ВВЕДЕНИЕ10

Работа добавлена на сайт samzan.net:

Нижегородская государственная медицинская академия

Факультет повышения квалификации врачей

Л.Д. Андосова, К.Н. Конторщикова

Папилломавирусная инфекция

Нижний Новгород

2010

Содержание

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………..стр. 3

Биологические свойства вирусов папилломы человека………………………………..стр. 4

Формы и стадии папилломавирусной инфекции…………………………………….....стр. 9

Источник инфекции и пути передачи ВПЧ……………………………………………...стр. 10

Клиническая классификация ВПЧ…………………………………………………….....стр. 11

Клинические проявления ВПЧ-инфекции……………………………………………….стр. 13

Папилломавирусная инфекция и рак шейки матки……………………………………..стр. 16

Профилактика рака шейки матки: скрининг………………………………………….....стр. 21

Лабораторная диагностика папилломавирусной инфекции……………………………стр. 28

Клинико-лабораторные методы выявления дисплазии………………………………...стр. 32

Вакцинопрофилактика папилломавирусной инфекции………………………………...стр. 42

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………....стр. 47

Список литературы………………………………………………………………………..стр. 50

 

ВВЕДЕНИЕ

Папилломавирусная инфекция (ПВИ) – одно из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний: более половины сексуально активного населения в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека (ВПЧ). По данным различных исследований, частота инфицирования ВПЧ в возрастной группе 16-29 лет составляет 45-81%.

На настоящий момент известно около 100 различных типов вирусов папилломы человека, которые выявляются в тканях бородавок, кондилом и других опухолевых образований. Клетками-мишенями для ВПЧ являются эпителиальные клетки кожи и слизистых оболочек, 40 разновидностей ВПЧ обнаруживаются преимущественно в эпителии аногенитальной области и передаются при половых контактах. Вирусы могут оказывать на эпителий продуктивное или трансформирующее воздействие. При продуктивном воздействии возникают доброкачественные новообразования – папилломы и кондиломы кожи и слизистых оболочек. Результатом трансформирующего воздействия являются дисплазии тяжелой степени, прогрессирующее развитие которых приводит к онкопатологии.. Инфекция вызывает рак шейки матки, вульвы, влагалища, перианальной области. Отметим, что рак шейки матки является вторым по распространенности онкологическим заболеванием органов репродуктивной системы в мире и занимает первое место среди причин смерти от рака у женщин развивающихся стран (Прилепская В.Н., Бебнева Т.Н., 2009). По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно диагностируются почти 500 тысяч новых случаев рака шейки матки, из них почти половина (234 тысячи) заканчивается летально. Кроме того, отмечено, что ВПЧ может передаваться от матери к плоду, вызывая папилломатоз гортани у ребенка, и способен поражать клетки трофобласта, приводя к спонтанным абортам (Monsonego J., 2006; Calimisan J. et al, 2002).

Папилломавирусная инфекция широко распространена, контагиозна, способна вызывать злокачественную патологию, что делает диагностику и лечение заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, зоной интересов многих медицинских дисциплин.

 

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА (ВПЧ)

Таксономическое положение ВПЧ

Согласно классификации вирусов, в основу которой положена гомология нуклеотидной последовательности вирусных геномов, все папилломавирусы относят к семейству Papillomaviridae, объединяющему 16 родов от Alpha-papillomavirus до Pi-papillomavirus (в названии рода фигурируют буквы греческого алфавита); внутри родов выделяют виды, внутри видов - типы, подтипы и варианты.

Папилломавирусы, вызывающие заболевания у человека, Human papillomavirus (HPV), входят в состав 5 родов, объединяющих различные типы вируса (табл.1).

Таблица 1. Классификация ВПЧ. 

Родовое название	Типы
Alpha-papillomavirus	HPV-32, HPV- 42, HPV-10, HPV-3, HPV-28, HPV-29, HPV-78, HPV-94, HPV-61, HPV-72, HPV-81, HPV-83, HPV-84, cand HPV-62, cand HPV-86, cand HPV-87, cand HPV-89, HPV-2, HPV-27, HPV-57, HPV-26, HPV-51, HPV-69, HPV-82, HPV-53, HPV-30, HPV-56, HPV-66, HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, HPV-68, HPV-70, cand HPV-85, HPV-7, HPV-40, HPV-43, cand HPV-91, HPV-16, HPV-31, HPV-35, HPV-52, HPV-58, HPV-67, HPV-6, HPV II, HPV-13, HPV-44, HPV-74, HPV-34, HPV- 73, HPV-54, cand HPV-90, HPV 71
Beta-papillomavirus	HPV-5, HPV-8, HPV-12, HPV-14, HPV-19, HPV-20, HPV-21, HPV-25, HPV-36, HPV-47, HPV-93, HPV 9, HPV-15, HPV-17, HPV-22, HPV-23, HPV-37, HPV-38, HPV-80, HPV-49, HPV-75, HPV-76, cand HPV-92, cand HPV-96
Gamma-papillomavirus	HPV-4, HPV-48, HPV-50, HPV-60, HPV-88, HPV-65, HPV-95
Ми-papillomavirus	HPV-1, HPV-63
Nu-papillomavirus	HPV-41

Типы ВПЧ пронумерованы в порядке идентификации. В пределах каждого типа имеются подтипы, которые отличаются на 2-10%, и варианты, отличающиеся только на 1 - 2%.

Морфология и ультраструктура ВПЧ

ВПЧ по строению относят к простым, безоболочечным вирусам (рис.1).

Рис.1. Морфология ВПЧ:

А - электронно-микроскопическое изображение вирионов (размер масштабной полосы- 100 нм; Martin M., 2001); Б - звездообразная форма капсомеров капсида (L1+L2) вириона (3D- реконструкция, Hagensee M.E., 1994).

Вирион ВПЧ состоит из двуцепочечной ДНК, которая находится внутри белкового капсида. Для построения капсида достаточно присутствия одного структурного белка L1, который путем самосборки формирует 72 звездообразных капсомера. Капсид имеет геометрически правильную форму с икосаэдрической симметрией. Белок L1 связан с минорным структурным белком L2. До сих пор не совсем понятна его укладка внутри капсида, однако установлено, что белок L2 выполняет несколько важных функций на этапе упаковки геномной ДНК при сборке новых вирионов и на этапе проникновения вируса в клетку.

Характеристика генома и белков ВПЧ

Геном ВПЧ представлен циклически замкнутой двунитевой ДНК. Размер генома различных типов папилломавирусов составляет примерно 8000 пар нуклеотидов (геном ВПЧ-16 - 7904 пары оснований) и содержит 9 открытых рамок считывания. В состав генома входят гены структурных и регуляторных белков, а также участок около 1000 пар оснований, который не кодирует белки, но содержит cis-элемент, необходимый для регуляции экспрессии генов, репликации и упаковки геномной ДНК в белки капсида.

В геноме ВПЧ выделяют области Е, L и регуляторный регион URR (рис.2).

Рис.2. Организация генома HPV-16 (N. Munoz et al., 2006).

Экспрессия генов в области Е (от англ. early, ранний) происходит в начальной фазе внутриклеточной вирусной инфекции. Среди белков ранней фазы выделяют:

Е1. Связывается с областью Origin (начало репликации вирусного генома) в URR локусе. Белок Е1 обладает функциями хеликазы (фермент, который расплетает ДНК) и АТФ-азы. Е1 подготавливает вирусную ДНК для репликации с помощью клеточных факторов репликации.

Е2. Работает как регулятор вирусного промотора, локализованного в области URR. В составе белка обнаружен трансактиваторный домен. Е2 облегчает закрепление Е1 к области Origin; с помощью клеточного белка Bromodomain-4 (Brd4) E2 «привязывает» вирусный геном к хромосомам клетки хозяина, благодаря чему при клеточном делении вирус попадает в каждую из дочерних клеток. Предполагают, что Е2 подавляет экспрессию онкогенных генов е6 и е7. При интеграции вирусной ДНК в хромосому клетки хозяина белок Е2 не синтезируется, а уровень онкогенных белков Е6 и Е7 повышается.

Ген еЗ. Маленький ген, обнаруживается только в нескольких типах ВПЧ. Продукт гена неизвестен, как неизвестна и его функция.

Е4. Синтезируется в небольшом количестве в течение ранней фазы внутриклеточного цикла вирусной инфекции; его количество резко возрастает во время последней фазы. При ВПЧ инфекции Е4 может составлять до 30 % от белков бородавки. Предполагают, что белок Е4 у многих типов ВПЧ облегчает выход вирионов в окружающую среду, разрушая промежуточные филаменты цитоскелета кератиноцитов. У мутантных вирусов, не способных синтезировать Е4, не наблюдается высокого уровня репликации геномной ДНК. Е4 также блокирует клеточный цикл в фазе G2.

Е5. Маленькие, гидрофобные белки, которые дестабилизируют функцию многих мембранных белков в зараженной клетке. Е5 ВПЧ-16 и ВПЧ-2 снижает синтез белков главного комплекса гистосовместимости класса I, что нарушает распознавание и уничтожение зараженной клетки Т-киллерами.

Е6. Основная функция белка - инактивация клеточного тумор-супрессирующего белка р53. Е6 также взаимодействует с большим количеством других клеточных белков. Обладает онкогенной активностью.

Е7. Основная функция белка - подавление активности тумор-супрессирующих белков семейства pRb. Совместно с Е6 предотвращает развитие апоптоза. Кроме того, Е7 активизирует клеточные теломеразы, что приводит к иммортализации инфицированных клеток.

Е8. Только у нескольких типов папилломавирусов ген е8 кодирует небольшой белок Е8. В случае BPV-4 (бычий тип) открытая рамка считывания белка Е8 может быть заменена открытой рамкой считывания белка Е6.

Гены области L (от англ. late, поздний) кодируют структурные белки:

• L1. Структурный белок, спонтанно самособирается в пентамерные
капсомеры. Из очищенных капсомеров можно собрать капсид вириона in vitro. Капсиды из белка вируса L1, собранные в пробирке - основа профилактических вакцин против нескольких типов ВПЧ. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок L1 отличается редко встречающимся полиморфизмом, поэтому аминокислотные замены в белке - редкое событие. У различных типов ВПЧ могут существенно отличаться поверхностные петли L1. Таким образом, вероятно, вирусы уклоняются от нейтрализующих антител.

• L2. Совместно с L1 принимает участие в упаковке вирусной ДНК в капсид вириона; кроме того, L2 взаимодействует с множеством клеточных белков во время проникновения вириона в клетку. После закрепления вириона на поверхности клетки L2 должен быть расщеплен клеточной протеазой. Проникновение вириона происходит посредством клатрин-зависимого эндоцитоза. Во время проникновения вириона белок L2 взаимодействует также с клеточными белками β-актин и синтаксин-18. После выхода из эндосомы вирусная ДНК, связанная с L2, проникает в ядро клетки, где локализуется в субъядерном домене ND-10, богатом клеточными факторами транскрипции. В аминокислотной последовательности белка L2 обнаружены небольшие высококонсервативные участки, встречающиеся практически у всех типов ВПЧ, что создает предпосылки для создания вакцины против всех типов ВПЧ.

Внутриклеточный цикл развития ВПЧ

ВПЧ - облигатные внутриклеточные паразиты, их жизненный цикл происходит внутри клетки-хозяина.

Различные типы ВПЧ способны размножаться только в кератиноцитах многослойного плоского ороговевающего эпителия кожи и многослойного неороговевающего эпителия слизистых оболочек (рис. 3).

Стадии жизненного цикла ВПЧ строго зависят от дифференцировки кератиноцитов. Кератиноциты формируют многослойный эпителий кожи и слизистых оболочек, например, внутренней части щек или стенки влагалища. Многослойный эпителий состоит из нескольких слоев клеток. Клетки базального эпителия (прилежат к базальной мембране) способны к митотическому делению и служат источником регенерации вышележащих слоев. По мере продвижения к поверхности кератиноциты   подвергаются   дифференцировке,   превращаясь   из незрелых призматических в зрелые уплощающиеся. На поверхности находятся плоские клетки, которые заканчивают свой жизненный цикл, отмирают и отслаиваются.

