Лекция 3 ТОБ. Методы культивирования микроорганизмов

Работа добавлена на сайт samzan.net:

15

Сеп.

Фер-мен-татор

Ферм.

  V

Сеп.

[X]1 =

V1

W1

V1

W1

V2

W2

Vi

Wi

Vn

Wn

[S]0

Vn

Wn

[S]n

Vi

Wi

[S]i

V2

W2

[S]2

D2

V1

W1

[S]1

Лекция № 3 ТОБ.

Методы культивирования микроорганизмов.

План лекции

1.  Классификация процессов культивирования мко.
2.  Количественное описание процесса глубинного периодического     культивирования.
3.  Основные закономерности процессов непрерывной ферментации в    аппаратах полного смешения. Хемостатное культивирование. Каскад    хемостатов.
4.  Оптимизация процессов культивирования в аппаратах полного          вытеснения.
5.  Особенности количественного описания процесса культивирования отъемно-доливным способом.
6.  Смешанные культуры и автоселекция при непрерывной ферментации.

В. 1. Классификация процессов культивирования микроорганизмов.

Культивирование продуцентов в промышленных условиях принято называть ферментацией. В зависимости от классификационного признака различают следующие типы ферментационных процессов:

•  по отношению микроорганизмов продуцентов к кислороду: аэробные и анаэробные;
•  по локализации продуцентов в питательной среде: глубинные и поверхностные;
•  по условиям проведения процесса: периодические, полунепрерывные (отъемно-доливные, с подпиткой); непрерывные.

В основу количественного описания процессов глубинной ферментации положены кинетические закономерности, характеризующие влияние субстра-

та и продуктов на удельную скорость роста микроорганизмов и накопления метаболитов. При этом кинетика процессов периодического и непрерывного культивирования имеет существенные различия.

Периодический процесс относится к закрытым системам. Все компоненты среды вносятся в начале ферментации, продукты реакции в процессе культивирования не отводятся. Состав среды, концентрация биомассы и метаболитов постоянно изменяются. В процессе культивирования популяция мко проходит все стадии развития.

Периодическая ферментация позволяет поддерживать постоянную температуру, равномерное распределение растворенных веществ по всему объему биореактора. В то же время периодические процессы связаны с рядом проблем:

•  большие затраты времени в связи с необходимостью загрузки  и разгрузки биореактора;
•  низкая продуктивность, связанная с малой концентрацией клеток в среде, ингибированием конечным продуктом и исчерпанием субстрата;
•  длительность процесса ферментации.

Периодический процесс с подпиткой (полунепрерывный) используется для снижения эффекта ингибирования продуктами метаболизма и недостатком субстрата. Процесс осуществляют отъемно-доливным способом: при достижении определенной концентрации клеток, метаболитов или по истечении определенного времени определенную часть культуральной жидкости сливают и вносят такой же объем свежей среды.

Непрерывные процессы. Различают два типа непрерывной (проточной) ферментации.

1.  Биореакторы полного смешения – жидкая фаза в них интенсивно перемешивается, постоянно подается питательная среда и отводится культуральная жидкость. Данные реакторы могут работать по принципу хемостата или турбидостата. В первом случае в системе поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды, причем постоянный подвод клеток не обязателен, поскольку в начальном периоде проводят периодическое культивирование, а затем включают подачу жидкости с клетками или без них. Во втором случае в биореакторе поддерживают постоянную концентрацию клеток, регулируя скорость протока среды. При достижении определенной максимальной концентрации клеток подача среды может быть автоматически прекращена и процесс протекает некоторое время в периодических условиях.
2.  Биореакторы полного вытеснения (тубулярные). Среда протекает по турбулярному реактору без перемешивания, состав и концентрация питательных веществ, продуктивность неодинаково распределены по объему реактора;  вместе со средой в реактор подаются клетки.

Целью количественного описания процессов культивирования в биореакторах являются расчет и оптимизация производительности аппарата, определение рабочего объема.

В.2. Количественное описание процесса глубинного периодического     культивирования.

Процесс периодического культивирования полностью соответствует экспоненциальной модели роста мко. Использование уравнений Моно и экспоненциального роста позволяет вывести следующие количественные показатели периодической ферментации:

•  Продуктивность по биомассе:  Qx = (X1-X0)/(τ1 – τ0);

•  Продуктивность по продукту: Qр = (Р1-Р0)/(τ1 – τ0);
•  Удельная скорость потребления субстрата: qx = (S0-S1)/ X1(τ1 – τ0);
•  Удельная скорость образования продукта: qр = (Р1-Р0)/ X1(τ1 – τ0).

