. Акт катализа начинается со связывания субстрата, затем происходит с десяток изменений, и, наконец, появляется продукт. Вот эту последовательность химических операций и понимают под механизмом. Механизм – это понятие, заимствованное из химической кинетики. Оно отражает сложность процесса. То есть нет такого, что сразу тысяча атомов сместилась и встала в новое положение. Любая химическая реакция происходит на отдельных связях между атомами, и поэтому большие перемещения, большие изменения – это просто последовательность большого числа стадий, которую можно записать химически. Можно выразить и в физических терминах как изменение потенциальной энергии компонентов, можно записать в биологических терминах: одно вещество превращается в другое. В любом случае понятие механизма включает информацию о промежуточных соединениях.
В ферментах нет ничего, что не было бы известно в элементарной химии, за исключением одного – организации процесса. Ферментативные реакции отличаются от обычных химических только тем, что ферментативный процесс – это хорошо организованная последовательность элементарных актов. Смещение протона на полтора ангстрема повышает реакционную способность в десять миллионов раз. Вот вы берете воду, у нее каталитическая константа для какой- то реакции равна единице. Берете гидроксильный ион, у него скорость на 7 порядков выше, то есть он ускоряет эту же реакцию в 107 раз. Берете протон – это еще в 107 раз быстрее. А что делает фермент? Он делает очень простую вещь: берет этот протон и вытягивает его на себя с помощью отрицательно заряженной карбоксильной группы. Все это происходит в плотной упаковке активного центра. Вода, инертное соединение, превращается в гидроксильную группу с высокой реакционной способностью.
Сейчас даже студент может выделить почти любой белок; для этого достаточно пропустить раствор с ним через три-четыре колонки. Кроме того, три четверти выделяемых белков получают генно-инженерными методами. Есть способ извлечь из клеточного экстракта какой угодно белок. В ген этого белка вставляют определенную последовательность нуклеотидов, и в белке появляется известный фрагмент. Затем экстракт пропускают через колонку, где сорбент специфически связывается с этим фрагментом. Таким образом чистый белок получают всего в одну стадию. В общем, методы выделения стали стандартными.
Чтобы понять, как работает фермент, нужно знать его структуру и кинетику. И то и другое тоже узнают традиционными методами, и очень быстро. Структура – это в первую очередь сиквенс, последовательность аминокислот. Она содержит огромную информацию. Трехмерную структуру дает рентгеноструктурный анализ, полностью автоматизированный. После того как вы приготовили кристалл, вам нужно поехать в Германию, и там вам за две-три недели все сделают. Чтобы получить кристалл, нужно наработать около 5 миллиграмм белка, а генно-инженерные методы дают десятки грамм в литре. Кинетические исследования позволяют выделить и детально проанализировать все стадии каталитического акта.
3