Основная мишень ВПЧ - это способные к митозу кератиноциты базального слоя.

ВПЧ проникает в базальные кератиноциты через ранки и микротрещины в поверхностных слоях эпителия слизистых или кожи.

Рис.3. Строение многослойного плоского эпителия и стадии жизненного цикла ВПЧ (адаптировано из Nature Reviews Immunology, 2004,4(1) 46-54).

Справа - незаряженный эпителий; клетки базального слоя способны к митотическому делению и служат источником регенерации вышележащих слоев. По мере продвижения к поверхности кератиноциты подвергаются дифференцировке.

Слева - после проникновения ВПЧ в кератиноциты базального слоя начинается экспрессия ранних генов вирусного генома, что приводит к клональной экспансии зараженных клеток. Различные вирусные белки появляются в зависимости от стадии дифференцировки зараженной клетки. Зрелые дочерние вирионы образуются только в самых поверхностных слоях эпителия. Интраэпителиальных антигенпрезентирующих клеток (АПК) в зараженном ВПЧ эпителии практически нет. АПК -антигенпрезентирующие клетки.

На первом этапе происходит прикрепление мажорного белка капсида ВПЧ L1 к поверхности кератиноцита. Вероятными рецепторами, обеспечивающими проникновение вируса в клетку, являются α6/β4 интегрин и ламинин. Механизм проникновения в клетку -   это   клатрин-опосредованный   и/или   кавеолин-опосредованый (зависит от типа ВПЧ) эндоцитоз. После проникновения вириона геномная ДНК доставляется в ядро (точный механизм доставки не ясен), где существует в виде стабильно реплицирующейся эписомы, образуя 10-200 копий генома на клетку. Репликацию вирусной ДНК обеспечивают ранние белки вируса Е1 и Е2. Базальные кератиноциты многослойного эпителия могут поддерживать эписомальное существование ВПЧ в течение многих десятилетий.

Считывание информации с вирусного генома в виде сложных транскрипционных каскадов начинается при делении клетки и нарастает по мере ее дифференцировки. Все типы ВПЧ могут вызывать преходящую пролиферацию клеток, но только для ВПЧ-16 и ВПЧ-18 доказана способность индуцировать феномен иммортализации in vitro. Однако для индукции бесконечной пролиферации клеток помимо вирусной активности требуется еще активация клеточного ras-онкогена.

Образование зрелых дочерних вирионов происходит в клетках поверхностного слоя многослойного эпителия. В поверхностных слоях ороговевающего и неороговевающего эпителия клетки остаются без иммунологического надзора. Предполагается, что отсутствие продуктивной инфекции в базальном слое - эволюционно выработанный механизм уклонения вируса от иммунной защиты.

В клетках поверхностного слоя синтезируются структурные белки L1 и L2, чему предшествует резкое повышение количества копий вирусного генома.

Потомство вируса собирается в ядре клетки: многочисленные копии геномной вирусной ДНК и структурные белки самопроизвольно соединяются друг с другом. В основе самосборки лежит способность L1 собираться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник капсида.

Последняя стадия жизненного цикла ВПЧ - это выход вирусных частиц из клетки.

Папилломавирусы выработали интересный способ выхода зрелых вирионов из клетки. Как правило, у простых вирусов других семейств, например, пикорнавирусов, аденовирусов и др., выход вирусных частиц сопровождается лизисом клетки-хозяина. Часто такая деструкция клеток вызывает воспаление, а внеклеточные вирионы нейтрализуются антителами. Выход папилломавирусов с отшелушивающимися клетками - пример эволюционно выработанного способа обхода иммунологических «средств защиты» организма хозяина.

ФОРМЫ И СТАДИИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Попав в организм человека, ВПЧ инфицируют базальный слой эпителия. В зараженной клетке вирус может существовать в двух формах - эписомальной (вне хромосом клетки), которая считается доброкачественной формой, и интегрированной (ДНК вируса встраивается в хромосому клетки), которую определяют как злокачественную форму паразитирования вируса.

В зависимости от внутриклеточной формы существования ВПЧ возможно развитие следующих форм инфекционного процесса:

Персистенция папилломавируса в организме (или латентное течение) - вирус существует в эписомальной форме, не вызывая патологических изменений в клетках, клинических проявлений нет, определить его существование возможно только методами, позволяющими выявлять ДНК вируса, например, методом ПЦР.

Папилломы - вирус существует в эписомальной форме, однако происходит усиленное размножение клеток базального слоя, что ведет к появлению разрастаний, которые клинически определяются как бородавки или папилломы на коже лица, конечностей, половых органов. Можно расценивать это как защитную реакцию организма, который пытается локализовать размножение вируса путем создания своеобразного "саркофага" из ороговевающих клеток. Вирус определяется методом ПЦР, ИФА и др.

Дисплазия (неоплазия) - вирус существует в эписомальной и интегрированной форме; в структуре клетки происходят изменения, получившие название койлоцитоз, который возникает в поверхностных слоях эпителия. Характерными признаками койлоцитоза являются вакуолизация цитоплазмы, гиперхромия ядра и изменение его формы.

Карцинома - вирус существует в интегрированной форме; появляются измененные "атипичные" клетки, свидетельствующие о злокачественности процесса (инвазивная опухоль). Наиболее частая локализация - шейка матки (хотя возможны процессы озлокачествления на любом участке кожи и слизистой, инфицированном вирусом).

Инкубационный период папилломавирусной инфекции может длиться от половины месяца до нескольких лет. Под влиянием различных факторов происходит активация вируса,  его усиленное размножение и болезнь переходит в стадию клинических проявлений. В большинстве случаев (до 90 %) в течение 6-12 месяцев происходит самоизлечение, папилломавирусная инфекция заканчивается полным выздоровлением и организм освобождается от вируса. В других случаях отмечается длительное хроническое рецидивирующее течение с возможной малигнизацией процесса (в зависимости от типа вируса).  Некоторые типы ВПЧ могут вызвать злокачественные опухоли в эпителиальных тканях - это нетипичный исход папилломавирусной инфекции.

ИСТОЧНИК ИНФЕКЦИИ И ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ВПЧ

Папилломавирусная инфекция, вызываемая ВПЧ - антропонозное заболевание, передача инфекции возможна только от человека к человеку.

Вирус передается преимущественно при прямых кожных контактах или контактах кожа-слизистая.

ВПЧ устойчив к нагреванию и высушиванию, сохраняет жизнеспособность в отшелушенных клетках кожи, в связи с чем, при некоторых клинических формах (бородавки) встречается контактно-бытовой механизм заражения через микроповреждения кожи.

ВПЧ - возбудители аногенитальных бородавок (остроконечных кондилом) передаются половым путем (включая орально-генитальные контакты и анальный секс). Вследствие частого бессимптомного пребывания ВПЧ в организме инфицированные люди  не знают, что заражены. Недавно появившиеся генитальные бородавки более контагиозны, чем давно существующие.

Согласно эпидемиологическим наблюдениям риск возникновения аногенитальных кондилом и рака шейки матки находится в прямой зависимости от количества половых партнеров (включая половые контакты партнера). Презервативы не защищают от заражения.

Возможно заражение ВПЧ новорожденных при родах, что приводит к развитию ларингеального папилломатоза у детей и аногенитальных бородавок у младенцев. Дети, страдающие ювенильным рецидивирующим папилломатозом гортани - чаще первенцы юных матерей. Как происходит трансмиссия вируса от матери плоду, до настоящего времени не ясно. Маловероятна передача через кровь, т.к. ВПЧ лишь иногда обнаруживается в лейкоцитах крови. Наиболее вероятна восходящая ВПЧ-инфекция околоплодных вод и плаценты.

Третий возможный путь - инфицирование во время зачатия через сперму.

Человек может одновременно заражаться несколькими типами папилломавирусов.

КЛИНИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ВПЧ

До середины 1970-х годов считали, что заболевания у человека вызывает только один тип ВПЧ, и что клинические проявления и морфологические особенности поражений определяются природой слущивающегося эпителия в месте внедрения инфекции. После выявления множества типов ВПЧ стало ясно, что природа заболевания зависит от специфических особенностей ВПЧ (табл.2).

Таблица 2. Заболевания, вызываемые различными типами ВПЧ.

Клинические формы и их локализация	Типы ВПЧ
Кожа
Подошвенные бородавки	HPV-l.HPV-2, HPV-4
Обычные бородавки	HPV-1, HPV-2, HPV-3, HPV-4, HPV-7, HPV-10, HPV-26, HPV-27, HPV-29, HPV-41, HPV-48, HPV-57, HPV-60, HPV-63, HPV-65, HPV-75, HPV-78
Плоские бородавки	HPV-3, HPV- 5, HPV-10, HPV-28, HPV-49
Бородавки Бютчера	HPV-7
Бородавчатая эпидермодисплазия	HPV-5, HPV-8, HPV-9, HPV-10, HPV-12, HPV-14, HPV-15, HPV-17, HPV-19, HPV-20, HPV-21, HPV-22, HPV-23, HPV-24, HPV-25, HPV-36, HPV-39, HPV-40, HPV-47
Верруциформная эпидермодисплазия Левандовского - Лютца	HPV-3, HPV-5, HPV-8, HPV-9, HPV-12, HPV-14, HPV-15, HPV-17, HPV-19, HPV-25, HPV-36, HPV-38, HPV-46, HPV-47, HPV-49, HPV-50
Небородавчатые кожные поражения	HPV-37, HPV-38
Клинические формы и их локализация	Типы ВПЧ
Кожа
Фокальная гиперплазия эпителия (болезнь Хека)	HPV-13, HPV-32
Бовеноидный папуллез	HPV-16,HPV-18,HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68
Карцинома	HPV-5, HPV-8, HPV-14, HPV-17, HPV-20, HPV-47
Кожа и слизистые аногенитальной области
Аногенитальные бородавки	HPV-6, HPV-11, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-54, HPV-55, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-64, HPV-68, HPV-79
Гигантская кондилома Бушке - Левенштейна	HPV-6, HPV-11
Некондиломатозные поражения	HPV-43, HPV-51, HPV-52, HPV-55, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-64, HPV-67, HPV-69, HPV-70
Карцинома	HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-54, HPV-56, HPV-66, HPV-68
Слизистые оболочки
Папиллома гортани	HPV-6, HPV-11, HPV-30
Карцинома миндалины	HPV-16, HPV-33
Карцинома языка	HPV-2, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-30

По мере изучения ВПЧ также выяснилось, что риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами ВПЧ. Они были обозначены как вирусы высокого онкогенного риска. Перечень типов ВПЧ высокого онкогенного риска расширяется за счет уточнения свойств вирусных геномов строения ДНК (табл.3).

Таблица 3. Деление типов ВПЧ по степени онкогенного риска.

Степень	Генотип ВПЧ
Высокая	HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59
Промежуточного риска	HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-68, HPV-73, HPV-82
Низкая	HPV-6, HPV-11, HPV-13, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-61, HPV-70, HPV-72, HPV-81, HPV-89
Не определена	HPV-2, HPV-3, HPV-7, HPV-10, HPV-27, HPV-28, HPV-29, HPV-30, HPV-32, HPV-34, HPV-55, HPV-57, HPV-62, HPV-67, HPV-69, HPV-71, HPV-74, HPV-77, HPV-83, HPV-84, HPV-85, HPV-86, HPV-87, HPV-90, HPV-91

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ВПЧ-ИНФЕКЦИИ

Клинические проявления ВПЧ-инфекции зависят от типа вируса.

1. К первой группе заболеваний можно отнести разнообразные бородавки, вызываемые онкогенными ВПЧ из группы низкого онкогенного риска.

