Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСОБІВ З НООТРОПНОЮ ДІЄЮ І РЕГУЛЯТОРНИХ ПЕПТИДІВ ПРИ СТРЕСІ
(експериментальне дослідження)
Науковий консультант: |
доктор медичних наук, професор Дев'яткіна Тетяна Олексіївна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, професор кафедри експериментальної та клінічної фармакології |
Офіційні опоненти: |
доктор медичних наук, професор Французова Стелла Борисівна, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та експериментальної кардіології Науково-дослідного лабораторного центру, Національний медичний університет ім. О.О. Бого-мольця МОЗ України; |
|
доктор медичних наук, професор Ярош Олександр Кузьмич, завідувач відділу фармакокінетики, Інститут фармакології та токсикології АМН України; |
|
доктор медичних наук, професор Киричок Людмила Трохимівна, професор кафедри фармакології з медичною рецептурою, Харківський державний медичний університет МОЗ України |
Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології.
Захист відбудеться " 21 "_січня____________ 2004 р. о _13_ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє,14).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє,14).
Автореферат розісланий "__18___" _грудня_______ 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
Д.26.550.01
к. б. н. І.В. Данова
Актуальність теми. Стресорні ситуації постійно супроводжують життя сучасної людини і можуть бути причиною численних захворювань (М.М. Хананашвили, 1998; Z.L. Houtman et al., 1998; Y. Nakano et al., 1998). Це потребує пошуку фармакологічних засобів, які підвищують резистентність організму до дії стресорів. Найбільш перспективними стреспротективними засобами вважають такі, що при зростанні порогу психофізіологічної стійкості організму зберігають його дієздатність (В.И.Петров и соавт., 1996). До них належать препарати з ноотропною дією, серед яких привертає увагу синтетичний антиоксидант мексидол, котрий поєднує психотропні і метаболічні властивості (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; К.М. Дюмаев и соавт., 1995). Потребує подальшого дослідження за умов стресу класичний представник групи ноотропів –пірацетам, стреспротективні властивості якого інтенсивно вивчаються (Л.Т. Киричек, Э.В. Карнаух, 1999; В.И. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; П.П. Мурзенок, Н.А. Чура, 1998; Я.В. Рожковский, 2000).
Інша група засобів, здатних поліпшувати розвиток адаптації, представлена регуляторними пептидами. Нині відомо, що ендогенні регуляторні пептиди, зокрема тироліберин, окситоцин, вазопресин, беруть участь у формуванні відповіді організму на дію стресорних факторів (А.И. Робу, 1989; В.Н. Славнов и соавт., 1992; C.S. Carter, M. Altemus, 1997). Водночас можливість профілактики і корекції стресорних зрушень за допомогою екзогенного введення цих препаратів мало досліджена. Ефективність регуляторних пептидів з нейротрофічними властивостями при стресі майже не вивчена. Існують лише поодинокі роботи, присвячені дії церебролізину при мікрохвильовому стресі (А.Т. Гречко, 1998). Трофінотропні пептиди екстракту неокортексу SNC (А.Н. Макаренко, 1994) за умов стресу раніше не досліджувались.
На сьогодні найбільш вивчені мозкові ефекти ноотропів і регуляторних пептидів. Водночас їхні екстрацеребральні ефекти за умов стресу досліджені недостатньо. Особливо це стосується впливу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і клітини крові, які чутливо реагують на стрес (Е.Д. Гольдберг и соавт., 1987-1999; П.Д. Горизонтов и соавт., 1983; Н.В. Лунина и соавт., 1986-1998). Важливість дослідження впливу фармакологічних засобів на стресорні зрушення в цих органах і клітинах визначається тим, що останні можуть бути причиною патологічних змін гемопоезу та імунітету (Е.Д. Гольдберг и соавт., 1987-1999; А.М. Дыгай и соавт., 1989-1992; В.П. Шахов, 1986-1996; I. Rinner et al., 1992; J.F. Sheridan et al., 1998; M. Shimaoka et al., 1998). За певних умов такі зміни зумовлюють розвиток імунодефіцитних станів, аутоімунних або онкологічних захворювань (К.П. Балицкий, Ю.П. Шмалько, 1987; S.M. Consoli, 1992; P. Derevenco, 1997).
До теперішнього часу не розроблені критерії кількісної оцінки стреспротективної дії фармакологічних засобів. Це зумовлює актуальність створення таких методів, в тому числі на основі застосування системного аналізу до ефектів препаратів у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові тварин, підданих стресу.
Таким чином, ноотропні засоби і регуляторні пептиди широко вивчаються
і застосовуються в медицині, однак їх лікувальні і профілактичні ефекти при стресі надзвичайно мало досліджені. На основі існуючих даних не можна зробити висновки стосовно перспективності застосування препаратів цих фармакологічних груп для попередження негативних наслідків стресу, зокрема в кровотворних органах і крові. Тому актуальною проблемою фармакології є пошук стреспротективних засобів із числа ноотропів і регуляторних пептидів, вивчення їхнього впливу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і клітини крові при стресі і обгрун-тування кількісних критеріїв оцінки ефективності цих фармакологічних засобів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках
НДР Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава) "Запальні та незапальні хвороби
органів і систем людини, що формуються під впливом екологічних, стресових, імунних, метаболічних та інфекційних факторів. Стан гемо-гомеостазу, гемодинаміки при застосуванні традиційних та нетрадиційних засобів лікування" (№ держреєстрації 0198U000134). Дисертант був співвиконавцем вказаної теми.
Мета дослідження –на основі експериментальних досліджень встановити профілактичні властивості ноотропів і регуляторних пептидів при стресі та виявити серед них найбільш активні фармакологічні засоби, які запобігають розвитку порушень у кровотворних органах і крові.
Для досягнення поставленої мети були визначені основні завдання дисертаційної роботи:
Об'єкт дослідження –лімфоїдні органи, кістковий мозок і кров лабораторних тварин за умов стресу.
Предмет дослідження –ефективність та механізми дії засобів з ноотропною дією і регуляторних пептидів при стресі.
Методи дослідження. В роботі використані фармакологічні, цитологічні, цитохімічні, біохімічні та статистичні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Поглиблено уявлення про порушення в лімфоїдних органах і крові в стадії тривоги гострого стресу, а саме про посилення апоптозу в тимусі і селезінці, збільшення експресії поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові та зміни функціонального стану поліморфноядерних лейкоцитів (підвищення показника фагоцитозу, активацію мієлопероксидази та зниження продукції активних метаболітів кисню).
Вперше виявлено захисний вплив антиоксиданту з ноотропними властивостями мексидолу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і кров при гострому і хронічному стресі. Показано, що в фармакодинаміці мексидолу певне місце займає попередження посиленого апоптозу в тимусі і селезінці, викликаного стресом. Встановлено, що протективна дія мексидолу стосовно стресорних порушень у кровотворних органах і крові зумовлена зменшенням активності надниркових залоз (за даними морфологічних досліджень) і впливом препарату на процеси перекисного окислення ліпідів і обмін глюкози. Дія мексидолу в системі крові при хронічному стресі синергічна природним адаптаційним процесам і супроводжується стадійними змінами гістологічної структури надниркових залоз і антиоксидантного захисту.
Поглиблено уявлення про фармакодинаміку пірацетаму за умов стресу. Встановлено превентивний вплив препарату щодо посилення апоптозу в лімфоїдних органах. Показано, що протективний ефект пірацетаму при гострому стресі зумовлений зменшенням активності надниркових залоз (за даними морфологічних досліджень), антиоксидантною дією і оптимізацією обміну глюкози в лімфоїдних органах.
Уперше встановлено стреспротективні властивості пітуїтрину і розкрито механізми його дії в лімфоїдних органах і крові –здатність регулювати експресію мембранних рецепторів лімфоцитів і активність антиоксидантних ферментів.
Доведена можливість попередження церебролізином стресорних порушень у лімфоїдних органах і крові та розкрито його механізми дії –зниження рівня перекисного окислення ліпідів у тимусі, активація антиоксидантного захисту і зменшення вмісту лактату в селезінці.
Вперше виявлено протективну дію природного комплексу пептидних факторів неокортексу SNC та доведено, що його вплив на лімфоїдні органи створює передумови для попередження стресорних порушень імунітету і грунтується на опіатергічних механізмах.
Уперше показано, що протективна дія ноотропів і регуляторних пептидів при гострому стресі закономірно супроводжується попередженням стресорного посилення кореляцій та змін розподілу їх дисперсії в системі крові, а при хронічному стресі характеризується стадійними змінами цих характеристик кореляційної мережі.
Вперше обгрунтовано можливість кількісної оцінки ефективності фармакологічних засобів при стресі і встановлено, що серед досліджених ноотропів і регуляторних пептидів мексидол є найбільш ефективним препаратом для попередження стресорних порушень у кровотворних органах і крові.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб кількісної оцінки стреспротективної дії фармакологічних засобів на етапі доклінічного дослідження і впроваджено його в наукову роботу ЦНДЛ Української медичної стоматологічної академії (акт впровадження від 3.04.2002 р.), ЦНДЛ Харківського державного медичного університету (акт впровадження від 16.01.2002 р.), ЦНДЛ Національного фармацевтичного університету (акт впровадження від 8.02.2002 р.). Обгрунтовано перспективність застосування мексидолу, пірацетаму, пітуїтрину і церебролізину для профілактики зрушень у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові, обумовлених впливом стресорних факторів.
За результатами досліджень одержано 2 деклараційні патенти України на винаходи: "Спосіб визначення ефективності фармакологічних засобів при стресі" (№99073834) і "Спосіб імунокорекції" (№ 99073835). За матеріалами дисертації підготовлено і видано методичні рекомендації: "Доклінічне дослідження стреспротективної дії фармакологічних засобів", а також 2 інформаційні листки: "Применение пирацетама для профилактики повреждений иммунокомпетентных органов и печени стрессорного генеза" та "Экстрацеребральные эффекты церебролизина и возможности их клинического использования".
Результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім О.О. Богомольця (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Дніпропетровської державної медичної акаде-мії (акт впровадження від 21.02.2002 р.), Тернопільської державної медичної акаде-мії ім. І.Я. Горбачевського (акт впровадження від 17.01.2002 р.), Національного фар-мацевтичного університету (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 7.02.2002 р.), Харківського державного медичного університету (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Івано-Франківської державної медичної академії (акт впровад-ження від 16.01.2002 р.), Луганського державного медичного університету (акт впровадження від 12.02.2002 р.), Буковинської державної медичної академії (акт впровадження від 4.02.2002 р.), та на кафедрі патологічної фізіології Української медичної стоматологічної академії (акт впровадження від 8.04.2002 р.).
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням серверів "МЕDLINE" та "РUBMED", розроблено програму досліджень. Самостійно проведено всі експериментальні дослідження. Гістологічне вивчення надниркових залоз, визначення експресії поверхневих глікопротеїнів лейкоцитів та досліди in vitro з вивчення впливу мексидолу на дихальний вибух поліморфноядерних лейкоцитів були виконані за методичною допомогою асистента кафедри гістології к.м.н. Н.Ф. Єреміної, наукових співробітників ЦНДЛ Української медичної стоматоло-гічної академії к.б.н. Н.О. Бобрової і д.б.н. О.І. Цебржинського. Автором особисто проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів дослідження, сформульовано основні положення та висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на міжнародній конференції "Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Проблемы экологии в медицине" (Астрахань, Росія, 1996), IV Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, Росія, 1997), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), V та VI Російських національних конгресах "Человек и лекарство" (Москва, Росія, 1998, 1999), V національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 1999), ІІ Російському конгресі з патофізіології (Москва, Росія, 2000), ІІ національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), науковій конференції "Фізіологія і патологія перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імуногенезу" (Полтава, 1997).
Публікації. Основні результати дисертації висвітлено в 42 публікаціях. Із них 1-монографія, 23 –статті в виданнях, затверджених ВАК України, 4 - статті в зарубіжних журналах, 9 робіт –у матеріалах і тезах з’їздів і конференцій. 13 робіт самостійні, з них статей –. Видано 1 методичні рекомендації, 2 інформаційні листки, одержано 2 деклараційні патенти України на винахід.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 363 сторінках машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, обговорення одержаних даних, висновки, практичні рекомендації, список використаних джерел, який містить 656 джерел, в тому числі 406 українсько- і російськомовних і 250 англомовних публікацій. Робота ілюстрована 52 таблицями, 26 рисунками.
В щурів моделювали гострий іммобілізаційний стрес (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983) і емоційно-больовий стрес (ЕБС) (O. Desiderato et al., 1974). Гострий стрес у мишей відтворювали шляхом атравматичного підвішування тварин за шкірну складку шиї (И.В. Дардымов, 1976). Хронічний гіпокінетичний стрес моделювали шляхом 16-годинного обмеження рухів тварин у дерев’яних пеналах протягом 30-и діб (Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский, 1980).
Взяття матеріалу в щурів проводили через 1,5-2 год, у мишей –через 1 год після завершення дії стресорного фактору. Евтаназію тварин здійснювали під гексеналовим або тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньоочере-винно) шляхом забирання крові з серця до його зупинки. Мишей декапітували під ефірним наркозом.
З метою профілактики стресорних зрушень тваринам вводили мексидол у дозі 100 мг/кг (Національний дослідницький центр біологічно активних речовин, Стара Купавна, Росія); пірацетам у дозах 100 і 300 мг/кг (Фармацевтична фірма "Дарниця", Київ, Україна); тироліберин (ТРГ) у дозі 0,04 мг/кг (Berlin-Chemie AG, Берлін, Германія); окситоцин у дозі 1 ОД/кг (Хіміко-фармацевтичне АО "Октамед", Харків, Україна); пітуїтрин у дозі 1 ОД/кг (НВО "Фермент", Каунас, Литва); церебролізин у дозі 0,1 мл/кг (ЕВЕWE, Унтерах, Австрія), а також екстракт неокортексу SNC у дозі 1 мг/кг маси тіла, люб’язно наданий д.мед.н. О.М. Макаренко (Інститут загальної і судової психіатрії, Київ, Україна). Препарати розводили стерильним 0,9% розчином натрію хлориду ex tempore та вводили тваринам внутрішньоочеревинно або в м’язи за 30 хв до початку дії стресорного фактора. Дози препаратів не перевищували 0,1 ЛД. Вибір доз і шляхів введення препаратів і субстанцій здійснювали на основі літературних даних щодо їхнього застосування за умов стресу або за іншої неврологічної патології, якщо при стресі препарат раніше не вивчали. Зокрема, мексидол застосовували в дозі 100 мг/кг (К.М. Дюмаев и соавт., 1995), яка виявляла протективну дію стосовно показників перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) при гострому стресі (Т.А. Девяткина, 1990). Дози пірацетаму (100 і 300 мг/кг) відповідали терапевтичним дозам при парентеральному введенні в разі невідкладних станів (А.И. Федин, 1997) і узгоджувались із дозами, що застосовувались дослідниками для корекції стресорних порушень у ЦНС, міокарді і крові (від 50 до 500 мг/кг) (В.М. Виноградов и соавт., 1987; В.И. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; В.И. Петров и соавт., 1996). Доза ТРГ (40 мг/кг) була обрана на основі даних щодо впливу подібної дози на біоелектричну активність у ЦНС (А.Т. Марьянович, Е.Л. Поляков, 1991). Доза окситоцину (1 ОД/кг) відповідала такій в дослідах з вивчення седативної дії пептиду при стресі (C. S. Carter, M. Altemus, 1997). Доза пітуїтрину (1 ОД/кг) була обрана як співставима з дозою для окситоцину. Церебролізин (0,1 мг/кг) застосовували в терапевтичній дозі, рекомендованій в неврологічній практиці (M. Windisch et al., 1998). Екстракт неокортексу тварин SNC вводили тваринам у дозі 1 мг/кг, яка узгоджується з дозою SNC, ефективною при передозуванні барбітуратів (2 мг/кг) (А.Н. Макаренко, 1994). Одночасно з профілактикою стресу препарати та екстракт неокортексу SNC вводили інтактним тваринам.
При аналізі ефектів мексидолу використано засоби, аналогічні за хімічною будовою його структурним компонентам: емоксипін (2-етил-6-метил-3-оксипіридин у вигляді хлорводневої солі) в дозі 100 мг/кг (Талліннський хіміко-фармацевтичний завод, Таллінн, Естонія) і натрію сукцинат у дозі 50 мг/кг (ВАТ "Фармак", Київ, Україна). З метою вивчення механізмів дії SNC тваринам вводили блокатор опіаторецепторів налоксон у дозі 0,1 мг/кг ("Здоровье народа", Харків, Україна).
