Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
15
Сеп.
Фер-мен-татор
Ферм.
V
Сеп.
[X]1 =
V1
W1
V1
W1
V2
W2
Vi
Wi
Vn
Wn
[S]0
Vn
Wn
[S]n
Vi
Wi
[S]i
V2
W2
[S]2
D2
V1
W1
[S]1
Лекция № 3 ТОБ.
Методы культивирования микроорганизмов.
В. 1. Классификация процессов культивирования микроорганизмов.
Культивирование продуцентов в промышленных условиях принято называть ферментацией. В зависимости от классификационного признака различают следующие типы ферментационных процессов:
В основу количественного описания процессов глубинной ферментации положены кинетические закономерности, характеризующие влияние субстра-
та и продуктов на удельную скорость роста микроорганизмов и накопления метаболитов. При этом кинетика процессов периодического и непрерывного культивирования имеет существенные различия.
Периодический процесс относится к закрытым системам. Все компоненты среды вносятся в начале ферментации, продукты реакции в процессе культивирования не отводятся. Состав среды, концентрация биомассы и метаболитов постоянно изменяются. В процессе культивирования популяция мко проходит все стадии развития.
Периодическая ферментация позволяет поддерживать постоянную температуру, равномерное распределение растворенных веществ по всему объему биореактора. В то же время периодические процессы связаны с рядом проблем:
Периодический процесс с подпиткой (полунепрерывный) используется для снижения эффекта ингибирования продуктами метаболизма и недостатком субстрата. Процесс осуществляют отъемно-доливным способом: при достижении определенной концентрации клеток, метаболитов или по истечении определенного времени определенную часть культуральной жидкости сливают и вносят такой же объем свежей среды.
Непрерывные процессы. Различают два типа непрерывной (проточной) ферментации.
Целью количественного описания процессов культивирования в биореакторах являются расчет и оптимизация производительности аппарата, определение рабочего объема.
В.2. Количественное описание процесса глубинного периодического культивирования.
Процесс периодического культивирования полностью соответствует экспоненциальной модели роста мко. Использование уравнений Моно и экспоненциального роста позволяет вывести следующие количественные показатели периодической ферментации:
Для определения количества биомассы, образующейся в периодическом реакторе за некоторое время, используют дифференциальные уравнения материального баланса:
dMx = rх*V*dτ; dMs = rs*V*dτ;
где: rх и rs –скорости образования биомассы и расходования субстрата, которые определяют соответственно как количество биомассы (АСБ или число клеток), образующейся в единице объема в единицу времени и количество граммов (или молей) субстрата, расходованного в единице объема за единицу времени.
Соотношение изменения массы субстрата и клеток определяется экономическим коэффициентом:
Y = -dMx/dMs; rx = -rs/Y
Производительность периодического ферментатора по биомассе определяют соотношениями:
Gx = (Mx – Mx.o.)/(V τ) = ([X] – [X]0)/τ.
Для периодического процесса производительность равна средней скорости прироста биомассы. При отыскании оптимальной производительности реактора используют выражение:
dGx/dτ = 1/τ * d[X]/dτ – ([X] – [X]0)/τ2 = 0;
d[X]opt/dτ = Gx opt ; Gx opt = ([X]opt – [X]0)/τ.
На практике время операции значительно превышает оптимальное время активного роста культуры, т.к. включается продолжительность стерилизации τс, загрузки τз, лаг-фазы τл, активного роста τ и выгрузки τв:
τ общ = τс + τз+ τл+ τ + τв
Оптимизируя производительность ферментатора по биомассе необходимо учитывать расход субстрата, т.к. в ряде случаев при достижении [X]opt субстрат израсходован не полностью и значение экономического коэффициента может существенно снизиться.
В.3. Основные закономерности процессов непрерывной ферментации в аппаратах полного смешения.
Использование непрерывно действующих (проточных) реакторов имеет ряд преимуществ перед периодическими процессами. Это открытые системы, которые при определенных условиях приходят в стационарное состояние, когда все параметры системы (концентрации всех компонентов среды и клеток) постоянны во времени. Это резко упрощает управление работой биореактора и автоматизацию процесса.
Количественные показатели процесса непрерывного культивирования:
где: W – скорость потока среды, м3/ч;
dX/d τ = μX – DX = (μ – D)X$
dS/dτ = D(S0 – S1) – μX/Yx/s;
dP/dτ = qpX – DP = 0.
Если μ = D, то dX/dτ = 0, т.е. система находится в состоянии динамического равновесия. В зависимости от метода, благодаря которому поддерживается данное состояние, различают хемостатный (поддержание постоянной концентрации лимитирующего субстрата) и турбидостатный (поддержание постоянной концентрации биомассы) принципы культивирования.
Также известны методы управления ростом непрерывной культуры при рН (рН-стат) и по кислороду (оксистат).
В промышленности из аппаратов полного смешения наиболее широко используют биореакторы, работающие по принципу хемостата. Их преимущества – простота конструкции, легкость поддержания заданного режима, возможность длительного непрерывного культивирования.
Стационарные концентрации клеток [X] и субстрата [S] связаны с соответствующими концентрациями во входном потоке уравнениями материального баланса.
V*rx + W*[X]0 - W*[X] = 0;
W*[S]0 – W*[S] – V*rx*1/Y = 0.
Если выразить скорость прироста по уравнению Моно, получим основное кинетическое уравнение процесса ферментации в режиме хемостата:
µmax*[X]*[S]/(Ks + [S]) = µ*[X] = D*([X[ - [X]0).
Из этого уравнения следует, что подача клеток в аппарат в непрерывном режиме хемостата не обязательна; в этом случае работа биореактора начинается с периодического культивирования некоторой посевной дозы, а после перехода культуры в экспоненциальную фазу включают непрерывную подачу питательной среды.Для такого режима кинетическое уравнение принимает вид (при [X]0 = 0):
µ*[X] = D*[X];
µ = D.
Последнее равенство называют законом хемостата, который заключается в том, что в стационарном режиме удельная скорость роста устанавливается равной скорости разбавления среды, которая задается подбором параметров V и W0. Согласно уравнению Моно:
D = µ = µmax* [S] /(Ks + [S]);
[S]= Ks * D/(µmax – D);
где: [S] – концентрация субстрата в стационарном режиме работы
хемостата.
Концентрация биомассы в стационарном режиме (при [X]0 = 0)^
[X] = Y*([S]0 – Ks*D/(µmax – D)/
Концентрация субстрата [S] накладывает ограничение на скорость разбавления: 0 <D<Dкр;
где: Dкр = μmax*[S]0/(Ks + [S]0) – критическая скорость разбавления, превышение которой вызывает вымывание клеток из биореактора.
Производительность отдельно работающего хемостата по биомассе определяется как число клеток, образующихся в единицу времени в единице объема биореактора:
Gx = [X[/τ = D*[X] = D*Y*([S]0 – D*Ks/(μmax – D)).
Оптимальная производительность хемостата определяется выражением dGx/dD = 0
При этом Dopt = μmax*(1 - √Ks/([S]0+Ks));
[S]opt = Ks*Dopt/(µmax – Dopt) = (√Ks/([S]0+Ks)) – Ks;
[X]opt = Y*([S]0 – [S]opt) = Y*([S]0 + Ks - √Ks/([S]0+Ks));
Gxopt = [X]opt*Dopt = Y*µmax*(√([S]0+Ks) - √Ks)2
Хемостатный реактор с рециклом по биомассе и культуральной жидкости. В промышленных процессах используют при хемостатном культивировании блоки «биореактор-сепаратор».
W0 [S]0 о.к.ж.
W2, [S]2
к.ж. к.б/м
W1;[X]1,[S]1 [X]2
W0 [S]0 к.б/м
[X[2, W2
к.ж. о.к.ж.
W1;[X]1,[S]1 [S]2
Основные закономерности процесса:
W2*[X]2 + V*µ*[X]1 – W1*[X]1 = 0;
[X]1 = W2*[X]2/(W1 – V*µ).
Выражая W2 = a*W0; W1 = W0 + a*W0 = (1 + a)*W;
[X]2 = b*[X]1, получим
a*W0*b*[X]1
(1 + a)*W – V*µ
исходя из этого, основной закон хемостата для аппаратов с рециклом примет вид:
µ = u*D;
где: u = 1 = а – а*b – фактор рециркуляции;
[S]1 = Ks* D*u /(µmax – D*u);
Gx = D*[X] = D*Y*([S]0 – Ks* D*u /(µmax – D*u));
Gxopt = Y*µmax/u *(√( Ks +[S]0) - √Ks)2
При рецикле по биомассе [X]2 > [X]1, при этом u < 1и производительность по сравнению с хемостатом без рецикла увеличивается. Недостаток:
увеличение среднего возраста клеток и снижение их активности (падение µmax), опасность заражения культуры посторонней микрофлорой.
