Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Тема: Речовини, які визначають безпосередньо в біологічному матеріалі. Оксид вуглецю. Виявлення в крові та кількісне визначення.
Мета: Ознайомити студентів з фізико-хімічними властивостями оксиду вуглецю, з хімічними та фізико-хімічними методами визначення карбоксигемоглобіну в крові.
Актуальність: отруєння чадним газом має велике токсикологічне значення. Оксид вуглецю( в побуті чадний газ) утворюється при неповному згоранні горючих матеріалів. Часто трапляються випадки отруєння людей в житлових приміщеннях з пічним опаленням. Оксид вуглецю в крові утворює стійку сполуку карбоксигемоглобін. Тому актуальним постає питання навчити студентів методам якісного та кількісного визначення карбоксигемоглобіну в крові потерпілого.
План лекції
Тільки обмежену кількість токсичних речовин можна виявити і визначити кількісно безпосередньо в біологічному матеріалі. До таких речовин належить оксид вуглецю(ІІ).
1. Фізичні та хімічні властивості оксиду вуглецю, його токсикологічне значення та метаболізм.
Оксид вуглецю(ІІ) СО утворюється при неповному згоранні вуглеводів і вуглеводнів( дерева, вугілля, нафти) та деяких інших горючих матеріалів. Оксид вуглецю в побуті називають чадним газом, входить до складу вихлопних газів автомобілів, а також газів, які утворюються при неповному згорянні горючих матеріалів у несправних печах, на кухнях тощо. Відмічені випадки отруєнь оксидом вуглецю(ІІ) на пожежах, при вибухах, а також у погано вентильованихжитлових приміщеннях з пічним опаленням.
Оксид вуглецю(ІІ) проникає в кров через дихальні шляхи, а потім з гемоглобіном крові утворює досить стійку сполуку–карбоксигемонлобін(СОНb). Спорідненість гемоглобіну до оксиду вуглецю(ІІ) майже в 300 разів більша, ніж до кисню.
У крові людей, які отруїлися оксидом вуглецю(ІІ), містяться гемоглобін та його сполуки, до яких належать дезоксигемоглобін, оксигемоглобін, карбоксигемоглобін та деяка кількість мектгемоглобіну.
Дезоксигемоглобін (Нb) – це вільний гемоглобін, який не звязаний ні з киснем, ні з оксидом вуглецю(ІІ).
Оксигемоглобін (ОHb) – сполука гемоглобіну з киснем.
Карбоксигемоглобін(СОНb) – це сполука гемоглобіну з оксидом вуглецю(ІІ). Крім дезоксигемоглобіну, оксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну в крові людей, отруєних оксидом вуглецю(ІІ), може міститися певна кількість мектгемоглобіну(МtНb), який не сполучається з цим оксидом.
В дезоксигемоглобіні (Нb) – Fe++ – при несприятливих умовах(цукровий діабет, після інфаркту) в організмі Нb перетворюється в МtНb зі ступенем окислення не +2, а +3 – в метгемоглобіні(МtНb) – Fe+++.
У тканинах м’язів людей, які отруїлися окидом вуглецю(ІІ), можуть міститися дезоксиміоглобін (MHb), оксиміоглобін (OMHb), карбоксиміоглобін (COMHb).
Виявлення певних кількостей карбоксигемоглобіну в крові є доказом отруєння оксидом вуглецю(ІІ). Для виявлення та кількісного визначення карбоксигемоглобіну в крові застосовують спектроскопічні, спектрофотометричні, фотоколориметричні, газохроматографічні, хімічні та деякі інші методи. Газохроматографічні і спектрофотометричні методи використовують переважно для кількісного визначення карбоксигемоглобіну в крові.
2. Спектроскопічний метод виявлення оксиду вуглецю(ІІ) в крові.
У крові людей, отруєних оксидом вуглецю(ІІ), гемоглобін не повністю перетворюється на карбоксигемоглобін. Смерть настає значно раніше, ніж відбувається повне перетворення гемоглобіну на карбоксигемоглобін.
Карбоксигемоглобін можна виявити в крові за допомогою спектроскопа– приладу для візуального виявлення багатьох речовин, у тому числі й карбоксигемоглобіну. За допомогою спектроскопа в спектрі крові спостерігаються лінії та смуги, які дають змогу зробити висновок про наявність або відсутність карбоксигемоглобіну. Досліджувану кров розбавлюють водою доти, доки розбавлений розчин крові не набуде світло-рожевого кольору. При спектроскопічному дослідженні цього розчину в його спектрі чітко видно відповідні спектральні лінії та смуги.
Спектр оксигемоглобіну ОHb крові має дві смуги поглинання при довжинах хвиль 536-556нм і 577-589нм. Спектр карбоксигемоглобіну СОНb також має дві смуги поглинання при довжинах хвиль 523-536нм і 564-579нм.
Після додавання до розчину крові, свіжовиготовленого розчину сульфіду амонію (NH4)2S або інших відновників(натрій дитионіт Na2S2O42H2O) оксигемоглобін ОHb перетворюється на дезоксигемоглобін Нb, у спектрі якого спостерігається одна широка смуга поглинання при 543-596нм.
Карбоксигемоглобін COHb не відновлюється сульфідом амонію та іншими відновниками. Тому після додавання відновників до крові, яка містить карбоксигемоглобін, смуги поглинання його не зникають і не змінюються.
Отже, після додавання розчину (NH4)2S або дитионіту натрію до крові, яка містить окси- і карбоксигемоглобін, зберігаються дві смуги поглинання карбоксигемоглобіну, але зникають смуги поглинання оксигемоглобіну. Замість них виникає широка смуга поглинання, властива дезоксигемоглобіну. За наявністю відповідних смуг поглинання в спектрі крові роблять висновок про можливе отруєння оксидом вуглецю(ІІ). Рекомендується застосовувати спектроскопічний метод при дослідженні крові, яка містить 10–30% карбоксигемоглобіну. При менших кількостях карбоксигемоглобіну в крові цей метод не застосовується.
3. Хімічні методи виявлення оксиду вуглецю(ІІ) в крові.
Хімічні методи виявлення оксиду вуглецю(ІІ) в крові базуються на порівнянні забарвлень нормальної крові і крові, яка містить карбоксигемоглобін, після додавання до цих проб крові відповідних реактивів. Кров, яка містить карбоксигемоглобін, після додавання зазначених нижче реактивів не змінює (або майже не змінює) забарвлення, а кров, що не містить карбоксигемоглобіну, під впливом цих реактивів значно змінює своє забарвлення.
При виконанні всіх описаних нижче реакцій на наявність карбоксигемоглобіну паралельно проводять два досліди. Для виконання першого досліду беруть нормальну кров, яка на містить карбоксигемоглобін, адля другого досліду беруть кров людей, отруєних оксидом вуглецю(ІІ). До обох проб крові додають однакові об’єми реактивів і спостерігають зміни, які відбулись в обох пробах під впливом добавлених реактивів.
У літературі описано ще кілька реакцій. Висновок про наявність карбоксигемоглобіну в крові не повинен базуватися на результаті однієї з перелічених реакцій. Про наявність карбоксигемоглобіну в крові можна робити висновок тільки на основі результатів більшості з них.
Слід мати на увазі, що перелічені вище реактиви дають реакції з кров’ю, яка не містить карбоксигемоглобіну.
Кров, яка містить карбоксигемоглобін, практично не змінюється під впливом цих реактивів.
При отруєнні оксидом вуглецю(ІІ) легкого ступеня в крові міститься лише незначна кількість карбоксигемоглобіну. Відносно більша кількість гемоглобіну в крові при легкому отруєнні перебуватиме у вигляді дезокси- і оксигемоглобіну, які реагують з переліченими вище реактивами. Забарвлення, яке виникає під час взаємодії великих кількостей дезокси- і оксигемоглобіну з відповідними реактивами, маскуватиме забарвлення незначної кількості продуктів взаємодії карбоксигемоглобіну з тими самими реактивами.
У зв’язку з цим описані вище реакції придатні для виявлення відносно великих кількостей карбоксигемоглобіну в крові і не придатні для виявлення малих кількостей карбоксигемоглобіну при легкому ступені отруєння оксидом вуглецю(ІІ).
4. Кількісне визначення оксиду вуглецю(ІІ) в крові.