Визначали цитологічні показники тимусу, селезінки, кісткового мозку і крові. Загальну кількість каріоцитів (цитоз) у лімфоїдних органах досліджували за методом П.Д. Горизонтова і співавт. (1983). Відбитки тимусу і селезінки, а також мазки кісткового мозку фіксували метанолом і фарбували за Паппенгеймом (М.А. Базарнова и соавт., 1988). При ідентифікації лімфоїдних елементів керувались їхніми розмірами і морфологічними особливостями. Досліджуючи апоптоз, із тимусу і селезінки щурів виділяли ДНК і визначали міжнуклеосомну фрагментацію в ній електрофоретичним методом (С. Херрингтон, Дж. Макги, 1999). Загальну кількість лейкоцитів і еритроцитів у крові вивчали шляхом підрахунку клітин у камері Горяєва. Лейкоцитарну формулу підраховували в мазках крові, пофарбованих за Паппенгеймом (М.А. Базарнова и соавт., 1988).
Досліджували процеси, котрі характеризують киснезалежні реакції поліморфноядерних лейкоцитів (ПМЯЛ): тест з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест) за Б.С. Нагоєвим (1983), активність мієлопероксидази (МПО) за Р.П. Нарцисовим (1964); кисненезалежні реакції: лізосомально-катіонний тест (ЛКТ) за В.Є. Піга-ревським і співавт. (1983) і стан клітинних мембран: життєздатність (Ю.М. Лопухин, Э.М. Коган, 1975) і поверхневі глікопротеїни (А.Д. Луцик и соавт., 1989). Експресію поверхневих глікопротеїнів визначали також на лімфоцитах крові. Цитохімічні реакції оцінювали напівкількісно (G. Astaldi, L. Verga, 1957) і обчислювали середній цитохімічний коефіцієнт за L.S. Kaplow (1957). Одночасно досліджували фагоцитарну активність ПМЯЛ (В.И. Стручков и соавт., 1978; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 1990).
З метою з’ясування механізмів дії мексидолу проводили досліди in vitro (n=94) з використанням ПМЯЛ крові здорових донорів. Виконання дослідів in vitro включало передінкубацію донорської крові з розчином НСТ і мексидолом при 37 С протягом 5 хв та інкубацію зі стимуляторами дихального вибуху. Концентрацію мексидолу розраховували згідно з подвоєною вищою разовою дозою препарату, припускаючи, що він одномоментно надходить до крові і рівномірно розподіляється в ній.
Оскільки цитологічні зрушення в лімфоїдних органах можуть вести до змін імунітету, досліджували кількість антитілоутворюючих клітин у селезінці (Г. Фримель, 1987) і титр антиеритроцитарних антитіл у сироватці крові (Е.А. Кост, 1975).
У тимусі, селезінці і крові визначали основні показники ПОЛ і антиоксидантного захисту: вміст продуктів, що реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП) (В.Б. Гаврилов и соавт., 1987), активність супероксиддисмутази (СОД) (О.С. Брусов и соавт., 1976) і каталази (М.А. Королюк и соавт., 1988). У лімфоїдних органах також визначали вміст молочної (Ю.В. Хмелевский, 1985) та піровиноградної кислот (Н.К. Кучеренко и соавт., 1988).
З метою підтвердження протективного характеру дії ноотропів і регуляторних пептидів досліджували класичні загальносоматичні ознаки стрес-синдрому, які відображають стан гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи: відносну масу тимусу і надниркових залоз, виразкоутворення в шлунку (В.М. Виноградов, В.А. Полонский, 1983), описували гістологічну будову надниркових залоз, використовуючи забарвлення гематоксилін-еозином (О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, 1971), і визначали ширину їхнього коркового і мозкового шарів (Г.Г. Автандилов, 1990).
Одержані результати піддавали статистичній обробці методом варіаційної статистики. Вірогідність різниці оцінювали за критерієм t Ст’юдента та непараметричним критерієм “точний метод Фішера” (ТМФ). Кореляційний аналіз 34 морфофункціональних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові здійснювали за методом кореляційних плеяд (Ю.В. Редькин, Т.Ф. Соколова, 1988). Оцінку ефективності фармакологічної профілактики стресорних порушень проводили з використанням дискримінантного аналізу (С.Н. Лапач и соавт., 2000), а також за допомогою розробленого способу визначення ефективності фармакологічних засобів при стресі (О.М. Важнича, Т.О. Дев’яткіна, 2000). Цей спосіб полягає в тому, що до всіх засобів застосовують єдину схему дослідження з наступним абстрагуванням від цифрового матеріалу, вираженням його в балах з урахуванням направленості зрушень і знаходженням алгебраїчної суми балів. Перевага превентивних ефектів виражається сумою зі знаком “+” і свідчить про наявність стреспротективної дії. Обчислення виконано на мікрокалькуляторі "Электроника "МК-52" за стандартними програмами (А.Е. Шелест, 1988) та на персональному комп’ютері ІВМ РС Pentium III-1000 за програмами С.Н. Лапача і співавт. (2000).
Результати досліджень та їх обговорення
Стресорні порушення в лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові.
Під впливом гострого стресу в стадію тривоги стрес-синдрому спостерігається вірогідне зменшення цитозу тимусу на 49% і зростання в ньому вмісту великих тимоцитів і бластів, зменшення цитозу селезінки на 24% і зростання серед її клітин частки лімфоцитів розмірами 4-8 мкм (Т-клітини); істотно збільшується цитоз кісткового мозку на 62%; відмічається лімфопенія, еозинопенія і нейтрофільний лейкоцитоз. Такі результати узгоджуються з даними літератури (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983; Е.Д. Гольдберг и соавт., 1997) і вказують на закономірний характер клітинних реакцій у системі крові за умов стресу. Гострий стрес супроводжується посиленням міжнуклеосомної фрагментації ДНК у тимусі і селезінці, що вказує на роль активації апоптозу в клітинному спустошенні цих органів. Під впливом стресорного фактору експресія поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів зростає на 33% (р<0,05), що свідчить про порушення функціональної активності цих клітин. Вірогідно підвищується активність МПО на 32% і показник фагоцитозу ПМЯЛ на 25%. На момент спостережень НСТ-тест знижується в 2 рази порівняно з таким у інтактних тварин (р<0,02). Серед зазначених зрушень стану гранулоцитів найбільш постійно реєструється активація МПО. Це доповнює відомі дані щодо реакції на стрес лізосомального апарату ПМЯЛ (Н.В. Луніна і співавт., 1998).
У тимусі тварин, підданих ЕБС, вміст ТБКАП вірогідно зростає на 62%, тоді як за умов гострого іммобілізаційного стресу він не змінюється, вочевидь, завдяки підвищенню активності СОД на 152 % (р<0,05). За цих моделей стресу в селезінці розвиток надлишкової пероксидації стримується активацією антиоксидантного захисту. Водночас при відтворенні нервовом’язового напруження в мишей вміст ТБКАП у селезінці вірогідно зростає на 70 % (р<0,05). Стан ПОЛ і антиоксидан-тного захисту свідчить, що через 1,5 год після завершення стресорного впливу в тимусі і селезінці може мати місце як посилення, так і гальмування ПОЛ. Стрес викликає також зміни концентрації продуктів гліколізу в лімфоїдних органах, які супроводжуються накопиченням лактату в селезінці (p<0,05).
Описані процеси відбуваються на фоні морфологічних ознак підвищеної активності надниркових залоз, зокрема вірогідного збільшення товщини їх коркового і мозкового шару.
Зрушення, викликані гострим стресом, супроводжуються зростанням загальної кількості міцних вірогідних кореляцій у системі крові. Відбувається перерозподіл дисперсії зв’язків на користь кореляцій між клітинними показниками і параметрами ПОЛ, а також збільшення числа взаємозв’язків за участю морфофункціональних показників селезінки.
При моделюванні хронічного гіпокінетичного стресу виявлено стадійність клітинних реакцій у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові. На 15-у добу цитоз тимусу зменшується на 91% (р<0,05), а кількість великих тимоцитів у ньому –на 45% (р<0,05) порівняно з початковими даними. В кістковому мозку вірогідно зростає вміст мієлобластів, промієлоцитів і мієлоцитів у 1,5 рази, що свідчить про посилення гранулоцитопоезу. На 30-у добу цитоз тимусу відновлюється, але кількість малих тимоцитів лишається нижчою за початковий рівень показників (р<0,001). У селезінці вірогідно зростає вміст еритроїдних клітин, що вказує на посилення екстрамедулярного гемопоезу. Активність СОД селезінки підвищується на 15-у (р<0,05) і повертається до норми на 30-у добу гіпокінезії.
Протягом усього терміну хронічного гіпокінетичного стресу кількість міцних вірогідних кореляцій між морфофункціональними показниками кровотворних органів і крові нижча за початковий рівень, але на 30-у добу вона підвищується в 1,4 рази порівняно з такою на 15-у добу спостережень. Це свідчить про стадійність змін мережі попарних лінійних кореляцій в системі крові протягом хронічного стресу.
Рис. 1. Попередження мексидолом фрагментації ДНК у тимусі (А) і селезінці (Б) тварин при гострому стресі (електрофореграма, фото). Доріжки електрофореграми: 1-3 –інтактні тварини; 4-6 –стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 7-9 –стрес + мексидол.
Ефективність засобів з ноотропною дією за умов стресу. Для профілактики стресорних порушень було застосовано мексидол, який має антиоксидантну та нейротропну дію. При одноразовому внутрішньоочере-винному введенні перед гострим стресом у дозі 100 мг/кг він вірогідно збільшує цитоз тимусу на 40%, попереджує зміни клітинного складу та активацію апоптозу в тимусі і селезінці (рис. 1). Мексидол запобігає розвитку нейтрофільо-зу (р<0,001) і еозинопенії (p<0,05), зменшує активність мієлопероксидази ПМЯЛ на 15% (р<0,05).
Мексидол при гострому стресі попереджує активацію ПОЛ у лімфоїдних органах, зокрема знижує вміст ТБКАП у селезінці в 2 рази порівняно з контролем (р<0,05). Передумовою превентивного впливу препарату на клітинні реакції в тимусі і селезінці можна вважати його здатність регулювати обмін глюкози в цих органах. Причому в тимусі він підвищує вміст пірувату (р<0,01), а в селезінці знижує вміст лактату (р<0,01) (рис. 2).
Здатність мексидолу гальмувати стимульовану продукцію активних метаболітів кисню в ПМЯЛ і знижувати експресію поверхневих глікопротеїнів цих клітин у дослідах in vitro вказує, що одним з механізмів дії препарату на лейкоцити є стабілізація їх клітинних мембран.
Рис. 2. Вплив мексидолу і пірацетаму на вміст піровиноградної (А) і молочної (Б) кислот у тимусі і селезінці при гострому стресі. 1 –стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 –стрес + мексидол; 3 –стрес + пірацетам; 100% - показники інтактних тварин; p<0,05 у порівнянні: * - з інтактними тваринами; ** - зі стресом.
Оскільки відомо, що мексидол гідролізується з утворенням 3-оксипіридинів і сукцинату (А.К. Сариев и соавт., 2001), в дослідах з препаратами, які є аналогами структурних компонентів мексидолу, показано, що емоксипін вірогідно знижує вміст інтермедіатів ПОЛ у селезінці, але не впливає на клітинні порушення, викликані гострим стресом у лімфоїдних органах і крові (рис. 3). Водночас натрію сукцинат вірогідно попереджує нейтрофільоз і еозинопенію, підвищує вміст лімфоцитів у крові. Він знижує вміст ТБКАП у селезінці і крові. Це свідчить, що дія мексидолу в лімфоїдних органах і крові за умов стресу значною мірою зумовлена сукцинатом, котрий входить до складу препарату.
Рис. 3. Порівняння профілактичної активності мексидолу, емоксипіну і натрію сукцинату при гострому стресі. А, Б, В –абсолютна кількість у крові нейтрофілів, лімфоцитів та еозинофілів відповідно; Г-ТБКАП, селезінка; Д-ТБКАП, кров. Групи тварин: 1 –стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 –стрес + мексидол; 3 –стрес +емоксипін; 4 –стрес + натрію сукцинат. 100% - показники інтактних тварин. р<0,05 у порівнянні: * - з інтактними тваринами; ** - зі стресом.
За даними дискримінантного аналізу всієї сукупності морфофункціо-нальних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові тварин, яким перед стресом вводили мексидол, дискримінантна функція 1,0 Е+16 перевищує константу –,8Е+15. Це вказує на належність зазначеної сукупності до умовної норми. Ефективність мексидолу при гострому стресі за сумою балів дорівнює +6 (табл. 1). Такі результати свідчать про наявність стреспротективної дії і узгоджуються з попередженням розвитку загальносоматичних ознак стресу.
Таблиця 1
Протективний ефект засобів з ноотропною дією за умов гострого стресу
|
Показники |
Мексидол |
Пірацетам |
|
Тимус: цитоз клітинний склад ТБК-активні продукти активність СОД |
+1 +1 |
+1 +1 +1 |
|
Селезінка: цитоз клітинний склад ТБК-активні продукти активність СОД |
0 +1 +1 |
-1 -1 |
|
Кров: кількість лейкоцитів лейкограма ТБК-активні продукти активність СОД |
0 +1 |
+1 -1 |
|
Поліморфноядерні лейкоцити: активність МПО ЛКТ життєздатність фагоцитоз |
+1 |
+1 -1 |
|
Протективний ефект (сума балів) |
+6 |
+1 |
Примітки:1. +1 –вірогідне попередження стресорних зрушень; 2. -1 –по-дальше поглиблення зрушень; 3. 0 –відсутність зрушень у порівнянні зі стресом.
Мексидол здатний попереджати стресорні порушення в кровотворних органах і крові, залежні як від гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи (зміни цитозу і клітинного складу тимусу, посилення апоптозу тимоцитів, еозинопенію), так і від симпатоадреналової системи (зміни клітинного складу селезінки, нейтрофільоз). Він також зменшує морфологічні ознаки активації надниркових залоз, зокрема ширину їх коркового і мозкового шару на 12% (р<0,05). Це свідчить, що основним механізмом протективної дії препарату є гальмування активності центральних стрес-реалізуючих систем. Вочевидь, його ініціальною ланкою є модифікація ГАМК-бенздіазепінового рецепторного комплексу в ЦНС і пов’язана з нею анксіолітична дія (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; К.М. Дюмаев и соавт., 1995). Вона веде до обмеження активності провідних стрес-реалізуючих систем і, відповідно, до зменшення зрушень у лімфоїдних органах і крові. Ще одним механізмом захисного впливу мексидолу є антиоксидантна дія в селезінці і оптимізація обміну глюкози в тимусі і селезінці з перевагою серед кінцевих продуктів гліколізу пірувату, який є основним субстратом циклу Кребса і антиоксидантом (К.Brand. 1997).
Інакше діє мексидол (100 мг/кг) при щоденному внутрішньоочеревинному введенні протягом хронічного гіпокінетичного стресу. На 15-у добу гіпокінезії препарат викликає вірогідне зниження кількості малих і середніх тимоцитів у тимусі, збільшує число нейтрофілів у крові в 2,6 рази (p<0,001) (рис.4), сприяє зростанню вмісту мієлобластів, промієлоцитів і мієлоцитів у кістковому мозку в 1,3 рази (рTМФ<0,025), підвищує активність СОД у селезінці (р<0,05).
Рис. 4. Вплив мексидолу на цитоз тимусу (1), селезінки (2) і кісткового мозку (3) та абсолютну кількість нейтрофілів у крові (4) при хронічній гіпокінезії (відхилення від показників при гіпокінезії без введення мексидолу, %). * р<0,05 у порівнянні з гіпокінезією.
За даними гістологічного дослідження такий вплив препарату супроводжується збереженням морфологічних ознак підвищеної активності коркового і мозкового шару надниркових залоз.
На 30-у добу експерименту мексидол збільшує цитоз тимусу в 2,3 рази (рТМФ <0,025) (рис. 4) за рахунок великих і малих тимоцитів, попереджує активацію екстрамедулярного гемопоезу в селезінці і запобігає пригніченню активності СОД у ній (р<0,05). Зазначені процеси відбуваються на фоні зменшення морфологічних ознак активності надниркових залоз порівняно з патологічним фоном - у корковому шарі спостерігається більше світлих клітин, зменшується стаз крові. Цитоз селезінки і кісткового мозку протягом хронічного гіпокінетичного стресу істотно не змінюється (рис.4).