1.1 На коже часто выявляются:

Вульгарные бородавки (Common warts) - эпидермально-дермальные папулы (узелки) серовато-бурого цвета с характерной "бородавчатой" поверхностью (сосочковые разрастания с ороговением): локализуются, преимущественно, на тыльной поверхности кистей и пальцев рук.

Плоские бородавки (Plane warts) - узелки до 3 мм в диаметре с плоской поверхностью, локализуются на лице и тыльной поверхности кистей. Часто появляются в подростковом возрасте, поэтому получили название "юношеские". В большинстве случаев наблюдается самоизлечение.

Подошвенные бородавки (Plantare warts) возникают на местах давления обувью. Представляют собой утолщение рогового слоя величиной 5-10 мм, неправильной формы, при надавливании болезненны. Отличаются от большинства других бородавок тем, что их рост направлен внутрь. В отличие от мозолей на срезе видны тромбированные капилляры, которые легко кровоточат. Самоизлечение происходит редко, требуется лечение.

Подногтевые и околоногтевые бородавки образуются под или вокруг ногтей на пальцах. По сравнению с бородавками других локализаций труднее поддаются лечению.

К кожным поражениям относится также редко встречающееся аутосомно-рецессивное заболевание бородавчатая эпидермодисплазия (Epidermodysplasia Verruciformis). Оно проявляется множественными полиморфными плоскими папулами розового, красного цвета с умеренно бородавчатой поверхностью. Заболевание обычно возникает в юношеском возрасте. Вызывают бородавчатую эпидермодисплазию онкогенные типы ВПЧ как низкого, так и высокого онкогенного риска.

1.2 Аногенитальные бородавки могут появиться на коже и слизистых оболочках наружных половых органов и в перианальной области. Возбудители аногенитальных бородавок передаются половым путем. Ими могут быть разнообразные типы ВПЧ, но в 90 % случаев – это HPV-6 и HPV-11.

Аногенитальные бородавки следует отличать от широких кондилом при вторичном сифилисе, контагиозного моллюска, гранулярных папул полового члена, фиброэпителиом и др. поражений.

Как правило, аногенитальные бородавки через некоторое время исчезают, но вирусы могут продолжать передаваться даже в отсутствие клинических признаков заболевания.

ВПЧ - возбудители аногенитальных бородавок, не связаны с развитием цервикального рака. Однако, так как человек одновременно может быть заражен разными типами ВПЧ, присутствие бородавок может свидетельствовать о заражении онкогенными ВПЧ из группы высокого онкогенного риска.

К аногенитальным бородавкам относят:

• Остроконечные кондиломы (Condylomata acuminata) - наиболее частое проявление папилломавирусной инфекции человека. Согласно Международной классификации болезней отнесены к ИППП. Представляют собой образования тестоватой консистенции, имеющие дольчатое строение, по форме напоминающие "петушиный гребень" или "цветную капусту" и расположены на узком основании ("ножке"). Локализация у мужчин - крайняя плоть, венечная борозда головки полового члена, у женщин - преддверие влагалища, малые и большие половые   губы, область заднего прохода.

Кератотические бородавки имеют роговой вид, часто напоминают цветную капусту или себорейный кератоз; обычно располагаются на сухой коже (ствол полового члена, мошонка, половые губы).

Гигантская кондилома Бушке-Левенштейна - гигантские кондиломы, развивающиеся у больных со сниженным клеточным иммунитетом или при беременности.

Эндоуретральные кондиломы локализуются в уретре, часто сочетаются с обычными кондиломами. В основном встречаются у мужчин. Связи между ними и раком полового члена не выявлено. При выраженном процессе - затрудненное мочеиспускание и явления хронического уретрита.

Кондиломы шейки матки часто сочетаются с генитальными кондиломами, выявляются при осмотре шейки матки и(или) кольпоскопии, различают:

а) Экзофитные кондиломы - не отличаются от аногенитальных бородавок, часто отмечаются при интраэпителиальной дисплазии легкой и умеренной степени.

б) Эндофитные (плоские) кондиломы. Обычно располагаются в толще эпителия и практически не видны невооруженным глазом, однако их можно выявить при кольпоскопии. Озлокачествление плоских кондилом с атипией до степени интраэпителиального рака развивается у 4-10 % женщин в течение 2-х лет.

К осложнениям аногенитальных бородавок относятся зуд и кровотечения. В редких случаях присоединяется вторичная бактериальная и грибковая инфекции. Крупные скопления бородавок могут служить механическим препятствием, закрывая, например, родовой канал.

1.3 Респираторный рецидивирующий папилломатоз. HPV-6 и HPV-11 могут вызывать редкое заболевание - ларингеальный папилломатоз (Laryngeal papillomatosis). Представляет собой доброкачественное опухолевидное поражение в виде разрастания папиллом по всему респираторному тракту: от полости носа до периферии легких, чаще поражается гортань. Заражение происходит обычно при родах, хотя не исключен и путь передачи при орально-генитальных контактах. Выделяют две формы респираторного рецидивирующего папилломатоза: юношеский, с началом заболевания либо в младенческом возрасте, либо в возрасте 11-12 лет, и взрослый респираторный паппилломатоз, возникающий в возрасте 30-40 лет и старше 60 лет. Чаще встречается у детей в возрасте до 5 лет и младенцев. Новорождённым детям ВПЧ передаётся в родах от инфицированной матери; респираторный рецидивирующий папилломатоз у взрослых считают результатом полового пути передачи. Основные симптомы - осиплость голоса и затруднение глотания. Это заболевание часто рецидивирует и может привести к малигнизации слизистой гортани, но в чрезвычайно редких случаях.

2. Вторую группу составляют заболевания, вызываемые онкогенными ВПЧ из группы высокого онкогенного риска.

Более десяти типов ВПЧ, включая типы 16,18,31 и 45, относят к вирусам высокого онкогенного риска, так как папилломатозная инфекция, вызываемая ими, может привести к развитию рака шейки матки, ануса, вульвы, пениса, орофарингеальной карциномы, рака кожи шеи и головы. Например, бовеноидный папуллез и плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия шейки матки, развитие которых наблюдается вследствие заражения ВПЧ из группы высокого онкогенного риска, под влиянием различных факторов могут перерасти в злокачественную опухоль.

Бовеноидный папулез (Bowenoid papulosis). Проявляется куполообразными, плоскими папулами и пятнами с гладкой, бархатистой поверхностью, цвет элементов в местах поражения слизистой коричневатый или оранжево-красный, серовато-белый, а поражения на коже имеют цвет от пепельно-серого до коричневато-черного. Бовеноидный папулез развивается у мужчин, имеющих множество половых партнеров, что свидетельствует о половом пути заражения. Течение обычно доброкачественное, часто происходит самоизлечение, тенденция к инвазивному росту отмечается редко.

Дисплазия (неоплазия) шейки матки

а) Легкая дисплазия шейки матки, или цервикальная интраэпителиальная неоплазия I класса (ЦИН I) и ВПЧ-индуцированные морфологические изменения (койлоцитотическая атипия) наиболее частая форма, которая не проявляется клинически (выявляется только при кольпоскопии и (или) гистологическом исследовании). Часто сочетается с экзофитными и эндофитными кондиломами ВПЧ типов 6 и 11.

б) Умеренная дисплазия шейки матки, или ЦИН II, выявляется при кольпоскопии и цитологическом исследовании. Часто сочетается с экзофитными и эндофитными кондиломами.

в) Выраженная дисплазия и интраэпителиальный рак in situ - ЦИН III, также выявляется при кольпоскопическом и цитологическом исследовании. Часто встречаются участки лейкоплакии и плоские (эндофитные) кондиломы.

• Рак шейки матки

Рак шейки матки (плоскоклеточная карцинома, Cervical cancer) в отсутствии вируса не развивается. Выявляется при кольпоскопическом, цитологическом и гистологическом исследовании. В 70% случаев возникает после заражения HPV-16 и HPV-18.

ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ И РАК ШЕЙКИ МАТКИ

У большинства зараженных ВПЧ из группы высокого онкогенного риска инфекция протекает бессимптомно в транзиторной форме; ВПЧ-индуцированные изменения эпителия носят переходный характер; 70% случаев разрешается в течение 1 года и около 90% случаев - в течение 2-х лет благодаря формированию вирус-специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. Установлено, что иммунная система большинства зараженных ВПЧ элиминирует вирус из организма с помощью вирус-специфических цитотоксических лимфоцитов, реакции иммунного лизиса и вирус-нейтрализующих антител, которые препятствуют распространению вируса, блокируя его рецепторы для проникновения внутрь клетки. Однако в ряде случаев вирус не удаляется, а длительно сохраняется в эпителиальной ткани. В таком случае может произойти трансформация нормального эпителия в раковую опухоль. Этот процесс обычно происходит на фоне длительного носительства ВПЧ из группы высокого онкогенного риска. Так, рак шейки матки в большинстве случаев развивается через 10-15 лет после персистентной стадии заболевания. Средний возраст больных карциномой in situ - 29 лет, т.е. проходит примерно 10 лет от момента первичного инфицирования до появления выраженной дисплазии. Легкая дисплазия может исчезнуть самопроизвольно. Инвазивный рак, в среднем, регистрируется в возрасте 49 лет.

Важно отметить, что ВПЧ проявляет неодинаковую тропность к плоскому эпителию слизистых оболочек женского полового тракта: вульвы, влагалища, шейки матки. Частота развития цервикальной внутриэпителиальной неоплазии (ЦИН) в десять раз превышает частоту развития аналогичной патологии во влагалище или вульве. Цервикальная карцинома развивается на 10 лет раньше, чем карцинома влагалища. Это связано с тем, что эпителиальная зона трансформации шейки матки имеет специфический риск канцерогенности при ВПЧ-инфекции.

Патогенез рака шейки матки отличает длительность и стадийность развития патологии (схема 1 и рис.4).

Схема 1. Патогенез ВПЧ-индуцированного рака шейки матки.

Рис. 4. Гистологическая и цитологическая оценка стадий развития рака шейки матки при ВПЧ-инфекции (пояснения в тексте).

На первых этапах развивается первичная инфекция пролиферирующих клеток базального слоя многослойного плоского эпителия. Если клетки заражаются онкогенными ВПЧ из группы высокого онкогенного риска, и присутствуют нарушения в работе иммунной системы, а также некоторые ко-факторы, организм не справляется с размножающимся вирусом.  Развивается персистентная инфекция, которая приводит к неопластической трансформации эпителия. Наиболее частое проявление потенциально прогрессирующего состояния, при котором может произойти трансформация инфицированного, но еще нормального эпителия, при котором иммунная система еще контролирует инфекционный процесс - это ЦИН I.

На следующем этапе, в зависимости от индивидуальных особенностей организма-хозяина, в течение 2-3 лет развивается ЦИН П/ЦИН III. Это означает, что благодаря активности онкогенных вирусных белков Е6 и Е7 аннулируется контроль над клеточным циклом и механизмами апоптоза, что, в свою очередь, является сигналом перехода вирусной инфекции в процесс малигнизации. Затем следуют генетические изменения клетки, необратимые нарушения в регуляции клеточного цикла деления, что и приводит к перерождению ЦИН П/Ш в злокачественную раковую опухоль.

Молекулярные механизмы канцерогенеза

Молекулярные механизмы онкогенной трансформации клеток при ВПЧ-инфекции связаны с активностью онкогенных генов е6 и е7, кодирующих онкогенные белки Е6 и Е7. Воздействие белков Е6 и Е7 приводит к потере клеткой восприимчивости к сигналам запрограммированной гибели – апоптозу и остановке клеточного деления. Оба белка способны самостоятельно вызывать иммортализацию различных типов клеток; но одновременное их воздействие значительно увеличивает эффект воздействия. У вирусов из группы высокого онкогенного риска эти белки транслируются совместно с одной полицистронной мРНК.

Механизм действия белка Е6 связывают с разрушением клеточного белка р53 (рис.5).