Вміст оксиду вуглецю(ІІ) в крові визначають за кількістю карбоксигемоглобіну. З цією метою був використаний СПФ-метод, який запропонували Крамаренко В.П., Собчук Б.А., Гладишевська Т.М. в 1974 році.
Відомо, що оксид вуглецю(ІІ), потрапляючи в організм, сполучається з дезокси- і оксигемоглобіном з утворенням карбоксигемоглобіну.
В організмі метгемоглобін не сполучається з оксидом вуглецю(ІІ), але в лабораторних умовах при дії дитіоніту Na – Na2S2O3·2H2O (гідросульфіт натрію) метгемоглобін можна перевести в дезоксигемоглобін.
Усі форми гемоглобіну (дезоксигемоглобін, оксигемоглобін, карбоксигемоглобін, метгемоглобін) можна виявити за їхніми спектрами поглинання у видимій ділянці в інтервалі довжин хвиль від 450 до 620 нм.
Спектри поглинання оксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну мало відрізняється один від одного.
У зв’язку з цим спектральні характеристики оксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну не використовуються. Значно відрізняються один від одного спектри поглинання дезоксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну. Тому ці спектри і використовують при кількісному визначенні карбоксигемоглобіну в крові.
Для кількісного СПФ-го визначення СО виготовляють ряд розчинів:
Розчин А – розчин досліджуваної крові.
Розчин Б – розчин крові, в якому знаходиться карбоксигемоглобін і дезоксигемоглобін.
Розчин В – розчин крові, в якому всі форми гемоглобіну(дезоксигемоглобін Hb, оксигемоглобін OHb, метгемоглобін MtHb– повністю переведені в карбоксигемоглобін).
Дезоксигемоглобін має максимум поглинання при 557 нм. Карбоксигемоглобін має 2 максимуми поглинання при 541 і 571 нм. При накладанні спектральних кривих карбоксигемоглобіну і дезоксигемоглобіну на один графік спостерігається поява трьох ізобестичних точок при λ – 550, 565, 580 нм.
У цих ізобестичних точках(а, б, в), які є точками перетину спектральних кривих дезоксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну, оптичні густини обох зазначених форм гемоглобіну однакові (рис.1).
Приступаючи до вимірювання оптичної густини досліджуваних розчинів крові, потрібно знайти довжину хвилі, при якій біля першого максимуму поглинання карбоксигемоглобіну(541нм) віддаль між його спектральною кривою і спектральною кривою дезоксигемоглобіну є найбільшою. На основі спектральних даних встановлена довжина хвилі 538нм.
Похибка визначення COHb в межах концентрацій від 3% до 20% становить ±3%. При концентраціях понад 20% похибка зростає до ±5%.
Рис 1. Спектри поглинання карбоксигемоглобіну(1) і дезоксигемоглобіну(2)
На основі результатів вимірювання оптичної густини розчинів крові Б і В обчислюють вміст карбоксигемоглобіну у відсотках (Р) у досліджуваній крові, користуючись формулою:
Залежність симптомів отруєння від кількості карбоксигемоглобіну в крові
|
Співвідношення карбоксигемоглобіну і загальної кількості гемоглобіну в крові, % |
Симптоми отруєння |
|
0-10 |
Ніяких симптомів |
|
10-20 |
Легкий головний біль, розширення кровоносних судин шкіри |
|
20-30 |
Головний біль, відчуття пульсу в скронях |
|
30-40 |
Сильний головний біль, слабість, запаморочення, нудота, блювання, колапс |
|
40-50 |
Ті самі симптоми, більш ймовірний колапс, почастішання дихання і пульсу |
|
50-60 |
Почастішання дихання і пульсу, кома, яка переривається тимчасовими судорогами |
|
60-70 |
Ті самі симптоми, послаблення дихання і серцевої діяльності, може настати смерть |
|
70-80 |
Слабкий пульс, сповільнене дихання, зупинка дихання, смерть |
Смертельна концентрація карбоксигемоглобіну в крові становить у середньому близько 60%, але може коливатися від 40 до 80%. Ці коливання зумовлені як впливом зовнішніх умов, так і індивідуальними особливостями організму.
PAGE 4