Мексидол при хронічній гіпокінезії, поряд із впливом на окремі морфофунк-ціональні показники кровотворних органів і крові, змінює всю сукупність міцних вірогідних кореляцій між ними. Він збільшує кількість значущих зв’язків на 15-у добу і зменшує її на 30-у добу експерименту. За даними дискримінантного аналізу, загальний стан тимусу, селезінки, кісткового мозку і крові на 15-у добу належить до класу “стрес” (константа 1,12 Е+17, функція 1,01Е+17), а на 30-у добу –до умовної норми (константа 3,1Е+16, функція 3,5Е+16).
Таким чином, ефекти мексидолу залежать від терміну гіпокінезії. В усі строки хронічного стресу вони синергічні природним адаптаційним процесам. Відмінності в фармакодинаміці мексидолу при гострому і хронічному стресі, вочевидь, зумовлені переходом від швидкої неспецифічної (анксіолітичної) дії препарату до специфічної ноотропної активності при його багаторазовому застосуванні.
Відомий ноотроп пірацетам (100 і 300 мг/кг) при внутрішноочеревинному введенні за 30 хв до гострого стресу попереджує порушення цитозу і клітинного складу тимусу. При цьому він збільшує загальну кількість каріоцитів у вилочковій залозі на 68% і зменшує вміст великих тимоцитів на 34% (р<0,05). Препарат запобігає посиленню апоптозу в тимусі і селезінці. Профілактичне введення пірацетаму попереджує стресорні зміни в лейкоцитарній формулі крові (р<0,01) і активацію мієлопероксидази ПМЯЛ (р<0,01).
Вплив пірацетаму на клітинні реакції відбувається на фоні підтримання на рівні норми активності СОД тимусу (p<0,05), зниження вмісту ТБКАП у селезінці на 33% (р<0,05) і активації СОД у цьому органі на 57% (р<0,05) порівняно зі стресом без фармакопрофілактики. Пірацетам сприяє зрушенню співвідношення лактат/піруват у лімфоїдних органах вбік останього подібно до мексидолу (рис.2).
Ефекти пірацетаму супроводжуються усуненням морфологічних ознак активності надниркових залоз, зокрема зменшенням ширини їх коркової і мозкової речовини на 16% і 14% відповідно (p<0,05).
Пірацетам запобігає стресорному збільшенню кількості міцних вірогідних кореляцій серед морфофункціональних показників системи крові і попереджує порушення розподілу дисперсії значущих зв’язків. За даними дискримінантного аналізу, коли дискримінантна функція 1,9Е+18 перевищує константу 8,1Е+17, загальний стан лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові при застосуванні пірацетаму наближується до умовної норми. Згідно з розробленим способом ефективність пірацетаму при стресі дорівнює +1 бал (табл.1). Це означає, що дія пірацетаму при введенні перед гострим стресом є протективною. Такий висновок узгоджується з гальмівним впливом препарату на розвиток загальносоматичних ознак стресу.
Попередження пірацетамом клітинних реакцій, залежних від гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи (зменшення цитозу тимусу, активація апоптозу в тимусі, лімфопенія), та процесів, залежних від симпатоадреналової системи (нейтрофільоз), разом із структурними змінами в надниркових залозах свідчить, що механізм дії пірацетаму при стресі зумовлений гальмуванням активності центральних стрес-реалізуючих систем. Антиоксидантна дія препарату і зміни під його впливом вмісту продуктів гліколізу в тимусі і селезінці вказують на наявність у пірацетаму периферичних механізмів стреспротективної дії в кровотворних органах.
При порівнянні ефектів мексидолу і пірацетаму встановлено, що вони мають спільні риси фармакодинаміки при гострому стресі: попереджають зміни цитозу тимусу і вмісту в ньому великих тимоцитів і бластів, запобігають активації апоптозу в лімфоїдних органах, попереджають стресорні зрушення лейкоцитарної формули крові і активацію МПО лейкоцитів. Спільність існує також стосовно дії ноотропних препаратів на структуру надниркових залоз, антиоксидантних ефектів і змін концентрації лактату і пірувату в лімфоїдних органах. Вочевидь, виявлені особливості є закономірними для протективної дії ноотропів різної хімічної структури при гострому стресі.
Ефективність регуляторних пептидів за умов стресу. Відомо, що окситоцин і вазопресин в організмі регулюють стрес-реакцію, перебуваючи в динамічній взаємодії між собою (C.S. Carter, M. Altemus, 1997). Поєднана дія окситоцину і вазопресину була досліджена при застосуванні препарату пітуїтрину (1 ОД/кг), який містить зазначені пептиди. За умов гострого стресу він вірогідно збільшує цитоз тимусу на 71% і сприяє збереженню вмісту великих тимоцитів і бластів у тимусі на рівні показників інтактних тварин (р<0,05). Препарат зменшує міжнуклеосомну фрагментацію ДНК з селезінки щурів, що свідчить про попередження стрес-індукованого апоптозу в цьому органі. Для розуміння механізмів дії пітуїтрину важливо, що він підтримує на рівні норми стан поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові, зменшуючи їх експресію в 1,3 рази (рис. 5). Препарат також попереджує активацію СОД у тимусі і селезінці (р<0,001). Вплив пітуїтрину на лімфоїдні органи і клітини крові за умов гострого стресу не супроводжується зменшенням морфологічних ознак підвищеної активності коркової і мозкової речовини надниркових залоз.
Пітуїтрин запобігає стресорному збільшенню кількості міцних вірогідних кореляцій серед морфофункціональних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові. Він сприяє збереженню на рівні норми розподілу дисперсії зв’язків (табл.2). За даними дискримінантного аналізу, коли дискримі-нантна константа становить 8,3Е+16, а функція дорівнює 2,1Е+17, сукупність показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові тварин, які перед стресом одержували пітуїтрин, наближується до умовної норми. За сумою балів, ефективність пітуїтрину дорівнює +4. Це свідчить про наявність стреспротективної дії і узгоджується зі здатністю препарату зменшувати класичні загальносоматичні ознаки стресу – інволюцію тимусу і пошкодження
%
**
*
слизової оболонки шлунка.
Рис. 5. Середній цитохімічний коефіцієнт поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові при введенні пітуїтрину перед гострим стресом. 1 – стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 – стрес + пітуїтрин. 100% – показники інтактних тварин. р <0,05 у порівнянні: * – з інтактними щурами, ** – зі стресом.
Слід вважати, що в основі протективних ефектів пітуїтрину стосовно порушень у лімфоїдних органах і крові знаходиться дія на стан мембранних структур лімфоцитів і активність антиоксидантних ферментів у тимусі і селезінці. Вочевидь, вона обмежує вплив глюкокортикоїдів і катехоламінів на клітинні процеси в системі крові щурів, підданих стресу.
Поряд із природним пептидним комплексом пітуїтрином досліджено ефекти окремих регуляторних пептидів – окситоцину і тироліберину, які беруть участь у формуванні відповіді на стрес (А.И. Робу, 1989; Я.Х. Туракулов и соавт., 1993; I.D. Neunann et al., 2000; D.А. Robinson, 2002). Показано, що ці пептиди модифікують окремі клітинні реакції і процеси ПОЛ у лімфоїдних органах і крові, але не виявляють стреспротективної дії. Зокрема, окситоцин (1 ОД/кг) вірогідно поглиблює стресорні зрушення в лейкоцитарній формулі крові і викликає подальше зниження рівня ПОЛ у селезінці на 35% (р<0,01), хоча при цьому попереджує активацію СОД у тимусі (р<0,001) і селезінці (р<0,05). Тироліберин (0,04 мл/кг) за умов гострого стресу сприяє подальшій декатіонізації ПМЯЛ, знижуючи ЛКТ на 33% (р<0,05), а також підвищує активність СОД селезінки на 61% (р<0,001), хоча водночас попереджує активацію СОД у тимусі (р<0,001).
Таблиця 2
Вплив пітуїтрину на кількісні характеристики сукупності попарних
лінійних кореляцій між морфофункціональними показниками лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові при гострому стресі (n=22)
|
Показники |
Інтактні тварини |
Стрес |
Стрес + пітуїтрин |
|
Кількість елементів кореляційної матриці |
576 |
576 |
576 |
|
Кількість міцних вірогідних кореляцій |
104 |
134 |
102 |
|
Кількість кореляційних плеяд |
1 |
1 |
1 |
|
Потужність плеяди |
34 |
34 |
34 |
|
Міцність плеяди |
0,81 |
0,82 |
0,79 |
|
Кількість зв’язків за участю параметрів: тимусу |
48 |
52 |
49 |
|
селезінки |
44 |
60 |
40 |
|
кісткового мозку |
5 |
6 |
6 |
|
крові |
47 |
49 |
44 |
|
ПМЯЛ |
35 |
46 |
33 |
Таким чином, пітуїтрин виявляє більшу стреспротективну дію, ніж окремі короткі гіпоталамічні пептиди, що узгоджується з даними літератури про їх функціонування лише в складі широкого пептидного континууму (И.П. Ашмарин, 1992; Л.А. Громов, 1992).
Пептидвміщуючий препарат церебролізин (0,1 мл/кг) при гострому стресі попереджує зміни клітинного складу тимусу, зменшуючи вміст великих тимоцитів і бластів на 41% (р<0,05) порівняно з патологічним фоном. Він гальмує апоптоз у селезінці та запобігає активації МПО і фагоцитозу ПМЯЛ, знижуючи ці показники на 11% (р<0,01) і 45% (р<0,05) у порівнянні з такими при стресі. Церебролізин також впливає на стан ПОЛ і процеси гліколізу в лімфоїдних органах - знижує вміст проміжних продуктів ПОЛ у тимусі на 31% (р<0,05), підвищує активність СОД у селезінці в 1,5 рази (р<0,05), зменшує вміст лактату в цьому органі (р<0,02). Гістологічна картина і морфометричні показники надниркових залоз щурів при застосуванні церебролізину не відрізняються від таких у контролі.
Особливістю фармакодинаміки даного препарату є превентивний вплив на розподіл дисперсії міцних кореляцій у системі крові без змін їх загальної кількості. За даними дискримінантного аналізу, коли дискримінантна константа 8,1Е+17 менша за функцію 2,5Е+18, стан лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові вцілому при введенні церебролізину перед гострим стресом відповідає умовній нормі. При застосуванні загальної схеми дослідження ефективність церебролізину оцінюється в +1 бал. Це означає, що дія препарату є стреспротективною.
Одержані результати дозволяють стверджувати, що механізм дії церебролізину в лімфоїдних органах і крові при гострому стресі пов’язаний з його антиоксидантними властивостями і зниженням вмісту лактату в селезінці. Найбільш імовірно, що в основі такої дії церебролізину знаходиться вплив на А1-аденозинорецептори лімфоїдних клітин, як це має місце в ЦНС (H. Xiong еt al., 1995).
Екстракт неокортексу SNC (1 мг/кг, внутрішньоочеревинно) при гострому стресі (ЕБС) вірогідно попереджує зниження кількості В-клітин і запобігає активації апоптозу в селезінці. Він істотно підвищує активність СОД і зменшує вміст ТБКАП у цьому органі. Зміни клітинного складу селезінки і гальмування ПОЛ створюють умови для попередження імунодепресії, зумовленої гострим стресом. Це характеризується підвищенням кількості антитілоутворюючих клітин у селезінці в 2,7 рази (р<0,001) і зростанням титру гемаглютинінів у 1,7 рази (р<0,05) порівняно з імунізацією на фоні стресу без введення екстракту неокортексу. В крові SNC різко знижує активність МПО лейкоцитів (р<0,001).
При введенні екстракту неокортексу (1/мг/кг) в м’язи перед гострим іммобілізаційним стресом він вірогідно збільшує цитоз селезінки і кількість в ній В-лімфоцитів. За цих умов SNC посилює стресорні зміни в лейкоцитарній формулі крові і не впливає на ПМЯЛ. Водночас він справляє антиоксидантну дію в тимусі (р<0,05), знижує вміст ТБКАП і активність СОД у селезінці (p<0,01). Це показує, що фармакодинаміка SNC залежить від шляху його введення, але її постійними компонентами є вплив на клітинні зрушення в селезінці і процеси пероксидації.
Гістологічна будова і морфометричні показники надниркових залоз при застосуванні SNC не відрізняються від таких при стресі.
Відмічено також превентивний вплив екстракту неокортексу на загальну кількість та розподіл міцних кореляцій у системі крові.
За даними дискримінантного аналізу, коли дискримінантна константа дорівнює 5,4Е+18, а функція 1,7Е+19, стан кровотворних органів і крові при внутрішньоочеревинному введенні екстракту неокортексу перед гострим стресом наближується до такого в інтактних тварин. Ефективність SNC за цих умов дорівнює +3 бали. Аналогічну ефективність (+2 бали) екстракт неокортексу SNC має й при внутрішньом’язовому введенні перед гострим іммобілізаційним стресом. Це свідчить, що SNC справляє стреспротективну дію і узгоджується із його превентивним впливом на один з компонентів тріади Сел’є, а саме на пошкодження шлунку.
З метою вивчення механізмів дії SNC було досліджено його ефекти на фоні блокади опіаторецепторів налоксоном. Результати досліджень свідчать, що існує функціональний антагонізм між SNC і блокатором стосовно стресорних порушень у тимусі, селезінці та кістковому мозку. Зокрема, екстракт неокортексу, введений разом із налоксоном перед гострим стресом, зменшує цитоз тимусу порівняно з дією самого блокатору (р<0,05). При цьому цитоз селезінки зростає на 80% (р<0,05), а цитоз кісткового мозку вірогідно зменшується в порівнянні з таким за умов дії налоксону на фоні стресу. В селезінці SNC вдвічі збільшує активність СОД (р<0,05) і попереджує накопичення ТБКАП (р<0,05), котре викликав налоксон при стресі. Наведені результати означають, що дія SNC реалізується за участю опіатергічних механізмів.
Таким чином, одним із підсумків роботи є встановлення стреспротек-тивної дії в регуляторних пептидів із нейротрофічними властивостями (церебролізин, SNC) і пітуїтрину. Спільним у стреспротективних ефектах пітуїтрину, церебролізину і SNC є запобіжний вплив на міграцію лімфоцитів, апоптоз у селезінці і процеси ПОЛ у лімфоїдних органах. Перевага "внутрішньосистемних" механізмів у захисній дії регуляторних пептидів на лімфоїдні органи і кров щурів, підданих стресу, імовірно, пояснюється тим, що їхні клітини експресують рецептори до цих пептидів, а стрес впливає на рецепцію нейропептидів у тимусі і селезінці (D.S. Jessop et al., 1997).
На системному рівні протективна дія досліджених засобів при гострому стресі закономірно супроводжується попередженням стресорного збільшення кількості міцних вірогідних кореляцій між морфофункціональними показниками кровотворних органів і крові та змін розподілу дисперсії зв’язків. Вочевидь, менша кількість зв’язків відображає більшу пластичність процесів, полегшує реалізацію оптимальних програм адаптації. В основі даного явища може знаходитись вплив ноотропів і регуляторних пептидів на процеси саморегуляції в системі крові та її відгук на далекорангові сигнали, зумовлені активацією гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової і симпатоадреналової систем.
Нами встановлено, що серед фармакодинамічних ефектів кожного засобу поряд із попередженням порушень реєструється й поглиблення стресорних зрушень окремих показників, тому стреспротективна дія може бути об’єктивно оцінена лише на системному рівні. Вона має кількісні характеристики, доступні дискримінантному аналізу. За даними цього аналізу, мексидол універсально попереджує стресорні зрушення сукупності кількісних показників кожного з органів (тимусу, селезінки, крові). Водночас стреспротективна дія пірацетаму поступається мексидолу тим, що не позначається на сукупностях кількісних характеристик селезінки і ПМЯЛ. Ефекти пітуїтрину не супроводжуються попередженням порушень сукупності показників крові. На фоні протективної дії церебролізину комплекс параметрів селезінки і сукупність морфофункціональ-них показників крові відповідають таким при стресі. Екстракт неокортексу SNC, за даними дискримінантного аналізу, справляє протективну дію на лімфоїдні органи, кістковий мозок і кров уцілому, але при цьому сукупності показників тимусу і крові лишаються на рівні таких при стресі без фармакопрофілактики.
З метою виявлення найбільш активних засобів для профілактики стресорних порушень може бути застосований як дискримінантний аналіз, так і спрощений логікоматематичний спосіб оцінки ефективності фармакологічних засобів при стресі. Застосовуючи цей спосіб до комплексу морфофункціональ-них і біохімічних показників кровотворних органів і крові, вивчені фармаколо-гічні засоби можна розподілити за їх ефективністю при гострому стресі наступним чином: мексидол > пітуїтрин > SNC > пірацетам = церебролізин. Важливо зазначити, що для всіх засобів, за винятком церебролізину, характерне попередження розвитку класичних загальносоматичних ознак стресу.
Таким чином, дослідження фармакодинаміки і порівняльний аналіз ефективності препаратів з ноотропною дією (мексидолу, пірацетаму) та регуляторних пептидів (пітуїтрину, окситоцину, ТРГ, церебролізину, екстракту неокортексу SNC) у кровотворних органах і крові при стресі дозволили встановити, що найбільш ефективним препаратом для профілактики стресорних порушень є мексидол.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми – профілактики порушень у кровотворних органах і крові, викликаних гострим і хронічним стресом, шляхом застосування препаратів з ноотропною дією і регуляторних пептидів.
1. Гострий стрес у стадії тривоги викликає у білих щурів і мишей клітинні порушення в лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові: вірогідне зменшення цитозу тимусу на 49%, збільшення вмісту великих тимоцитів і бластів на 62%, зниження цитозу селезінки на 24% і зростання в ній вмісту Т-лімфоцитів, збільшення цитозу кісткового мозку на 62%, лімфопенію, еозинопенію та нейтрофільоз. Одним із механізмів зниження цитозу тимусу і селезінки при гострому стресі є посилення апоптозу, яке виявляється міжнуклеосомною фрагментацією ДНК. Зміни функціонального стану лімфоцитів характеризуються посиленням експресії їх поверхневих глікопротеїнів на 33% (р<0,05). Рання реакція гранулоцитів на стресорний вплив полягає в підвищенні показника фагоцитозу, зниженні тесту з нітросинім тетразолієм і збільшенні активності мієлопероксидази.
2. Хронічний гіпокінетичний стрес характеризується стадійністю клітин-них реакцій в лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові. На 15-у добу гіпокінезії реєструються максимальні відхилення від норми: в тимусі цитоз і кількість великих тимоцитів вірогідно зменшуются на 91% і 45% відповідно, в кістковому мозку вміст мієлобластів, промієлоцитів і мієлоцитів зростає в 1,5 рази. На 30-у добу цитоз тимусу відновлюється, в селезінці вірогідно зростає вміст еритроїдних клітин.
3. Мексидол (100 мг/кг) при одноразовому внутрішньоочеревинному введенні білим щурам і мишам за 30 хв до гострого стресу справляє протективну дію, що полягає у вірогідному збільшенні цитозу тимусу на 40%, попередженні змін клітинного складу тимусу і селезінки, запобіганні активації апоптозу в цих органах, нейтрофільозу, еозинопенії, а також у зниженні активності мієлопероксидази поліморфноядерних лейкоцитів на 15%. Такий ефект мексидолу супроводжується послабленням морфологічних ознак активації надниркових залоз (вірогідне зменшення ширини коркового і мозкового шару на 12%), а також антиоксидантною дією в селезінці і зміною в тимусі і селезінці співвідношення вмісту лактату і пірувату на користь піровиноградної кислоти.
4. Дія мексидолу (100 мг/кг) при щоденному внутрішньоочеревинному введенні щурам протягом 30 діб в лікувальнопрофілактичному режимі при хронічному гіпокінетичному стресі синергічна природним адаптаційним процесам в лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові. На 15-у добу гіпокінезії це виявляється вірогідним зниженням у тимусі кількості малих і середніх тимоцитів, розвитком нейтрофільозу, збільшенням вмісту молодих клітин гранулоцитарного ряду в кістковому мозку. На 30-у добу під впливом мексидолу відбувається суттєве зростання цитозу тимусу, чисельності великих та малих тимоцитів у тимусі, попереджується екстрамедулярне кровотворення в селезінці. Ефекти мексидолу супроводжуються збереженням морфологічних ознак підвищеної активності надниркових залоз на 15-у добу та збільшенням у них кількості світлих клітин на 30-у добу гіпокінетичного стресу.
5. Пірацетам (100 і 300 мг/кг) при одноразовому внутрішньоочеревинному введенні щурам за 30 хв до гострого стресу справляє захисну дію – вірогідно збільшує цитоз тимусу на 68%, попереджує зміни його клітинного складу, запобігає посиленню апоптозу в тимусі і селезінці, зрушенням лейкоцитарної формули крові і активації мієлопероксидази лейкоцитів. При цьому послаблюються морфологічні ознаки активації надниркових залоз, що характеризується вірогідним зменшенням ширини їх коркового і мозкового шару на 16% і 14% відповідно. Стреспротективні ефекти пірацетаму обумовлені антиоксидантною дією препарату в тимусі і селезінці, а також змінами співвідношення вмісту лактату і пірувату в лімфоїдних органах на користь піровиноградної кислоти.
6. Пітуїтрин (1 ОД/кг) при одноразовому внутрішньом’язовому введенні щурам перед гострим стресом має протективну дію, що виявляється вірогідним збільшенням цитозу тимусу на 71%, попередженням змін його клітинного складу і посилення апоптозу в селезінці. Захисний вплив препарату зумовлений підтриманням на рівні норми експресії мембранних рецепторів лімфоцитів та антиоксидантного захисту в тимусі і селезінці. Пітуїтрин не зменшує морфологічних ознак активації надниркових залоз.
Окситоцин (1 ОД/кг) і тироліберин (0,04 мг/кг) при одноразовому внутрішньом’язовому введенні щурам перед гострим стресом не справляють протективної дії на кровотворні органи і кров.
7. Церебролізин (0,1 мл/кг) при одноразовому внутрішньоочеревинному введенні щурам за 30 хв до гострого стресу вірогідно зменшує вміст великих тимоцитів у тимусі на 41%, попереджує посилення апоптозу в селезінці, знижує показник фагоцитозу на 45% і активність мієлопероксидази поліморфноядерних лейкоцитів на 11% у порівнянні з патологічним фоном. Одним з механізмів дії церебролізину є антиоксидантний вплив на лімфоїдні органи (зменшення вмісту проміжних продуктів перекисного окислення ліпідів у тимусі, підвищення активності супероксиддисмутази в селезінці), а також зниження вмісту лактату в селезінці. Ефекти церебролізину не супроводжуються зменшенням морфологічних ознак активації надниркових залоз.
8. Природний комплекс регуляторних пептидів SNC (1 мг/кг) при одноразовому внутрішньом’язовому та внутрішньоочеревинному введенні щурам перед гострим стресом вірогідно збільшує цитоз селезінки і вміст в ній В-лімфоцитів, запобігає посиленню апоптозу в селезінці, а також попереджує активацію мієлопероксидази поліморфноядерних лейкоцитів. Ефекти SNC зумовлені пригніченням процесів перекисного окислення ліпідів у тимусі і селезінці. Вони відбуваються за посередництвом опіаторецепторів, що характеризується антагонізмом ефектів SNC і налоксону стосовно стресорних зрушень цитозу тимусу, селезінки і кісткового мозку. Завдяки впливу на клітинні реакції і процеси пероксидації в лімфоїдних органах SNC попереджує стресорну імунодепресію, що характеризується суттєвим підвищенням кількості антитілоутворюючих клітин у селезінці в 2,7 рази і титру гемаглютинінів у 1,7 рази.
9. Гострий стрес у стадії тривоги супроводжується збільшенням кількості міцних вірогідних кореляцій між показниками лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові, а також змінами дисперсії значущих зв’язків, з яких найбільш постійними є збільшення числа кореляцій за участю морфофункціональних параметрів селезінки та взаємозв’язків між клітинними показниками і параметрами перекисного окислення ліпідів. Протективна дія ноотропів (пірацетаму) і регуляторних пептидів (пітуїтрину, екстракту неокортексу SNC) при гострому стресі закономірно супроводжується зменшенням загальної кількості міцних вірогідних кореляцій у системі крові та підтриманням на рівні норми розподілу їх дисперсії.
Хронічний гіпокінетичний стрес на 15-у і 30-у добу характеризується зменшенням загальної кількості міцних вірогідних кореляцій між морфофункціональними показниками лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові. Мексидол збільшує кількість значущих кореляцій на 15-у добу і зменшує її на 30-у добу гіпокінезії, що свідчить про прискорення адаптативних процесів під впливом препарату.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. Наявність у мексидолу (100 мг/кг, парентерально) профілактичної дії стосовно порушень у кровотворних органах і крові, викликаних гострим стресом і хронічною гіпокінезією, доцільно враховувати при наданні невідкладної допомоги при гострих розладах мозкового кровообігу, а також при застосуванні препарату в період тривалої гіпокінезії.
2. Здатність пірацетаму (100 і 300 мг/кг, парентерально) запобігати стресорним порушенням, які виникають у тимусі, селезінці і крові під дією гострого стресу, може бути врахована при використанні максимальних терапевтичних доз препарату в лікуванні невідкладних станів, котрі мають стресорний компонент у своєму патогенезі (травма, гостре отруєння), а також при застосуванні пірацетаму в осіб, що перебувають в екстремальних ситуаціях (бойовий стрес, ліквідація наслідків аварій і катастроф).
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Анотації
Важнича О.М. Ефективність засобів з ноотропною дією і регуляторних пептидів при стресі (експериментальне дослідження) - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2003.
Дисертація присвячена вивченню ефективності ноотропів (мексидолу і пірацетаму) і регуляторних пептидів (пітуїтрину, окситоцину, тироліберину, церебролізину, екстракту неокортексу SNC) стосовно зрушень у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові при стресі. Встановлено захисний вплив мексидолу і пірацетаму на лімфоїдні органи і клітини крові при стресі, який зумовлений зменшенням активності надниркових залоз, модифікацією перекисного окислення ліпідів і обміну глюкози. Показано наявність протективної дії пітуїтрину і церебролізину при гострому стресі, яка стосується міграції лімфоцитів і апоптозу. Встановлено, що регуляторні пептиди в складі SNC мають стреспротективну дію. Вплив SNC на лімфоїдні органи грунтується на опіатергічних механізмах. Він створює основу для попередження стресорної імунодепресії. Комплекси пептидів є більш ефективними стреспротективними засобами, ніж окремі пептиди (окситоцин і тироліберин). Доведено, що стреспротективна дія ноотропів і регуляторних пептидів у системі крові має кількісний еквівалент, доступний методам системного аналізу. Це дозволило порівняти ефективність фармакологічних засобів при стресі і встановити, що мексидол є найбільш активним препаратом для профілактики стресорних порушень у кровотворних органах і крові.
Ключові слова: стрес, тимус, селезінка, кістковий мозок, кров, регуляторні пептиди, ноотропи.
Важничая Е.М. Эффективность средств с ноотропным действием и регуляторных пептидов при стрессе (экспериментальное исследование). – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Институт фармакологии и токсикологии МЗ Украины, Киев, 2003.
Диссертация посвящена изучению протективного действия ноотропов и регуляторных пептидов на процессы в лимфоидных органах, костном мозге и крови при стрессе.
В условиях стресса и его профилактики на 339 белых крысах и 69 мышах изучены цитологические показатели тимуса, селезенки, костного мозга и крови, цитохимические и биохимические реакции, параметры гуморального иммунитета и состояние апоптоза. Для профилактики стрессорных нарушений использованы средства с ноотропным действием (пирацетам, мексидол) и регуляторные пептиды (тиролиберин, окситоцин, питуитрин, церебролизин, екстракт неокортекса SNC). Механизмы действия мексидола изучены в опытах in vitro на крови здоровых доноров. При исследовании регуляторных пептидов использована блокада опиаторецепторов. Проведено гистологическое исследование и морфометрия надпочечников. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики, корреляционного и дискриминантного анализа.
Установлено, что мексидол (100 мг/кг) предупреждает изменения клеточ-ного состава тимуса, селезенки и крови, тормозит апоптоз, снижает миелопе-роксидазную активность полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) при остром стрессе. Действие мексидола (100 мг/кг) при хроническом гипокинетическом стрессе синергично естественным адаптационным процессам.
Пирацетам (100 и 300 мг/кг) проявляет выраженное протективное действие при остром стрессе. Он предупреждает изменения цитоза и клеточного состава тимуса, уменьшает межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимусе и селезенке, стрессорные сдвиги в лейкоцитарной формуле крови и активацию миелопероксидазы ПМЯЛ.
У обоих ноотропных препаратов эти процессы сопровождаются уменьшением морфологических признаков повышенной активности надпочеч-ников, антиоксидантным действием и сдвигом в лимфоидных органах соотно-шения пируват/лактат в сторону пирувата.
Установлено, что питуитрин (1 ЕД/кг) оказывает протективное действие при остром стрессе, которое заключается в предупреждении изменений цитоза и клеточного состава тимуса, а также в уменьшении межнуклеосомной фрагментации ДНК в селезенке. Эти эффекты основываются на модификации мембранных рецепторов лимфоцитов и антиоксидантной защиты в лимфоидных органах.
Гипоталамические пептиды тиролиберин (0,04 мг/кг) и окситоцин
(1 ЕД/кг) при остром стрессе регулируют отдельные клеточные реакции и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в лимфоидных органах и крови, что не придает защитного характера их действию на системном уровне.
Показано, что церебролизин (0,1 мл/кг) при остром стрессе предупреждает изменения клеточного состава тимуса, уменьшает межнуклеосомную фрагмен-тацию ДНК в селезенке, снижает активность ПМЯЛ. В основе влияния церебролизина на лимфоидные органы находится снижение ПОЛ, активация антиоксидантной защиты и уменьшение содержания лактата в селезенке.
Установлено, что экстракт неокортекса SNC (1 мг/кг) имеет стресспротективное действие, которое проявляется увеличением цитоза селезенки, торможением апоптоза спленоцитов, а также предупреждением изменений кислородзависимой бактерицидности и фагоцитоза ПМЯЛ. Результатом этих изменений является предупреждение стрессорной иммуносупрессии. В их основе находятся опиатергические механизмы и снижение ПОЛ в лимфоидних органах.
Показано, что вывод о наличии стресспротективного действия у препарата может быть сделан только на системном уровне. Разработана количественная оценка протективного действия препаратов при стрессе на основании методов системного анализа, что позволяет проводить отбор наиболее эффективных средств для профилактики стрессорных нарушений. С этих позиций доказано, что мексидол является наиболее эффективным препаратом для предупреждения нарушений в кроветворных органах и крови при стрессе.
Ключевые слова: стресс, тимус, селезенка, костный мозг, кровь, регуляторные пептиды, ноотропы.
Vazhnichaya Ye.M. The effectiveness of nootropic drugs and regulatory peptides at stress (experimental investigation) – Manuscript.
Thesis for obtaining a scientific degree Doctor of Medical Sciences in speciality 14.03.05 – Pharmacology.- Institute of Pharmacology and Toxicololgy of the Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.
The thesis is devoted to studing the effectiveness of the protective action of nootrops (mexidol and piracetam) and regulatory peptides (pituitrin, oxytocin, thyroliberin, cerebrolysin, neocortical extract SNC) upon the processes in lymphoid organs, bone marrow and blood under stress conditions. It is established, that the protective influence of nootropic drugs using mexidol and piracetam on lymphoid organs and blood cells is grounded on the decrease of the activity of adrenal glands as well as on the modification of lipid peroxidation and glucose metabolism. The existance of stressprotection by pituitrin and cerebrolysin, which caused lymphocytes' migration and apoptosis, is shown. It is found that regulatory peptides of SNC have stressprotective effect. SNC's influence on lymphoid organs is based on opiatergic mechanisms. It forms the ground for the prevention of stressoric immune suppression. Peptides’ complexes are more effective stressprotective agents than individual peptides (oxytocin and thyroliberin). It is proved, that stressprotective effects of regulatory peptides and nootrops in the blood system have quantitative equivalent, determined by systemic analysis methods. It has permitted to compare the effectiveness of pharmacological remedies under stress conditions and to determine that mexidol is the most active drug for the prophylaxis treatment of stressoric disorders in the blood system.
Key words: stress, thymus, spleen, bone marrow, blood, regulatory peptides, nootropic drugs.
Підписано до друку 04.12.2003 р. Формат 60Х90/16.
Папір офсетний. Умовн. Друкар. Лис. 0,9. Тираж 100 прим.
Надруковано в поліграфічному центрі ТОВ “КопіЦентр”,
М. Полтава, вул. Ст. Фронту, 29, к. 223, тел. 3-84-69, 3-85-34