Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Протокол иммуногистоцитохимического метода (иммунофлуоресценция)
для замороженных срезов
1. Фиксация препарата:
1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4);
1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике);
1.3. удалить остатки формалина с препарата;
1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (если в парах, то достаточно 1 смены);
2. Пост-фиксация (пермеабилизация препарата):
2.1 постфиксация 0,1 % Тритоном Х-100 (по 15 мкл на срез), комнатная температура, 20 минут.
2.2 промывка PBS (2 смены по 5 минут).
3. Блокирование сывороткой:
3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;
3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;
3.3. осторожно слить раствор со среза.
4. Добавление первичных антител:
4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (обычно 1:25-
1:100) в PBS с 1% WGS ;
4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной
камере;
4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
5. Добавление вторичных антител (в темноте):
5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (обычно 1:100-
1:200) в PBS с 1% WGS;
5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во
влажной камере в темноте;
5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
6. Микроскопирование:
6.1. нанести на срез монтирующую жидкость (15 мкл 70% глицерина в PBS);
6.2. накрыть срез покровным стеклом;
6.3. микроскопировать.
Примечание 1: в случае использования первичных меченых антител этап 5 пропускается, а этап 4 проводится в темноте.
Примечание 2: можно использовать препарат клеток, приготовленный следующим образом: