Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ОСНОВНЫЕ СОВРЕМЕННЫЕ ГЕНОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
XXI век, несомненно, войдет в историю, как век молекулярной генетики. Бурное развитие молекулярно-биологических методов, появление новых, компьютерных, подходов к анализу данных обеспечили прорыв в нашем представлении о том, как устроен и как функционирует геном. Современные геномные технологии в зависимости от целей их применения можно условно разделить на сканирующие, скринирующие, функциональные и хромосомные (картирующие) (табл. 1). Получаемые с помощью этих методов огромные массивы данных обрабатываются с применением биоинформационных технологий. Хорошее знание основных принципов и этапов молекулярно-генетического тестирования позволяет совершенствовать существующие технологии, учитывая открывающиеся с их помощью возможности и сознавая подстерегающие на этом пути опасности.
|
Геномные технологии |
Meтоды |
|
|
Получение и выделение ДНК |
Выделение нативной ДНК |
Метод фенол-хлороформной экстракции |
|
Синтез ДНК |
Химический синтез Ферментативный синтез (полимеразно цепная реакция) |
|
|
Получение и выделение определенных фрагментов ДНК |
Методы гибридизации с ДНК-зондами Клонирование |
|
|
Сканирующие (поиск новых аллелей/генов, полиморфизмов) |
Определение нуклеотидной последовательности |
Секвенирование |
|
Методы детекции точковых мутаций |
Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) Денатурирующий гель-электрофорез Гетероцуплексный анализ Химическое расщепление некомплементарных сайтов |
|
|
Методы, основанные на полиморфизме генома |
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов Анализ мини- и микросателлитных маркеров |
|
|
Анализ продуктов генов |
Тест на укороченный белок Масс- спектрометрия |
|
|
Биоинформационные технологии |
Технология микрограмм (ДНК-чипы) |
|
|
Скринирующие (детекция известных генов/аллелей) |
Аллель-специфическая гибридизаиия/амплификация Капиллярный денатурирующий гегь-электрофорез Минисеквенирование в твердой фазе Олигонуклеотид-лигазный анализ (OLA) |
|
|
Функциональные |
Изучение транскриптов |
Технология микрограмм (экспрессионные РНК-чипы) |
|
Изучение продуктов гена |
Двухмерный электрофорез Многомерная хроматография Изотопно-меченные афинные мишени (IСАТ-технологии) Масс-спектрометрия (матричная лазерная десорбционная ионизация (MALDI), электроспрейная ионизация (ESI) Белковые чипы (SELDI) Интерактивные протеомные технологии (дрожжевая двухгибридная система, биомолекулярньй интерактивный анализ (BIA)) |
|
|
Изучение локализации тэанскриптов и продуктов гена |
Технолсгия микрограмм (экспрессионные РНК-чипы и белковые чипы —анализ уровня экспрессии в различных органах и тканях, определение внутри/вне клеточной локализации) |
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК
ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и других жидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Процесс выделения ДНК состоит из нескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. Оценку качества выделенной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) —оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно.
ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДНК
Для научных исследований ДНК не только выделяют из биологического материала, но и получают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов —приборов для автоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химического синтеза от биологического состоит в присоединении каждого нового нуклеотида к 5'-гидроксильному концу цепи, а не к З'-концу.
Наиболее распространенным методом химического синтеза ДНК является фосфорамидитный (фосфиттриэфирный) метод. Для синтеза используют модифицированные дезоксирибонуклеозиды. Для предотвращения неспецифического взаимодействия 5'-гидроксильной группы первого нуклеотида до добавления в реакционную смесь второго нуклеотида ее защищают с помощью диметокситритильной (ДМТ) группы Каждый последующий присоединяемый к растущей цепи нукпеотид добавляется в колонку в виде фосфорамидита, т.е. содержит ДМТ-группу и диизопропиламинную группу на З'-фосфитной группе,защищенную метильным остатком.
Химический синтез необходим для получения одноцелочечных олигонуклеотидов длиной <50 п.н. Такие олигонуклеотиды используют для конструирования целых геномов и их фрагментов, в качестве праймеров для амплификации специфических последовательностей и секвенировании ДНК, для сайт-специфического мутагенеза in vitro, в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. Химический синтез применяют при затруднении клонирования гена (если известна аминокислотная последовательность белка). В тех случаях, когда кодоны гена плохо считываются организмом хозяина, можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), который сохраняет аминокислотную последовательность прежней, но транскрибируется более эффективно. Для того чтобы синтезировать ген, необходимо каждую из цепей составляющей его последовательности синтезировать отдельно. При большой протяженности гена его синтезируют отдельными фрагментами, которые впоследствии «собирают» с помощью ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы.
АМПЛИФИКАЦИЯ И РЕСТРИКЦИЯ ДНК
Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два из которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимеразы и рестриктазы.
ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК, и для их работы необходима одно цепочечная матричная ДНК с двухцепочечным участком на З'-конце молекулы и четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP. dATP, dCTP, dGTP и dTTP). ДНК полимеразы обладают различными видами активности, в том числе и экзонуклеазной в направлении З'-> 5', что позволяет этим ферментам репарировать дефекты образовавшиеся при синтезе ДНК.
Способность ДНК-полимеразы I E coli инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК используется для введення в ДНК меченых нуклеотидов методом ник-трансляции, а также для заполнения брешей при сборке протяженного гена из химически синтезированных олигонуклеотидных последовательностей.
Основное свойство ДНК-полимераз —осуществлять синтез ДНК —используют при амплификации изучаемого фрагмента ДНК. Одним из видов амплификации является полимеразная цепная реакция.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР был предложен в 1983 г. американским исследователем Кари Муллисом. Суть этого метода заключается в специфической амплификации ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы З'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДНК на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода ПЦР. Основной недостаток этого метода —необходимость знания ДНК-последовательностей, фланкирующих изучаемый ген. для создания праймеров.
Для проведения специфической амплификации необходимы:
1) матричная ДНК-мишень (достаточно даже одной молекулы) длиной от 100 до = 35 000п.н.;
2) два искусственно синтезированных праймера —олигонуклеотидные последовательности длиной 15-30 п.н.;
3) термостабильная ДНК-полимераза (чаще используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, или Taq), сохраняющая свою активность при температуре 94 °С и выше;
4) четыре дезоксирибонуклеотида.
ПЦР состоит из многократных повторений цикла, состоящего из трех этапов:
1) денатурации (плавления) двухцепочечных структур —перевод их в одноцепочечную форму путем нагревания до температуры 94 °С;
2) ренатурации или гибридизации (отжига) комплементарных участков ДНК с праймерами при температуре 37—°С;
3) синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК при 72 °С.
Механизм ПЦР
В первом цикле праймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК и образуют так называемые «длинные матрицы». В последующих циклах праймеры спариваются с вновь синтезированными молекулами ДНК, образуя «короткие матрицы». При этом синтезДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка. Скорость синтеза определяется длиной амплифицируемого фрагмента. Как правило, ПЦР включает 25—циклов, и к последнему циклу в реакционной смеси содержатся практически только «короткие матрицы» (амплифицируемые фрагменты).
ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы —термоциклеры или амплификаторьт ДНК, позволяющие задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждого этапа цикла.
Модификации ПЦР, используемые в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от метода последующего молекулярного анализа амплификатов:
1. Метод мультиплексной амплификации (МПА), позволяющий проводить ПЦР нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке, что не только убыстряет и удешевляет анализ, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получающиеся в результате МПА, в качестве положительного контроля реакции для других. Добавляя в реакционную смесь меченые dNTP, можно при необходимости, получать меченые продукты ПЦР.
2. Проведение ПЦР с молекулами кДНК (кодирующей ДНК) позволяет анализировать экспрессию генов и получать большие количества кДНК.
3. Реакцию амплификации можно проводить непосредственно на хромосомных препаратах и при использовании меченых нуклеотидов визуализировать комплементарные продуктам амплификации участки ДНК на хромосомах, (метод PRINS - от англ. polymerase reaction in situ).
4. Асимметричная ПЦР —с избытком одного из олиго-праймеров;
. ПЦР с использованием магнитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином и биотиновой метки одного из праймеров
4 и 5 позволяют синтезировать и выделять преимущественно одноцепочечные фрагменты ДНК, что значительно облегчает их секвенирование.
. Метод GAWTS (от англ. genome amplification with transcript sequences) —амплификацию с праймерами, несущими сайт узнавания для фермента Т7-РНК-полимеразы, с последующим секвенированием одноцепочечного РНК-транскрипта, полученного из амплификата при помощи Т7-РНК-полимеразы.
Продукты ПЦР и любые другие фрагменты ДНК наблюдают в геле после проведения гель-электофореза и специфического окрашивания. При окрашивании геля бромидом этидия и просмотре в проходящем ультрафиолетовом свете места локализации ДНК выявляются в виде красной полосы.
На электрофореграмме можно определять наличие или отсутствие амплифицированного фрагмента в изучаемом образце, обусловленное протяженными делециями и структурными перестройками, регистрировать изменение его длины. Причинами отклонения в размерах синтезированных молекул могут быть:
Таким образом, ПЦР представляет собой не только метод амплификации (синтеза), но и альтернативный метод анализа геномной ДНК.
Рестрикция ДНК. Рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеазы, —ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью и участвующие в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожения чужеродных ДНК in vivo. Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, каждая из которых узнает свою специфическую последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК. Длина распознаваемого участка варьирует от 4 до 12 нуклеотидов. Обнаружив эту последовательность, рестриктаза разрезает молекулу ДНК на фрагменты в местах ее локализации, называемых сайтами рестрикции. Чем больше сайтов рестрикции, тем больше образуется рестрикционных фрагментов. Длина рестрикционных фрагментов зависит от распределения сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК: образующиеся фрагменты тем короче, чем чаще расположены эти сайты. В зависимости от частоты расположения сайтов рестрикции в молекуле ДНК выделяют три класса рестриктаз: частощепящие —как правило, узнают короткие специфические последовательности длиной в 4—п.н. (например, TaqI); среднешепящие —узнают средней длины (6—п.н.) специфические последовательности (например, EcqRI); редкощепящие - узнают длинные специфические последовательности в 8—п.н. (например, Notl).
Сайты рестрикции часто используют в качестве генетических маркеров ДНК, так как образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле в зависимости от их молекулярной массы. Зная молекулярную массу фрагментов, можно определить физическое расстояние между сайтом рестрикции и концами исходного фрагмента ДНК, что является основой метода, получившего название физического картирования.
Картирование сайтов рестрикции
а - результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции (М - маркер молекулярной массы; EcoRI, BamHI - рестриктазы; BamHI+EcoRI -смесь рестриктаз).
б - рестрикционная карта, построенная на основе определения длины фрагментов (п.н.), которая соответствует расстоянию между сайтами узнавания рестриктаз.
При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, например ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонуклеазами образуется огромное количество фрагментов различной длины (в среднем порядка 1 млн.). Разделить эти фрагменты с помощью электрофореза и визуально идентифицировать каждый из них невозможно: на электрофореграмме видна полоса, равномерно окрашенная по всей длине геля - шмер. Обнаружение определенных фрагментов рестрицированной геномной ДНК на эгектрофореграмме возможно только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами.
Длительное время, до разработки ПЦР, единственными методами обнаружения и выделения специфических фрагментов ДНК (геномных и кДНК) с целью их последующего изучения были гибридизация с ДНК-зондами и клонирование, несмотря на целый ряд ограничений их применения. К основным ограничениям относятся следующие: большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу; невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК; необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5—мл крови), для геномной гибридизации —наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./(минмкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.
Все это, а также большая трудоемкость исследований, ограничивают использование методов блот-гибридизации и клонирования для пренатальной диагностики плода (ответ в этом случае надо получить быстро) и диагностики наследственного заболевания при гибели больного в этом случае невозможно получить большое количество ДНК). Однако эти методы не потеряли своей актуальности и используются для картирования и изучения новых генов.
ГИБРИДИЗАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ
ДНК-зонд —одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК. ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.
Блот-гибридизация. Это высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. Денатурированные фрагметы ДНК переносят на плотный носитель —нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Далее фиксированную на этом носителе ДНК гибридизуют с радиоактивно меченным ДНК- или РНК-зондом. Затем положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме определяют методом радиоавтографии. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 109 расп./(мин мкг)) этот метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДНК.
В зависимости от типа изучаемого вещества, способов его предварительной обработки и переноса (блоттинга) различают несколько разновидностей этого метода.
Саузерн-блот, или блот-гибридизация по Саузерну —наиболее эффективный метод идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов, предложенный в 1975 г. Эдвардом Саузерном. Геномную ДНК обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и образовавшиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном геле. Далее фрагменты ДНК подвергают денатурации in situ и переносят с геля на плотный носитель. В данном случае блоттинг (перенос) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума.
Методы дот- и слот-гибридизации получили свои названия в зависимости от формы анализируемого пятна ДНК на фильтре —округлой или продолговатой, соответственно. На твердую матрицу препараты ДНК и РНК наносятся капельно. Принципиальное отличие этих методов в том, что с меченым ДНК-зондом гибридизуются молекулы ДНК или РНК без предварительной обработки рестриктазами и электрофореза.
Нозерн-блот (Northern-blot) —метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК.
Вестерн-блот (Western-blot), или иммуноблот —это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами.
Названия двух последних методов образованы по аналогии с Саузерн-блот (Southern-blot). Их можно рассматривать как дань уважения сообщества молекулярных генетиков Эдварду Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку методов, используемых для анализа ДНК.
Перечисленные виды блот-гибрида-зации имеют ряд недостатков: необходимость использования хорошо очищенных препаратов ДНК и радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры. Все это делает данные методы весьма дорогостоящими. Тем не менее, блот-гибридизация не утратила своего значения и в настоящее время. Использование различных вариантов нерадиоактивного мечения (биотин- или флуоресцеин-меченные ДНК-зонды) или окраски ДНК нитратом серебра позволяет применять этот метод для диагностики генных болезней.
Методика блот-гибридизации. (Из: В.Н. Горбунова, В,С. Баранов, 1997)
а - блот-гибридизация по Саузерну, б - дот-гибридизация; в - слот-гибридизация
Гибридизация in situ. Метод гибридизации с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК). В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) —вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.
Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек. Гибридизация in situ —один из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Его применяют при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения; при определении хромосомной принадлежности и внутрихромосомной локализации уникальных генов, взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса. Разрешающая способность FISH-метода достигает нескольких хромосомных бэндов: при проведении гибридизации in situ на интерфазных (растянутых) хромосомах человека она может достигать 50 г.п.н., что составляет около 5% величины среднего хромосомного бэнда.
Гибридизация in situ молекул РНК с кДНК-зондами, проводимая на гистологических препаратах, эффективно используется для анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.
КЛОНИРОВАНИЕ: ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ. СОЗДАНИЕ И СКРИНИНГ БИБЛИОТЕК ГЕНОВ
Клонирование —один из методов выделения и идентификации фрагментов ДНК, а также получения их в неограниченном количестве. Выделенные и идентифицированные фрагменты могут быть использованы для молекулярного анализа, в качестве ДНК-зондов и для создания библиотек генов. Метод был разработан на бактериях и свое название получил из-за того, что все производные одной бактериальной колонии содержат идентичные фрагменты ДНК, т.е. представляют собой клоны.
Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапов:
1) встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (образование химерной молекулы —рекомбинантной ДНК);
2) проникновение этой конструкции в бактериальную клетку-хозяина;
3) идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, и их отбор (как правило, осуществляется на селективной среде);
4) получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (собственно клонирование). При необходимости индуцируют экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получают кодируемый им белок.
Этапы клонирования фрагмента ДНК с использованием плазмидного вектора
Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК. Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента ДНК в клетку хозяина, для прокариот и эукариот различны. Для клонирования в прокариотических клетках, используют плазмиды, фаги и космиды. В зависимости от типа векторной системы, используемой для доставки клонируемого фрагмента ДНК, процесс переноса генов носит название: при использовании плазмиды —трансформации; при использовании фага —трансдукции. Перенос экзогенной ДНК в эукариотические клетки называют трансфекцией. В качестве векторов для переноса ДНК в эукариотические клетки используют дрожжевые плазмиды (единственные плазмиды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотические вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциирован-ные вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляют путем ко-трансформации —одновременного введения плазмиды и сегмента чужеродной ДНК. В клетках эукариот векторные конструкции сохраняются в виде эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина.
Конструирование клонирующих векторов подразумевает встраивание или удаление удобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции). Например, при создании плазмидных клонирующих векторов ослабляют систему контроля репликации и добавляют или вырезают гены антибиотикоустойчивости. При формировании фаговой векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов по экспрессии химерного белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному белку, а часть —информации, заключенной во встроенном фрагменте ДНК). Определение химерного белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или участку, кодируемому чужеродной ДНК, а также путем выявления функционально активного белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. При конструировании искусственных дрожжевых хромосом YAC (от англ. yeast artificial chromosomes) используют плазмидные векторы, содержащие в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина.
Некоторое время идентификация нужных геномных клонов проводилась очень трудоемкими методами —«прогулки» и «прыжков по хромосоме».
Принципиальная схема методов клонирования путем «прогулки» (а) и «прыжков» (б) по хромосоме
а - для создания каждого последующего зонда гибридизовавшуюся последовательность суб-клонируют и строят ее рестрикционную карту. С помощью созданного зонда выбирают следующую последовательность. В результате получают ряд перекрывающихся последовательностей общей длиной 40т.п.н., исключая перекрывающийся участок между ними (зонд). Четыре таких фрагмента охватывают примерно 160 п.н. б - см.
«Прогулка по хромосоме», или скользящее зондирование, заключается в последовательном отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДНК из определенной области генома. Выделив клоны, например, путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют в качестве ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последовательностями. В результате получают набор фрагментов, полностью перекрывающих область поиска гена, —контиги. С помощью методов физического картирования устанавливают размер перекрывающихся участков (в п.н.) и строят физическую карту данной области. Несмотря на то, что прогулку можно осуществлять в двух направлениях, при использовании рестрикционной карты, эффективность этого метода мала. При использовании космидных библиотек каждый шаг зондирования в одном направлении равен 20 т.п.н. (0,02 Мб), а из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей можно пройти около 200—т.п.н. (0,2—,3 Мб).
Метод клонирования способом «прыжков по хромосоме» позволяет идентифицировать участки, отстоящие друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов, не выделяя промежуточную последовательность. Для создания библиотеки генов методом «прыжков по хромосоме» проводят рестрикцию геномной ДНК редкощепящей рестриктазой (как правило, наиболее удобен фермент, сайты рестрикции которого находятся на расстоянии примерно 200 т.п.н. —длина прыжка). Эти фрагменты сшивают с небольшим маркерным геном, как правило, с геном supF (длина =7 т.п.н.) фага X, что приводит к циклизации фрагмента. В результате этого концевые участки, исходно находившиеся на расстояние несколько сотен т.п.н. удалены друг от друга лишь на длину маркерного гена. Обработав кольцевые молекулы среднещепяшей рестриктазой (наиболее часто используют EcoRl), отбирают фрагменты длиной примерно 20 т.п.н., среди которых и содержащие маркерный ген и фланкирующие его последовательности. При встраивании в вектор амплифицироваться в клетках-хозяевах отрицательных по маркерному гену будут только последовательности, содержащие этот ген. Далее идентифицируют клон методом гибридизации с ДНК-зондом, специфичным для исходной последовательности. При последующем субклонировании в плазмидном векторе получают два субклона. Один субклон гчбридизуется с ДНК-зондом, специфичным для исходной последовательности, второй —не гибридизуется с этим ДНК-зондом и содержит фрагмент ДНК, отстоящий от начала исходной молекулы на длину прыжка.
После создания геномных библиотек, содержащих большие фрагменты ДНК, и построения карт контиг методы «прогулки» и «прыжков по хромосоме утратили свою актуальность.
Библиотеки генов и их скрининг. На осьове технологии клонирования, позволяющей обнаруживать определенный фрагмент ДНК и поручать его в необходимом количестве, сконструированы библиотеки генов, служащие источником различных фрагментов ДНК. Библиотека генов —это полный набор клонированных перекрывающихся ДНК-фрагментов, которые получены в результате рестрикции или механического разрезания исходной молекулы ДНК, выделенной из какого-либо биологического материала (тканей, культур клеток, отдельной хромосомы или из ее фрагментов). Количество различных клонов, или информационная емкость библиотеки, зависит от размера исходной ДНК (генома) и обязательности присутствия каждого фрагмента хотя бы в одном клоне. Оптимальный размер перекрывающихся фрагментов для клонирования при создании библиотеки генов должен соответствовать среднему размеру гена того вида или типа живых организмов (для млекопитающих ——т.п.н.), для которого она создается.
Библиотека может содержать всю геномную ДНК данного вида (экзоны, интроны и межгенные участки) или только кодирующие последовательности.
Библиотеки, созданные на основе тотальной геномной ДНК и включающие экзоны, интроны и межгенные участки называют геномными. Информационная емкость геномных библиотек млекопитающих составляет не менее 8х105—6. Фрагменты оптимального размера из геномной ДНК человека получают при рестрикции частощепящими рестриктазами Sau ЗА или Mbol.
Библиотеки кДНК состоят только из экзонов. Их конструируют из кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции мРНК, которая выделена из биологического материала, экспрессирующего изучаемые гены. Различают библиотеки экспрессирующихся кДНК и селективных кДНК.
Получив ДНК/кДНК, ее разрезают на фрагменты, длина которых зависит от выбранного клонирующего вектора, и конструируют векторную систему. В зависимости от выбранного для клонирования вектора различают YAC-, ВАС (bacterial artificial chromosomes)- и РАС (plasmid artificial chromosomes)-библиотеки, содержащие крупные фрагменты ДНКчеловека. Фаговые (Р1 и X) и космидные библиотеки генов наиболее удобны для хранения больших количеств химерных ДНК. Для создания библиотек генов в основном используют фаговые, космидные и YAC-системы. YAC-библиотеки генов представляют собой фрагменты геномной ДНК человека размером до 1 млн п.н., «сшитые» с центромерными районами хромосом дрожжей. После идентификации необходимого клона YAC-библиотеки вставочный участок может быть субклонирован в фаговых или космидных библиотеках. Наиболее удобно библиотеки генов человека конструировать, используя клонирующие векторы на основе фага X —EMBL3 и EMBL4. Это обусловлено характеристиками векторов: интервалом пакующей способности —-23 т.п.н.; наличием большого количества удобных клонирующих сайтов (что позволяет использовать разные рестриктазы при получении фрагментов ДНК для инсердии); отсутствием последовательностей плазмид pBR322 и Co/El, наиболее часто используемых для клонирования (что позволяет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая вставку).
