Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Національна АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
іНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.Палладіна
Скоморовська-Прокволіт
Олена Вікторівна
УДК 577.112:577.151.6
Ефекторна дія фібриногену/фібрину та їх фрагментів
на властивості Glu-плазміногену
03.00.04 - Біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття
наукового ступеня кандидата
біологічних наук
Київ 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор
Кудінов Станіслав Олександрович,
Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України,
завідувач відділу хімії та біохімії ферментів.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Веремеєнко Кузьма Микитович,
Київський науково-дослідний інститут отоларингології ім.О.С.Коломійченка МОЗ України,
головний науковий співробітник;
доктор біологічних наук, професор
Кібірєв Володимир Костянтинович,
Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу хімії білків.
Провідна установа – Київський універститет імені Тараса Шевченка
(кафедра біохімїї) Міносвіти України, м.Київ.
Захист відбудеться “ 27 ” вересня 1999 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий “26” серпня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук кірсенко о.в.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Ферментативне розщеплення фібринового згустка – фібриноліз – є одним з механізмів, що забезпечують підтримання рідкого стану крові в організмі. У нормі між фібринолітичою системою та системою зсідання крові існує рівновага. З її порушенням безпосередньо пов'язані різноманітні серцево-судинні захворювання, тромбози та геморагії. Фібринолітична система включає неактивний профермент плазміноген, який активується до плазміну (КФ 3.4.21.7), здатного гідролізувати фібрин до розчинних продуктів. Функцію активації плазміногену за фізіологічних умов виконують тканинний активатор плазміногену (t-PA) та активатор урокіназного типу. За існуючою теорією, основою молекулярного механізму фібринолізу є утворення потрійного комплексу: тканинний активатор плазміногену–плазміноген–фібрин. На фібрині відбуваються ключові процеси фібринолізу. Згодом активний фермент вивільняється у кровоток, де швидко і необоротно інактивується природними інгібіторами – 2-антиплазміном та 2-макроглобуліном. Існуюча молекулярна модель фібринолізу базується здебільшого на білок-білкових взаємодіях, тобто необхідна сорбція плазміногену на фібрині та, як наслідок цього, активація проферменту.
Уже понад тридцять років досліджують конформаційні зміни, які відбуваються у складноорганізованій молекулі плазміногену при взаємодії з низькомолекулярними лігандами, що виявляється в розкооперуванні внутрішньомолекулярних зв’язків, притаманних молекулі плазміногену. Такі конформаційні переходи важливі для виконання проферментом його основної фізіологічної функції – активації до ферменту, основна роль якого полягає в руйнуванні фібринового згустка в кровотоці та внутрішньосудинних відкладень фібрину. Останнім часом встановлено, що конформація нативного плазміногену змінюється при його взаємодії з деякими білками. Наприклад, моноклональні антиіла до окремих кринглових ділянок плазміногену руйнують існуючі в молекулі внутрішньомолекулярні взаємодії, що також приводить до конформаційних перебудов у молекулі проферменту. Нативна (Glu-плазміноген) та частково гід-ролізована (Lys-плазміноген) форми проферменту сильно різняться здатністю взаємодіяти з фізіологічним лігандом – фібрином – та чутливістю до дії природних активаторів плазміногену. Після нетривалого плазмінового гідролізу фібрину різко збільшується спорідненість проферменту до нього, що приводить до прискорення активації плазміногену тканинним активатором.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є продовженням робіт по вивченню молекулярного механізму фібринолізу, які проводились у відділі хімії та біохімії ферментів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України протягом 1986 – 96 рр. у рамках науково-дослідної теми N17 за проблемою “Біохімія тварин і людини” (шифри 2.28.4.8 та2.28.2.6). №№ держ. реєстрації 01830064150, 01880076299, 01930012659.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчити ефекторну дію фібрин(оген)у, частково гідролізованого фібрин(оген)у та їх фрагментів на зміну властивостей Glu-плазміногену.
Відповідно до основної мети в роботі вирішувались такі завдання:
Порівняти зв'язування Glu- та Lys- форм плазміногену з нативним та частково деградованим фібрином.
Одержати та охарактеризувати препарати фібрин-мономера різного ступеня деградації.
Дослідити взаємодію Glu-плазміногену з Е-фрагментом фібриногену.
Порівняти взаємодію двох форм плазміногену з фрагментами фібрин(оген)у, які містять D-домен.
Вивчити вплив часткової деградації фібрину на швидкість гідролізу фібрину плазміном та Glu- або Lys-плазміногеном при їхній активації t-PA.
Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що взаємодія Glu- та Lys-плазміногену з нативним фібрином здійснюється неоднаковими ділянками проферменту. Так, сорбція Glu-плазміногену на нативному фібрині забезпечується низькоафінною ділянкою, а частково деградованої форми проферменту – ділянками як високої, так і слабшої спорідненості до лізину та його аналогів. Вперше показано, що при взаємодії Glu-плазміногену з частково деградованим фібрином у молекулі проферменту відбуваються конформаційні зміни, в результаті яких до білок-білкових взаємодій залучаються високоафінні зв'язуючі ділянки нативної форми проферменту. Саме утворення Х-фрагментів спричиняє перехід Glu-плазміногену до відкритої конформації, притаманної Lys-плазміногену.
При дослідженні взаємодії нативного плазміногену з Е-фрагментом фібриногену спостерігалося перетворення проферменту на частково деградовану форму. Вперше було встановлено, що як комплекс плазміноген-Е-фрагмент, так і профермент після дисоціації комплексу виявляють протеолітичну активність. Тобто Е-фрагмент фібрин(оген)у індукує в нативному плазміногені формування активного центру, яке є результатом конформаційних перебудов у молекулі проферменту. Феномен конформаційної активації плазміногену при взаємодії з пізніми продуктами деградації фібрин(оген)у може бути одним з шляхів регуляції фібринолітичного процесу.
Вперше показано, що іммобілізований DH-димер фібрину утворює комплекс з Glu-плазміногеном. Розраховано константи дисоціації Glu- та Lys-плазміногену з DH-димером, які становлять 3,210-6 М та 3,710-6 М відповідно.
Досліджено ефекторні властивості нативного і частково гідролізованого desAABB-фібрину щодо плазміну. Показано, що на початкових етапах гідролізу при відщепленні С-доменів окремих молекул фібрин-мономера збільшується спорідненість плазміну до фібрину. Цей факт дозволяє припустити, що з появою Х-полімерів протеолітична дія плазміну щодо фібрину так само, як і при взаємодії з фібриногеном, регулюється додатковими лізин-зв'язуючими ділянками.
Теоретичне та практичне значення роботи. Початкові етапи гідролізу полімерного фібрину, коли відбувається відщеплення С-доменів окремих фібрин-мономерних одиниць, викликають конформаційні перебудови нативного проферменту, внаслідок чого він переходить до відкритої конформації Lys-плазміногену і стає доступнішим для активації. Одержані результати щодо ефекторної дії фібриногену/фібрину та їх похідних на властивості Glu-плазміногену поглиблюють наші уявлення про молекулярний механізм фібринолізу. Проведені дослідження здебільшого носять теоретичний характер, але вони можуть стати основою для розробки методів контролю за тромболітичною терапією та станом системи гемостазу при серцево-судинних захворюваннях.
Особистий внесок дисертаната. Експериментальну частину роботи, добір та опрацювання літератури зроблено автором особисто. Аналіз та обговорення одержаних результатів проведено спільно з науковим керівником д.б.н. Кудіновим С.О. та керівником групи к.б.н. Гриненко Т.В. Друковані праці підготовлені за безпосередньої участі автора.
Апробація роботи. Основні результати та окремі положення дисертаційної роботи були викладені на конкурсі молодих учених Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, 1987), на VI Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992), на III симпозіумі “Химия протеолитических ферментов” (Москва, 1993), на XV міжнародному конгресі “Thrombosis and Haemostasis” (Єрусалим, 1995), на засіданнях відділу хімії та біохімії ферментів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, 1996), відділу структури та функції білка Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, 1999), на науковому семінарі Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, 1999).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті та тези 2 доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинопису та складається з розділів “вступ”, “огляд літератури”, “матеріали та методи досліджень”, “результати досліджень та їх обговорення”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, що налічує 214 одиниць. Робота ілюстрована 31 рисунком та 5 таблицями.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з п’яти розділів, в яких висвітлені питання структури та конформаційного стану молекули плазмін(оген)у, структури його зв’язуючих ділянок, структури молекули фібриногену, природи білок-білкових взаємодій між Glu- та Lys-плазміногеном та фібрин(оген)ом та їх протеолітичними фрагментами.
Матеріали та методи дослідженЬ
Glu-плазміноген людини виділяли з плазми донорської крові шляхом афінної хроматографії на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970) з наступною гель-фільтрацією на сефадексі G-150.
Lys-плазміноген отримували з фракції донорської крові III2,3 за Коном в такий саме спосіб, що і Glu-плазміноген (Deutch, Mertz, 1970), не додаючи інгібітора. Гель-фільтрацію проводили при кімнатній температурі.
Плазмін одержували, активуючи Lys-плазміноген стрептокіназою ("Streptase" Швейцарія) (Wiman, 1977).
Протеолітичну активність плазміну та потенційну активність плазміногену визначали за їх здатністю гідролізувати казеїн (за Гамерстеном) (Robbins, Summaria, 1979).
Фрагмент плазміногену К1-3 отримували шляхом обмеженого протеолізу Lys-плазміногену свиною панкреатичною еластазою (Sottrup-Jensen et al., 1978).
Введення радіоактивної мітки 125І до препарату Glu-плазміногену проводили за допомогою хлораміну Т (McConahey, Dixon, 1980). Питома радіоактивність препарату становила 4,68 МБк/мг. Мічений білок не відрізнявся від вихідного ні казеїнолітичною активністю, ні електрофоретичною рухомістю.
Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові бика у присутності соєвого інгібітора трипсину шляхом висолювання сульфатом натрію (Варецька та ін., 1961) з додатковим очищенням від домішок плазміногену (Mosseson, 1962). Вміст фібриногену, що зсідався під дією тромбіну, становив 95-98%.
Фрагменти фібриногену DH та Е отримували з плазмінового гідролізату фібриногену, фрагмент Dla – пепсинолізом DH-фрагмента (Privalov, Medved’, 1982; Medved’ et al., 1983, 1986, 1988).
Частково деградований фібрин(оген) одержували за допомогою обмеженого плазмінолізу в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4 протягом 30 хв при 20°С. реакцію зупиняли додаванням пара-нітрофенілгуанідинбензойної та 6-аміногексанової кислот, кінцеві концентрації яких становили 10-4 та 10-1 М відповідно. Ступінь гідролізу фібриногену (у відсотках до фібриногену, який містився в пробі) визначали за кількістю білка, який лишився в розчині після утворення згустка та його видалення. Склад продуктів фібринолізу визначали за допомогою електрофорезу в ПААГ за присутності ДС-натрію (Weber, 1969) розчинених в оцтовій кислоті фібринових згустків, що утворені з частково гідролізованого фібриногену.
Одержання desAABB-фібрину проводили в 0,15 М хлористому натрії при 37С за присутності пара-хлормеркурійбензойної кислоти. Одержаний в такий спосіб фібрин-мономер був вільний від плазмін(оген)у, оскільки реакцію зсідання проводили за наявності 100 mM -амінокапронової кислоти (Posdnjakova et al., 1979).
DH-димер виділяли з плазмінових гідролізатів фібрину. Одержаний D-димер був вільний від домішок D- та Е-фрагментів (Бєліцер та ін., 1988).
Електрофорез в поліакриламідному гелі (ПААГ) проводили за кислих значень pH в системі сечовина/оцтова кислота для визначення форми одержаного плазміногену (Panyim, Chalkley, 1969) та за присутності ДС-натрію для визначення чистоти фібриногену, фібрину, їх фрагментів, плазміногену та його фрагментів (Weber, Osborn, 1969; McDonagh et al., 1972; Cummins, Perry, 1973).
Швидкість руйнування фібринового згустка визначали турбідиметричним методом (Bouvier et al., 1975).
Вивчення взаємодії Glu-плазміногену з іммобілізованими Е-, DH-, DL-фрагментами та DH-димером проводили методом афінної хроматографії при 20С.
Дослідження взаємодії плазміногену з фібрином проводили в процесі утворення фібрину, додаючи до реакційного середовища 125I-Glu-плазміноген. Для врахування неспецифічної сорбції до контрольних проб додавали лізин до кінцевої концентрації 0,05 М. Через 30 хв інкубації при 37°С фібриновий згусток, що утворився, вимотували скляними паличками. Після цього кількість білка в розчині визначали спектрофотометричним методом або за радіоактивністю на лічильнику Beckman Gamma 5500 (США). Кількість плазміногену, що зв'язався з фібриновим згустком, розраховували за різницею між кількістю білка або радіоактивністю, що вносилися до проби та лишилися в розчині після видалення фібрину та неспецифічно сорбованого плазміногену.
Зв’язування Glu- та Lys-плазміногену з частково гідролізованим фібрином та вплив фрагментів плазміногену на взаємодію плазміногену з фібрином проводили за таких самих умов та співвідношень взаємодіючих білків, як і з нативним фібрином, однак у проби, що містили профермент, вносили фібрин-мономер, отриманий з частково гідролізованого фібриногену.
Кількісна характеристика переходу 125I-Glu-плазміногену до Lys-форми була одержана за допомогою електрофоретичного аналізу білкових фракцій, які елюювали -амінокапроновою кислотою з Е-фрагмент-агарози, або розчинних комплексів 125I-Glu-плазміногену з Е-фрагментом. Після фарбування та висушення гелів з них вирізали білкові зони, радіоактивність яких вимірювали на лічильнику Beckman Gamma 5500 (США).
Активність комплексу Glu-плазміногену з розчинним Е-фрагментом визначали за методом фібринових платівок та за швидкістю гідролізу H-D-Val-L-Leu-L-Lys-пара-нітроаніліду (S-2251) при 37°С.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Взаємодія Glu- та Lys-плазміногену з нативним фібрином
Рис. 1.2 Вплив -АКК на зв’язування Glu- (1) та Lys- (2) плазміногену з desAABB-фібрином, утвореним з част-
ково гідролізованого фібриногену, та Glu- плазміно-
гену(3) з нативним фібрином.
Зв’язування плазміногену на полімерному фібрині вивчали в процесі полімеризації останнього. При всіх досліджених співвідношеннях білків кількість сорбованого Lys-плазміногену була майже в 7 разів більша за кількість Glu-плазміногену. При розрахунку максимальної кількості плазміногену, що може зв’язатися з 1 молем фібрин-мономера за умов експерименту, встановлено, що ця величина дорівнює близько 0,5 та 0,08 моля для Lys- та Glu-форми відповідно (рис.1.1).
Рис. 1.1 Залежність кількості зв’яза-ного Glu- (1) та Lys- (2) плазміноге-ну від кількості внесеного плазміногену.
Як видно з результатів, поданих на рис.1.2, за присутності -амінокапронової кислоти в концентраціях, які насичують високоафінну ділянку, зменшується кількість сорбованого Lys-плазміногену, а кількість сорбованого за тих самих умов нативного проферменту не змінюється. Зменшення сорбції Lys-форми на 50% спостерігалось при концентрації інгібітора 810-5 М, що узгоджується з даними (Suenson, Thorsen, 1987), отриманими при використанні транексамової кислоти. Це дозволяє стверджувати, що взаємодія двох форм проферменту з нативним фібрином опосередкована зв'язуючими ділянками різних типів. Сорбція Lys-плазміногену відбувається за рахунок високоафінної ділянки, а Glu-плазміногену – ділянки низької спорідненості.
Зa допомогою методу афінної хроматографії показано, що за наявності фрагмента К1-3 плазміногену, який містить високоафінну ділянку, не змінюється кількість Glu-плазміногену, який сорбується у процесі полімеризації на нативному фібрині. Що ж до впливу К1-3 на взаємодію Lys-плазміногену з нативним фібрином, то встановлено інгібуючий ефект фрагмента, який містить високоафінну ділянку (Lucas, 1983). Найвирогідніше це пов'язано з тим, що Glu-плазміноген знаходиться в закритій конформації, яка не дозволяє йому сорбуватися на нативному фібрині за допомогою ділянки, розташованої в області К1-3. Отримані результати дозволяють стверджувати, що низька спорідненість нативного плазміногену до фібрину, можливо, опосередкована взаємодією однієї з тих слабких зв'язуючих ділянок, яка не виявляє спорідненості до аргініну (Verevka et al., 1986).
Тож, ураховуючи отримані результати та дані літератури щодо нечутливості зв’язуючої ділянки К4 до аргініну, можна стверджувати, що взаємодія Lys-плазміногену з фібрином опосередкована, окрім ділянки високої спорідненості (лізин-зв'язуюча ділянка, розташована в кринглі К1), ще й іншими ділянками слабшої спорідненості до аналогів лізину, тоді як з боку Glu-плазміногену в комплексоутворенні, ймовірно, бере участь низькоафінна ділянка, розташована в кринглі К4.
2. Взаємодія Glu- та Lys-плазміногену з частково гідролізованим фібрином
Зв'язування плазміногену з desААВВ-фібрином досліджували в системі з полімерним фібрином, який утворювали з частково деградованого фібриногену різного ступеня гідролізу. Кількість сорбованого Lys-плазміногену зростала на 5% при збільшенні ступеня гідролізованості вихідного фібриногену, з якого утворювали desAABB-фібрин (рис.2.1). Зовсім іншою за умов експерименту була поведінка Glu-плазміногену. Навіть при найменшому ступені гідролізу фібриногену (не вище 0,5%) кількість сорбованого білка збільшувалася в кілька разів та досягала максимального значення, коли ступінь деградації фібриногену становив 1-2%, і не змінювалась при подальшій деградації фібриногену (рис.2.1).
|
Рис. 2.1 Залежність кількості зв’язано- го Glu- (1) та Lys- (2) плазміногену від ступеня гідролізованості фібриногену. |
Рис. 2.2 Вплив кринглу К1-3 на зв'язування Glu-плазміногену з нативним (1) та desAABB-фібрином (2), утвореним з частково гідролізованого фібриногену |
При досліджених співвідношеннях взаємодіючих білків кількість зв'язаного з частково гідролізованим фібрином нативного проферменту збільшува-лась майже в 10 разів і сягала величини сорбції Lys-плазміногену на частково деградованому фібрині. Залежність кількості зв'язаного Glu-плазміногену від ступеня гідролізу вихідного фібриногену має експоненційний, а не лінійний характер. Ми припускаємо, що саме утворення Х1-фрагмента приводить до змін у здатності Glu-плазміногену взаємодіяти з фібрином.
Фрагмент К1-3 сильно пригнічує зв'язування Glu-форми з частково деградованим фібрином (при 50-разовому молярному надлишку К1-3 порівняно до проферменту кількість сорбованого плазміногену зменшується на 60%), а сорбція Glu-плазміногену на нативному фібрині в присутності К1-3 лишається незмінною (рис.2.2).
Зв'язування як Glu-, так і Lys-форми плазміногену з частково гідролізо-ваним desAABB-фібрином за наявності -амінокапронової кислоти пригнічувалось в концентраціях, які насичують високоафінні ділянки (рис.1.2).
Одержані результати дозволяють стверджувати: при взаємодії Glu-плазміногену з частково деградованим фібрином у молекулі проферменту відбуваються такі конформаційні зміни, за яких до білок-білкових взаємодій залучаються високоафінні зв'язуючі ділянки нативної форми проферменту. Саме утворення Х-фрагментів приводить до переходу Glu-плазміногену у відкриту конформацію, притаманну Lys-формі.
3. Протеолітична активність Glu-плазміногену при його взаємодії з
Е-фрагментом
Glu-плазміноген виявляє слабку спорідненість до DL-фрагмента, яка значно збільшується після попередньої взаємодії нативного проферменту з іммобілізованим Е-фрагментом. Для з'ясування причин, які викликають зміни властивостей проферменту, нами був проведений електрофоретичний аналіз плазміногену після дисоціації комплексу з іммобілізованим Е-фрагментом. Наведені на рис. 3.1 дані свідчать, що при взаємодії 125І-Glu-плазміногену з Е-фрагментом поступово з'являється Lys-форма. Так, протягом перших п’яти хвилин Glu-плазміноген зберігає свою початкову, недеградовану форму, а при збільшенні часу інкубації комплексу нативний профермент перетворюється у частково деградовану, позбавлену NH2-кінцевого пептиду, форму – Lys-плазміноген. Через 2 год лише близько 30% Glu-плазміногену вимивається з Е-фрагмент-агарози у початковому вигляді, а решта білка являє собою Lys-плазміноген і суміш низькомолекулярних мічених пептидів. Залежний від часу перехід Glu-плазміногену в Lys-форму спостерігався не тільки при взаємодії проферменту з іммобілізованим Е-фрагментом, а й при інкубації протягом кількох годин еквімолярної суміші цих білків в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4 при 37С. На електрофореграмі після відновлення 2-меркаптоетанолом видно зменшення зони плазміногену і появу радіоактивних зон з нижчою молекулярною масою, які являють собою важкий і легкий ланцюги плазміну або продукти протеолізу плазміногену (рис.3.2).
Рис. 3.1 Залежність переходу 125І-Glu -плазміногену в Lys-форму від часу
існування комплексу з іммобілізованим Е-фрагментом.
А – електрофоретичний аналіз у 11% ПААГ в системі сечовина/оцтова кислота, рН 3,2: вихідного Glu-плазміногену (а) та проферменту, який елююється 0,1 М -АКК через 5, 8, 10, 15, 30, 60 та 120 хв (б, в, г, д, е, ж, з, відповідно), контрольний зразок - Lys-плазміноген (к);
Б – розподіл радіоактивності електрофоретичних зон: 1- Lys-плазміноген;
2 - Glu-плазміноген; 3 - низькомолекулярні пептиди.
Рис. 3.2 Електрофореграма відновлених 2-меркаптоетанолом зразків 125І-Glu-плазміногену та його комплексів з розчинним Е-фрагментом:
1 – вихідний Glu-плазміноген;
2-5 – комплекси Glu-плазміногену з Е-фрагментом, які інкубували при 37С протягом 1, 2, 3 та 4 год.
Розподіл проводили у 10% DS-Na ПААГ.
Одержані результати дозволяють припустити, що Е-фрагмент при утвренні комплексу з Glu-плазміногеном викликає в ньому конформаційні перебудови, внаслідок яких з'являється активний центр.
Як комплекс Glu-плазміногену з розчинним Е-фрагментом, так і плазміноген, який елюювали з Е-фрагмент-агарози 0,1 М -амінокапроновою кислотою, виявляє фібринолітичну активність (табл. 3.1).
