Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция 3
Ранее мы рассмотрели три группы механизмов репликации вирусной ДНК по способу инициации синтеза ДНК.
1.Образование РНК-затравки на о.ц. ДНК-матрице
а) с помощью РНК полимеразы
б) с помощью праймазы
2.Инициация с внесением разрывов в д.ц. ДНК-матрицу
3.Нуклеотид-белковая затравка
Инициация с образованием внутренней затравки на двуцепочечной ДНК-матрице без внесения разрывов.
Задача: локально расплести ДНК и посадить хеликазу с праймазой.
Решить эту задачу можно несколькими способами.
Papilloma
Polioma
Vacuolating virises (SV 40 (Simian Vacuolating Virus))
Размер генома примерно одинаков: вирусы папилломы – 8 т.п.н., полиомы – 5 т.п.н. Детально мы рассмотрим вирусы полиомы и SV 40.
Хозяева: SV 40 – приматы
Полиомы – мышиные
Место репликации: в ядре, находящемся в S-фазе. SV 40 может переводить клетку в S-фазу клеточного цикла.
Схема репликации: Θ-схема (Cхема Кернса).
Придумана Кернсом 40 л.н для объяснения репликации ДНК E.coli. Было известно, что геном E.coli представлен кольцевой молекулой. Кернс понял, что основной проблемой в ее репликации – устранение топологических препятствий (о сверхспиральности в то время не имели понятия). Он предположил, что должен быть «шарнир», позволяющий вращаться одной цепи ДНК вокруг другой. Сейчас этим «шарниром» мы называем топоизомеру.
У молекулы ДНК, реплицирующейся согласно схеме Кернса, имеется участок, называемый ori.
SV 40.
Геном представлен двуцепочечной кольцевой ДНК. В геноме закодирован белок – большой Т-Ag (80 кДа). Он единственный вирусный белок участвующий в репликации ДНК. Белок полифункционален:
1.способен взаимодействовать с рядом TF (переход клетки в S-фазу)
2.сам является TF (синтез вирусных белков)
3.узнает ori (т.е. отностся к группе белков OBP-Ori Binding Proteins)
4.способен к олигомеризации. В присутствии АТФ и ori образует кольцевой гексамер.
5.обладает хеликазной активностью (3'-5')
Примечание: может неспецифически взаимодействовать с о.ц.ДНК.
Структура ori SV 40.
ori состоит из трех участков. В этих находятся пентануклеотидные последовательности GAGGC ( ), узнаваемые T-Ag. В III участке находятся повторы 21, 22 п.н.
Во II втором участке находится ORE (Ori Recognition Element), с которым связывается T-Ag, он входит в состав CORE (Core Ori Recognition Element) длиной 64 п.н., и фланкирован c одной стороны А/Т богатым участком, с другой - Pu/Py последовательностью. Общая длина ori со всеми прилегающими участками – 170 п.н.
Сила взаимодействия T-Ag с ORE зависит от степени его фосфорилирования.
Инициация репликации SV 40.
Далее T-Ag проявляет хеликазную активность (3'-5') и расплетает область Ori. На о.ц. ДНК тут же садятся олигомеры RPA (Replicating protein A, аналог SSB E.coli). Затем с расплетенным участком связывается ДНКpolα/праймаза. В комплексе устанавливается физическое взаимодействие T-Ag с RPA и ДНКpolα. ДНКpolα синтезирует РНК-ДНК затравку: короткий олигорибонуклеотид (10 нт) и короткий олигодезоксирибонуклеотид (~20 нт).
T-Ag специфически узнает клеточные белки RPA и ДНКpolα только приматов. Этим и ограничен круг хозяев SV40.
Примечание: внешние факторы, определяющие хозяева вирусов – белки оболочки, в данном случае мы встречаемся с внутренними факторами.
В комплекс входят также клеточная топоизомераза I, устраняющая топологические проблемы (также взаимодействует с Т-Ag) и протеинфосфатаза, регулирующая степень фосфорилированности T-Ag.
Примечание: ДНК SV40 упакована в нуклеосомы (около 20 нуклеосом), т.е. представляет собой минихромосому. Одна из нуклеосом позиционирована на ori и делает его недоступным для взаимодействия с T-Ag. Освобождают ori клеточные комплексы ремоделирования.
Инициация репликации у вирусов полиомы.
Все в принципе то же самое отличие в том, что вместо пентануклеотидных повторов в ori находятся гексануклеотидные и их положение немного отличается.
Элонгация репликации SV40.
ДНКpolα непроцессивный фермент, не обладающий 3'-5' экзонуклеазной активностью (proofreading activity), поэтому часто ошибается и часто соскакивает с ДНК. Она далее замещается на высокопроцессивный фермент ДНКpolδ. Репликация двусторонняя (хотя есть случаи односторонней репликации). Считается, гексамеры T-Ag закреплены на ядерных структурах, поэтому ДНК протаскивается через них.
Примечание: при репликации ДНК одна из синтезируемых цепей является "лидирующей", она синтезируется непрерывно, другая цепь называется отстающей, поскольку синтезируется фрагментами. Полимераза должна уметь делать все, при этом оставаясь связанной с T-Ag. Тогда получается, что T-Ag, связанный с 3'-5' цепью, физически движется в противоположную сторону относительно ДНКpolα, находящейся на 5'-3' цепи.
Умозрительное объяснение этого факта – модель "трубы".
В результате работы комплекса, включающего T-Ag и полимеразы, образуется репликативный " глазок ". По мере появления на 5'-3' цепи участков, на которых возможен синтез
Соединение фрагментов Оказаки.
Может участвовать РНКазаН, но здесь, видимо, работает иной механизм с участием эндонуклеазы FEN (Flap(фартук) ENdonuclease).
Терминация репликации ДНК SV40.
Структура как у любого уважающего себя фага: головка с хвостом. Сателлитный фаг: образует потомство лишь в присутствии фага Р2. ДНК реплицируется в отстутствие фага Р2, но без Р2 нет упаковки в частицы, поскольку геном Р4 не кодирует структурные белки и фермент для созревания ДНК. Геном кодирует белок А.
Ori узнается вирусным белком А (~80 кДа). А белок, как и T-Ag, полифункционален:
1.связывается с ori и с CRR (С-концевым ДНК-связывающим доменом);
2.способен к димеризации;
3.АТФ-зависимая хеликаза (3'-5');
4.праймаза (в отличие от T-Ag).
Репликация осуществляется по схеме Кернса. В инициации участвует вирусный белок А, в элонгации ДНК полимераза Ш, SSB, белок А. Не участвуют клеточные Dna B, DnaG, Rep.
В результате репликации образуются кольцевые ДНК. В вирион упаковывается только линейная ДНК. Процессинг ДНК осуществляет терминаза фага Р2.
Особенность репликации фага в том, что она начинается по схеме Кернса, а заканчивается по схеме разматывающегося рулона. Геном представлен линейной д.ц. ДНК длиной 48502 п.н., с липкими концами длиной 12 нт. Внутри инфицированной клетки ДНК циркуляризуется и сверхспирализуется с помощью клеточных белков. Кольцевые молекулы образуются и при выщеплении профага.
Структура ori.
Ori расположен внутри гена O, кодирующего ori-связывающий белок. Состоит из четырех палиндромов (их еще называют итеронами), к которым справа примыкает А/Т богатый участок.
Инициация репликации. Ori узнается вирусным белком – О-белком (продукт гена О). О-белок тетрамеризуется на ori и образует комплекс с ДНК, называемый О-сомой (комплекс виден в электронный микроскоп). В О-соме ДНК немного подплавляется и в комплекс привлекается клеточная хеликаза DnaB в комплексе с вирусным белком Р (аналог клеточного DnaC), который угнетает ее активность, а также способен взаимодействовать с О-белком.
Таким образом белок О привлекает хеликазу к ori, но она неактивна. В активации хеликазы участвуют клеточные белки – шапероны: DnaJ, GrpE, DnaK (комплекс аналогичен Hsp70 эукариот), которые вызывают диссоциацию белка Р из комплекса.
DnaB начинает расплетать ДНК. На одноцепочечные участки ДНК садится праймаза и начинает синтезировать РНК-затравку. Если в комплексе нет GrpE, то реплицируется только одна цепь (односторонняя (вправо) репликация). Для инициации репликации требуется транскрипция. Считается, что инициации репликации способствуют конформационные изменения, происходящие при транскрипции. При слабой интенсивности транскрипции происходит одностронняя репликация.
In vitro для репликации транскрипция не нужна, но если добавить белок E.coli – HU, то без транскрипции репликация не начинается.
Элонгация репликации. Осуществляется высокопроцессивной ДНК полимеразой III E.coli. Фермент состоит из нескольких субъединиц и представляет собой гетеродимер. Состоит из трех групп белков.
1)соre: α2-каталитическая (синтез ДНК 3’-5), ε2-экзонуклеазная (3’-5’, proofreading activity)
2)β2-фактор процессивности полимеразы (аналог PCNA)
3)τ2, γ2,δ2,δ’2, χ, ψ – clamp loader (загружает фактор процессивности на ДНК с затратой АТФ). τ в нужный момент способствует раскрыванию кольца β-субъединицы. δ,γ,δ’ – «гаечный ключ» раскрывает β2-фактор. Фактор процессивности снимается, когда полимераза сталкивается с затравкой.
Удаление РНК-затравок.
Затравку удаляют РНКазаН и ДНК полимераза I (обладает 5’-3’ экзонуклеазной активностью и способна удалять последний рибонуклеотид затравки, связанный с дезоксирибонуклеотидом). ДНК-полимераза III застраивает брешь.
Переход механизма репликации от схемы Кернса в схему разматывающего рулона.
Возможны несколько путей перехода.
1.Односторонняя репликация.
Гипотеза: превращение θ – σ, связано с ослаблением траскрипции в участке ori и, как следствие, возникновением односторонней репликации.
Причина ослабления транскрипции: а)действие cro-репрессора;
б) в клетке присутствует ограниченное количество белка DnaA, который влияет на транскрипцию с правого промотора фага. При увеличении количества фаговой ДНК, он вытитровывается и транскрипция ослабляется.
Если бы это был единственный механизм, то конец был бы фиксированным (как у φХ174). Но концы молекул могут разными.
2.Рекомбинационный механизм.
Фаг обладает red α,β,γ – системой: redα – 5’-3’экзонуклеаза, redβ – аналог SSB, redγ – ингибитор RecBCD системы (содержит экзонуклеазу), разрушающей линейные молекулы, а также σ-молекулы.
Redα образует агрессивный одноцепочечный 3’-конец, который внедряется в дуплекс кольцевой молекулы и вытесняет небольшой участок.
3.Внесение разрыва.
В принципе возможен случайный одноцепочечный разрыв.
Механизмы не исключают друг друга и в принципе возможны.
Rep-хеликаза не участвует, поскольку белок О обладает хеликазной активностью.
В итоге образуются конкатемерные молекулы, которые надо разрезать на мономеры так, чтобы образовались липкие концы длиной 12 нуклеотидов. Нарезание осуществляется вирусной терминазой и сопряжено с упаковкой ДНК в вирусные частицы. Терминаза состоит из трех субъединиц А(Nu1)2 (А, потому что крайний слева в геноме). Разрезание происходит по специфическим участкам – cos.
Структура cos.
I2 R3 I1 R2 R1
I1 , I2 - узнаются IHF (изгибает ДНК на 270˚С)
R1 , R2 , R3 - узнаются Nu1
Терминаза в виде димера присоединяется к CosB и на расстоянии 12 п.н. вносит разрыв в CosN. С этого участка начинается упаковка ДНК. CosQ нужен для правильного процессирования противоположного конца ДНК, чтобы упаковался точно один эквивалент генома. Поскольку для начала упаковки ДНК и завершения этого процесса используются сигналы одного и того же элемента, то должна быть регуляция специфичности внесения разрыва терминазой. Возможно, процесс регулируется путем взаимодействия белков капсида с терминазой.
Фаг Р22 (лямбдоидный фаг).
Геном представлен линейной двуцепочечной ДНК с тупыми концами. На концах прямые повторы длиной более 2000 п.н. Последовательность концевых повторов не фиксирована из-за кольцевых пермутаций. Причем пермутации полные, а у фага λ разброс в пределах 20%.
Как и у фага λ ori состоит из 4 итеронов, с прлегающей к ним А/Т-богатой областью. Ori находится внутри гена 18, гомологичного гену О, который кодирует аналог белка О фага λ. Рядом находится ген 12, кодирующий хеликазу.
На поздней стадии репликации трудно обнаружить кольцевые молекулы, но конкатемеры образуются. Может быть, конкатемеры образуются не по схеме Кернса.
Имеется белок угнетающий активность клеточной системы RecBCD. Упаковка ДНК начинается с сайта Pac разрыв вносится собственной терминазой. Работой упаковочной системы можно объяснить кольцевые пермутации. Имеется несколько Pac сайтов, разбросанных по геному. Pac сайт первого эквивалента генома выбирается случайно. Второй разрыв вносится после полного заполнения головки (fullhead упаковка). Помещается больше, чем эквивалент генома на длину прямого повтора (2000 п.н.). Упаковка следующего эквивалента генома начинается с конца первого (упаковка процессивна).
Фаг N15.
Открыт в России Виктором Равиным. Умеренный фаг. Геном представлен линейной двуцепочечной ДНК с липкими концами длиной 12 нуклеотидов. Левая половина генома как левая половина генома фага λ (структурные белки). В геноме закодирован белок RepA, функционально аналогичный белку A фага Р4, т.е. способен связываться с ori, обладает хеликазной и праймазной активностями.
В клетке происходит циклизация и сверхспирализация ДНК. Способен к лизогении, но есть потенциал и для репродуктивной инфекции.
Репродуктивная репликация изучена слабо, может быть, она осуществляется по схеме Кернса. Сейчас нас интересует репликация фага в лизогенном состоянии.
В состоянии профага существует в виде линейной плазмиды и не встраивается в геном клетки хозяина.
Внутри генома есть сайт TelLR, узнаваемый ферментом протеломеразой. Протеломераза вносит двуцепочечный разрыв в этот сайт с последующим замыканием концов цепей ДНК. Образуется структура похожая на ту, которую имеют парвавирусы и поксвирусы, но в отличие от них у фага N15 концы комплементарны.
Инициация репликации. Репликация инициируется на участке ori белком RepA. Репликация двусторонняя, из-за ассимметричного расположения ori до одного из концов репликативная вилка дойдет раньше. Далее возможны два пути.
Механизм отнюдь не уникален. Недавно он был обнаружен еще у одного фага Ersinii и может осуществляться в клетке. Существует возбудитель Bardelia bardoferi, вызывающая болезнь Лайма, которая передается клещами. Ее хромосома имеет точно такую же структуру и реплицируется таким же механизмом.
Ori находится в условном положении 0,67
21 22 22
L
III II I
L
E
1234 1234
2345 2345
+2000 п.н.
Е
0, 67
В области ori рядом друг с другом связываются два гексамера T-Ag (при этом форма гексамеров такова, что в электронном микроскопе видно, будто каждый состоит из двух колец) и фиксируют участок ДНК. Затем гексамеры поворачиваются друг относительно друга гидролизуя при этом АТФ. В результате меняется размер внутреннего канала, что сопровождается плавлением участка ДНК между ними. Поскольку гексамеры остаются связанными, происходит выпетлевывание ДНК.
5'
3'
5'
3'
затравки, ДНКpolα делает затравку. Синтезировав короткий кусок, она сваливается и на ее место загружается ДНКpolδ.
3'
5'
3'
5'
Для высокопроцессивной работы ДНКpolδ нужен PCNA, фактор увеличивающий процессивность полимеразы. Иначе его называют clamp («скрепка»). Фактор является гетеротримером и загружается на ДНК с помощью комплекса RF-C (), называемого clamp-loader. Лучше всего PCNA загружается на границе о.ц и д.ц. ДНК.
ДНКpolδ вытесняет кусок длиной около 30нт, который откусывает FEN. ДНКpolδ достраивает брешь, RF-C снимает clamp и полимераза отваливается. Клеточная лигаза зашивает разрыв.
FEN
Pol, лигаза
В итоге образуется катенан – два топологически связанных кольца (дочерние цепи еще не достроены). Топоизомераза II разъединяет кольца. Но кто сделает сверхспиральность, ведь у эукариот гиразы нет? Оказывается, до образования ковалентно замкнутого кольца ДНК наматывается на гистоны и уже после этого лигаза зашивает разрыв. Если потом сделать депротеинизацию, то окажется, что ДНК сверхспирализована.
T-Ag увеличивает экспрессию генов клеточных топоизомераз.
Топоизомераза II
Упаковка в нуклеосомы и достройка цепей
Линейная д.ц. ДНК длиной около 12 т.п.н. с липкими концами длиной 19 п.н. такими же как у фага Р2. Внутри клетки ДНК циклизуется и сверхспирализуется, за счет клеточных лигазы и гиразы.
Умеренный фаг. Мы рассмотрим репродуктивный цикл.
Репликация по схеме Кернса.
Cтруктура ori.
6 несовершенных повторов длиной 10-12 п.н и сбоку А/Т богатый участок. Для более эффективного функционирования ori нужен участок, удаленный на 1000 п.н, называемый CRR (Cis Replicative Region). Его функция не известна.
ori
CRR
А/Т rich
5’
3’
cos
TelLR
TelL TelR
cos ori
протеломераза
протеломераза
Pu/Py ORE A/T
CORE
протеломераза
+2000 п.н.