При рецикле по культуральной жидкости снижается производительность аппаратуры, т.к. u > 1. Это процесс может быть использован для более полной утилизации дорогостоящих субстратов. Его применение ограничивает торможение роста культуры повторно поступающим в реактор продуктом.
Каскад хемостатов. В производственных условиях в ряде случаев оказывается целесообразным культивирование в системе из нескольких последовательно или параллельно соединенных аппаратов. Батарея параллельно соединенных хемостатов имеет общую линию подачи сырья и отвода культурвльной жидкости. Концентрации и биомассы субстрата на выходе из установки связаны с концентрациями в отдельных аппаратах соотношениями:
W0
[X] = Σ[X]i *W1/W0;
[S] = Σ[S]i *W1/W0
[X]1 [X]2 [X]I [X]n
W0 [X]
Материальные балансы каждого ферментера имеют вид:
Vi*µmax* [X]I*[S]i/(Ks + [S]I) - Wi[X]I = 0;
[S]I = Ks*Di/(µmax – Di);
Gx = Di*Y*([S]0 – [S]I);
Gx = Y* ΣWi* ([S]0 – [S]I)
V
Если параметры роста культуры µmax и Кs в аппаратах одинаковы. То максимальная производительность батареи Gx достигается при равномерном
распределении потоков по аппаратам так, чтобы скорости разбавления в
каждом ферментаторе совпадали с общей скоростью разбавления:
Diopt = ΣWi/ΣVi
т.е. объемные подачи в каждый аппарат пропорциональны его объему:
W1/V1 = …Wi/Vi =…Wn/Vn.
При последовательном соединении реакторов скорость потока через всю систему остается постоянной, т.к. во входном потоке каждого из аппаратов каскада содержатся клетки из предыдущего аппарата.
W0 W0
[S]0
Если [X]0 ≠ 0, то скорость разбавления в каждом аппарате составляет:
Di = µmax * [S]I * [X]I
Ks + [S]I [X]I – [X]i-1
Производительность каскада последовательно соединенных хемостатов определяется приростом клеток за время пребывания D = 1/τ/
Gxi = ([X]I – [X]i-1)/τ = D ([X]I – [X]i-1)
Производительность каскада в целом достигает максимального значения при заданной концентрации биомассы на выходе:
Gxopt = W0 [X]opt/ ΣVi = Dopt [X]opt;
При этом минимальный объем каскада достигается при постоянной степени превращения субстрата на каждый степени превращения:
[S]1/[S]0 = …[S]2/[S]2 =…[S]n/[S]n-1.
В.4. Оптимизация процессов культивирования в аппаратах полного вытеснения.
В аппаратах полного вытеснения на вход подается постоянный поток жидкости со скоростью W0, содержащий субстраты и клетки в концентрациях [S]0 и [X]0.
Время пребывания клеток в биореакторе определяется как
τ = V/W0 = 1/D = 1/μ * ln[X]k/[X]0
W0 W0 [X]k
]S]0, [X]0 [S]k
Для турбулярных культур важным является нахождение времени τ, при котором достигается максимальная производительность биореактора по биомассе:
Gxopt = ([X]opt – [X]0)/τopt = Dopt ([X]opt – [X]0)
Время нахождения культуры в биореакторе определяется как скоростью протока, так и его геометрическими параметрами (V). В то же время, крайне трудно зафиксировать начало фазы экспоненциального роста, т.к. все фазы протекают в потоке.
В. 5. Особенности количественного описания процесса культивирования отъемно-доливным способом.
Одним из распространенных вариантов ферментации является полунепрерывный (отъемно-доливной) способ. По этому методу по достижении определенной концентрации биомассы при периодическом культивровании часть объема культуральной жидкости удаляют и вводят соответствующий объем питательной среды. Циклы «ферментация-слив-долив» повторяются
непрерывно, в результате чего через определенные промежутки времени биореактор дает определенную порцию продуктов, а при использовании батареи биореакторов вся система непрерывно поставляет биомассу.
При расчете биореакторов, работающих по отъемно-доливному способу задаются объемом реактора V, концентрацией биомассы [X]k, по достижении которой осуществляется отбор и подпитка долей отбираемой и доливаемой жидкости P = Vc /V; при этом после долива свежей культуры в реакторе устанавливается концентрация
[X]н = [X]k * (V – Vc)V = [X]k (1-P)/
Концентрация субстрата в начале каждого из циклов ферментации:
[S]н = [S]k + P([S]0 – [S]k);
где: [S]k – в конце цикла ферментации.
Производительность одного биореактора:
Gx = [X]k* P/τ.
Реальная продолжительность цикла (τц) включает помимо времени роста (τ) продолжительность операции слива и долива культуральной жидкости, однако последними величинами при расчетах, как правило, пренебрегают.
Задача оптимизации в данном случае сводится к определению оптимальной доли отбираемой и добавляемой жидкости при заданных значениях [X]k и τ цикла. Величина Р, в свою очередь, зависит от параметров роста культуры (μmax, Ks, [S]0).
ферментации.
В биотехнологических производствах широко используется хемостатное культивирование смешанных культур, состоящих из двух и более штаммов. В этом случае задача по оптимизации процесса культивирования сводится к
определению значений скорости протока и стационарной концентрации лимитирующего субстрата, при которых достигается максимальный выход биомассы каждого из биообъектов.
При условии, что [X1]0 = 0 и [X2]0 = 0, справедливо уравнение:
μmax 1 *[S]/(Ks.1. + [S]) = D
μmax 2*[S]/(Ks.2. + [S]) = D
Из уравнения следует, что характер взаимодействия культур в реакторе будет определяться значениями констант уравнения Моно для каждой из них. При этом возможны два случая:
1). μ,
1/ч
μmax
D 1 2
[S]1 [S]2 [S], г/л
Кривые роста штаммов не пересекаются, причем не важно равны ли величины μmax 1 и μmax 2 или нет, т.к. форма кривых определяется величинами Ks.1. и Ks.2.
В этом случае в предпочтительном положении оказывается тот штамм, для которого величина μmax достигается при меньшей концентрации лимитирующего субстрата. При любом значении D стационарная величина концентрации лимитирующего субстрата на уровне, оптимальном для штамма 1. В результате штамм 1 при заданном значении D растет и развивается нормально, а штамм 2 не способен размножаться вследствие лимитирования роста недостатком субстрата и неизбежно вымывается из биореактора.
2) Кривые роста штаммов пересекаются (обязательным условием являются неравенства μmax 1 ≠ μmax 2, Ks.1. ≠ Ks.2.).
μ
μmax 0
μ max1
Dopt
D1
[S]opt [S] г/л
В этом случае оптимальные параметры процесса культивирования достигаются в точке пересечения кривых роста. При D‹ Dopt предпочтение будет иметь штамм 1, при D › Dopt штамм 2.
При исследовании закономерностей роста культур в условиях лительной непрерывной ферментации было обнаружено явление автоселекции, связанное со спонтанными мутациями используемых штаммов в биореакторе. При этом мутации, приводящие к увеличению удельной скорости роста, называют положительными, а приводящие к изменению удельной скорости – отрицательными.
В условиях хемостата клетки, образовавшиеся в результате отрицательных мутаций, при установившемся значении [S] растут медленнее, чем основная культура. В результате они будут полностью вымываться из аппарата. Клетки, образовавшиеся в результате положительных мутаций, способны расти и размножаться при концентрациях субстрата меньше стационарной величины [S].
Накопление положительных мутантов приводит к вымыванию основной культуры из биореактора. Т.о., автоселекция заключается в отборе более жизнеспособных, быстрорастущих и эффективно потребляющих субстрат
клеток.
Несмотря на перечисленные аспекты, автоселекция в ряде случаев является нежелательным явлением, т.к. мутация, приводящая к увеличению кинетических показателей роста неоднозначно связана с другими технологическими свойствами штамма. Например, положительный штамм с точки зрения роста, может снизить или утратить способность синтезировать метаболит, являющийся целевым продуктом, содержать меньшее количество белка и т.д.