Скринируя библиотеки генов, осуществляют поиск нужных последовательностей ДНК. Выбор метода скрининга зависит от специфических особенностей этих последовательностей. Для скрининга библиотек, как правило, используют блот-гибридизацию с ДНК-зондами (олигонуклеотидными, кДНК и другими) или иммунноблот со специфическими антителами (если библиотека сконструирована на основе экспрессирующего вектора). Скрининг включает несколько последовательных этапов: высевание химерных фагов библиотеки на газон бактерий, растущих на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри (каждая литическая бляшка на бактериальном газоне - результат инфицирования клеток одним клоном фага); «перепечатывание» полученных культур на другие чашки Петри с целью их дублирования; перенос растущих и лизированных исходных колоний на фильтр с одновременным разрушением клеточных мембран, фиксированием белков и ДНК; блот-гибридизация с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). Заключительный этап скрининга включает выявление положительных колоний фагов методом радиоавтографии (после удаления несвязавшихся ДНК-зондов и антител темные пятна на рентгеновской пленке обнаружатся в местах локализации колоний, содержащих комплементарный зонду фрагмент ДНК, или специфический антиген) и их отбор на дублированных культурах. С целью избежания ошибок проводят неоднократный скрининг отобранных колоний. Далее для получения достаточного количества отобранного фрагмента с целью его исследования или использования в качестве ДНК-зонда его субклонируют в плазмидном векторе.
МЕТОДЫ ПОИСКА ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ОСНОВАННЫЕ НА ПОЛИМОРФИЗМЕ ГЕНОМА
Последовательности ДНК человека идентичны между собой на 99,8%, однако, оставшиеся 0,2% генома человека характеризуются значительной вариабельностью. Исследования генома, позволившие установить наличие вариабельных участков, а также широкое внедрение метода ПЦР, позволили разработать более легкие методы идентификации фрагментов ДНК, основанные на полиморфизме генома. Эти методы имеют ряд преимуществ: 1) можно использовать один и тот же (универсальный) набор праймеров, 2) нет необходимости в ДНК-зондировании, гибридизации итд., 3) возможность автоматизации анализа результатов. Все это позволяет быстро охарактеризовать большое количество образцов.
Как известно, полиморфизм генома обусловлен, главным образом, наличием полиморфных локусов, представляющих собой нейтральные мутации, не проявляющиеся фенотипически и не влияющие на жизнеспособность и репродуктивные свойства особей. Такие локусы сконцентрированы в некодирующих областях генома человека, более подверженных изменчивости, чем кодирующие участки. Наследование полиморфных локусов подчиняется менделевским закономерностям. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.
С помощью молекулярных методов анализа наиболее просто выявляются два типа геномного полиморфизма: 1) количественные изменения мини- и микросателлитных последовательностей ДНК (уменьшение или увеличение числа повторов), создающие целую серию уникальных по характеру и частоте аллелей для каждого вариабельного локуса, и 2) качественные замены отдельных нуклеотидов, обусловливающие появление полиморфных сайтов рестрикции. Эти типы полиморфных локусов представляют собой наиболее удобные генетические маркеры. Анализируя родословные можно проследить наследование аллелей этих маркеров в ряду поколений, определить сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, что широко используется как для картирования геномов, так и для косвенной диагностики наследственных заболеваний. Феномен ДНК-полиморфизма лежит в основе двух распространенных в настоящее время методов идентификации мутантных фрагментов ДНК: анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализа микросателлитных маркеров.
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Присутствие в геноме полиморфных сайтов рестрикции обусловливает вариацию (полиморфизм) длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В геноме человека такие полиморфные сайты рестрикции встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно 1: 300 - 500 п.н.
Этот метод используется для предварительного уточнения локализации мутации при наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции и для выявления уже известных точковых замен, меняющих сайт узнавания рестриктаз. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей рестриктазой и на электрофореграмме сравнивают длину изучаемых рестрикционных фрагментов с контролем. При необходимости полученные фрагменты идентифицируют, используя метод блот-гибридизации по Саузерну.
ПДРФ-анализ можно использовать для диагностики гетерозиготного носительства мутаций. При наличии точковых мутаций в гетерозиготном состоянии по данному сайту рестрикции на электрофореграмме будут выявляться три фрагмента: один —исходной длины и два —полученные после рестрикции. При наличии делеций в гетерозиготном состоянии наряду с фрагментами нормальной длины будут присутствовать и необычные по размеру. Выявление полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии позволяет отличить мутантный аллель от нормального, т.е. осуществить его молекулярную маркировку. Однако первичная идентификация полиморфного сайта рестрикции, сцепленного с определенным геном, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов.
ПДРФ-анализ применяют как для прямой (определяют уже известные нуклеотидные замены), так и для косвенной ДНК-диагностики. Косвенная диагностика проводится по полиморфным точкам, расположенным, как правило, в некодирующих областях либо в третьей букве вырожденного кодона, что позволяет различать материнскую и отцовскую хромосомы при семейном анализе в случае гетерозиготности по данному полиморфизму. С другой стороны, такие маркеры являются диаллельными, что приводит к невысокой гетерозиготности по данному локусу особей в популяции (не более 50%), что накладывает существенные ограничения на их использование (в связи с их низкой информативностью).
Результаты ПДРФ-анализа при прямой и косвенной ДНК-диагностике
а - прямая ДНК-диагностика (нуклеотидная замена в гене расположена в сайте узнавания рестриктазы R). Дорожка 1 - гомозигота по нормальному аллелю; дорожка 2 - гетерозигота по нормальному аллелю; дорожка 3 - гомозигота по аллелю с точковой заменой в сайте узнавания рестриктаы R (нуклеотидная замена привела к отсутствию сайту узнавания даны последовательности рестриктазой); б- косвенная ДНК-диагностика делеций (сайт рестрикции фланкирует область делеций): дорожка 1 - нормальная гомозигота; дорожка 2 - делеция в гетерозиготном состоянии (присутствует фрагмент другой длины), дорожка 3 - делеция в гомозиготном состоянии (отсутствует один из фрагментов, имеющихся в норме).
Анализ мини- и минросателлитиых маркеров. В настоящее время хорошо известно, что в некодирующих областях генома присутствуют так называемые тандемные повторы. Эти повторы представляют собой последовательности, состоящие из различного количества мономеров. Мономеры в свою очередь могут содержать от одного и до нескольких десятков нуклеотидов. Эффективность использования мини- и микросателлитных последовательностей (маркеров) в ДНК-диагностике обусловлена относительно равномерным распределением их на хромосомах и большим разнообразием. Полиморфизм мини- и микросателлитных повторов настолько высок, что на хромосомах разного происхождения (мать/отец), как правило, эти участки содержат разное количество мономеров, (т.е. отличаются по длине), что позволяет различать хромосомы при семейном анализе, прослеживая их передачу в поколениях, и при идентификации принадлежности биологического образца (например, пострадавший/подозреваемый). Информативность таких многоаллельных маркеров значительно выше (уровень гетерозиготности достигает 70—%), чем диаллельных (точковых замен), а характер расположения полос минисателитных ДНК на электрофореграмме («ДНК-отпечаток») индивидуален практически также как и отпечатки пальцев (вероятность идентичности двух индивидов в популяции составляет 10~5—КМ), что позволило дать название методу —геномная дактилоскопия (genetics fingeprinting).
Установление родства - анализ минисателлитных маркеров (диагностика отцовства)
а - принципиальная схема диагностики кровного родства в семье из трех, человек: 1 - предполагаемый отец; 2 - мать, 3 - ребенок; б - фрагмент электрофореграммы результатов ПДРФ-анализа при установлении биологического родства в семье из трех человек по двум STR-маркерам. L1 и L2 - аллельные лэддеры, по которым проводится определение длины фрагментов, соответственно, числа мономеров в повторе, AF - предполагаемый отец, С -ребенок; М - мать.
«Классический» метод геномной дактилоскопии представляет собой гибридизацию по Саузерну фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции и разделения в агарозном геле. В качестве зондов для гибридизации используется минисателлитная ДНК с длиной мономера от 9 до 40 п.н. и количеством его повтора от 10 до 30. Для установления или опровержения идентичности исследуемых образцов ДНК необходима последовательная гибридизация с 4—радиоактивно мечеными зондами. После каждой гибридизации на радиоавтографе визуализируют и сравнивают наборы различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитньм последовательностям образцов ДНК. К недостаткам данной методики идентификации биологического материала можно отнести значительную длительность исследования (от нескольких недель до нескольких месяцев) и необходимость достаточно большого количества ДНК.
В последние годы для обнаружения различных мини- и микросателлитных последовательностей стали использовать различные модификации полимеразной цепной реакции (мультиплексная ПЦР, ПЦР с использованием меченых нуклеотидов). На сегодняшний день наиболее эффективным (т.е. достоверным, не требующим большого количества биологического материала и достаточно быстрым) методом идентификации личности считается сравнительный электрофоретический анализ фрагментов ДНК, полученных в результате мультиплексной ПЦР STR (от англ. short tandem repeats) -последовательностей —тримерных и тетрамерных коротких тандемных повторов. При установлении биологического родства (диагностики отцовства) данным методом одна половина полос «ДНК-отпечатка» ребенка должна соответствовать таковым у отца, а другая —у матери.
Аналогичные методики используются и для ДНК-диагностики заболеваний. При прямой ДНК-диагностике, например, болезней, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов (STR) в регуляторных или транскрибируемых частях генов, выбор метода анализа количества повторов зависит от их протяженности: при числе повторов менее 200 для генотипирования аллелей используют электрофоретический анализ амплифицированных STR, в случаях больших размеров участка повторов используют метод блот-гибридизапии с соответствующими зондами.
Для косвенной диагностики наследственных заболеваний применяют анализ количества микросателлитных (динуклеотидных) повторов. Наиболее часто используют СА-повторы, локализованные в интронах исследуемых генов или в непосредственной близости от кодирующей части гена.
Анализ полиморфизма мини- и микросателлитных последовательностей незаменим и при картировании. Определив генотипы всех членов родословной, можно установить сцепление маркера с геном заболевания.
МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ
Наиболее эффективный способ выявления мутаций —секвенирование кДНК или отдельных экзонов. Довольно часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Для генов, имеющих сравнительно небольшие разметы (например, ген фактора IX свертывания крови, детерминирующий гемофилию В), метод прямого секвенирования иногда используют как основной метод сканирования мутации. Однако, несмотря на наличие методик (различные модификации ПЦР, использование мРНК для получения кДНК), переводящих секвенирование в разряд рутинных методов, секвенирование полноразмерной кДНК (т.е. всех экзонов) для выявления мутаций у отдельных индивидов остается трудоемкой, дорогой и требующей больших затрат времени процедурой. Поэтому на практике полученные путем амплификации или клонирования фрагменты ДНК предварительно тестируют на наличие мутаций более простыми методами, основанными на сравнении физико-химических характеристик мутантных и нормальных последовательностей. Однако точные молекулярные характеристики каждой мутации независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации, инсерции и др.), могут быть получены только путем прямого секвенирования.
ПЦР-АНАЛИЗ КАК МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ
С помощью ПЦР и последующего электрофореза продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном геле обнаруживают мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов. К таким мутациям относятся делеции и инсерции.
Делеции регистрируют по разнице в размерах и числе амплифицированных фрагментов на электрофореграмме нормального и мутантного образцов ДНК. При отсутствии делеции на электрофореграмме выявляются все амплифицированные фрагменты в виде соответствующих полос.
Небольшие по размеру делеции и инсерции лишь слегка меняют размеры амплифицированных фрагментов ДНК. Именно так была обнаружена в гене муковисцидоза делеция трех нуклеотидов —AF5O8.
Протяженные делеции в генах, находящихся в состоянии геми- или гомозиготности, выявляют при электрофорезе продуктов мультиплексной амплификации экзонов, наиболее подверженных такой мутации. Если в исследуемом образце ДНК какие-то экзоны делетированы, то на электрофореграмме соответствующие им полосы отсутствуют. Используя перекрывающиеся участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции и определить ее внутригенную локализацию. Этот метод применяют для выявления делеции в гене дистрофина.
Для обнаружения протяженных делеций, находящихся в гетерозиготном состоянии, используют мультиплексную ПЦР с обязательной количественной оценкой результатов амплификации (количественная ПЦР). Этот метод основан на амплификации кДНК, полученной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В качестве олигопраймеров для ПЦР используют последовательности из фланкирующих делецию экзонов гена. При амплификации будут получены лишь фрагменты мутантной молекулы кДНК, небольшие по размеру вследствие близкого расположения граничащих с делецией экзонов. Участок между фланкирующими делецию экзонами в нормальной молекуле кДНК может быть слишком велик для амплификации при выбранных условиях.
На практике проводят мультиплексную ПЦР с использованием набора олигопраймеров, обеспечивающего амплификацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
ВЫЯВЛЕНИЕ ТОЧКОВЫХ МУТАЦИЙ
Выявление мутаций, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, с помощью ПЦР-анализа невозможно: длина мутантного фрагмента ДНК остается прежней; нарушается лишь конформационная структура, а вместе с ней и некоторые физико-химические свойства молекулы ДНК. Для обнаружения мутаций в виде замен используют анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) и метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE). Еще два метода выявления точковых мутаций —гетеродуплексный анализ (НА) и химическое расщепление некомллементарных сайтов (CMC) —основаны на возникновении структурных нарушений в месте негомологичного спаривания при гибридизации нормальной и мутантной цепей ДНК. Все эти методы анализа амплифицированных продуктов (кроме CMC-метода) для точной идентификации точковых замен в обязательном порядке предполагают секвенирование.
Анализ коиформационного полиморфизма одноцеиочечной ДНК (SSCP —от англ. single strand conformation polymorphism). SSCP-анализ —наиболее часто используемый метод для выявления точковых замен внутри фрагмента ДНК (как правило, размером от 50 до 300 п.н.), полученного в результате ПЦР. Этот метод, предложенный в 1989 году, чрезвычайно эффективен, так как основан на регистрации различий электрофоретической подвижности одноцепочечной ДНК исследуемого и контрольного образцов одинаковых по длине, но различающихся по нуклеотидному составу. Различие в нуклеотидной последовательности обусловливает разницу вторичной конформации одноцепочечных фрагментов, образующихся при денатурации (химической или температурной). Именно от вторичной конформации зависит электрофоретическая подвижность молекул ДНК в полиакриламидном геле. На процесс конформации также влияют различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов. Эффективность выявления мутаций этим методом существенно зависит от размера анализируемого фрагмента: при его длине менее 200 п.н. она составляет 80—%, а при размере более 400 п.н. —около 50%. После обнаружения фрагмента с измененной электрофоретической подвижностью, как правило, проводится секвенирование первичной последовательности ДНК мутантного фрагмента для определения конкретной нуклеотидной замены.
Гетеродуплексный анализ (НА - от англ. heteroduplex analysis). Метод НА позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде (мутации в гомологичных генах различные по молекулярной природе и внутригенной локализации) или в гетерозиготном состоянии. Метод основан на выявлении различий электрофоретической подвижности гомодуплексов м гетеродуплексов, полученных при ПЦР. При амплификации небольших фрагментов генов гетерозигот и гомозиготных компаундов образуются три типа молекул ДНК: два типа гомодуплексов —из двух нормальных и из двух мутантных цепей, и молекулы, несущие мутацию лишь з одной из цепей (гетеродуплексы). Отличие электрофоретической подвижности гетеродуплексных молекул ДНК от обоих типов гомодуплексов обусловлено конформационными особенностями вследствие наличия мест несовпадения нуклеотидов. Вероятность идентификации точковых мутаций методом НА при длине фрагментов ДНК <300 п.н. составляет 90-98%.
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE —от англ. denaturation gradient gel electrophoresis). Метод DGGE —основан на различиях в условиях и характере денатурации нормальных и мутантных двухцепочечных фрагментов ДНК, выявляемых путем сравнения их электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов (мочевины и формальдегида). Скорость денатурации (или плавления) зависит от соотношения A—T/G—C пар в исследуемых фрагментах (G—С-связь более устойчива). При известной нуклеотидной последовательности для подбора условий плавления или определения скорости денатурации при выбранном градиенте концентрации применяют специальную компьютерную программу. Плавление двухцепочечных фрагментов ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления (температура, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью может соединиться или разойтись). После начала плавления продвижение двухцепочечного фрагмента ДНК в геле резко замедляется, вследствие изменения пространственной конфигурации молекулы, до момента полной денатурации. Скорость дальнейшего продвижения денатурированных фрагментов ДНК зависит от их нуклеотидного состава. Для предотвращения денатурации концов молекул ДНК до достижения оптимальной области плавления (обусловлено определенным нуклеотидным составом фрагмента ДНК), к концам молекул ДНК присоединяют так называемые зажимы (синтетические фрагменты из GC-нуклеотидов размером в несколько десятков п.н.). Использование GC-зажимов позволяет выявить все мутации, локализованные вблизи концов амплифицированных участков ДНК, и при длине цепи до 600 п.н. эффективность выявления мутаций методом DGGE достигает 95%. Достоинства метода: возможность его использования для анализа крупных амплифицированных фрагментов ДНК и высокая чувствительность (позволяет улавливать точковые мутации, возникшие даже в одной из 100 обработанных мутагеном клеток, что используется при анализе индуцированных мутаций). Чаще всего DGGE применяют для скрининга мутаций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК. Недостатки: техническая сложность получения равномерного градиента концентрации денатурирующего агента в полиакриламидном геле и высокая стоимость искусственно синтезированных GC-концов.
Принципы и результаты идентификации точковых мутаций различными методами
(По: В.Н. Горбунова, B.C. Баранов, 1997)
а - SSCP-анализ; б - НА-метод; в - DGGE-метод; г - СМС-метод
Дорожка 1 – обраэец ДНК нормальной гомозиготы; дорожка 2 - образец ДНК гетерозиготы по точковой мутации; дорожка 3 - образец ДНК гомозиготы по точковой мутации.
Химическое расщепление некочплементарных сайтов (CMC - от англ. chemical mismatch cleavage). Метод CMC основан на способности ряда химических агентов специфически разрывать цепь ДНК в месте локализации неспаренного основания: например, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, тимин - к действию осмия тетраоксида, а тимин и гуанин - к карбодиимиду. Тестируемые образцы ДНК (или РНК) смешивают с образцом радиоактивномеченного ДНК-зонда и создают условия для образования дуплексов (нагревание с целью полной денатурации и последующее охлаждение). При наличии мутации в тестируемых молекулах образуются гегеродуплексы с участками негомологичного спаривания, что и является мишенью для специфического химического агента. Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в данной точке и образованию двух коротких фрагментов, обнаруживаемых при электрофорезе и последующей радиоавтографии. При определении длины каждого фрагмента не составляет труда установить локализацию мутации. Эффективность выявления мутаций методом CMC при использовании радиоактивно меченых ДНК-зондов составляет 95-100%. Метод CMC пригоден для тестирования протяженных участков ДНК —до 2 т. п.н.. Кроме того, с помощью этого метода можно одновременно выявить и локализовать как несколько одинаковых мутаций, так и разных (при использовании нескольких ДНК-зондов —мультиплексный вариант метода) в одном фрагменте ДНК, что можно отнести к огромным преимуществам метода. Основной недостаток метода CMC —высокая токсичность используемых химических агентов (карбодиимид менее токсичен).
ДРУГИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ
Для первичной идентификации мутаций можно использовать и анализ аминокислотной последовательности продукта гена. Этот метод целесообразно применять для выявления редких (не мажорных) мутаций в протяженных генах с большим числом экзонов (ген миопатии Дюшенна, ген нейрофиброматоза 1). Метод включает выделение тотальной мРНК из лейкоцитов крови, обратную транскрипцию, амплификацию специфических экзонов кДНК, встраивание амплифицированной области ДНК в экспрессирующую систему и анализ образовавшегося продукта (выявление преципитации с антителами к домену белка).
Методы:
Необходимые условия:
1). Секвенирующий праймер –искусственно синтезированная олигонуклеотидная последовательность, комплементарная определённому участку исходной молекулы ДНК.
). Набор из четырёх дезоксинуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), один из которых изотопно меченный соответственно добавляемому одному из четырёх дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).
). ДНК-полимераза.
Этапы:
1). Гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером.
). Ферментативный синтез ДНК.
). Денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные, различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер).
). Электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках (по числу типов нуклеотидов).
). Анализ результатов на радиоавтографе.
На большинстве радиоавтографов можно чётко различить 250-350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н. Нуклеотидная последовательность на радиоавтографе считывается снизу вверх (самые длинные участки –наименее подвижные). По размеру синтезированных фрагментов может быть определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.
Модификации метода Сангера (для прочтения более длинных последовательностей):
Секвенирование крупных фрагментов ДНК (около 2000 п.н.): предварительно фрагмент клонируют в плазмидном векторе и строят его подробную рестрикционную карту; идентифицируют перекрывающиеся рестрикционные фрагменты длиной 100-150 п.н.; субклонируют каждый из рестрикционных фрагментов в ДНК фага М13 E.coli; секвенируют их; определяют последовательность исходного фрагмента ДНК.
Секвенирование фрагментов ДНК более 5000 п.н.: методы секвенирования двуцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Например, «праймер-опосредованная прогулка» («блуждающая затравка»): последовательное дидезоксисеквенирование по 250-350 п.н. Этапы (цепь циклов дидезоксисеквенирования и идентификации нуклеотидной последовательности): 1. Отжиг плазмидной ДНК, содержащей вставку, с праймером, комплементарным последовательности одной из цепей векторной ДНК; дидезоксисеквенирование и идентификация первых 250-350 п.н. вставки; 2. Синтез второго праймера, комплементарного сегменту вставки, который отстоит от места связывания первого праймера примерно на 300 п.н.; дидезоксисеквенирование и идентификация следующих 250-350 п.н. вставки. Далее цикл повторяется. Необходимое условие: длина праймера должна быть не менее 24 нуклеотидов, чтобы избежать спаривание праймера внутри вставки более одного раза.
Современные методы широкого использования:
Автоматическое ДНК-секвенирование с использованием меченных различными флуорохромами дидезоксинуклеотидов (электрофорез проводят на одной дорожке и на электрофореграмме каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы, которую сканируют в луче лазера, занося данные в компьютер). При помощи специального программного обеспечения данные обрабатываются, и выдаётся нуклеотидная последовательность.
Секвенирование путём гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов (олигонуклеотидной матрицей), включающим все возможные варианты перестановок из 4 стандартных нуклеотидов, определённой длинны. Наиболее удобными считаются наборы матриц (чипы) из октануклеотидов (число возможных комбинаций –). Секвенируемый фрагмент ДНК, меченный радиоактивным фосфором, гибридизуется только с комплементарными его участкам олигонуклеотидами. В результате определяется спектр октануклеотидов, составляющих исследуемый фрагмент ДНК. Локализация октамеров в изучаемом фрагменте устанавливается при помощи специального ПО.