Для определения количества биомассы, образующейся в периодическом реакторе за некоторое время, используют дифференциальные уравнения материального баланса:

dMx = rх*V*dτ;   dMs = rs*V*dτ;

где: rх и rs –скорости образования биомассы и расходования субстрата, которые определяют соответственно как количество биомассы (АСБ или число клеток), образующейся в единице объема в единицу времени и количество граммов (или молей) субстрата, расходованного в единице объема за единицу времени.

Соотношение изменения массы субстрата и клеток определяется экономическим коэффициентом:

Y = -dMx/dMs;          rx = -rs/Y

Производительность периодического ферментатора по биомассе определяют соотношениями:

Gx = (Mx – Mx.o.)/(V τ) = ([X] – [X]0)/τ.

Для периодического процесса производительность равна средней скорости прироста биомассы. При отыскании оптимальной производительности реактора используют выражение:

dGx/dτ = 1/τ * d[X]/dτ – ([X] – [X]0)/τ2 = 0;

d[X]opt/dτ = Gx opt ;          Gx opt = ([X]opt – [X]0)/τ.

На практике время операции значительно превышает оптимальное время активного роста культуры, т.к. включается продолжительность стерилизации τс, загрузки τз, лаг-фазы τл, активного роста τ и выгрузки τв:

τ общ = τс  + τз+ τл+ τ + τв

Оптимизируя производительность ферментатора по биомассе необходимо учитывать расход субстрата, т.к. в ряде случаев при достижении [X]opt субстрат израсходован не полностью и значение экономического коэффициента может существенно снизиться.

В.3. Основные закономерности процессов непрерывной ферментации в аппаратах полного смешения.

Использование непрерывно действующих (проточных) реакторов имеет ряд преимуществ перед периодическими процессами. Это открытые системы, которые при определенных условиях приходят в стационарное состояние, когда все параметры системы  (концентрации всех компонентов среды и клеток) постоянны во времени. Это резко упрощает управление работой биореактора и автоматизацию процесса.

Количественные показатели процесса непрерывного культивирования:

•  Скорость протока (коэффициент разбавления): D = W/V,

где: W – скорость потока среды, м3/ч;

•  Скорость образования биомассы и выноса биомассы из системы:

dX/d τ = μX – DX = (μ – D)X$

•  Скорость поступления и потребления лимитирующего субстрата:

dS/dτ = D(S0 – S1) – μX/Yx/s;

•  Скорость образования и выноса из системы продукта Р:

dP/dτ = qpX – DP = 0.

Если μ = D, то dX/dτ = 0, т.е. система находится в состоянии динамического равновесия. В зависимости от метода, благодаря которому поддерживается данное состояние, различают хемостатный (поддержание постоянной концентрации лимитирующего субстрата) и турбидостатный (поддержание постоянной концентрации биомассы) принципы культивирования.

Также известны методы управления ростом непрерывной культуры при рН (рН-стат) и по кислороду (оксистат).

В промышленности из аппаратов полного смешения наиболее широко используют биореакторы, работающие по принципу хемостата. Их преимущества – простота конструкции, легкость поддержания заданного режима, возможность длительного непрерывного культивирования.

Стационарные концентрации клеток [X] и субстрата [S] связаны с соответствующими концентрациями во входном потоке уравнениями материального баланса.

V*rx + W*[X]0 - W*[X] = 0;

W*[S]0 – W*[S] – V*rx*1/Y = 0.

Если выразить скорость прироста по уравнению Моно, получим основное кинетическое уравнение процесса ферментации в режиме хемостата:

µmax*[X]*[S]/(Ks + [S]) = µ*[X] = D*([X[ - [X]0).

Из этого уравнения следует, что подача клеток в аппарат в непрерывном режиме хемостата не обязательна; в этом случае работа биореактора начинается с периодического культивирования некоторой посевной дозы, а после перехода культуры в экспоненциальную фазу включают непрерывную подачу питательной среды.Для такого режима кинетическое уравнение принимает вид (при [X]0 = 0):

µ*[X] = D*[X];

µ = D.

Последнее равенство называют законом хемостата, который заключается в том, что в стационарном режиме удельная скорость роста устанавливается равной скорости разбавления среды, которая задается подбором параметров V и W0. Согласно уравнению Моно:

D = µ = µmax* [S] /(Ks + [S]);

[S]= Ks * D/(µmax – D);

где: [S] – концентрация субстрата в стационарном режиме работы

                хемостата.

Концентрация биомассы в стационарном режиме (при [X]0 = 0)^

[X] = Y*([S]0 – Ks*D/(µmax – D)/

Концентрация субстрата [S] накладывает ограничение на скорость разбавления: 0 <D<Dкр;

где: Dкр = μmax*[S]0/(Ks + [S]0) – критическая скорость разбавления, превышение которой вызывает вымывание клеток из биореактора.

Производительность отдельно работающего хемостата по биомассе определяется как число клеток, образующихся в единицу времени в единице объема биореактора:

Gx  = [X[/τ = D*[X] = D*Y*([S]0 – D*Ks/(μmax – D)).

Оптимальная производительность хемостата определяется выражением dGx/dD = 0

При этом Dopt = μmax*(1 - √Ks/([S]0+Ks));

[S]opt = Ks*Dopt/(µmax – Dopt) = (√Ks/([S]0+Ks)) – Ks;

[X]opt = Y*([S]0 – [S]opt) = Y*([S]0 + Ks - √Ks/([S]0+Ks));

Gxopt = [X]opt*Dopt = Y*µmax*(√([S]0+Ks) - √Ks)2

Хемостатный реактор с рециклом по биомассе и культуральной жидкости. В промышленных процессах используют при хемостатном культивировании блоки «биореактор-сепаратор».

W0 [S]0            о.к.ж.

                     W2, [S]2

                                         

                          к.ж.                       к.б/м

                   W1;[X]1,[S]1                         [X]2

         

                                               W0 [S]0            к.б/м

                                                                          [X[2, W2

                                                                               к.ж.                        о.к.ж.

                                                                          W1;[X]1,[S]1                         [S]2

Основные закономерности процесса:

•  W1 = W0 + W2;
•  Кратность рециркуляции a = W2/W0 > 0;
•  Степень сепарации b = [X]2/[X]1 > 0 (при рецикле по осветленной жидкости b < 1, по биомассе b > 1):
•  Материальный баланс ферментатора с рециклом:

W2*[X]2 + V*µ*[X]1 – W1*[X]1 = 0;

[X]1 = W2*[X]2/(W1 – V*µ).

Выражая W2 = a*W0;  W1 = W0 + a*W0 = (1 + a)*W;

[X]2 = b*[X]1, получим

                a*W0*b*[X]1

              (1 + a)*W – V*µ

исходя из этого, основной закон хемостата для  аппаратов с рециклом примет вид:

µ = u*D;

где: u = 1 = а – а*b – фактор рециркуляции;

[S]1 = Ks* D*u /(µmax – D*u);

Gx = D*[X] = D*Y*([S]0 – Ks* D*u /(µmax – D*u));

Gxopt = Y*µmax/u *(√( Ks +[S]0) - √Ks)2

При рецикле по биомассе [X]2 > [X]1, при этом u < 1и производительность по сравнению с хемостатом без рецикла увеличивается. Недостаток:

увеличение среднего возраста клеток и снижение их активности (падение µmax), опасность заражения культуры посторонней микрофлорой.

При рецикле по культуральной жидкости снижается производительность аппаратуры, т.к. u > 1. Это процесс может быть использован для более полной утилизации дорогостоящих субстратов. Его применение ограничивает торможение роста культуры повторно поступающим в реактор продуктом.

Каскад хемостатов. В производственных условиях в ряде случаев оказывается целесообразным культивирование в системе из нескольких последовательно или параллельно соединенных аппаратов. Батарея параллельно соединенных хемостатов имеет общую линию подачи сырья и отвода культурвльной жидкости. Концентрации и биомассы субстрата на выходе из установки связаны с концентрациями в отдельных аппаратах соотношениями:

  W0

                                                                                                               [X] = Σ[X]i *W1/W0;

                                                                         [S] = Σ[S]i *W1/W0

          [X]1      [X]2      [X]I         [X]n

                                                    W0      [X]

Материальные балансы каждого ферментера имеют вид:

Vi*µmax* [X]I*[S]i/(Ks + [S]I)   - Wi[X]I = 0;

[S]I = Ks*Di/(µmax – Di);

Gx = Di*Y*([S]0 – [S]I);

Gx = Y* ΣWi* ([S]0 – [S]I)

                        V

Если параметры роста культуры µmax и Кs в аппаратах одинаковы. То максимальная производительность батареи Gx достигается при равномерном

распределении потоков по аппаратам так, чтобы скорости разбавления в

каждом ферментаторе совпадали с общей скоростью разбавления:

Diopt = ΣWi/ΣVi

т.е. объемные подачи в каждый аппарат пропорциональны его объему:

W1/V1 = …Wi/Vi =…Wn/Vn.

При последовательном соединении реакторов скорость потока через всю систему остается постоянной, т.к. во входном потоке каждого из аппаратов каскада содержатся клетки из предыдущего аппарата.

W0                                                                                                                              W0

[S]0

Если [X]0  ≠ 0, то скорость разбавления в каждом аппарате составляет:

Di = µmax * [S]I       *      [X]I

               Ks + [S]I      [X]I – [X]i-1

Производительность каскада последовательно соединенных хемостатов определяется приростом клеток за время пребывания D = 1/τ/

Gxi = ([X]I – [X]i-1)/τ = D ([X]I – [X]i-1)

Производительность каскада в целом достигает максимального значения при заданной концентрации биомассы на выходе:

Gxopt  = W0 [X]opt/ ΣVi = Dopt [X]opt;

При этом минимальный объем каскада достигается при постоянной степени превращения субстрата на каждый степени превращения:

[S]1/[S]0 = …[S]2/[S]2 =…[S]n/[S]n-1.

В.4. Оптимизация процессов культивирования в аппаратах полного          вытеснения.

В аппаратах полного вытеснения на вход подается постоянный поток жидкости со скоростью W0, содержащий субстраты и клетки в концентрациях [S]0 и [X]0.

Время пребывания клеток в биореакторе определяется как

τ = V/W0 = 1/D = 1/μ  * ln[X]k/[X]0

    W0                                                                             W0                    [X]k

    ]S]0, [X]0                                      [S]k

Для турбулярных культур важным является нахождение времени τ, при котором достигается максимальная производительность биореактора по биомассе:

Gxopt = ([X]opt – [X]0)/τopt = Dopt ([X]opt – [X]0)

Время нахождения культуры в биореакторе определяется как скоростью протока, так и его геометрическими параметрами (V). В то же время, крайне трудно зафиксировать начало фазы экспоненциального роста, т.к. все фазы протекают в потоке.

В. 5. Особенности количественного описания процесса культивирования отъемно-доливным способом.

Одним из распространенных вариантов ферментации является полунепрерывный (отъемно-доливной) способ. По этому методу по достижении определенной концентрации биомассы при периодическом культивровании часть объема культуральной жидкости удаляют и вводят соответствующий объем питательной среды. Циклы «ферментация-слив-долив» повторяются

непрерывно, в результате чего через определенные промежутки времени биореактор дает определенную порцию продуктов, а при использовании батареи биореакторов вся система непрерывно поставляет биомассу.

При расчете биореакторов, работающих по отъемно-доливному способу задаются объемом реактора V, концентрацией биомассы [X]k, по достижении которой осуществляется отбор и подпитка долей отбираемой и доливаемой жидкости P = Vc /V; при этом после долива свежей культуры в реакторе устанавливается концентрация

[X]н = [X]k * (V – Vc)V = [X]k (1-P)/

Концентрация субстрата в начале каждого из циклов ферментации:

[S]н = [S]k + P([S]0 – [S]k);

где: [S]k – в конце цикла ферментации.

Производительность одного биореактора:

Gx = [X]k* P/τ.

Реальная продолжительность цикла (τц) включает помимо времени роста (τ) продолжительность операции слива и долива культуральной жидкости, однако последними величинами при расчетах, как правило, пренебрегают.

Задача оптимизации в данном случае сводится к определению оптимальной доли отбираемой и добавляемой жидкости при заданных значениях [X]k и τ цикла. Величина Р, в свою очередь, зависит от параметров роста культуры (μmax, Ks, [S]0).

В.6. Смешанные культуры и автоселекция при непрерывной

ферментации.

В биотехнологических производствах широко используется хемостатное культивирование смешанных культур, состоящих из двух и более штаммов. В этом случае задача по оптимизации процесса культивирования сводится к

определению значений скорости протока и стационарной концентрации лимитирующего субстрата, при которых достигается максимальный выход биомассы каждого из биообъектов.

При условии, что [X1]0 = 0 и [X2]0 = 0, справедливо уравнение:

μmax 1 *[S]/(Ks.1. + [S]) = D

μmax 2*[S]/(Ks.2. + [S]) = D

Из уравнения следует, что характер взаимодействия культур в реакторе будет определяться значениями констант уравнения Моно для каждой из них. При этом возможны два случая:

1). μ,

  1/ч

  μmax

    

    D           1       2

                  [S]1   [S]2                                           [S], г/л

Кривые роста штаммов не пересекаются, причем не важно равны ли величины μmax 1 и μmax 2 или нет, т.к. форма кривых определяется величинами Ks.1. и Ks.2.

В этом случае в предпочтительном положении оказывается тот штамм, для которого величина μmax достигается при меньшей концентрации лимитирующего субстрата. При любом значении D стационарная величина концентрации лимитирующего субстрата на уровне, оптимальном для штамма 1. В результате штамм 1 при заданном значении D растет и развивается нормально, а штамм 2 не способен размножаться вследствие лимитирования роста недостатком субстрата и неизбежно вымывается из биореактора.

2) Кривые роста штаммов пересекаются (обязательным условием являются неравенства μmax 1 ≠ μmax 2, Ks.1. ≠ Ks.2.).

μ

                                                      μmax 0

μ max1

Dopt

D1

                  [S]opt                                                [S] г/л 

В этом случае оптимальные параметры процесса культивирования достигаются в точке пересечения кривых роста. При D‹ Dopt предпочтение будет иметь штамм 1, при D › Dopt штамм 2.

При исследовании закономерностей роста культур в условиях лительной непрерывной ферментации было обнаружено явление автоселекции, связанное со спонтанными мутациями используемых штаммов в биореакторе. При этом мутации, приводящие к увеличению удельной скорости роста, называют положительными, а приводящие к изменению удельной скорости – отрицательными.

В условиях хемостата клетки, образовавшиеся в результате отрицательных мутаций, при установившемся значении [S] растут медленнее, чем основная культура. В результате они будут полностью вымываться из аппарата. Клетки, образовавшиеся в результате положительных мутаций, способны расти и размножаться при концентрациях субстрата меньше стационарной величины [S].

Накопление положительных мутантов приводит к вымыванию основной культуры из биореактора. Т.о., автоселекция заключается в отборе более жизнеспособных, быстрорастущих и эффективно потребляющих субстрат

клеток.

Несмотря на перечисленные аспекты, автоселекция в ряде случаев является нежелательным явлением, т.к. мутация, приводящая к увеличению кинетических показателей роста неоднозначно связана с другими технологическими свойствами штамма. Например, положительный штамм с точки зрения роста, может снизить или утратить способность синтезировать метаболит, являющийся целевым продуктом, содержать меньшее количество белка и т.д.

1. Тема 2 Предмет і метод бухгалтерського обліку
2. Зонная плавка
3. на тему- ldquo;Забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення
4. Экологическое прав
5. а Древний Египет
6. История дизайна Хрустальный дворец 1851 был возведен- атрадиционной кирпичной кладкой но с б
7. Анализ производственной себестоимости на ФГУП «Орошаемое»
8. Задание 1. Связывание и консолидация рабочих листов в excel
9. Мобильник Стивен Кинг Мобильник OCR Денис; RedCheck Rolnd http---lib
10. Уздзеянне звяроў на пладаноскасць і натуральнае ўзнаўленне лесу
11. 86 Форма 1.
12. Мировые суды
13. Трасса Аляска-Сибирь
14. ХИРУРГИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ 3 ТЕСТЫ Колоноскопия Прямая кишка имеет изги
15. ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра ldquo;Информа
16. Осложнения анестезии и профессиональные вредности в анестезиологи
17. ТЕМА. Лесные звери
18. Методика составления индивидуальной номенклатуры дел
19. ОБОГОМОЛЬЦЯ ldquo;Утвержденоrdquo; на методическом совещании
20. бхагаван увача майй асактаманах партха йогам йунджан мадашрайах асамшайам самаграм мам йатха джнасйаси т

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе