Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна
Шакіна Любов Олександрівна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ ПОЛІТЕННИХ ХРОМОСОМ DROSOPHILA MELANOGASTER MEIG. У ЗВ′ЯЗКУ З ЕФЕКТОМ ГЕТЕРОЗИСУ, ІЗОГЕНІЗАЦІЄЮ ТА ВПЛИВОМ ЩІЛЬНОСТІ КУЛЬТУРИ
03.00.15 - генетика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
|
Науковий керiвник: |
доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч
d8
науки і техніки України,
Шахбазов Валерій Гайович ,
Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України,
професор кафедри генетики та цитології
|
Офiцiйнi опоненти: |
доктор біологічних наук, професор, Дуган Олексій Мартем'янович, Національний технічний університет України „Київський політехнічний інститут” НТУУ (КПІ) Міністерства освіти і науки України, декан факультету біотехнології і біотехніки |
|
кандидат бiологiчних наук, Суханов Святослав Всеволодович, Iнститут шовкiвництва УААН, завiдувач лабораторi генетики |
|
|
Провiдна установа: |
Iнститут бiологi клiтини НАН Украни, м. Львiв |
Захист відбудеться “5 ” жовтня 2006 р. о 15-15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. III-15.
З дисертацією можна ознойомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий 21 червня 2006 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 О. М. Федота
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Однією з актуальних задач сучасної генетики є з'ясування механізмів дії несприятливих факторів на генному та хромосомному рівні. Ця проблема піддається ретельному дослідженню [Маркель А. Л., Бородин П. М., 1990; Parsel D., Lindquist S., 1993; Раушенбах И. Ю. и др., 2001; Хлебодарова Т. М., 2002; Грунтенко Н. Е. и др., 2004], але багато питань залишаються невирішеними. У даному аспекті особливості структурно-функціональної організації інтерфазних хромосом вивчені недостатньо.
Одним із розповсюджених екологічних стресових факторів, що діють у природних умовах та у значній мірі визначають індивідуальне пристосування організмів є висока щільність популяції [Раушенбах И. Ю., 1990]. Особливо значущим для розуміння генетичних механізмів дії та адаптації до цього фактора є дослідження показників активності ядерного геному. Наявні дані з цього питання щодо ступеня політенії й транскрипційної активності генів, отримані на модельному об'єкті - Drosophila melanogaster, неповні та суперечливі [Беляева Е. С., Жимулев И. Ф, 1974; Рарог М. А. и др., 1999].
Як відомо, генотип є провідним чинником, що визначає пристосованість організмів. З цього погляду актуальним як у теоретичному, так і в практичному плані є дослідження дії інбридингу, гібридизації та ізогенізації хромосом, як процесу одержання гомозиготних диплоїдів, на хромосомному рівні. Гетерозис привертає до себе увагу дослідників як потужний резерв підвищення неспецифічної стійкості та поліпшення інших господарсько корисних ознак організмів [Шахбазов В. Г., 2001; 2003]. Перехід до ізогенних ліній значно підвищує ефективність генетичних досліджень та дозволяє вирішити цілий ряд теоретичних і практичних задач селекції. Незважаючи на тривалий період вивчення цих явищ, багато питань залишаються недостатньо з'ясованими, що перешкоджає більш планомірному їх використанню у практичній селекції. Значною мірою це стосується розвитку теоретичних уявлень щодо генетичних механізмів впливу ізогенізації хромосом, диференційної стійкості генотипів, ефекту гетерозису і модифікації його проявів залежно від дії стресових факторів. У зв'язку з означеним значний науковий інтерес представляє дослідження особливостей структури та функціональної активності політенних хромосом слинних залоз, зокрема пуфової активності, ступеня політенії, гомологічної й негомологичної кон'югації гігантських хромосом, у інбредних ліній і гібридів дрозофіли в умовах різної щільності культури та при ізогенізації хромосом.
В умовах дії несприятливих факторів, крім вивчення модифікаційної мінливості, окремий інтерес становить також дослідження мутаційних процесів, враховуючи їх внесок у формування спадкової мінливості. Зокрема, доцільним і новим є визначення впливу щільності культури і генотипу дрозофіли на нерівну гомологічну рекомбінацію - процес, що має суттєве еволюційне значення [Betrбn E., Long M., 2002; Jelesko J. G. et al., 1999].
Зв′язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і є складовою тем “Дослідження дії іонізуючого і неіонізуючого випромінювання на геном і механізмів стресового та антистресового впливу”за номером держреєстрації 0103U004274 (2003-2005) та “Вивчити генетичні, фізіологічні та біофізичні механізми і прояви ефекту гетерозису у рослин і тварин”за номером держреєстрації 0103U004270 (2003-2005).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідження структурно-функціональних особливостей хромосом і прояву адаптивно важливих ознак у D. melanogaster у зв'язку з ефектом гетерозису, ізогенізацією і щільністю культури.
Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені наступні задачі:
Об'єкт дослідження –структурна організація і функціональна активність хромосом дрозофіли в залежності від генотипу та щільності культури;
Предмет дослідження –пуфова активність, ступінь політенії (СПХ), ектопічна кон'югація, спонтанний асинапсис політенних хромосом, нерівна гомологічна рекомбінація, домінантні летальні мутації, теплостійкість імаго, вихід імаго, маса тіла імаго, яйцепродукція, експресивність ознаки Bar у D. melanogaster;
Методи дослідження - генетичний аналіз, метод давлених ацетоорсеїнових препаратів політенних хромосом, цитоморфометричний метод, методи визначення пристосованості ліній і гібридів F, математичний аналіз отриманих результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Результати дослідження впливу перенаселення культури, ефекту гетерозису та ізогенізації хромосом на ступінь політенії, пуфову активність, гомологічну і негомологічну кон'югацію політенних хромосом, частоту домінантних летальних мутацій та частоту нерівної гомологічної рекомбінації є новими і важливими для розуміння генетичних механізмів дії наведених чинників на хромосомному рівні.
Вперше встановлено зниження ендореплікативної й пуфової активності політенних хромосом у інбредних ліній і гібридів F дрозофіли за умов перенаселення культури. Показана залежність виявлених ефектів від генотипу мух. Встановлено позитивну кореляцію показників СПХ та пуфової активності в ряді локусів з виходом імаго, масою тіла імаго, теплостійкістю особин (r = 0,71– 0,78) і негативну кореляцію між СПХ і частотою пізніх домінантних летальних мутацій (r = – 0,82).
Для лінії Oregon-R виявлено цитологічний маркер –ектопічний контакт між районами 100F і 92EF хромосоми 3R. Показано генотипічні розходження за показниками ектопічного спарювання і частотою асинапсису в районі ектопічного спарювання в інбредних ліній і гібридів F дрозофіли. Встановлено наявність позитивної кореляції між частотою ектопічних контактів у досліджуваному районі хромосоми 3R і активністю пуфінгу в локусі 93D (r = 1), а також збільшення частоти асинапсису гомологів хромосоми 3R за наявності ектопічного контакту. Отримані дані свідчать про розходження просторової організації хромосом інтерфазного ядра інбредних ліній і гібридів F дрозофіли, що може бути однією з причин гетерозису.
Вперше досліджено вплив ізогенізації на ендореплікативну та пуфову активність політенних хромосом дрозофіли. Показано негативний ефект даного чинника на показник ступеня політенії. Активність пуфіювання за умов ізогенізації переважно знижувалася, однак в ряді локусів виявлено відсутність зміни пуфової реакції та її посилення в одному з локусів.
У роботі вперше отримано дані про зміну показників мутаційного процесу за умов личинкового перенаселення і при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли, таких як частота нерівної гомологічної рекомбінації в локусі Bar і частота ДЛМ.
Практичне значення одержаних результатів. Інбридинг і гетерозисна гібридизація - надзвичайно ефективні генетичні засоби зміни пристосованості і продуктивності організмів, які широко застосовуються у практичній селекції. Отримані в дисертаційній роботі дані свідчать про залежність проявів гетерозисного ефекту від щільності культури, що вказує на необхідність урахування цього фактора в селекції з використанням ефекту гетерозису.
Мутація Bar є зручною моделлю для дослідження нерівної гомологічної рекомбінації і може бути використана для розробки нового методу оцінки мутагенної дії екзогенних та ендогенних чинників.
Результати проведених досліджень використовуються у навчальному процесі кафедри генетики і цитології Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і статистичну обробку отриманих результатів. Аналіз отриманих даних проведено разом з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, наявні в дисертації, доповідалися на конференції молодих учених, аспірантів і студентів з молекулярної біології і генетики (Київ, 2003), на VI з'їзді українського ентомологічного товариства (Біла Церква, 2003), на конференції молодих учених “Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету”(Харків, 2003), на третьому з'їзді генетиків і селекціонерів Росії “Генетика в ХХІ веке: современное состояние и перспективы развития”(Москва, 2004), на установчому з'їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), VIII міжнародній науковій екологічній конференції “Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем”(Бєлгород, 2004), на науковій ентомологічній конференції “Загальна і прикладна ентомологія в Україні”(Львів, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 друкованих праць: 5 статей у наукових фахових журналах і 7 тез.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, об'єкти та методи дослідження, результати досліджень і їх обговорення, узагальнення, висновки, список цитованої літератури та додатки. Дисертацію викладено на 165 сторінках і проілюстровано 10 рисунками, 10 таблицями та 35 мікрофотографіями. Бібліографічний список складає 230 ждерел, з яких 86 іншомовних.
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на класичному об'єкті генетичних досліджень - плодовій мушці Drosophila melanogaster Meig. Матеріалом служили інбредні лінії дикого типу різного географічного походження: Oregon-R (Or) (інбридинг 56-116 поколінь), Canton-S (C-S) (інбридинг 58-118 поколінь) та міжлінійні гібриди F: Or Ч C-S, C-S Ч Or. У роботі також використовували неселектовану аутбредну мутантну лінію Bar (B) (локалізація мутації 1 –.0; дуплікація; гомозиготи життєздатні; мутація фенотипово проявляється у редукції очей до вузької вертикальної смуги з кількістю фасеток біля 90 у самців і 70 у самок), линію BarC-S, отриману шляхом насичувальних схрещувань мух лінії Bar з мухами лінії Canton-S (C-S), а також лінію isoII; isoIII BarC-S, ізогенну за хромосомами 2 і 3. Дослідження проводили на стадії личинки, 0-годинні передлялечки й імаго дрозофіли.
Культури дрозофіли вирощували на стандартному цукрово-дріжджовому середовищі при температурі 240,5C в термостаті. Щільність культури задавали кількістю пар батьківських особин на один стаканчик, при об'ємі живильного середовища 5 мл: 1 пара (контроль) і 3, 5, 7 пар (дослід). Ізогенізацію хромосом проводили за класичною схемою із використанням лінії-балансера Cy/Pm;D/Sb [Тихомирова M. M., 1990].
Політенні хромосоми досліджували при збільшенні мікроскопа Ч 600 на давлених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз, виготовлених згідно до стандартної методики [Полуэктова Е. В., Евгеньев М. Б., 1974]. Відмінності за ступенем політенії хромосом (СПХ) визначали цитоморфометричним методом [Страшнюк В. Ю. и др., 1995]: хромосоми з різним ступенем політенії відрізняються за шириною й інтенсивністю забарвлення ацетоорсеїном. Відомо, що до кінця третьої личинкової стадії в клітинах слинних залоз D. melanogaster проходить від шести до дев′яти циклів ендоредуплікації і хромосоми досягають ступеня політенії 256C, 512C, 1024C і 2048C [Rodman T. C., 1967]. У районі диска 22А хромосоми 2L, що приблизно відповідає середній ширині хромосом, поперечні розміри хромосом із різним ступенем політенії складають відповідно 1,6; 2,3; 3,2; 4,5 мкм. Визначали відсотковий вміст ядер із різним ступенем політенії на тотальних препаратах слинних залоз. За результатами цих даних розраховували середні значення політенії в кожному варіанті експерименту. Для виготовлення препаратів використовували самок і самців наприкінці третього личинкового віку.
Активність пуфів онтогенезу досліджували в локусах 2EF (хромосома Х), 21F, 22C, 23E (хромосома 2L), 50CD (хромосома 2R), 63F, 71CE, 72CD (хромосома 3L), 82EF, 83E, 93D (хромосома 3R) на хромосомах з однаковим ступенем політенії (1024С). Локалізацію пуфів проводили за уточненими картами Бриджеса [Lindsley D. E., Grell E. H., 1968]. Відношення розміру пуфа до розміру прилеглого диска, не залученного у процес пуфіювання, слугувало мірою пуфової активності: 2EF/2D, 21F/22B, 22C/22B, 23E/24C, 50CD/51В, 63F/64B, 71CE/73A, 72CD/73A, 82EF/84A, 83E/84A і 93D/93F. Виміри проводили за допомогою окуляр-мікрометра. За даними авторадіографічних досліджень, розміри пуфів позитивно корелюють з рівнем транскрипційної активності локусів [Pelling G., 1959]. З огляду на стадієспецифічність картини пуфінгу, досліджували самок на стадії 0-годинної передлялечки, яка триває протягом декількох секунд, що є важливим фактором створення синхронізованих вибірок особин дрозофіли.
Частоту ектопічних контактів між районами хромосоми 3R 100 F і 92 EF, а також процент асинапсису в хромосомі 3R за наявності й відсутності ектопічного контакту розраховували за відношенням кількості хромосом 3R із аналізованою ознакою до загальної кількості досліджуваних хромосом 3R з розрахунку на препарат. Досліджували самок на стадії 0-годинної передлялечки.