Ймовірні домішки активаторів плазміногену в препаратах плазміногену та Е-фрагмента перевіряли методом фібринових платівок і визначенням плазмінової активності за гідролізом хромогенного субстрату, які дозволяють зафіксувати наномолярні концентрації ферменту в розчині. Жодним з названих методів у препаратах Glu-плазміногену і Е-фрагмента активності виявлено не було. На непрогрітих фібринових платівках ні Glu-плазміноген, ні Е-фрагмент не дали зон лізису. Тобто білкові препарати, які використовувалися в роботі, були вільними від домішок Таблиця 3.1
Фібринолітична активність Glu-плазміногену, що виникає при його взаємодії з
Е-фрагментом фібриногену, M±m
|
Білок, який наносили на фібринові платівки, 10 мкг 10 мкг |
Площа зон лізису, мм2 |
|
Glu-плазміноген |
0 |
|
Е-фрагмент |
0 |
|
Плазмін |
113±4 |
|
Комплекс Glu-плазміногену (10 мкг) з Е-фрагментом (5 мкг) |
34±3 |
|
Плазміноген, що вимивається з Е-фрагмент-агарози* |
25±5 |
Час взаємодії Glu-плазміногену з іммобілізованим Е-фрагментом становив 2 год при кімнатній температурі. Після елюції 0,1 М -амінокапроновою кислотою білок піддавали гель-фільтрації на сефадексі G-50.
t-PA. Методом електрофорезу в ПААГ у системі сечовина/ оцтова кислота після інкубації 125І-Glu-плазміногену протягом 4 год за наявності та без -амінокапронової кислоти при 37С в 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 7,4 було встановлено, що плазміноген зберігає свою нативну, неде-градовану форму.
Формування активного центру в комплексі підтверджується тим, що за наявності діізопропілфторфосфату (ДФФ) не було відмічено перетворення Glu-плазміногену на Lys-форму. Під час інкубації еквімолярної суміші білків за наявності інгібітора (концентрація якого становить 10-2 М) протягом 2 год при 37С профермент зберігає нативну, недеградовану форму, попередня ж обробка інгібітором індивідуальних білків з наступним його відокремленням не впливала на здатність комплексу проявляти протеолітичну активність (рис.3.3).
Утворення комплексу Glu-плазміногену з Е-фрагментом забезпечується комплементарними центрами кожної з молекул, тобто активність комплексу залежить від насиченості ділянок зв'язування як плазміногеном, так і Е-фрагментом. Максимальна активність комплексу відповідала 5-10-разовому надлишку одного з білків порівняно до іншого. Відомо, що Glu-плазміноген взаємодіє з Е- фрагментом двома центрами різної спорідненості з константами дисоціації, які
|
Рис. 3.3 Інгібування протеолітичної активності комплексу Glu-плазміногену з розчинним Е-фрагментом ДФФ: 1 - контрольний зразок Lys-плазміногену; 2 - контрольний зразок Glu-плазміногену; 3 - суміш Glu-плазміногену з Е-фрагментом після інкубації протягом 2 год при 37С за наявності 110-2 М ДФФ; 4 - те ж саме, але за відсутності ДФФ. |
дорівнюють 1,810-6 та 7,510-6 М (Гриненко та ін., 1989). -амінокапронова кислота в концентраціях, які насичують лізин-зв'язуючі ділянки плазміногену, пригнічує протеолітичну активність комплексу нативного проферменту з розчинним Е-фрагментом. З літератури відомо, що конформаційні зміни в нативному проферменті відбуваються як при насиченні його слабких лізин-зв'язуючих ділянок, так і при відщепленні NH2-кінцевого пептиду (Ponting, 1998). Ми вважаємо, що конформація Glu-плазміногену може змінюватися саме при насиченні однієї з слабких лізин-зв'язуючих ділянок Е-фрагментом фібриногену.
Рис. 3.4 Залежність амідолітичної активності комплексу Glu-плазміногену з Е-фрагментом від часу його існування. На осі абсцис – час передінкубації комплексу.
Для розрахунку швидкості виникнення плазміну при утворенні комплексу Glu-плазміногену з розчинним Е-фрагментом використовували хромогенний специфічний для плазміну субстрат – S2251 (Wiman, 1980). Еквімолярну суміш Glu-плазміногену та Е-фрагмента інкубували при 37С, додавали до розчину субстрату, визначали кількість p-нітроаніліну (p-NA), який вивільняється. З отриманих кінетичних кривих розраховували кількість p-NA, що утворився, в кожному випадку в початковий період реакції (через 2 хв після її початку) (рис.3.4). Вста-новлено, що швидкість появи в системі плазміну залежить від часу існування комплексу. Як видно, активність стає максимальною через 30 хв після утворення комплексу, а потім починає знижуватися. Ми припускаємо, що водночас з активацією йде процес інактивації, який зумовлений автолізом плазміну, який утворився.
Таким чином, можна стверджувати, що Е-фрагмент фібриногену, змінюючи конформацію Glu-плазміногену, індукує в ньому формування активного центру. Ми пропонуємо два, на перший погляд, протилежні пояснення фізіологічного змісту цього явища. Перше. Конформаційне формування активного центру приводить до більш швидкого видалення плазміногену з місця колишнього згустка за рахунок інактивації його 2-антиплазміном. Друге. Виникнення при сорбції Glu-плазміногену на Е-фрагменті активних центрів у проферменті приводить до різкого, але нетривалого збільшення локальної концентрації активного ферменту, що може бути важливим для розчинення внутрішньосудинних фібринових згустків. Обидва припущення свідчать, що подібна активація проферменту при взаємодії з пізніми продуктами деградації фібриногену може бути одним з шляхів регуляції фібринолітичного процесу.
4. Деякі особливості взаємодії двох форм плазміногену з фрагментами D фібрин(оген)у
Перехід розчинного фібриногену у форму полімерного фібрину під дією тромбіну характеризується значними конформаційними змінами складноорганізованої багатодоменної молекули. При утворенні протофібрил С-домени однієї молекули взаємодіють з такими сусідньої. Встановлено, що відбувається взаємодія не лише між E1D1 центрами, а й у С-кінцевих ділянках -ланцюгів сусідніх молекул, які потім прошиваються фактором ХІІІа. Раніше було встановлено, які фрагменти фібриногену містять плазміноген-зв'язуючі центри (Лежен, 1987), проте питання, які ж саме з них важливі для сорбції плазміногену на прошитому полімерному фібрині, лишалося не з’ясованим.
При вивченні взаємодії Glu- та Lys-форм плазміногену з різними D-фрагментами методом афінної хроматографії було показано, що з DH-фрагмента Lys-плазміноген елююється лише 0,1 М аргініном, це збігається з даними щодо сорбції легкого ланцюга на цьому фрагменті (Tran-Thang, 1986). Такі результати дозволили припустити, що D-домени фібриногену містять центри, компле-ментарні аргініл-зв'язуючим ділянкам Lys-плазміногену. Водночас було встановлено, що при подальшому гідролізі DH-фрагмента на його низькомолекулярних формах експонуються ділянки, комплементарні сильним лізин-зв'язуючим ділянкам плазміногену.
Методом афінної хроматографії показано, що Glu- та Lys-форми плазміногену взаємодіють з DH-димером лише за рахунок лізин-зв’язуючих ділянок, оскільки 0,1 М -амінокапронова кислота повністю руйнувала їх взаємодію. Встановлено, що константа дисоціації комплексу Glu-плазміноген*DH-димер дорівнює 3,210-6 М, а для комплексу Lys-плазміноген*DH-димер – 3,710-6 М. Ці константи дуже близькі одна до одної на відміну від констант дисоціації Glu- та Lys-плазміногену з DL-фрагментом (табл. 4.1).
Після нетривалого плазмінового гідролізу фібрину різко збільшується спорідненість проферменту до нього, що пояснюється появою на молекулі фібрину нових плазміноген-зв'язуючих центрів. При утворенні частково деградованого фібрину експонуються плазміноген-зв'язуючі центри, розташовані в D-домені.
Таблиця 4.1
Кількісна характеристика взаємодії плазміногену з фібриногеном,
DL-фрагментом та DH-димером
|
Плазміноген |
Кd, мкМ |
||
|
фібриноген |
DL-фрагмент |
DH-димер |
|
|
Lys-форма |
5,6 |
0,44 * |
3,7 |
|
Glu-форма |
не взаємодіє |
20,0 |
3,2 |
* Кудінов С.О., Андріанов С.І., Лежен Т.І., 1988
5. Дослідження швидкості гідролізу нативного та частково гідролізованого
фібрину плазміном. Ефекторні властивості частково гідролізованого desAABB-фібрину щодо швидкості гідролізу фібрину Glu- та Lys-плазміногеном, активованими t-PA.
Полімерний фібрин виступає, з одного боку, як стимулюючий фактор активації плазміногену тканинним активатором, а з другого боку, саме він і є природним субстратом для утвореного плазміну. Ефекторні властивості полімерного фібрину зумовлені наявністю в ньому зв'язуючих ділянок як для плазміногену, так і для тканинного активатора. Відомо, що саме формування потрійного комплексу: тканинний активатор плазміногену–фібрин–плазміноген є необхідною умовою утворення плазміну, тобто фібрин ніби є містком між проферментом та його активатором. Водночас, сорбція на фібрині тканинного активатора та плазміну захищає їх від дії інгібіторів.
Метою стало порівняти швидкості гідролізу нативного та частково деградованого полімерного фібрину як плазміном, так і Glu- та Lys-плазміногеном при їх активації t-PA.
Використання методу визначення терміну напівлізису фібринового згустка дозволяє досліджувати швидкість розчинення фібрину плазміном по всьому об'єму. Основним показником ефективності процесу фібринолізу була зміна світлорозсіювання фібринового згустка при 350 нм. Швидкість гідролізу фібрину визначали за величиною t1/2, яка характеризувала час, необхідний для зменення максимального світлорозсіювання на 50%, визначення ж часу, необхідного для повного розчинення згустка, дозволило розрахувати швидкість деградації фібрину у мкг білка за одну хвилину.
Нами встановлено: якщо препарат фібрин-мономера містить більше 5% Х-фрагментів, зміна часу напівлізису не є дуже різкою. Водночас швидкість плазмінолізу значно зростає із збільшенням ступеня гідролізу вихідного фібрину. Збільшення швидкості на 30 % спостерігалося при відщепленні 1,5-3% молекулярної маси вихідного фібриногену. Молекулярна маса C-доменів становить четверту частину молекулярної маси фібриногену, таким чином, відщеплення навіть невеликої кількості C-кінцевих пептидів від A-ланцюгів є достатньою умовою прискорення процесу фібринолізу.
Дослідження залежності швидкості плазмінолізу від концентрації фібрин-мономера за сталої концентрації ферменту дозволило розрахувати константи Міхаеліса: 710-6 M та 3,310-6 М для плазміну при гідролізі нативного та частково деградованого фібрину відповідно. Ці дані свідчать про збільшення спорідненості ферменту до субстрату на початкових етапах гідролізу. Збільшення спорідненості плазміну до частково гідролізованого фібрину дозволяє припустити, що X-полімери відіграють регуляторну роль в процесі фібринолізу.
Встановлено, що швидкість плазмінолізу полімерного фібрину як Glu-, так і Lys-плазміногеном, активованими t-PA, залежить від нативності вихідного фібрину. Швидкість гідролізу нативного фібрину плазміном, що утворюється
|
Рис. 5.1 Зміна швидкості гідролізу фібринового згустка, утвореного з нативного та частково гідролізованого фібриногену (визначали як тангенс кута нахилу дотичної через 2,5 хв для нативного фібрину та 50 с для частково гідролізованого фібрину). |
при активації Lys-форми t-PA, майже в два рази більша за швидкість гідролізу при активації Glu-плазміногену. Водночас при гідролізі фібрину, сформованого з частково гідролізованого фібриногену, швидкості стають однаковими (рис. 5.1). Цей факт цілком узгоджується із зробленим висновком, що до взаємодії з частково деградованим фібрином залучаються ті ж ділянки Glu-плазміногену, що відповідають за сорбцію Lys-форми проферменту на нативному фібрині.
Висновки
Встановлено, що сорбція Glu-плазміногену на нативному фібрині забезпечується низькоафінною ділянкою, а взаємодія Lys-плазміногену з нативним фібрином опосередкована як високо-, так і низькоафінною до аналогів лізину ділянкою.
Встановлено, що частково деградований (до стадії Х-фрагментів) фібрин викликає в нативному плазміногені значні конформаційні зміни, в результаті яких взаємодія Glu-плазміногену з таким фібрином відбувається за рахунок високоафінних зв'язуючих ділянок, а кількість зв’язаного Glu-плазміногену збільшується в 10 разів.
Встановлено, що Е-фрагмент фібриногену при взаємодії з Glu-плазміногеном індукує в останньому конформаційне формування активного центру і появу плазміну. Така активація проферменту при взаємодії з пізніми продуктами деградації фібрин(оген)у може бути одним з шляхів регуляції фібринолітичного процесу.
Досліджено взаємодію Glu- та Lys-плазміногену з D-фрагментом фібриногену та DH-димером фібрину. Вперше показано здатність DH-димера взаємодіяти з Glu-формою плазміногену. Розраховано константи дисоціації Glu- та Lys-плазміногену з іммобілізованим DH-димером, які становлять 3,210-6 М та 3,710-6 М відповідно. Встановлено, що утворення D-димера супроводжується зміною плазміноген-зв’язуючих властивостей D-фрагментів, що входять до його складу.
Досліджено ефекторні властивості нативного і частково гідролізованого desAABB-фібрину щодо плазміну. Показано, що на початкових етапах гідролізу при відщепленні С-доменів окремих молекул фібрин-мономера збільшується спорідненість плазміну до фібрину. Цей факт дозволяє припустити, що з появою Х-полімерів протеолітична дія плазміну щодо фібрину так само, як і при взаємодії з фібриногеном, регулюється додатковими лізин-зв'язуючими ділянками.
перелік робіт, що опубліковані за темою дисертації
Скоморовська О.В., Гриненко Т.В., Третяченко В.Г., Кудінов С.О. Протеолітична активність Глу-плазміногену при його взаємодії з Е-фрагментом фібриногену //Доп. АН УРСР, серія “Б”. – 1988. – N10. – С.72-75.
Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Исследование протеолитической активности комплекса Glu-плазминогена с Е-фрагментом фибриногена// Биохимия. – 1991. – 56, N 3. – С.458-466.
Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Особенности взаимодействия Glu- и Lys-форм плазминогена с нативным и частично гидролизованным фибрином //Биохимия. – 1992. – 57, N 5. – С.728-729.
Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Золотарева Э.Н., Кудинов С.А. Изучение комплексообразования различных форм плазминогена с фибрином // III симпозиум “Химия протеолитических ферментов”, Москва, 1993. – С.80.
Skomorovskaya E.V., Grinenko T.V., Platonova T.N Interaction between Glu-plasminogen and Lys-plasminogen with DH-dimer //XV International Congress on Thrombosis and Haemostasis, Jerusalem, 1995. – P. 1136. – A 906.
Анотація
Скоморовська-Прокволіт О. В. Ефекторна дія фібриногену/фібрину та їх фрагментів на властивості Glu-плазміногену. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України. Київ, 1999.
Дисертацію присвячено вивченню змін властивостей Glu-плазміногену при його взаємодії з фібриногеном/фібрином та їх протеолітичними фрагментами. Показано, що зміна сорбційних властивостей Glu- і Lys-форм проферменту пов’язана не лише з експонуванням нових плазміноген-зв’язуючих центрів на молекулі фібриногену/фібрину, а й з конформаційним станом молекули нативного проферменту. Частково гідролізований (до стадії Х-фрагментів) фібрин індукує в нативному плазміногені значні конформаційні зміни, в результаті яких Glu-плазміноген переходить в Lys-плазміноген подібний стан. Взаємодія з таким фібрином відбувається за високоафінними зв'язуючими ділянками нативного проферменту. Вперше показано, що Е-фрагмент фібриногену індукує конформаційне формування активного центру в молекулі Glu-плазміногену. Конформаційна активація проферменту при взаємодії з пізніми продуктами деградації фібриногену/фібрину може бути одним з шляхів регуляції фібринолітичного процесу. Вперше показано, що DH-димер фібрину утворює комплекс з Glu-плазміногеном. Показано, що на початкових етапах гідролізу при відщепленні С-доменів окремих молекул фібрин-мономера збільшується спорідненість плазміну до фібрину. З появою Х-полімерів протеолітична дія плазміну щодо фібрину так само, як і при взаємодії з фібриногеном, регулюється додатковими лізин-зв'язуючими ділянками.
Ключові слова: фібрин, X- та E-фрагмент фібриногену, DH-димер фібрину, Glu- та Lys-плазміноген, протеолітична активність, активний центр.
Аннотация
Скоморовская-Прокволит Е. В. Эффекторное действие фибриногена/фибрина и их фрагментов на свойства Glu-плазминогена. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины. Киев, 1999.
Диссертация посвящена изучению изменений свойств Glu-плазминогена при его взаимодействии с фибриногеном/фибрином и их протеолитическими фрагментами. Показано, что изменение сорбционных свойств Glu- и Lys-форм профермента связано не только с экспонированием новых плазминоген-связывающих центров на молекуле фибрин(оген)а, а и с конформационным состоянием молекулы нативного профермента. Частично гидролизованный (до стадии Х-фрагментов) фибрин индуцирует в нативном плазминогене значительные конформационные изменения, в результате которых Glu-плазминоген переходит в Lys-плазминоген подобное состояние. Взаимодействие с таким фибрином происходит по высокоаффинным связывающим участкам нативного профермента. Впервые показно, что Е-фрагмент фибриногена индуцирует конформационное формирование активного центра в молекуле Glu-плазминогена. Конформационная активация профермента при взаимодействии с поздними продуктами деградации фибриногена/фибрина может быть одним из путей регуляции фибринолитического процеса. Впервые показано, что DH-димер фибрина образует комплекс с Glu-плазминогеном. Показано, что на начальных этапах гидролиза при отщеплении С-доменов отдельных молекул фибрин-мономера увеличивается сродство плазмина к фибрину. С появлением Х-полимеров протеолитическое действие плазмина по отношению к фибрину так же, как и при взаимодействии с фибриногеном, регулируется дополнительными лизин-связывающими участками.
Ключевые слова: фибрин, X- и E-фрагмент фибриногена, DH-димер фибрина, Glu- и Lys-плазминоген, протеолитическая активность, активный центр.
SUMMARY
Skomorovska-Proquolyt O.V. Effect of fibrinogen/fibrin and their fragments on Glu-plasminogen properties. – Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry. – A.V.Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 1999.
The thesis is devoted to the study of the changes in Glu-plasminogen properties upon its interaction with fibrinogen/fibrin and their proteolytic fragments.
Glu- and Lys-plasminogen interactions with native and desAABB-fibrin obtained from partly degraded fibrinogen were investigated. Glu-plasminogen is a native form of the proenzyme and Lys-plasminogen is a partially degraded one that lacks first 77 amino acid residues. It is found that native fibrin binds 7 times more Lys-plasminogen as compared to Glu-plasminogen. At the same time, when fibrin is formed from partly hydrolyzed fibrinogen, the appearance of less than 1% X1-fragments in the system leads to a 10-fold increase in glu-plasminogen binding, but the quantity of adsorbed Lys-plasminogen increases only for 5%. The amount of Glu-plasminogen bound to partly hydrolyzed fibrin reaches the level of Lys-plasminogen binding. It is found that both, plasminogen fragment kringle K1-3 containing strong lysine binding site, and -aminocaproic acid at concentration saturating this binding site, inhibit Lys-plasminogen binding to native fibrin. There is no effect when the native form of proenzyme is used. It is shown that the changes in sorption properties of Glu- and Lys- forms of proenzyme are associated not only with the exposure of new plasminogen binding centers at fibrinogen/fibrin molecule but also with conformational state of the intact proenzyme molecule. Partly hydrolyzed (to X-fragment state) fibrin induces considerable conformational changes in intact plasminogen resulting in Glu-plasminogen transfer to Lys-plasminogen like state and the interaction with this fibrin is mediated by high affinity binding site of the native pro-enzyme.
Fibrinogen E-fragment induces the formation of the active center in Glu-plasminogen by conformational changes upon interaction. During this interaction in the absence of plasmin and tissue-type plasminogen activator Glu-plasminogen transforms to a partly degraded form. Both, Glu-plasminogen complex with soluble fibrinogen E-fragment and the native proenzyme eluted from immobilized fibrinogen E-fragment are active towards fibrin and plasmin-specific chromogenic substrate. This activation of the proenzyme upon interaction with the late degradation products of fibrinogen/fibrin could be one of the ways of fibrinolytic process regulation.
The changes in sorption properties of immobilised fibrin DH-dimer as compared to immobilised fibrinogen D-fragments are observed. The affinity of fibrinogen DL and DLa-fragments to Glu-plasminogen is much lower than to Lys-plasminogen, DH-fragment of fibrinogen does not interact with the native form of proenzyme, while fibrin DH-dimer binds Glu- as well as Lys-plasminogen. The formation of fibrin DH-dimer complex with Glu-plasminogen is shown first. Both, Glu-plasminogen and Lys-plasminogen interactions with DН-dimer are abolished by -aminocaproic acid that could be an evidence of plasminogen binding sites exposure at fibrin D-domain. They are complementary to lysine binding sites of plasminogen and they are inaccessible to Glu-plasminogen at fibrinogen molecule.
Complex dissociation constants for native and partly degraded form of plasminogen with DH-dimer are calculated to be 3.210-6 and 3.710-6 M, correspondingly.
It is established that there is an increase of the enzyme affinity towards the substrate during the plasmin hydrolysis of native and partly hydrolyzed polymeric fibrin. It is shown that at the beginning stages of hydrolysis when C-domains are cleaved from some fibrin monomer molecules the plasmin affinity to fibrin is increased. This fact allows concluding that the proteolytic action of plasmin to fibrin with appearance of X-polymers as well as upon interaction with fibrinogen is regulated by additional lysine binding sites. The rate of native fibrin hydrolysis by plasmin formed by t-PA activation of Lys-plasminogen is twice higher the one of Glu-plasminogen. At the same time, rates became equal upon hydrolysis fibrin, which is obtained from partly degraded (to X-fragment state) fibrinogen. So, it could be assumed that X-polymers are playing a regulatory role in fibrinolytic process.
Key words: fibrin, fibrinogen X- and E-fragment, fibrin DH-dimer, Glu- and Lys-plasminogen, proteolytic activity, active center.