Частоту нерівного кросинговеру в локусі Bar визначали за відношенням кількості мутантних особин +/Y, B/+, BB/Y, BB/B до загальної кількості проаналізованих особин ліній Bar, BarC-S, isoII; isoIII BarC-S. Наявність мутації в локусі Bar підтверджували цитологічним контролем.
Експресивність ознаки Bar оцінювали за часткою мух із максимальним проявом ознаки від загальної кількості досліджених імаго. Вихід імаго визначали, підраховуючи кількість дорослих мух у період від початку і до кінця виходу імаго. Імаго зважували у віці від 6 годин до однієї доби на торсійній вазі. Використовували показник маси 100 особин. Теплостійкість імаго дрозофіли досліджували методом термотесту [Шахбазов В. Г., 1966]. Яйцепродукцію оцінювали за середньою кількістю яєць, відкладених самкою протягом 8 годин у період максимальної плідності (5 доба після вильоту імаго). Частоту ДЛМ, як відсоток ембріональної смертності, визначали за стандартною методикою [Тихомирова М. М., 1990].
Результати експериментів піддавали статистичному аналізу. Визначали середнє арифметичне значення ознаки і помилку середнього значення. Вірогідність розходжень середніх оцінювали за критерієм Ст′юдента. Статистичні зв'язки оцінювали за допомогою коефіцієнта кореляції. Дисперсійний аналіз одно- і двофакторних комплексів здійснювали за методом Плохінського.
Результати досліджень та їх обговорення
Вплив щільності культури на прояв адаптивно важливих ознак у інбредних ліній і гібридів F дрозофіли. Питання про вплив щільності культури на показники пристосованості у дрозофіли в зв'язку з генотипічними розходженнями є актуальним як у теоретичному, так і в практичному плані. В табл. 1 наведені результати дослідження прояву низки адаптивно важливих ознак у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли за умов різної щільності культури.
За умов підвищеної личинкової щільності (3 - 7 пар особин батьківського покоління) виявлено достовірне зниження виходу імаго, маси тіла імаго, яйцепродукції, а також збільшення частоти ДЛМ порівняно з контролем (1 пара особин батьківського покоління). Зниження теплостійкості в досліді (7 пар батьків) відзначене у гібрида F Or Ч C-S, тоді як для самців гібрида F С-S Ч Оr показано збільшення даного показника при щільності культури 5 пар у батьківському поколінні.
Встановлено істотний вплив генотипу на прояв досліджуваних ознак у дрозофіли. У контролі (1 пара батьків) лінія C-S перевищувала лінію Or за виходом імаго, мала менші значення частоти ДЛМ, але поступалася лінії Or за теплостійкістю. За показниками маси імаго і яйцепродукції лінії достовірно не відрізнялися. Міжлінійні гібриди FC-S Ч Or і Or Ч C-S виявляли значний гетерозисний ефект за виходом імаго, теплостійкістю та яйцепродукцією. Маса імаго у гібридів не відрізнялася від кращої з батьківських форм. За умов перенаселення (3 - 7 пар батьків) гібриди зберігали перевагу над інбредними лініями за адаптивно важливими ознаками, однак фактор щільності культури значно модифікував прояв ефекту гетерозису у дрозофіли. За показником виходу імаго максимальний прояв гетерозису спостерігався при щільності культури 1 та 3 пари батьківських особин. За умов максимального перенаселення (7 пар батьківських особин) величина гетерозису зменшувалася за показником яйцепродукції. За показником теплостійкості імаго, як правило, прояв ефекту гетерозису збільшувався за умов високої щільності культури (3 - 7 пар батьківських особин). Ефект гетерозису за сумарною частотою ДЛМ і частотою пізніх ДЛМ,
Таблиця1
Показники адаптивної цінності інбредних ліній і гібридів D. melanogaster за умов різної щільності культури (М±m)
|
Генотип ліній і гібридів |
Вихід імаго в розрахунку на одну пару особин батьківського покоління |
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) |
|
1 пара |
3 пари |
5 пар |
7 пар |
|
|
С-S ♀ |
43,52±4,10 |
,73±3,10*** |
,55±1,10*** |
,80±1,00*** |
|
Оr ♀ |
19,84±1,60 |
14,73±1,20* |
,93±0,80*** |
,96±0,40*** |
|
FС-S Ч Оr ♀ |
67,70±0,90 |
,50±2,00*** |
,63±1,20*** |
,00±0,70*** |
|
FОr Ч С-S ♀ |
49,64±1,90 |
,23±1,03*** |
,80±1,03*** |
,80±0,60*** |
|
С-S ♂ |
39,16±3,10 |
,65±2,60*** |
,90±1,00*** |
,66±0,80*** |
|
Оr ♂ |
21,26±1,30 |
,38±1,80* |
,53±0,50*** |
,28±0,50*** |
|
FС-S Ч Оr ♂ |
66,34±1,90 |
,30±2,00*** |
,93±1,00*** |
12,84±0,60*** |
|
FОr Ч С-S ♂ |
49,96±2,00 |
,75±0,80*** |
,38±0,70*** |
,82±0,60*** |
Таблиця1 (продовження)
|
Генотип ліній і гібридів |
Маса 100 імаго, мг |
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) |
|
1 пара |
3 пари |
5 пар |
7 пар |
|
|
С-S ♀ |
126,75±2,00 |
,07±3,10* |
,65±3,20*** |
,59±4,70*** |
|
Оr ♀ |
121,64±1,00 |
,61±4,60 |
,81±4,50* |
,73±6,80* |
|
FС-S Ч Оr ♀ |
119,49±2,20 |
,34±5,50 |
,02±7,60 |
,71±3,80** |
|
FОr Ч С-S ♀ |
132,48±1,90 |
,76±4,40* |
,05±5,80** |
,35±5,80** |
|
С-S ♂ |
92,55±2,20 |
,56±1,80 |
,60±2,70* |
,56±3,60* |
|
Оr ♂ |
90,10±1,80 |
,96±1,70* |
,12±2,10*** |
,77±3,70** |
|
FС-S Ч Оr ♂ |
85,86±1,40 |
,05±2,20 |
,40±4,70 |
,43±2,40 |
|
FОr Ч С-S ♂ |
93,70±2,20 |
,32±2,10 |
,53±3,80* |
,23±3,90* |
Таблиця1 (продовження)
|
Генотип ліній і гібридів |
Теплостійкість, % |
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) |
|
1 пара |
3 пари |
5 пар |
7 пар |
|
|
С-S ♀ |
55,75±3,14 |
,33±2,52 |
,67±2,69 |
,25±2,61 |
|
Оr ♀ |
67,50±3,64 |
,00±3,03 |
,50±3,07 |
,50±2,88 |
|
FС-S Ч Оr ♀ |
80,00±2,09 |
,50±2,16 |
,50±1,96 |
,50±2,08 |
|
FОr Ч С-S ♀ |
69,25±2,73 |
,00±2,23 |
,00±2,27 |
,00±2,22* |
|
С-S ♂ |
49,75±3,33 |
,67±2,47 |
,33±2,72 |
,25±2,64 |
|
Оr ♂ |
57,75±3,64 |
,75±3,05 |
,50±2,89 |
,50±2,71 |
|
FС-S Ч Оr ♂ |
67,50±2,53 |
,75±2,31 |
,75±2,13* |
,75±2,40 |
|
FОr Ч С-S ♂ |
76,50±2,68 |
,00±2,11 |
,75±2,14 |
,75±2,63*** |
Таблиця1 (продовження)
|
Генотип ліній і гібридів |
Яйцепродукція |
Сумарна частота ДЛМ, % |
Частота пізніх ДЛМ, % |
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) |
|
1 пара |
пар |
пара |
пар |
пара |
пар |
|
|
C-S |
175,80±34,74 |
,60±16,35 |
,95±1,45 |
,12±1,51 |
,83±0,37 |
,12±0,42 |
|
Or |
199,40±18,07 |
,20±25,14 |
,59±1,63 |
,26±1,82 |
,49±0,45 |
,41±0,61 |
|
FC-S Ч Or |
288,80±10,96 |
245,83±8,36* |
,06±0,35 |
,60±0,54*** |
,24±0,17 |
,33±0,17 |
|
FOr Ч C-S |
380,00±28,67 |
,33±23,64 |
,71±0,50 |
,78±0,39 |
,19±0,13 |
,18±0,13 |
* - вірогідність відмінності від контролю Р > 0,95, ** - Р > 0,99, *** - Р > 0,999
оцінений за зниженням цих показників у гібридів порівняно з кращою батьківською формою, в контролі перевищував дослідний варіант у гібрида F C-S Ч Or, у гібрида F Or Ч C-S спостерігалася зворотня тенденція.
Отримані дані свідчать про те, що прояв адаптивно важливих ознак дрозофіли залежить як від щільності культури, так і від генотипу, встановлено значний модифікуючий вплив щільності культури на прояв інбредної депресії і гетерозису у D. melanogaster.
Вплив щільності культури на експресивність ознаки Bar у дрозофіли. Відомо, що зовнішні чинники істотно впливають на експресивність морфологічних ознак дрозофіли. Комплексні генетичні і морфофізіологічні зміни, що виникають при цьому, можуть мати складний системний плейотропний ефект на процеси індивідуального розвитку організму. Ознака Bar D. melanogaster характеризується варіюючою експресивністю і є зручною моделлю для вивчення успадкування кількісних ознак.
У контролі (1 пара батьківських особин) експресивність досліджуваної ознаки, яку оцінювали за часткою мух з максимальним проявом ознаки Bar від загальної кількості імаго, в неселектованій лінії Bar складала 33,336,42 % у самок і 7,413,56 % у самців. За умов стресу, зумовленого личинковим перенаселенням (7 пар батьківських особин), експресивність досліджуваної ознаки знижувалася відносно контролю у самок на 46,77 % (P 0,999). Істотного впливу досліджуваного фактора на експресивність ознаки Bar у самців не встановлено. Силу впливу щільності культури на експресивність ознаки Bar у самок встановлено на підставі однофакторного дисперсійного аналізу, і вона складала 6,27 % (Р 0,99).
Вплив щільності культури на ендоредуплікацію політенних хромосом інбредних ліній і гібридів дрозофіли. Для з'ясування генетичних механізмів ефекту гетерозису й адаптації до дії факторів навколишнього середовища велике значення мають дослідження на хромосомному рівні. У даний час мало відомо про вплив щільності культури на ступінь політенії гігантських хромосом дрозофіли у зв'язку з генотипічними розходженнями.
На підставі дослідження змін ступеня політенії хромосом у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S в умовах різної щільності культури встановлено, що личинкове перенаселення знижує ендореплікативну активність політенних хромосом D. melanogaster (рис. 1).
Рис. 1. Розподіл ядер із різним ступенем політенії хромосом і середні значення СПХ у слинних залозах інбредних ліній і гібридів F D. melanogaster за умов різної щільності культури: А –контроль (1 пара батьківських особин), Б –дослід (7 пар батьківських особин); а –ступінь політенії 256С; б –С; в –С; г –,5 2048С; д –середній ступінь політенії.
При підвищенні щільності культури до 7 пар батьківських особин збільшується кількість ядер з нижчим ступенем політенії - 256С і 512С, і зменшується вміст ядер зі ступенем політенії 1024С і 2048С. Зниження середнього ступеня політенії хромосом у особин інбредних ліній і гібридів Fскладало 11,84 –,27 % (Р 0,999) у самок і 6,76 –,87 % (Р 0,95) у самців, за винятком самок гібрида F C-S Ч Or, для яких розходження з контролем недостовірні.
Генетично обумовлені відмінності за показником середнього ступеня політенії хромосом в контролі встановлені тільки для самців: самці інбредної лінії C-S і гібридів FC-S Ч Or, Or Ч C-S перевищували лінію Or у середньому на 11,70 –,93 % (Р 0,99). Вплив фактора щільності культури призводив до посилення прояву генетичних розходжень за СПХ: перевага самців лінії C-S і гібридів F C-S Ч Or, Or Ч C-S над лінією Or за умов досліду, в середньому, складала 19,58 –,39 % (Р 0,99 –,999). Самки гібрида FC-S Ч Or за досліджуваним показником перевищували обидві інбредні лінії на 14,84 – 25,14 % (Р 0,999). Достовірних розходжень між самками інбредних ліній і гібрида FOr Ч C-S у досліді не виявлено.
Сила впливу щільності культури і генотипу на показник ступеня політенії хромосом у самців складала 17,16 % (Р 0,999) і 27,50 % (Р 0,999), відповідно. У самок встановлено вплив сполучення градацій досліджуваних факторів (8,34 %, Р 0,999), що свідчить про істотну залежність впливу щільності культури від генотипу.
Встановлено кореляцію між показником ступеня політенії хромосом та виходом імаго (r = 0,74, Р 0,95), масою тіла імаго (r = 0,71, Р 0,95), теплостійкістю особин (r = 0,71, Р 0,95) у самок; а також між СПХ та виходом імаго (r = 0,75, Р 0,95), масою тіла імаго (r = 0,73, Р 0,95), частотою пізніх ДЛМ (r = –,82, Р 0,95) у самців.
Показник ступеня політенії характеризує рівень помноження геному і пов'язаний із реплікативною активністю хромосом. Отримані дані про вплив щільності культури, інбредної депресії й гібридизації на показник СПХ свідчать про те, що механізми гетерозису, підвищеного гомеостазу гібридів F, адаптації до високої щільності культури пов'язані з регуляцією функції ендоредуплікації політенних хромосом дрозофіли.
Вплив щільності культури на пуфову активність політенних хромосом інбредних ліній і гібридів дрозофіли. Результати дослідження впливу щільності культури на активність пуфів онтогенезу політенних хромосом у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли представлені в табл. 2. Для аналізу було взято 6 пізніх екдизонових пуфів –F, 71CE, 72CD, 82EF, 83E, 93D. За умов перенаселення відзначено зниження розмірів пуфів відносно контролю в лінії C-S (локуси 63F, 71CE, 72CD, 82EF), Or (локуси 63F, 82EF, 83E) і у гібрида FC-S Ч Or (локуси 71CE, 82EF) у середньому на 9,82 – 20,10 % (Р 0,95 – 0,999). Достовірного впливу личинкового перенаселення на пуфову активність у гібрида FOr Ч C-S не встановлено. Отримані дані свідчать про підвищену стійкість гібридів Fдо дії стресового фактора щільності культури.
Слід зазначити, що є певні труднощі в оцінці генетичних розходжень за показником пуфової активності політенних хромосом з огляду на встановлений вплив щільності культури на даний показник і різну плідність ліній і гібридів F дрозофіли. У зв'язку з цим виконано аналіз генетичних розходжень за показником пуфової активності політенних хромосом за умови однакової щільності культури в поколінні F. За показником виходу імаго достовірних відмінностей в досліді (7 пар батьківських особин) між інбредною лінією C-S і гібридом F C-S Ч Or, а також реципрокними гібридами F не встановлено. При цьому розмір пуфа 63F у гібрида FC-S Ч Or на 22,67 % більший, ніж у лінії C-S. Різниця за розмірами пуфів між гібридами достовірно виявлялася в районі 93D і складала 11,84 % (Р > 0,99). За іншими пуфами достовірних генетичних розходжень не виявлено.
Статистична обробка результатів експерименту із використанням двофакторного дисперсійного аналізу показала достовірний вплив генотипу і щільності культури на пуфову активність політенних хромосом у локусах 63F, 71CE, 72CD, 82EF і 63F, 72CD, 82EF. Сила впливу генотипу складала, у середньому, 3,91 –,05 % (Р 0,95 –,999), щільності культури –,61 –,53 % (Р 0,95 –,999).
Таблиця 2
Розміри пуфів політенних хромосом у D. melanogaster за умов різної щільності культури (M±m)
|
Пуф/диск |
Генотип |
|
С-S ♀ |
Оr ♀ |
FС-S Ч Оr ♀ |
FОr Ч С-S ♀ |
|||
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) |
1 пара |
63F/64B |
2,11±0,07 |
,09±0,11 |
,16±0,07 |
,09±0,07 |
|
71CE/73A |
2,40±0,11 |
,67±0,12 |
,29±0,12 |
,29±0,14 |
||
|
72CD/73A |
1,51±0,05 |
,53±0,06 |
,54±0,06 |
,38±0,06 |
||
|
82EF/84A |
2,55±0,10 |
,43±0,08 |
,63±0,09 |
,14±0,08 |
||
|
83E/84A |
1,62±0,06 |
,63±0,05 |
,61±0,07 |
,59±0,05 |
||
|
93D/93F |
1,33±0,04 |
,49±0,04 |
,41±0,05 |
,43±0,04 |
||
|
7 пар |
63F/64B |
1,72±0,06*** |
,67±0,07 ** |
,11±0,09 |
,89±0,07 |
|
|
71CE/73A |
2,03±0,06** |
,60±0,15 |
,23±0,10 |
,18±0,08 |
||
|
72CD/73A |
1,35±0,03* |
,57±0,09 |
,36±0,05 * |
,36±0,05 |
||
|
82EF/84A |
2,26±0,08* |
,99±0,07 *** |
,21±0,08 *** |
,07±0,07 |
||
|
83E/84A |
1,49±0,05 |
1,47±0,04 * |
,59±0,06 |
,50±0,05 |
||
|
93D/93F |
1,37±0,04 |
,42±0,05 |
,34±0,03 |
,52±0,05 |
* - вірогідність відмінності від контролю Р > 0,95, ** - Р > 0,99, ***- Р > 0,999
Встановлено тісну і середню позитивну кореляцію показника пуфової активності в локусах 63F, 82EF, 83E із виходом імаго (r = 0,71 –,73, Р 0,95), масою тіла імаго (r = 0,75 –,78, Р 0,95), теплостійкістю особин (r = 0,75, Р 0,95), а також зі ступенем політенії хромосом (r = 0,75 –,96, Р 0,95 –,99).
Отримані дані свідчать про те, що механізми гетерозису, адаптації до перенаселення культури, а також підвищеного гомеостазу гетерозисних гібридів Fпов'язані з регуляцією пуфової активності хромосом, яка відібражає транскрипційну активність клітинного ядра.
Особливості гомологічної і негомологічної кон'югації хромосом у інбредних ліній і гетерозисних гібридів дрозофіли. Відповідно до сучасних даних, архітектоніка клітинного ядра має велике значення щодо здійснення його генетичних функцій. З метою вивчення особливостей просторової організації хромосом інтерфазного ядра в інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів F1 C-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли досліджували гомологічну і негомологічну кон'югацію політенних хромосом. Для інбредної лінії Or виявлено цитологічний маркер –ектопічний контакт між районами 100F і 92EF хромосоми 3R (рис. 2. В.), присутній у 100,00±0,00 % проаналізованих препаратів та не характерний для лінії C-S (рис. 2. А.). У гібрида FC-S Ч Or наявність контакту виявлено в 60,00±15,49 % препаратів, а у гібрида F Or Ч C-S –в 77,78±13,86 %. Сила впливу генотипу на частоту виникнення ектопічного контакту між ділянками 100 F і 92 EF хромосоми 3R у досліджуваних інбредних ліній і гетерозисних гібридів F складала 56,13 % (Р 0,999).
Встановлено генотипічні розходження за частотою асинапсису в досліджуваному районі ектопічного спарювання (рис. 3, рис. 2. Г.). Для лінії Or цей показник становив 21,65±2,71 %. Перевага гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S відносно лінії Or за досліджуваною ознакою складала 85,64 % (Р > 0,999) і 79,82 % (Р > 0,999), відповідно. Для лінії C-S, що не має ектопічного контакту, досліджуваний показник мав значення 1,67±1,17 % (рис. 2. Б.). Результати однофакторного дисперсійного аналізу свідчать про достовірний вплив генотипу (3,75 %, Р 0,999) на частоту асинапсису в досліджуваному районі ектопічного спарювання.
Рис 2. Морфологія хромосоми 3R: А –хромосома 3R без ділянок асинапсису і ектопічних контактів (Ч 600); Б - порушення синапсису в хромосомі 3R (Ч 600); В –ектопічна кон'югація між ділянками 100 F і 92 EF хромосоми 3R (Ч 1800); Г –порушення синапсису при ектопічній кон'югації між ділянками 100 F і 92 EF хромосоми 3R (Ч 1800). Білими стрілками позначено місця ектопічної кон'югації, чорними - початок і кінець ділянок асинапсису.
Порівняльний аналіз частот асинапсису в хромосомі 3R при наявності (рис. 2. Г.) і відсутності ектопічного спарювання ділянок 100 F і 92 EF (рис. 2. Б.) у гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S виявив достовірний вплив (Р > 0,999) асоціації районів 100 F і 92 EF на частоту асинапсису гомологів у хромосомі 3R (рис. 3.). Сумарна частота асинапсису в гібридів FC-S Ч Or і Or Ч C-S за наявності ектопічного контакту складала 68,12±3,97 %, тоді як за його відсутності досліджуваний показник знижувався до 5,71±1,75 %. Сила впливу ектопічного спарювання ділянок 100 F і 92 EF на частоту асинапсису гомологів складала 14,85 %, Р 0,999.
Рис. 3. Частота порушень гомологічної кон'югації хромосом 3R в інбредних ліній і гібридів D. melanogaster за наявності (1) і відсутності (2) ектопічного контакту між ділянками 100 F і 92 EF хромосоми 3R.
Показано наявність тісної позитивної кореляції (r = 1, Р 0,999) між частотою ектопічних контактів у досліджуваному районі хромосоми 3R у інбредних ліній Or, C-S і реципрокних гібридів FC-S Ч Or, Or Ч C-S і активністю пуфінга в локусі 93D, розташованому на незначній відстані від місця контакту (рис. 2 В.).
Таким чином, отримано нові дані про наявність впливу генотипу на просторову організацію хромосом інтерфазного ядра, що є важливим доповненням до існуючих гіпотез про механізми гетерозису.
Зміни адаптивно важливих ознак при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли. Відомо, що використання ізогенних ліній дозволяє вирішити цілий ряд теоретичних і практичних задач селекції. Однак вплив ізогенізації на пристосування організмів вивчено недостатньо. Проведені дослідження свідчать, що за умов ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли спостерігається достовірне зниження виходу імаго (на 32,27 % у самок і 34,03 % у самців, Р > 0,999), а також яйцепродукції (на 56,10 %, Р > 0,999) (табл. 3). Сила впливу ізогенізації на вихід імаго складала 31,81 % (Р 0,95) у самок і 40,68 % у самців (Р 0,95), на яйцепродукцію –48,94 % (Р 0,999).
Таблиця 3
Показники адаптивної цінності у ліній BarC-S і isoII;isoIII BarC-S D. melanogaster (М±m)
|
Генотип |
Ознака |
|
|
вихід імаго |
яйцепродукція |
|
|
BarC-S ♀ |
,540,36 |
,821,24 |
|
BarC-S ♂ |
,720,35 |
- |
|
isoII;isoIII BarC-S ♀ |
,881,214 *** |
,750,77 *** |
|
isoII;isoIII BarC-S ♂ |
,011,32 *** |
- |
*** - вірогідність відмінності від контролю Р > 0,999
Вплив ізогенізації другої і третьої пар хромосом дрозофіли на експресивність ознаки Bar. Відомо, що фенотипічний прояв окремих генів залежить від зовнішнього середовища та їхнього генетичного оточення, зокрема генетичного фону. Так, за результатами наших досліджень, у лінії BarC-S експресивність ознаки Bar достовірно відрізнялася від неселектованої лінії і складала 65,31±6,80 % і 25,00±6,25 % у самок і самців, відповідно.
Аналіз експресивності ознаки Bar в лінії isoII; isoIII BarC-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, показав залежність фенотипічного прояву досліджуваної ознаки від процесу ізогенізації хромосом. Гомозиготизація генів за хромосомами 2 і 3 призводила до зниження експресивності мутантної ознаки у самок на 36,95 % (P 0,95) відносно лінії BarC-S та істотно не впливала на експресивність ознаки Bar у самців. Сила впливу ізогенізації хромосом на експресивність ознаки Bar у самок складала 6,10 % (Р 0,99).
Вплив ізогенізації на ендореплікативну і пуфову активність політенних хромосом дрозофіли. У даний час вплив ізогенізації на генетичний апарат клітини не викликає сумнівів. Однак мало дослідженим залишається питання щодо зміни функціональної активності хромосом за умов ізогенізації.
На підставі дослідження ліній BarC-S і isoII;isoIII BarC-S показано, що процес ізогенізації хромосом негативно впливає на ендореплікативну активність політенних хромосом у самок D. melanogaster та істотно не змінює її у самців (рис. 4). Зниження середнього ступеня політенії хромосом складало 8,16 % (Р > 0,999). Аналіз співвідношення відсотка ядер із різним ступенем політенії хромосом показав значне зростання у досліді частки ядер зі ступенем політенії 512С - на 48,10 % (Р > 0,99). При цьому мала місце тенденція до зниження кількості ядер із рівнем політенії 1024С, 2048С і зростання відсотка ядер із найменшим ступенем політенії - 256С. Сила впливу ізогенізації на рівень політенії гігантських хромосом у самок складала 44,92 % (Р 0,999).
Рис. 4. Розподіл ядер із різним ступенем політенії хромосом і середні значення СПХ у слинних залозах ліній BarC-S і isoII;isoIII BarC-S; а –ступінь політенії 256С; б –С; в –С; г –,5 2048С; д –середній ступінь політенії.
Результати дослідження ефекту ізогенізації на активність пуфінгу в локусах 2EF (хромосома Х), 21F, 22C, 23E (хромосома 2L), 50CD (хромосома 2R), 63F, 71CE, 72CD (хромосома 3L), 82EF, 83E, 93D (хромосома 3R) представлені на рис. 5. У лінії isoII; isoIII BarC-S встановлено зниження розмірів пуфів порівняно з лінією BarC-S у локусах 2EF, 50CD, 71CE, 72CD, 83E на 11,72 % (Р > 0,99), 10,65 % (Р > 0,95), 22,41 % (Р > 0,999), 16,80 % (Р > 0,99) і 16,04 % (Р > 0,95), відповідно. Одночасно показано посилення пуфової активності в локусі 21F на 11,06 % (Р > 0,95). У локусах 22C, 23E, 63F, 82EF, 93D розміри пуфів істотно не змінювалися. Сила впливу ізогенізації хромосом 2, 3 D. melanogaster на активність пуфінгу політенних хромосом в локусах 2EF, 21F, 50CD, 71CE, 72CD, 83E, встановлена на підставі однофакторного дисперсійного аналізу, складала, в середньому, 6,90 –,00 % (Р 0,95 –,999).
Отримані дані свідчать про зниження функціональної активності політенних хромосом дрозофіли за умов ізогенізації. Пригнічення ендореплікативної та пуфової активності гігантських хромосом слинних залоз корелює зі зниженням плідності й життєздатності особин ізогенної лінії, що збігається з результатами літературних даних [Страшнюк В. Ю. и др., 1995; 1997; 2001], в яких показано зв'язок проявів функцій політенних хромосом із адаптивно важливими ознаками.
Рис. 5. Розміри пуфів політенних хромосом D. melanogaster у зв'язку з ізогенізацією хромосом 2 і 3.
Зміна частоти нерівного кросинговеру в локусі Bar і частоти ДЛМ за умов перенаселення культури і при ізогенізації другої та третьої пар хромосом дрозофіли. Серед великої кількості робіт щодо генетичних ефектів личинкового перенаселення та ізогенізації хромосом дані про вплив наведених факторів на мутаційний процес неповні та суперечливі.
Результати досліджень впливу щільності культури і процесу ізогенізації хромосом 2 і 3 D. melanogaster на частоту нерівної гомологічної рекомбінації в локусі Bar наведені в табл. 4. Наявність мутації в локусі Bar підтверджували цитологічним контролем (рис. 6). Показано зростання частоти нерівного кросинговеру в неселектованій лінії Bar за умов личинкового перенаселення на 296,04 % (P 0,99) відносно контролю. Збільшення частоти нерівного кроссинговеру на 151,53 % (P 0,95) встановлено також для лініїisoII; isoIII BarC-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, відносно лінії BarC-S. Достовірних відмінностей між лініями Bar і BarC-S за досліджуваним показником не виявлено.
Таблиця 4
Частота нерівного кросинговеру в локусі Bar за умов різної щільності культури і при ізогенізації хромосом 2 і 3 у D. melanogaster (M±m)
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) в линії Bar |
Генотип |
|
1 пара |
пар |
BarC-S |
isoII; isoIII BarC-S |
|
1,01·10-30,50·10-3 |
,00·10-30,87·10-3** |
,96·10-3±0,08·10-3 |
4,93·10-3±1,05·10-3* |
Рис. 6. Морфологія ділянки 16 А Х-хромосоми у різних ліній (Ч 1800): А –С-S (контроль); Б –В (вихідна лінія); В –В+ (реверсія до норми); Г –ВВ (триплікація гена Bar). (В, Г –мутації, спричинені нерівним кросинговером у локусі Bar).
У табл. 5 наведені результати дослідження впливу щільності культури і процесу ізогенізації хромосом 2 і 3 D. melanogaster на частоту ДЛМ. Встановлено достовірне зниження частоти ДЛМ на 10,02 % (Р 0,99) при збільшенні щільності культури в лінії Bar до семи пар батьківських особин відносно контролю (одна пара батьківських особин). В лінії isoII; isoIII BarC-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, показано збільшення даного показника на 18,52 % (P 0,99), відносно лінії BarC-S. Слід зауважити, що мутантні лінії Bar, BarC-S, isoII;isoIII BarC-S характеризуються високою частотою ДЛМ –,05 –,21 %, перевищуючи лінію C-S в 2,95 –,49 рази, що погоджується з даними про генетичну нестабільність ознаки Bar.
Таблиця 5
Частота ДЛМ за умов різної щільності культури і при ізогенізації хромосом 2 і 3 у D. melanogaster (M±m)
|
Щільність культури (кількість пар батьківських особин) в лінії Bar |
Генотип |
|
1 пара |
пар |
C-S |
BarC-S |
isoII; isoIII BarC-S |
|
45,82±1,32 |
,23±1,16 ** |
,95±1,45 |
,05±1,53 |
,21±2,29 ** |
Таким чином, отримані дані свідчать про те, що дія екологічного стресового фактора щільності культури та генетичного чинника –ізогенізації хромосом –є важливим джерелом зміни спадкової мінливості. Враховуючи дані таблиці 1, слід зауважити, що вплив фактора щільності культури на частоту ДЛМ залежить від генотипу: показник збільшується у гібридних особин, не змінюється в інбредних лінях і зменшується в мутантної лінії Bar. З огляду на широку розповсюдженість процесу нерівного кросинговеру в природі та його важливе біологічне значення, виявлена висока чутливість нерівної гомологичної рекомбінації в локусі Bar до впливу чинників різного походження може бути використана для розробки тест-системи щодо оцінки мутагенного ефекту екзогенних та ендогенних чинників.
ВИСНОВКИ
У дисертації, відповідно до поставленої мети та задач, наведено нові дані щодо хромосомних механізмів впливу щільності культури, ізогенізації хромосом, диференційної стійкості генотипів та ефекту гетерозису у плодової мушки Drosophila melanogaster Meig. Встановлено, що вплив щільності культури та ізогенізації хромосом пов'язаний з регуляцією структурних та функціональних особливостей політенних хромосом дрозофіли. Відмінності за активністю пуфіювання, ступенем політенії, гомологічною і негомологічною кон'югацією гігантських хромосом у інбредних ліній і гетерозисних гібридів свідчать про те, що прояви гетерозису торкаються різних рівнів регуляції функцій генетичного апарату клітини.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЯ
Шакіна Л. О. „Структурно-функціональна організація політенних хромосом Drosophila melanogaster Meig. у зв′язку з ефектом гетерозису, ізогенізацією та впливом щільності культури”. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 –генетика. –Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, Харків, 2006.
Дисертація присвячена вивченню структурно-функціональної організації політенних хромосом і прояву кількісних ознак дрозофіли в залежності від генотипу і щільності культури. Встановлено істотний вплив щільності культури та генотипу на прояв кількісних ознак у дрозофіли: при перенаселенні культури показано зниження виходу імаго, маси тіла імаго, теплостійкості, яйцепродукції та експресивності ознаки Bar, при цьому за показниками виходу імаго, теплостійкості, яйцепродукції міжлінійні гібриди F виявляли значний гетерозисний ефект в умовах різної щільності культури. Показано зниження ступеня політенії (СПХ) та пуфової активності гігантських хромосом дрозофіли за умов перенаселення та залежність цього ефекту від генотипу. Гібриди F за показниками СПХ та активності пуфіювання виявляли підвищений гомеостаз до дії перенаселення порівняно з інбредними лініями. У високоінбредних ліній та реципрокних гібридів F встановлено існування генетичних відмінностей за частотою ектопічного спарювання та частотою асинапсису в районі ектопічного контакту. Показано негативний вплив ізогенізації хромосом 2, 3 на прояв кількісних ознак у дрозофіли: виходу імаго, яйцепродукції, експресивності ознаки Bar. Встановлено пригнічення ендореплікативної і пуфової активності політенних хромосом дрозофіли за умов ізогенізації хромосом 2 і 3. У роботі вперше отримано дані про зміну показників мутаційного процесу в умовах личинкового перенаселення і при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли, таких як частота нерівного кросинговеру в локусі Bar і частота домінантних летальних мутацій.
Ключові слова: Drosophila melanogaster, політенні хромосоми, ступінь політенії, пуфінг, асинапсис, ектопічна кон′югація, нерівний кросинговер, гетерозис, щільність культури, ізогенізація хромосом, пристосованість.
АННОТАЦИЯ
Шакина Л. А. „Структурно-функциональная организация политенных хромосом Drosophila melanogaster Meig. в связи с эффектом гетерозиса, изогенизацией и влиянием плотности культуры”. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 –генетика. –Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, Харьков, 2006.
Диссертация посвящена изучению структурно-функциональной организации политенных хромосом и проявления количественных признаков дрозофилы в зависимости от генотипа и плотности культуры.
В результате исследования влияния плотности культуры на проявление адаптивно важных признаков у инбредных линий и гибридов F Drosophila melanogaster показано, что приспособляемость дрозофилы зависит как от плотности культуры, так и от генотипа. В условиях повышенной личиночной плотности (3 - 7 пар особей родительского поколения) выявлено достоверное снижение выхода имаго, массы тела имаго, яйцепродукции и теплоустойчивости имаго. Межлинейные гибриди F как в контроле (1 пара особей родительского поколения), так и в условиях перенаселенности культуры проявляли значительный гетерозисный эффект по показателям выхода имаго, теплоустойчивости и яйцепродукции, однако плотность культуры оказывала значительный модифицирующий эффект на проявление гетерозиса у дрозофилы.
Наряду с изменением адаптивно важных признаков в условиях стресса, обусловленного личиночным перенаселением, выявлено снижение экспрессивности признака Bar, который является удобной моделью для изучения наследования количественных признаков у дрозофилы.
Для выяснения генетических механизмов эффекта гетерозиса, влияния и адаптаци к перенаселению культуры большое значение имеют исследование на хромосомном уровне. Результаты исследования показали, что личиночное перенаселение снижает эндорепликативную и пуфовую активность политенных хромосом D. melanogaster. Наблюдаемый эффект зависит от генотипа: гибридные особи проявляли повышенную устойчивость к действию стрессового фактора по изучаемым показателям. Показано наличие положительной корреляции показателя степени политении хромосом (СПХ) с выходом имаго, массой тела имаго, теплоустойчивостью особей; а также отрицательной корреляции показателя СПХ с частотой поздних ДЛМ. Установлена положительная корреляция показателя пуфовой активности в ряде локусов с выходом имаго, массой тела имаго, теплоустойчивостью особей, а так же степенью политении хромосом. Полученные данные указывают на то, что механизмы гетерозиса, повышенного гомеостаза гибридов F, адаптации к высокой плотности культуры связаны с регуляцией функции эндоредупликации и пуфовой активности политенных хромосом дрозофилы.
С целью изучения особенностей пространственной организации хромосом интерфазного ядра исследовали явления гомологичной и негомологичной конъюгации политенных хромосом дрозофилы. Показаны генотипические различия по частоте эктопического спаривания районов 100F и 92EF и частоте асинапсиса в районе эктопического спаривания у инбредных линий и гетерозисных гибридов F D. melanogaster. Установлена тесная положительная корреляция между частотой эктопических контактов в исследуемом районе хромосомы 3R и активностью пуфинга в локусе 93D, а также увеличение частоты асинапсиса гомологов хромосомы 3R при наличии эктопического контакта. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии влияния генотипа на пространственную организацию хромосом интерфазного ядра, что является важным дополнением к существующим гипотезам про механизмы гетерозиса.
При изучении генетических эффектов изогенизации хромосом 2 и 3 дрозофилы показано негативное влияние данного фактора на показатель степени политении. Активность пуфирования при изогенизации преимущественно снижалась. Угнетение эндорепликативной и пуфовой активности гигантских хромосом слюнных желез коррелировало со снижением выхода имаго и яйцепродукции изогенных линий, что совпадает с литературными данными [Страшнюк В. Ю. и др., 1995; 1997; 2001], в которых показана связь проявлений функций политенных хромосом с адаптивно важными признаками. Отмечено снижение экспрессивности признака Bar при гомозиготизации генов хромосом 2 и 3 дрозофилы.
Анализ показателей мутационного процесса в условиях личиночного перенаселения и при изогенизации хромосомами 2 и 3 дрозофилы показал, что исследуемые факторы являются важным источником повышения наследственной изменчивости. Установлено возрастание частоты неравного кроссинговера в локусе Bar при перенаселенности культуры и изогенизации второй и третьей пар хромосом дрозофилы. Изогенизация хромосом 2 и 3 приводила к увеличению частоты доминантных летальных мутаций (ДЛМ). Влияние фактора плотности культуры на частоту ДЛМ зависело от генотипа: показатель увеличивался у гибридных особей, не изменялся у инбредных линий и уменьшался в мутантной линии Bar.
Таким образом, исследования, выполненные на дрозофиле, дают новый материал для понимания механизмов влияния плотности культуры, изогенизации хромосом, дифференциальной устойчивости генотипов, эффекта гетерозиса и модификации его проявлений в зависимости от действия стрессовых факторов и намечают новые подходы в изучении данных проблем.
Ключевые слова: Drosophila melanogaster, политенные хромосомы, степень политении, пуфинг, асинапсис, эктопическая конъюгация, неравный кроссинговер, гетерозис, плотность культуры, изогенизация хромосом, приспособленность.
SUMMURY
Shakina L. A. "Structural and functional organization of polytene chromosomes in Drosophila melanogaster Meig. in relation with heterosis effect, isogenization and the culture density influence”. –Manuscript.
The thesis for obtaining the degree of candidate of biological science, speciality 03.00.15 –genetics. –V. N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2006.
The dissertation is devoted to study of structural and functional organization of polytene chromosomes and manifestation of quantitative traits in drosophila depending on genotype and culture density. The essential influence of larval crowding and genotype on manifestation of quantitative traits in drosophila was established. Larval crowding was shown to result in significant decrease of the fitness, body weight, heat resistance, egg production and expressivity of the character Bar. At the same time the interlinear Fhybrids showed significant heterosis effect on the parameters of fitness, heat resistance, egg production in conditions of different density of culture. The decrease of polyteny degree (PDC) and puff activity in drosophila giant chromosomes under increased culture crowding and dependence of this effect on a genotype were found. The F hybrids showed higher homeostasis to culture density action on the parameters PDC and puffing activity in comparison with inbred lines. The existence of genetic differences on frequency of ectopic pairing and frequency of asynapsis in the area of ectopic contact in inbred lines and reciprocal Fhybrids was established. It was found that the process of chromosomes isogenization influenced negatively on manifestation of quantitative signs, such as fitness, egg production and expressivity of the character Bar in drosophila. The depression of the endoreduplication function and transcriptional activity of polytene chromosomes in drosophila under the influence of chromosomes 2, 3 isogenization was shown. In the work, data concerning of changing of mutational process parameters, such as the frequency of unequal crossing over in the locus Bar and the frequency of the dominant lethal mutations, in conditions of high density of culture and under the influence of chromosomes 2, 3 isogenization were obtained for the first time.
Key words: Drosophila melanogaster, polytene chromosomes, polyteny level, puffing, asynapsis, ectopic pairing, unequal crossing over, heterosis, culture density, isogenization of chromosomes, fitness.