Рис.5. Механизм действия онкогенного белка Е6 ВПЧ (пояснения в тексте).

Белок р53 иногда называют белком, "опекающим геном". Это фактор транскрипции, который обеспечивает в клетке экспрессию многих генов, включая гены семейства ВАХ (регулируют процессы апоптоза), гена р21 (отвечает за остановку клеточного цикла в фазе G1) и р53-зависимые гены семейства PIG (продукты экспрессии генов участвуют в процессе     апоптоза).  Белок р53  инициирует  синтез  белка р21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин (от англ. cyclin-dependent kinases, CDK- циклин-зависимые киназы, участвуют в смене фаз клеточного цикла), что приводит к остановке клеточного цикла. Так клетка, в которой повреждена ДНК, не вступает в S-фазу. Белки Е6 HPV-16 и HPV-18 в комплексе Е6/Е6АР связывают р53 с образованием комплекса р53-Е6/Е6АР, который подвергается протеолизу, что сопровождается деградацией белка р53. Белок р53 теряет активность, и клетка становится неспособной запустить процессы апоптоза - механизма, с помощью которого организм освобождается от клеток с поврежденной ДНК. Разрушение белка р53 приводит также к тому, что клетка утрачивает контроль над процессом деления.

Механизм действия онкогенного белка Е7 схематично представлен на рис. 6.

Рис. 6. Механизм действия онкогенного белка Е7 ВПЧ (пояснение в тексте).

Продукт гена е7 - это небольшой мультифункциональный онкопротеин Е7, имеющий структурное сходство с онкопротеинами других ДНК-содержащих онкогенных вирусов. Белок Е7 способен смещать клеточный цикл из фазы G1 в фазу S. Это происходит тогда, когда Е7 разрушает комплекс между белком pRb и клеточным фактором транскрипции E2F путем связывания туморсупрессирующего белка семейства pRb. Свободный фактор транскрипции E2F инициирует экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, перехода фаз G1 → S. Белок Е7 инактивирует ингибиторы циклин-зависимой киназы p27kip1 и р21cip1, что приводит к нестабильности генома и, как следствие, хромосомным аберрациям и анеуплоидии.

 

Роль ко-факторов в развитии рака шейки матки

Остается до конца невыясненным, почему наблюдается диаметрально противоположный исход ВПЧ-инфекции у разных индивидуумов. Очевидно, что кроме высокоонкогенных свойств вируса, решающее значение принадлежит индивидуальной восприимчивости и другим факторам.

Как показывают исследования, для развития рака шейки матки необходимо определенное сочетание ко-факторов, способствующее развитию заболевания. К ним относят:

• Определенные свойства возбудителя - онкогенный генотип; одновременное заражение несколькими типами ВПЧ из группы высокого онкогенного риска; ко-инфекция ВПЧ из группы высокого и низкого онкогенного риска; вирусная нагрузка в ходе инфекционного процесса; интеграционная форма персистенции вируса.

Эндогенные - гормональный фон, состояние неспецифической резистентности, сила специфического иммунного ответа, генетические факторы.

Экзогенные - прием гормональных противозачаточных средств, курение табака, сопутствующие инфекции мочеполовой системы, диета.

Анализ 10 000 случаев рака шейки матки выявил, что в 90% случаев рак связан с присутствием ВПЧ определенных генотипов. Это HPV-16, HPV-18, HPV-45, HPV-31, HPV-33, HPV-52, HPV-58 и HPV-35. Отмечено, что 16 тип наиболее часто встречается в ткани плоско-клеточного рака шейки матки, а 18 тип - в ткани железистого рака - аденокарциномы. Установлено, что при высоком содержании ДНК ВПЧ в шеечном канале матки риск опухоли или неоплазии более высок и наоборот.

Не вызывает сомнений влияние состояния иммунной системы и силы специфического иммунного ответа на онкогенез ВПЧ. Механизм такого воздействия сложен. Статистически значимыми ко-факторами онкогенной трансформации пораженного эпителия являются высокий уровень провоспалительных цитокинов и кортикостероидов, низкий титр антител к вирусному белку Е2 класса IgA, низкий титр (или отсутствие) антител к вирусному белку L1 класса IgG.

Данные многочисленных исследований указывают на влияние генетических факторов в развитии рака при папилломавирусной инфекции. К наиболее значимым среди них в настоящее время относят полиморфизм HLA-системы и ряда генов, в том числе:

рецептора ретиноидной кислоты (ген гага);

белка Р53 (ген tp53);

иммунорегулирующего цитокина интерлейкина -10 (ген il-10);

фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (ген mthfr). Редкая мутации в генах tmc6 и  tmc8 (локализованы в 17 хромосоме) приводит к 100% малигнизации папилломавирусной инфекции в раннем детстве и возникновению рака у 50% инфицированных взрослых. Определенное значение приписывают также полиморфизму гена cdknla, кодирующего белок WAE1 (ингибитор циклин-зависимой киназы G1).

Длительное употребление (10 лет и более) гормональных противозачаточных препаратов в два раза увеличивает риск развития инвазивного рака шейки матки. Предполагается, что это связано с возможным участием эстрогенов и прогестеронов в регулировании экспрессии генов ВПЧ.

Специфическая роль различных возбудителей ИППП в патогенезе цервикального рака установлена на основании эпидемиологических наблюдений. Ко-факторами инвазивного рака шейки матки признаны вирус простого герпеса 2 типа, C.trachomatis и ВИЧ. В случае с ВПГ-2 и C.trachomatis возможным механизмом считается наличие хронического воспаления и образование свободных радикалов, что приводит к нестабильности клеточного генома. При ВИЧ-инфекции выявлена прямая зависимость между частотой развития инвазивного рака и количеством CD4+ - лимфоцитов. Эти данные напрямую указывают на взаимосвязь между патогенезом рака при папилломавирусной инфекции и функциональной состоятельностью клеточного звена адаптивной иммунореактивности.

По данным эпидемиологических наблюдений прослеживается взаимосвязь между развитием рака шейки матки и употреблением некоторых продуктов питания. Возможная протективная роль приписывается рациону питания с преобладанием фруктов и овощей, содержащих большое количество витамина С и Е, β- и α-каротинов, ликопина. Напротив, повышенная концентрация гомоцистеина в крови после употребления пищи, богатой белками, способствует развитию цервикальной неоплазии. Однако не все исследователи разделяют эту точку зрения. Доказательная база ассоциации диеты со злокачественной трансформацией эпителия, зараженного ВПЧ, на текущий момент признана недостаточной.

ПРОФИЛАКТИКА  РАКА  ШЕЙКИ  МАТКИ: СКРИНИНГ

Широкое внедрение скрининговых программ во многих развитых странах создало возможности для своевременного выявления доброкачественных поражений и предопухолевых состояний шейки матки (ШМ), определения этиологических факторов последних и проведения адекватного лечения. Результаты скринингового обследования женщин с 18-20-летнего возраста позволяют сформировать группы риска и, наблюдая за ними, определять больных, в отношении которых необходимо проведение профилактических мероприятий. Выделение групп риска, несомненно, содействует расширению мероприятий по ранней диагностике РШМ.

Отмечается значительная вариабельность показателей заболеваемости и смертности от РШМ не только в различных странах мира, но и в разных областях одной и той же страны. Это может быть связано со многими обстоятельствами: социально-экономическими условиями, национальными традициями, образовательным уровнем населения, степенью развития системы здравоохранения, уровнем проведения программ скрининга и др.

В России в настоящее время ежегодная заболеваемость РШМ составляет 15,4 на 100 тысяч женщин. В 1999 г. по показателям заболеваемости и смертности РШМ находился на шестом месте среди злокачественных заболеваний у женщин; его удельный вес составлял соответственно 5,4 и 4,8%. В 2007 г. было зарегистрировано 12 600 новых случаев РШМ (стандартизированный показатель на 100 тысяч женщин составил 11,2) и от него умерли 6454 женщины. Приведенные данные демонстрируют достаточно высокую смертность от РШМ [2].

Вышеизложенные факты с большой убедительностью свидетельствуют о первостепенном значении ранней диагностики и своевременного лечения патологических состояний шейки матки. Важно также широкое внедрение вакцинации против вируса папилломы человека, роль которого доказана в генезе предраковых и раковых состояний шейки матки, вульвы и влагалища.

Инфицированность ВПЧ считается причиной развития РШМ в 97% случаев. Канцерогенез развивается в несколько этапов: инфицирование несколькими онкогенными типами ВПЧ, длительная персистенция вируса, высокая вирусная нагрузка, интеграция вирусной ДНК в клеточный геном хозяина. Важную роль в реализации патологического эффекта на ШМ имеют как эндогенные, так и экзогенные факторы. Как известно, ШМ относится к числу так называемых барьерных органов, наиболее часто подверженных внешнему влиянию.

Факторы риска

Проведенные эпидемиологические исследования позволили предположить, что факторами риска развития предрака и РШМ являются раннее (в 14-18 лет) начало половой жизни, ранняя (до 18 лет) первая беременность, два и более спонтанных аборта, раннее менархе, курение. Известно, что курение повышает риск развития папилломавирусной инфекции, способствуя накоплению канцерогенных продуктов курения. Никотин и другие компоненты дыма (3-4-бензопирен, антрацен) были найдены в цервикальной слизи активных и пассивных курильщиц.

Наблюдается определенная связь между РШМ и частой сменой половых партнеров. Больные РШМ и с предопухолевыми состояниями чаще характеризуются низким социально-экономическим статусом, имеют в анамнезе заболевания, передающиеся половым путем. В ряде эпидемиологических и клинико-статистических исследований показано, что РШМ сравнительно редко поражает мусульманок и евреек, мужья которых подверглись циркумизации.

Имеются исследования, содержащие вывод о том, что гиперэстрогения содействует развитию РШМ, а прогестины блокируют фазу инициации опухоли. Вопрос о действии гормональных противозачаточных средств как стимуляторов развития дисплазии ШМ остается дискутабельным, хотя существуют исследования, свидетельствующие о возрастании риска заболевания при длительном приеме высокодозированных синтетических прогестинов. В работе L A. Brinton показано, что риск развития аденокарциномы ШМ при применении оральных контрацептивов повышается почти в 2 раза. По данным VI Всемирного конгресса по гинекологической эндокринологии (Швейцария, 1988), у женщин в возрасте 45-54 лет, ранее применявших оральные контрацептивы, повышена частота премалигнизационного поражения ШМ, что может быть связано с более тщательным скринингом или с отсутствием применения барьерных методов контрацепции у таких женщин.

Фактор наследственности при РШМ особой роли не играет. Среди эндогенных модифицирующих факторов в генезе малигнизации эпителия ШМ немаловажную роль играет состояние иммунной системы, в частности клеточно-опосредованного иммунитета. Исследованиями последних десятилетий установлено, что иммунодефицит является обязательным компонентом любой  вирусной инфекции.

Скрининг

РШМ является одной из немногих нозологических форм злокачественных новообразований, которые удовлетворяют всем требованиям для проведения скрининга. Это заболевание имеет надежно распознаваемую преклиническую фазу и длительный период развития, по отношению к нему существуют возможности для дальнейшей верификации диагноза и методы эффективного лечения, а также надежный скрининг — цитологическое исследование слизистой ШМ.

Цервикальный скрининг – это обследование всех женщин группы риска с целью выявления и своевременного лечения предраковых изменений ШМ. Он эффективен только тогда, когда разработана система наблюдения и лечения для предотвращения развития РШМ. Скрининговый тест должен быть простым, неинвазивным, чувствительным и специфичным, безопасным, недорогим и доступным. Выбор теста зависит от организации системы здравоохранения и ее финансовых возможностей, подготовки медработников, наличия лабораторий и транспорта, доступности, стоимости метода. Скрининг на РШМ включает цитологическое исследование мазков с поверхности влагалищной части ШМ и цервикального канала. При начальных формах рака достоверность этого метода, по данным разных авторов, составляет 60-80%. Достоинствами цитологического метода являются безболезненность и безопасность получения материала, возможность исследования патологического процесса в динамике, диагностика рака на начальной стадии. Недостатком считается невозможность диагностирования инфильтративного ракового поражения. Цитологический метод должен быть не только чувствительным, но и высокоспецифичным, поскольку женщина с положительными данными цитологического исследования переходит из разряда здоровых в группу больных. В странах Европы для ранней диагностики РШМ используется цитологическое исследование мазков по Папаниколау (Рар-тест). Впервые цитологический скрининг на РШМ стал проводиться в канадской провинции Британская Колумбия в 1949 г. Затем программы скрининга начали осуществляться в других странах: в 50-х годах — в США и в Китае; с начала 60-х годов— в Японии, Финляндии, Швеции, Исландии; с начала 70-х годов — в Германии, Бразилии и других странах. В России скринингом на РШМ было охвачено более 50 млн. женщин и показатель заболеваемости снизился с 12,7 на 100 тысяч населения в 1980 г. до 10,4 (в некоторых областях – до 5,8) на 100 тысяч населения в 1985 г.

Следует отметить, что эффект цитологического скрининга проявляется не сразу, а через 15-20 лет; чем дольше осуществляется цитологический скрининг, тем выше его эффективность. Это подтверждается опытом проведения всех скрининговых программ и связано с биологическими особенностями развития РШМ. Дисплазия эпителия ШМ может перейти в преинвазивный рак в среднем через 5-8 лет, микроинвазивный рак может развиться еще через 7-10 лет, а клинический рак – через 10-15 лет; поэтому для проявления эффекта скрининга необходимо определенное время. Встречаются и опухоли с очень быстрым развитием, которое происходит менее чем за год; удельный вес таких опухолей не достигает 10%. Быстротекущие опухоли могут «ускользать» от скрининга. Известно также, что не все случаи дисплазии и внутриэпителиального рака переходят в инвазивный РШМ.

Успех скрининга на РШМ во многом зависит от правильной организации обследования и контроля за его проведением. Центр, ответственный за организацию скрининга, контролирующий периодичность его проведения, охват женского населения и наблюдение выявленных больных, обобщающий и анализирующий результаты скрининга, в нашей стране отсутствует. Служба медицинской статистики к скринингу не подключена.

Вызывает сомнение целесообразность проведения ежегодного скрининга всех женщин. Этот вопрос обсуждается с учетом того, что в разных странах приняты различные межскрининговые интервалы. Так, в Финляндии скрининг проводится с 5-летним интервалом, в Швеции – каждые 4 года, в Исландии и Китае — каждые 2-3 года; в США и Дании также применяется 3-летний межскрининговый интервал, в Германии — 2-летний.

Вопрос о периодичности цитологического скрининга на РШМ должен решаться в связи с рациональным размещением и наиболее эффективным использованием имеющихся ограниченных ресурсов. По расчетам специалистов, эффективность скрининга на РШМ при интервалах между обследованиями в 1 и 2 года примерно одинакова. Если же заменить скрининг периодичностью 1 раз в 3 года на ежегодный скрининг той же популяции женщин, то объем работы возрастет в 3 раза, а эффективность профилактики РШМ повысится лишь на 2%. Поэтому рост эффективности скрининга может быть достигнут не за счет увеличения его частоты, а посредством активного привлечения женщин, не проходивших обследование.

Сторонники ежегодных скринингов обосновывают свою позицию низкой чувствительностью цитологических исследований в некоторых лабораториях, большим количеством ложноотрицательных ответов. Однако более рациональными, чем необоснованная трата ресурсов и времени на повторные скрининги, представляются повышение квалификации, наращивание опыта врачей и лаборантов-цитологов. Для уменьшения ложноотрицательных цитологических исследований во многих странах рекомендуют проводить скрининг у женщин 2 года подряд и при отрицательных цитологических данных увеличивать интервал между скринингами до 3-5 лет. Так, если чувствительность цитологического исследования составляет 80%, а 20% случаев начального РШМ пропускаются, то при втором скрининге, произведенном через год, останутся невыявленными только 4% случаев начального рака.

ВОЗ рекомендует в странах с ограниченными ресурсами организовывать хотя бы одноразовый скрининг всех женщин 35-40 лет, а при наличии больших возможностей осуществлять обследование всех женщин 35-55 лет с интервалом в 10 или 5 лет. Идеальным считается скрининг женщин 25-60 лет сначала на протяжении 2 лет подряд, при отрицательных результатах – каждые 3 года.

Эффективность скрининга на РШМ, безусловно, зависит от чувствительности цитологического исследования, которая, по данным разных авторов, составляет от 66 до 83%. В 70-90% случаев причиной ложноотрицательных цитологических ответов является плохой забор материала для цитологического исследования и лишь в 10-30% случаев – ошибочная интерпретация цитологических данных. Если ложноположительные результаты, как правило, нивелируются проводимой кольпоскопией и прицельной биопсией, то высокая настороженность врачей в отношении рака заставляет их искать способы предотвращения ложноотрицательных результатов. Чаще всего неинформативный материал получают при взятии мазков из цервикального канала: отсутствие в мазках клеток эндоцервикального эпителия отмечается в 8-18% исследований. Вследствие этого именно случаи железистого рака и железисто-плоскоклеточного РШМ наиболее часто пропускаются при скрининге.

В течение последних 25 лет стратегия скрининга на РШМ не менялась. Отсутствие программы скрининга с разработкой всех организационных вопросов и контроля за ее выполнением, по-видимому, является одной из основных причин недостаточной эффективности скрининга.

Таким образом, учитывая, что в России цитологический скрининг носит оппортунистический характер, а охват им женского населения составляет не более 30%, для оптимизации профилактических мероприятий следует обратить внимание на:

•  разработку единой для страны скрининговой программы;
•  подготовку цитологов, кольпоскопистов и других специалистов в соответствии с международными стандартами по единой для страны программе;
•  изучение и внедрение новых технологий диагностики.

В настоящее время все большее распространение получает новая технология приготовления цитопрепаратов, известная как жидкостная цитология. Она основывается на размещении материала не на стекле, а в транспортной жидкости, и имеет более высокую чувствительность, чем традиционный мазок.

Исследование мазков по Папаниколау, полученных традиционным методом сбора материала, показывает, что не все, а только от 6,5 до 18% взятых клеток наносятся на мазок. Кроме того, вследствие плохого нанесения многие из этих клеток трудно или невозможно анализировать. Не вызывает сомнения, что традиционный метод анализа цитологического мазка имеет высокую диагностическую значимость. Тем не менее существует мнение, что его применение дает от 6 до 55% ложноотрицательных результатов. По данным обзора М. Т. Fahey, чувствительность традиционного метода составляет 55-65%, а специфичность — 65-70%. В работах многих авторов отмечаются преимущества жидкостного метода в определении патологии ШМ легкой и тяжелой степени, чувствительность которого составляет 71,4-95%, специфичность— 58-76,2%. Кроме того, в литературе представлены данные о сокращении на 54% мазков, непригодных для исследования. Не исключено, что оно связано с улучшением сохранности клеток и их репрезентативностью, которые и обеспечивают более точную интерпретацию цитологической картины. Это объясняет и данные, полученные D. Schledermann (2004), согласно которым частота обнаружения клеток с пограничными изменениями ядра при использовании жидкостного метода может быть на 41% ниже таковой при применении традиционного метода с соответствующим улучшением диагностики неопластических поражений при последующем врачебном наблюдении.

Одна из потенциальных трудностей — дифференциальная диагностика между группами клеток аденокарциномы и клетками, похожими на них из-за измененной структуры. G.R.Johnson и Н. L. RahemtuLla в небольшом исследовании (1999) сравнивали цитологические особенности аденокарциномы in situ в мазках по методу ThinPrep на основе жидкостной цитологии и аденокарциномы при взятии материала традиционным методом. В мазках ThinPrep авторы обнаружили все характерные особенности клеток, присущие им при взятии материала традиционным методом, а также отметили улучшение визуализации деталей ядра, неровности очертания ядерных мембран и наличия ядрышек, которые позволяют с большой вероятностью отличить аденокарциному от иной, сходной с ней, патологии.

Таким образом, мазки, приготовленные с помощью жидкостного и традиционного методов, сопоставимы, однако их различия более существенны, чем сходство. Не вызывает сомнения, что жидкостный метод имеет значительные преимущества перед традиционным. В последние годы получены новые данные о роли ВПЧ в генезе РШМ. Поэтому предлагаются новые технологии скрининга: клинико-визуальный метод с пробами, ВПЧ-тест, биомаркеры.  

Применение теста на вирус папилломы человека в скрининге на рак шейки матки

Установление этиологической роли ВПЧ в развитии РШМ привело к тому, что диагностика ПВИ наряду с цитологическими исследованиями стала рассматриваться как важнейший элемент скрининга и профилактики РШМ. В ходе многочисленных эпидемиологических исследований и анализа естественного течения ПВИ было доказано, что:

•  ВПЧ онкогенных типов обнаруживаются более чем в 99% случаев РШМ;
•  персистенция ПВИ – необходимое условие развития цервикального рака;
•  тест на ВПЧ обладает гораздо большей чувствительностью в отношении идентификации ЦИН, чем цитологическое исследование.

На основании данных, полученных во многих крупных международных исследованиях, были сформулированы рекомендации по применению теста на ВПЧ в указанных ниже случаях:

•  в первичном скрининге в сочетании с цитологическими исследованиями или в качестве самостоятельного теста;
•  при ведении пациенток, у которых при цитологическом исследовании выявлены атипические клетки плоского эпителия неопределенной значимости (atypical sguamous cells of undetermined significance – ASC-US);
•  для мониторинга терапии поражений высокой степени (ЦИН II/III) и рака.

Обзор последних скрининговых исследований, проведенных с целью оценки диагностических характеристик цитологического исследования и тестирования на ВПЧ, показал, что чувствительность теста на ДНК ВПЧ онкогенных типов для диагностики ЦИН II/III  исключительна высока. Несмотря на различия в дизайне исследований, обследуемых популяциях, показателях распространенности ПВИ, а также в используемых методах детекции ВПЧ и ЦИН, анализ полученных данных позволил сделать следующие общие выводы:

•  чувствительность тестирования на ВПЧ (88-98%) превышает чувствительность цитологического исследования (51-86%);
•  специфичность тестирования на ВПЧ (83-94%) уступает специфичности цитологического метода (92-99%);
•  чувствительность и прогностическая значимость отрицательного теста на ВПЧ в сочетании с отрицательным результатом цитологического теста приближаются к 100%.

Важным аргументом сторонников использования теста на ВПЧ в первичном скрининге является также то, что высокая чувствительность и прогностическая значимость отрицательных результатов позволяют существенно увеличить интервал скрининга для женщин с отрицательным ВПЧ-тестом. Относительно невысокие показатели специфичности и прогностической значимости положительных результатов ВПЧ-теста обусловлены тем, что у большинства женщин, особенно молодых, ПВИ носит транзиторный характер. Однако среди женщин старше 30-35 лет показатели спонтанной элиминации вируса значительно ниже и, следовательно, выше диагностическая ценность теста на ВПЧ. На этом основании тестирование на ВПЧ в сочетании с цитологическим тестом официально одобрено в США для первичного скрининга среди женщин старше 30 лет. В случае отрицательных результатов обоих тестов рекомендуемый интервал скрининга составляет 3 года. Женщинам с отрицательным результатом цитологического исследования, но положительным тестом на ВПЧ онкогенных типов, рекомендуется повторить оба теста через 6-12 месяцев. Если при повторном обследовании результат какого-либо теста окажется положительным, показано проведение кольпоскопии.

В Европе вопрос о применении теста на ВПЧ в первичном скрининге находится в стадии активного обсуждения. Более низкая по сравнению с цитологией специфичность теста на ВПЧ удерживает многие европейские агентства по изучению рака от включения его в скрининг, особенно в странах, где успешно действуют скрининговые  программы на основе цитологии. Для  повышения  специфичности тестирования  на  ВПЧ предлагается  несколько подходов. Один  из них состоит в использовании цитологического метода как дополнительного у ВПЧ-положительных женщин. Другой подход заключается в повторном тестировании на ВПЧ с интервалом в 6-12 месяцев. Динамическое наблюдение за ПВИ показало, что более чем в 80% случаев она носит транзиторный характер. Развитие тяжелой дисплазии возможно только у женщин с персистирующей ПВИ. Наиболее эффективным методом выявления персистенции вируса является генотипирование,  так как тестирование на ВПЧ без определения типа не позволяет дифференцировать персистенцию от реинфекции.

В качестве одного из критериев клинически значимой инфекции, способной развиться в заболевание, рассматривается количество вируса (вирусная нагрузка). Было установлено, что показатель спонтанной элиминации вируса ниже, а риск прогрессии выше в случаях ПВИ с большой вирусной нагрузкой. Точную количественную оценку ДНК можно провести с применением метода полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Кроме того, мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет определить типы вируса в исследуемой пробе. Несмотря на то, что высокая вирусная нагрузка как фактор риска неопластической прогрессии активно изучается, использование ее в клинической практике в настоящее время представляется весьма проблематичным. Во-первых, зависимость степени дисплазии от вирусной нагрузки в достаточной мере описана только для ВПЧ 16-го типа, а во-вторых, вследствие отсутствия стандартизованной методологии определения количества вирусной ДНК нельзя установить пороговое значение, выше которого она может считаться клинической значимой.

Тестированию на ВПЧ отводится особая роль в первичном скрининге на цервикальные аденокарциномы — редкие, но особенно агрессивные неоплазии. Хотя этиологическая роль ВПЧ в развитии этого заболевания однозначно не определена, показано, что практически во всех цервикальных аденокарциномах обнаруживаются онкогенные типы ВПЧ, главным образом 18-го типа. Так как цитологические методы выявления атипичных клеток железистого эпителия имеют существенные ограничения, включение тестирования на ВПЧ в скрининговые программы может повысить показатель выявления цервикальных аденокарцином и предшествующих им поражений.

Определение  ВПЧ   может  играть  существенную  роль в скрининге на РШМ. Основные стратегии выявления ВПЧ при данном скрининге могут быть основаны на следующих положениях:   

1.  Идентификация ВПЧ у женщин с нормальной цитологической картиной при исследовании шеечных мазков позволяет выделить группу риска развития раковых изменений(скрининговая функция).
2.  Существенное количество вируса папилломы приводит к ВПЧ-зависимым ЦИН.
3.  У женщин в возрасте до 30 лет более 90% ЦИН спонтанно регрессируют, тогда как у женщин среднего возраста, в связи с персистенцией ВПЧ, поражения регрессируют значительно реже.
4.  Только у женщин с персистирующей ПВИ (ВПЧ высокого риска) возможно развитие РШМ.

Таким образом, у женщин старше 30 лет необходимы скрининг, улучшающий определение ВПЧ, и цитологическое исследование цервикальных мазков по Папаниколау. Только  при  одновременном  определении  отрицательного РАР- и ВПЧ-тестов можно делать вывод о регрессе патологии.

Молекулярные маркеры в скрининге на рак шейки матки. Перспективы

Как известно, ключевую роль в индукции цервикального канцерогенеза играют ранние белки ВПЧ Е6 и Е7: неконтролируемая экспрессия генов Е6 и Е7 в базальных и парабазальных слоях эпителия выводит из строя два ключевых белка клетки - р53 и pRb, соответственно, регулирующих клеточный цикл.

Современная концепция скрининга на РШМ ставит его основной задачей выявление пациенток с цервикальными интраэпителиальными повреждениями высокой степени (ЦИН II/III), которые в данный момент времени в медицинском вмешательстве не нуждаются. Теоретически можно выделить три уровня риска развития цервикального рака:

•  инфицирование онкогенными типами ВПЧ;
•  появление в базальном и парабазальном слоях эпителия клонов клеток, в которых нарушена регуляция транскрипции вирусных онкогенов и, таким образом, инициирована дестабилизация гена;
•  прогрессия этих клонов до популяций клеток с высоким уровнем нестабильности хромосом и затем до клеток инвазивного рака.

Основываясь на этих концептуальных положениях и принимая во внимание высокий показатель транзиторной ПВИ, можно утверждать, что самым эффективным подходом к ранней диагностике цервикального рака будет выявление популяции клеток, только что инфицированных для трансформации. Специфичные и чувствительные маркеры, способные точно идентифицировать эти клетки, позволят существенно повысить качество цервикального скрининга.

Белки человека, которые в норме не экспрессируются в клетках цервикального эпителия, но значительно интенсивнее синтезируются вследствие неконтролируемой экспрессии вирусных онкогенов, являются одной из сфер поиска эффективных маркеров. К числу таких белков относится pl6INK4A – ингибитор циклин-зависимой киназы. Инактивация pRb белком Е7 индуцирует значительное повышение экспрессии pl6INK4A по принципу обратной отрицательной связи. Белок pl6INK4A сейчас рассматривается как один из многообещающих маркеров диспластических изменений в клетках плоского и железистого эпителия цервикального канала.
           Важным событием в цервикальном канцерогенезе считают интеграцию вирусной ДНК в геном хозяина. Процесс интеграции часто сопровождается нарушением интактности генов вируса Е1 и Е2, участвующих в регуляции экспрессии Е6 и Е7, вследствие чего экспрессия Е6 и Е7 значительно повышается. Полагают, что интеграция представляет собой активационный механизм прогрессии от дисплазии тяжелой степени к раку. Для выявления интегрированной формы вируса используются такие методы, как гибридизация in situ, ПЦР в реальном времени, обратно-транскриптазная ПЦР. Несмотря на противоречивость данных о формах вирусного генома на разных стадиях опухолевой прогрессии, которая отчасти может быть обусловлена разной чувствительностью используемых методов, как правило, на ранних стадиях опухолевого процесса вирусная ДНК обнаруживается в эписомальной форме, а на поздних стадиях — в интегрированной.

Еще одним подходом к идентификации потенциальных маркеров неопластической прогрессии является анализ эпигенетических изменений в хромосомах хозяина, являющихся прямым или непрямым следствием нерегулируемой экспрессии вирусных онкогенов. Примером таких изменений могут служить хромосомные аберрации, в результате которых инактивируются гены-супрессоры опухолевого роста. К инактивации этих генов может также приводить гиперметилирование их регуляторных последовательностей.

Можно ожидать, что с успехами в области изучения функций вирусных генов и генов человека, продукты которых взаимодействуют с белками вируса, список маркеров, обладающих реальным потенциалом для прогноза неопластической прогрессии, будет увеличиваться. Очевидно, что до внедрения в клиническую практику необходимо провести тщательную клиническую оценку всех предлагаемых маркеров. Детально спланированные молекулярные и эпидемиологические исследования помогут оценить диагностическую и прогностическую значимость предлагаемых маркеров и на основе самых надежных из них разработать эффективные скрининговые тесты.

Резюмируя представленную информацию, следует отметить, что правильная организация цитологического скрининга, а также выявление вируса папилломы человека играют существенную роль в скрининге на рак шейки матки. Снижение заболеваемости раком шейки матки может быть достигнуто также путем своевременной диагностики и адекватного лечения ее патологических состояний. Диагностика, направленная на прогнозирование патологии шейки матки, должна основываться на цитологическом методе, подкрепленном ПЦР-диагностикой на вирус папилломы человека и внедрением молекулярных маркеров.

Как известно, комплексный подход к профилактике рака шейки матки и борьбе против этого заболевания включает в себя различные виды воздействия в рамках широкого спектра мероприятий: от первичной профилактики посредством внедрения образовательных программ, направленных на снижение риска развития рака шейки матки, и вакцинации до раннего обнаружения, лечения и паллиативной терапии.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Особенностью лабораторной диагностики ВПЧ-инфекции является преимущественное использование молекулярно-биологических методов для обнаружения и идентификации ДНК ВПЧ, так как с помощью традиционных вирусологических методов вирус обнаружить невозможно.

Серологическое исследование также имеет ограничения. ВПЧ-инфекция сопровождается выработкой специфических антител к главному капсидному протеину, но антитела длительно циркулируют в крови, что вносит определенные трудности в интерпретацию результатов. Доступные тест-системы по большей части представляют собой варианты ИФА для выявления антител к белку L1. В процессе инфекции выявляются антитела в крови и в слизистых секретах. Интересно, что уровень ВПЧ-специфических антител классов IgG и IgA в эпителиальной ткани не коррелирует с элиминацией вируса. Обнаружение в плазме /сыворотке крови антител класса IgA совпадает с исчезновением вируса. При персистирующей инфекции у больных в крови обнаруживаются длительно циркулирующие антитела класса IgG.

Молекулярно-биологические методы диагностики папилломавирусной инфекции разрабатывались по двум направлениям:

• создание тест-систем для массового обследования женщин на ВПЧ с целью профилактики развития рака шейки матки, максимально поддающиеся автоматизации;

• создание тест-систем, позволяющих получать исчерпывающую информацию о течении ВПЧ-инфекции, необходимой при лабораторном мониторинге конкретной истории болезни и эпидемиологических исследованиях.

К первой группе тестов можно отнести ВПЧ  Digene-тест, который полностью автоматизирован, а также некоторые варианты ПЦР.

Ко второй группе тестов относятся методы, позволяющие определять генотипы ВПЧ (ПЦР), вирусную нагрузку (ПЦР в режиме реального времени), экспрессию онкогенных генов е6 и е7 (HPV OncoTect™ - тест, Invirkm Diagnostics LLC; "PreTect HPV-Proofer", Nor Chip) и другие.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют обнаружить вирус, а также дают однозначный ответ на вопрос, каким генотипом ВПЧ произошло заражение, сколько генотипов присутствует одновременно, какова вирусная нагрузка, в какой форме присутствует вирус в эписомальной или интегрированной.

Методы детекции ДНК ВПЧ

Гибридизация in situ 

ДНК ВПЧ может быть обнаружена непосредственно в эпителиальных клетках в цитологических мазках или биоптатах, взятых из пораженного эпителия кожи и слизистых с помощью гибридизации in situ. Этот метод основан на использовании меченых зондов, которые комплементарно гибридизуются с внутриклеточной ДНК ВПЧ. Хотя чувствительность метода имеет ограничения (25 копий ДНК ВПЧ на клетку), он позволяет определить локализацию вируса непосредственно в клетке. Однако в случае низкой копийности вируса в пораженной  ткани,  что  характерно,  например,  для  выраженной дисплазии шейки матки, метод дает ложно-отрицательные результаты. Метод  позволяет  также   одновременно   с  обнаружением  вируса определить генотип ВПЧ, если во время эксперимента используется смесь зондов, специфичных к ДНК различных генотипов ВПЧ.

ДНК ВПЧ также может быть выделена из клинического материала для постановки Саузерн-блота или гибридизации дот-спот. Однако такой подход не может быть автоматизирован и не подходит для массовых исследований. Ранее использующийся в качестве «золотого стандарта» Саузерн-блот в настоящее время вытеснен ПЦР.

ПЦР и её модификации

ПЦР (Amplicor HPV test, Roche Molecular Diagnostics) признана «золотым стандартом» диагностики ВПЧ-инфекции.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +94°С происходит разделение цепей ДНК, затем при +56°С ... +60°С — присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +72°С протекает синтез новых цепей ДНК. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для детекции.

Наиболее распространенным методом детекции продуктов амплификации является гель-электрофорез. После завершения ПЦР реакционная смесь вносится в лунки агарозного геля, содержащего флуоресцентный краситель, и подвергается электрофоретическому разделению в специальной камере. Флуоресцентный краситель связывается с двухцепочечными молекулами ДНК и под действием ультрафиолетового света начинает светиться. Продукты амплификации можно визуализировать с помощью специальных приборов, например, видео-система «Gel Doc» фирмы BioRad.

При постановке ПЦР должны соблюдаться определенные требования для исключения ложно-положительных результатов. Это строгое разграничение и разобщение разных этапов работы по отдельным помещениям, строгое соблюдение правил пользования перчатками, халатами, лабораторным оборудованием в пределах помещения, предназначенного для каждого этапа исследования. При несоблюдении этих требований легко возникает перенос какого-либо количества уже амплифицированной ДНК в новую реакционную смесь, что приводит к появлению ложно-положительных результатов из-за повторной амплификации ранее полученных ампликонов.

Разработанный метод ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени  (real-time PCR)  позволил значительно расширить возможности молекулярной диагностики. В основе данного метода лежит накопление и регистрация флуоресцентного сигнала, возникающего в результате взаимодействия специфического гибридизационного ДНК-зонда с продуктом амплификации непосредственно в процессе реакции, т.е. в режиме реального времени. Реакционная смесь, помимо описанных выше компонентов, содержит гибридизационные ДНК-зонды, имеющие на одном конце флуоресцентную метку, а на другом гаситель флуоресценции. В отсутствии специфического продукта амплификации флуоресценция не выявляется, т.к. пространственная структура зонда обеспечивает тесный контакт флуоресцентной метки и гасителя. В процессе накопления продуктов амплификации происходит увеличение флуоресцентного сигнала, который регистрируется специальным оптическим модулем, встроенным в прибор для постановки real-time PCR. Кинетика накопления продуктов амплификации зависит от исходного количества искомой матрицы, что позволяет определить титр возбудителя. Чем больше ампликонов накапливается в результате реакции, тем выше уровень регистрируемого флуоресцентного сигнала, который обрабатывается с помощью программного обеспечения и отображается в виде кривой флуоресценции. Таким образом, наличие или отсутствие и титр возбудителя в клиническом материале определяются без проведения дополнительных манипуляций, связанных с извлечением продукта амплификации из пробирок и последующим анализом.

При постановке ПЦР в режиме реального времени отсутствие отдельной стадии детекции продуктов амплификации позволяет уменьшить риск контаминации продуктами ПЦР и, таким образом, упростить требования, предъявляемые к организации ПЦР-лаборатории. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах без выделения отдельного помещения для детекции продуктов амплификации.

Существует также вариант детекции флуоресцентного сигнала по конечной точке (endpoint analysis), который отличается от детекции в реальном времени тем, что амплификация проводится в обычных амплификаторах без оптического модуля, а уровень флуоресценции измеряется после проведения реакции в специальных флуоримет-рических детекторах.

Большинство разработанных тест-систем для выявления ДНК ВПЧ с помощью ПЦР содержат праймеры, специфичные к консервативной области вирусного генома, например, к последовательности гена l1, кодирующего белки капсида. Однако такое исследование не позволяет определить генотип вируса, так как искомая мишень является общей для всех ВПЧ.

Определение генотипа ВПЧ с помощью ПЦР основано на подборе праймеров к участкам в нуклеотидной последовательности генов е6 и е7, отличающих один генотип ВПЧ от другого. Список генотипов, которые можно выявить с помощью разработанных тест-систем определяется в зависимости от частоты встречаемости того или иного типа ВПЧ. Для практического генотипирования в группу высокого онкогенного риска включают HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66 и HPV-68; в группу низкого онкогенного риска - HPV-6, HPV-11, HPV-13, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-61, HPV-70, HPV-72, HPV-81 и HPV-89. Выделяют также группу промежуточного риска, в которую включены HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-73 и HPV-82.

Все современные тест-системы содержат также праймеры для внутреннего контроля. Аналитическая чувствительность ПЦР колеблется между 10 и 200 копиями ВПЧ в образце в зависимости от типа ВПЧ и метода детекции продуктов амплификации.

Использование тест-систем для последовательного выявления ДНК определенного генотипа ВПЧ в настоящее время не находит широкого применения из-за ограничений в пропускной способности.

HPV Digene-тест (Digene Hybrid Capture System II)

Система двойной генной ловушки Digene Hybrid Capture System II -разработка фирмы Digene Corp., США использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей "хвостовой" реакцией между гибридом РНК пробы - ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест отличается высокой специфичностью, так как мишенью является весь геном вируса. Длинная одноцепочечная РНК эффективно гибридизуется со всеми 8000 нуклеотидами ДНК ВПЧ. Гибрид ДНК-РНК более стабилен, что позволяет избежать нежелательных побочных реакций. Источником дополнительной чувствительности в реакции является использование антител  к гибриду РНК-ДНК,  конъюгированных  с множеством молекул щелочной фосфатазы. Эти меченые антитела распознают короткие цепочки РНК-ДНК гибрида способом, который не имеет отношения к последовательностям нуклеотидов ДНК и РНК. Тысячи молекул антител могут покрыть единичный геномный гибрид ДНК ВПЧ. Каждый иммобилизованный энзим щелочной фосфатазы реагирует с множеством молекул хемилюминесцента диоксетана за 1 минуту и вызывает постоянный поток фотонов, которые прочитываются фотомультиплейерной трубкой люминометра. Система генной ловушки имеет преимущества перед амплификацией мишени, т.к. вовлекает большой объем (10-20%) клинического материала в реакцию. Интенсивность испускаемого света пропорциональна количеству ДНК ВПЧ и выражается как отношение сигнала к положительному контролю. Аналитическая чувствительность этого исследования составляет от 1 до 17,6 пг/мл в зависимости от типа ВПЧ. Это исследование стало уже стандартным в некоторых странах, широко используется в клинических исследованиях, а в США одобрено FDA как скрининговое исследование. На настоящий момент созданы уже модификации метода 4-го поколения. Дизайн постановки включает полную автоматизацию.

Однако метод имеет ряд ограничений. Исследование не позволяет определять наличие определенного генотипа, а лишь проводит дифференциацию между двумя группами вирусов ВПЧ. Это группа низкого онкогенного риска (HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, HPV-44) и группа высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 и HPV-68). Внутри групп генотип ВПЧ не определяется. Предел чувствительности метода составляет приблизительно 5000 геном-эквивалентов, что существенно ниже чувствительности ПЦР. При низкой вирусной нагрузке могут наблюдаться ложно-отрицательные результаты.

Кроме того, возможны перекрестно-реагирующие реакции в случае высокой концентрации ДНК (4 нг/мл и выше) ВПЧ генотипов 13, 6 и 42 из группы низкого онкогенного риска с реактивами для выявления ВПЧ из группы высокого онкогенного риска.

ВПЧ Digene-тест второго поколения и выше позволяет не только выявить присутствие высокоонкогенных типов ВПЧ, но и определить клинически значимую концентрацию ДНК в эпителиальной ткани, которая может служить прогностическим критерием развития заболевания и определить тактику врача в каждой конкретной ситуации.

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИСПЛАЗИИ

Эффективной стратегией, позволившей снизить летальность в связи с раком шейки матки или раком другой локализации, является регулярное профилактическое обследование с целью выявления папилломавирусной интраэпителиальной дисплазии. Развитие ВПЧ-индуцированного рака - процесс медленный, патологический процесс развивается в течение многих лет. В течение этого периода возможно обнаружение предраковых клеток.

Диагностика папилломавирусной инфекции (ПВИ) с целью профилактики рака шейки матки включает комплекс клинико-лабораторных методов исследования.

Клинический осмотр

При клиническом осмотре наружных половых органов возможно выявление бородавок, остроконечных кондилом. При осмотре влагалища и шейки матки выявляются различные изменения, характерные для ПВИ. При осмотре шейки матки в зеркалах можно определить невооруженным глазом участки очаговой гиперплазии эпителия в виде белесых бляшек. Для исключения эндоуретральных кондилом иногда проводится уретроскопия. При визуальном обследовании и при расширенной кольпоскопии используют тест с 3-5% уксусной кислотой и раствором Люголя.

Тест с уксусной кислотой считается положительным, если после обработки на влагалищной части шейки матки появляются белые пятна. Уксусная кислота коагулирует белки, делая клетки белыми и непрозрачными. Нормальный плоский эпителий после обработки уксусной кислотой не изменяется. Участки дисплазии, цилиндрического эпителия, метапластического эпителия дают положительную пробу с уксусной кислотой.

Положительная проба Шиллера - это выявление неокрашенных или неравномерно окрашенных йодным раствором Люголя измененных участков эпителия шейки матки. Нормальный многослойный плоский эпителий под воздействием раствора Люголя равномерно окрашивается в темно-коричневый цвет. Атипически измененный   эпителий   можно   увидеть   невооруженным глазом.

Положительные тесты с уксусной кислотой и раствором Люголя являются основанием для направления пациентки на кольпоскопическое исследование.

Кольпоскопия

Кольпоскопия и биопсия показаны всем женщинам с цервикальной интраэпителиальной неоплазией класса II (ЦИН II) и класса III (ЦИН III), независимо от подтверждения у них наличия ВПЧ-инфекции. Выделяют 5 классов кольпоскопических картин: нормальные, аномальные, неясные (неудовлетворительная кольпоскопия), подозрительные на рак и смешанные (разные). Кольпоскопическими признаками ПВИ шейки матки являются ацетобелый эпителий, лейкоплакия, пунктация, белые выросты и мозаика, жемчужная поверхность после обработки уксусом, атипические сосуды, йод-негативные участки после обработки раствором Люголя.

Цитологическое исследование - мазок по Папаниколау

Мазок по Папаниколау - один из эффективных методов выявления рака шейки матки и предшествующих ему состояний. Согласно эпидемиологическим наблюдениям, рак шейки матки развивается в 2-10 раз чаще у женщин, которым не выполняется это исследование. После введения обязательного регулярного цитологического обследования удалось резко снизить смертность от рака шейки матки. За последние 50 лет этот показатель снизился на 70%. Массовое профилактическое обследование цервикальных мазков по Папаниколау - это пример самого успешного скринингового теста в истории медицины.

Методика забора мазка по Папаниколау

Соскоб с поверхности экзоцервикса, влагалища, вульвы берут специальным шпателем. Материал из эндоцервикса берут смоченным в физиологическом растворе ватным тампоном или цервикальной щеточкой - эндобрашем. Щеточкой удается взять в 7 раз больше клеток. Чтобы получить информативный мазок, нужно соблюсти следующие правила:

• Материал для мазка берут перед бимануальным исследованием;

• Сначала проводят забор материала для цитологического исследования, а потом - для выявления возбудителей инфекций, передающихся половым путём;

• При обильных выделениях из половых путей перед исследованием их удаляют большим тампоном;

Сначала берут соскоб с шейки матки, а потом из цервикального канала;

Допустимо два образца (с экзоцервикса и эндоцервикса) наносить на одно стекло;

Небольшие кровянистые выделения не влияют на результат цитологического исследования, но при обильном кровотечении забор материала следует отложить.

Полученный материал равномерно распределяют тонким слоем по специально обработанному обезжиренному предметному стеклу, чтобы не было комков, и немедленно фиксируют, пока мазок еще не высох, смесью эфир/96% этиловый спирт или только 96% этиловым спиртом. При использовании фиксирующих аэрозолей головку распылителя следует держать на расстоянии не менее 25 см от предметного стекла, чтобы не нарушить расположение клеток.

Рак прямой кишки тоже вызывается вирусом папилломы человека. Мазок по Папаниколау и в данном случае представляет собой эффективный скрининговый метод.

Для получения анального мазка в анус вводят щеточку, вынимают её вращательным движением, соскабливая клетки, а затем фиксируют полученные клетки на предметном стекле или в специальном растворе. Чувствительность этого метода составляет 69-93%, а специфичность – 32-59%; эти величины сопоставимы с чувствительностью и специфичностью цитологических мазков из шейки матки.

Цитологическое исследование монослойных Пап-препаратов

Для повышения информативности Пап-мазков были разработаны и внедрены в практику новые технологии забора материала и подготовки цитологических мазков. Например, в США используются специальные наборы для приготовления мазка по методу Папаниколау. Это система PrepStain, ранее выпускавшаяся под названием AutoCyte, и система ThinPrep. В системе PrepStain цервикальные соскобы собирают в специальный раствор на основе этанола, центрифугируют в градиенте плотности для получения гомогенной концентрированной фракции эпителиальных клеток без примеси нейтрофилов и разрушенных клеток. В системе ThinPrep материал также сразу помещают в забуференный спиртовой раствор. В лаборатории тонкий слой суспензии помещается на стекло с помощью мягкого центрифугирования. Микропроцессор регулирует количество клеток, наносимых на стекло.

Методы жидкостной цитологии снижают вероятность приготовления мазков, непригодных для исследования, предотвращают деформацию клеток из-за высыхания, удаляют слизь, гной, эритроциты, бактерии, дрожжи и позволяют готовить однородный эпителиальный монослой, который легче анализировать. Это повышает чувствительность цитологического исследования и снижает количество ложно-отрицательных результатов.

Для практического применения доступны также автоматизированные компьютеризированные системы обработки мазков и цитологической картины (Avto PaP 300QC, NeoPath и PapNet, Neuromedical). Системы выводят изображение клеток на экран монитора, оснащены программным обеспечением анализа изображения и позволяют оценивать степень плоскоклеточных интраэпителиальных поражений по классификации Bethesda.

Другим подходом повышения информативности цитологического исследования является одновременная оценка цитологической картины и выявление ВПЧ в клетках с признаками атипии после иммунохимического окрашивания. Пример - автоматизированная модульная система BenchMark (Ventana Medical Systems, Tucson), которая выявляет ВПЧ высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-59 и HPV-70) и ВПЧ низкого онкогенного риска (HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 и HPV-44).

Оценка цитологической картины

Цитологические мазки окрашиваются по методу Папаниколау и просматриваются с помощью световой микроскопии (табл.4).

Таблица 4. Критерии оценки состояния эпителия.

Цитологическая оценка	Гистология
Bethesda System, 1999	Bethesda System, 1991	Папаниколау	Степень ЦИН
NILM Атипические клетки отсутствуют	WNL В пределах нормы	1-й класс Атипические клетки отсутствуют, нормальная цитологическая картина	Норма
ASC-US Атипия плоского эпителия неопределенной значимости.	ASCUS/AGUS	2-й класс Изменение клеточных элементов обусловлено воспалительным процессом во влагалище и (или) шейки матки
ASC-H Признаки атипии плоского эпителия, не исключающие HSIL LSIL Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	Атипия плоского эпителия неопределенной значимости	3-й класс Имеются единичные клетки с изменениями соотношения ядра и цитоплазмы, диагноз недостаточно ясен, требуется повторение цитологического исследования или необходимо гистологическое исследование биоптата для изучения состояния шейки матки
LSIL Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	LSIL Плоскоклеточое интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	4-й класс Обнаруживаются отдельные клетки с признаками злокачественности, а именно с увеличенными ядрами и базофильной цитоплазмой, неравномерным распределением хроматина	ЦИН I
HSIL	HSIL	5-й класс	ЦИН II/III
Плоскоклеточное	Плоскоклеточное	В мазке имеются
интраэпителиальное	интраэпителиальное	многочисленные
поражение высокой	поражение	атипические клетки
степени выраженности	высокой степени
(рак in situ)	выраженности (рак in situ)

Тактика цитологического обследования

Группами экспертов США, Европы, ВОЗ разработаны алгоритмы цитологического обследования.

Эксперты CDC (США) рекомендуют начинать цитологическое исследование мазков из шейки матки по Папаниколау у женщин не позднее истечения 3-х лет с момента первого полового акта и в возрасте не позже 21 года; далее ежегодно до 30-летнего возраста. Если при цитологическом исследовании не было выявлено патологии, то последующая кратность постановки теста может быть раз в 2-3 года до 65 лет. В Европейском руководстве рекомендуется начинать скрининговое обследование женщин с 20-30 лет, периодичность обследования - один раз в 3-5 лет до 60-65 лет; профилактическую диагностику прекращают при наличии у обследуемой 3-х и более отрицательных результатов цитологического теста при достижении ею 65 лет.

Группами экспертов США, Европы, ВОЗ предложены алгоритмы ведения пациентов с патологическими результатами цитологического исследования, основанные на Терминологической системе Бетесда. Алгоритм обследования пациенток с отклонениями в цитологической картине зависит от степени патологических изменений (табл.5).

Таблица 5. Алгоритм обследования пациентов с отклонениями в

Пап-мазках по терминологической системе Бетесда.

Цитологическая оценка	Тактика дальнейшего обследования
ASC-US	тест на ДНК ВПЧ, повторный Пап-мазок; женщинам старше 20 лет рекомендуется кольпоскопия
ASC-H	кольпоскопия или биопсия
LSIL	повторное цитологическое обследование или кольпоскопия
HSIL	кольпоскопия и гистологическое исследование биоптата; в США - незамедлительная диагностическая экцизия

Если в мазке найдены атипичные клетки неясного значения (ASC-US) при позитивном тесте на ДНК ВПЧ необходимо проведение кольпоскопии или биопсии. При отсутствии морфологически подтвержденных ЦИН/рака рекомендуется повторное цитологическое исследование через 6-12 месяцев или ВПЧ ДНК-тест через 12 месяцев.

Атипичные клетки плоского эпителия (ASC-H), не позволяющие исключить HSIL (высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения), предполагают немедленное кольпоскопическое исследование или биопсию. При отсутствии ЦИН/рака даже после неоднократного пересмотра цитологических, гистологических и кольпоскопических данных, рекомендуется также повторное цитологическое исследование через 6-12 месяцев или ВПЧ ДНК-тест через 12 месяцев.

При выявлении LSIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени выраженности) необходима кольпоскопия, а при отсутствии визуальных признаков поражения шейки матки - получение цервикального материала с помощью цервикальной щетки или кюретажа. У подростков с LSIL возможно проведение кольпоскопии с повторной цитологией через 6 месяцев или ВПЧ-тестирование через 12 месяцев. У женщин в постменопаузе при наличии цитологических и клинических признаков атрофии с отсутствием противопоказаний к терапии эстрогенами желательно перед повторным цитологическим исследованием для подтверждения интраэпителиальных поражений провести курс интравагинальной терапии эстрогенами.

Цитологический диагноз HSIL (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени тяжести) требует обязательной кольпоскопии и получения эндоцервикального образца с последующим морфологическим исследованием. Если при кольпоскопии поражение не визуализируется, а повторная цитология подтверждает HSIL, возможно проведение диагностической эксцизии. При цитологическом диагнозе HSIL и кольпоскопических изменениях шейки матки необходимо сразу проводить диагностическую эксцизию.

Гистологическое исследование

Прицельная биопсия шейки матки и выскабливание цервикального канала с гистологическим исследованием - основной метод диагностики  ЦИН.  Ревизия цервикального  канала показана всем пациенткам для исключения поражения эндоцервикса.

Гистологическое исследование биоптатов позволяет подтвердить большинство случаев ВПЧ-инфекции и выявить характерные гистологические признаки патологии:

гиперплазия эпителия - умеренное утолщение рогового слоя с папилломатозом, паракератозом и акантозом;

наличие в глубоких участках мальпигиева слоя койлоцитов - больших эпителиальных клеток с круглыми гиперхромными ядрами и выраженной перинуклеарной вакуолизацией.

Гистологическое исследование может быть комбинировано с одновременным выявлением антигенов ВПЧ, ДНК и РНК ВПЧ, определением вирусной нагрузки и др.

Для выявления антигенов доступны моноклональные и поликлональные антитела к белку капсида L1 различных фирм-производителей. Связавшиеся антитела выявляют затем вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (вариант ИФА), либо флюоресцентной меткой (вариант НИФ). Антигены, как правило, обнаруживаются в ядре зараженных клеток, но могут также локализоваться в цитоплазме койлоцитов.

Гистологическое исследование может быть дополнено гибридизацией in situ, позволяющей выявить присутствие в ткани ДНК и РНК ВПЧ. Гибридизация in situ основана на использовании меченых зондов, комплементарных к определенному участку нуклеиновой кислоты ВПЧ. В зависимости от того, чем помечен зонд (радиоизотопной меткой, флуоресцентной меткой, химическим лигандом) ДНК или РНК ВПЧ можно обнаружить с помощью радиографического, флуоресцентного или иммуноферментного анализа. Особенности сигнала позволяют дифференцировать эписомальную или интегрированную форму существования ДНК вируса. Интенсивность сигнала позволяет оценить вирусную нагрузку. Пример - Gen-Point system (Dako, Trappes, Франция) - автоматизированная система обнаружения ДНК ВПЧ в биоптатах, фиксированных формалином или заключенных в парафин.

Молекулярно-биологические методы диагностики

Кольпоскопическое, цитологическое и гистологическое обследования могут быть дополнены методами молекулярной диагностики.

В настоящее время разработаны молекулярно-биологические тесты, позволяющие выявить ДНК и РНК папилломавирусов, типировать ВПЧ, определять вирусную нагрузку, дифференцировать эписомальную и интеграционную форму персистенции вируса, выявлять активность генов онкогенных белков Е6 и Е7, а также определять состояние инфицированных клеток.

ДНК ВПЧ-тест

Методы детекции ДНК ВПЧ из группы высокого онкогенного риска в пораженной эпителиальной ткани - ВПЧ Digene-тест (Digene Corporation.), ПЦР (Amplicor HPV test, Roche Molecular Diagnostics) и их аналоги под общим названием ДНК ВПЧ-тест включены в программы по раннему выявлению предраковых состояний и рака шейки матки. Эти тесты прошли клиническую валидацию как самостоятельные скриниговые тесты и как тесты, дополняющие цитологическое исследование.

ДНК ВПЧ-тест рекомендуется использовать как:

скрининговый

диагностический

для контроля эффективности лечения.

Введение ДНК ВПЧ-теста в скрининговые программы по выявлению рака шейки матки и предшествующих ему состояний приводит к более раннему обнаружению ЦИН II и ЦИН III у женщин в возрасте старше 30 лет. Как скрининговый ДНК ВПЧ-тест используется при обследовании женщин старше 30 лет.

ДНК ВПЧ-тест не рекомендуется использовать в качестве самостоятельного диагностического критерия для неопластических процессов шейки матки без цитологического исследования. Использование этого метода без учета результатов цитологии приводит к гипердиагностике, так как примерно в 80% случаев инфицирование имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Однако ДНК ВПЧ-тест приобретает большую диагностическую и прогностическую значимость, если на фоне ВПЧ-инфекции уже имеется картина дисплазии эпителия. Как самостоятельный диагностический ДНК ВПЧ-тест используется при обследовании пациенток с ASC-US, так как в этом случае он обладает большей информативностью для прогноза развития рака шейки матки, чем повторное цитологическое обследование.

ДНК ВПЧ-тест, в сочетании с цитологическим обследованием, информативен при обследовании пациенток с ЦИН П/Ш после лечения для контроля эффективности лечения.

Типирование папилломавирусов

Для эпидемиологического и клинического мониторинга выявленных случаев папилломавирусных инфекций важно проводить типирование онкогенных папилломавирусов.

Как уже обсуждалось выше, скрининговые тест-системы для выявления ДНК ВПЧ определяют принадлежность папилломавирусов к той или иной группе онкогенного риска без уточнения типа вируса внутри группы.

Однако степень риска развития рака напрямую зависит от принадлежности ВПЧ к тому или иному типу из группы высокого онкогенного риска, от инфицирования несколькими типами ВПЧ одновременно. Наиболее онкогенными являются HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 и HPV-45, среди которых HPV-16 обнаруживается в 70% случаев рака, HPV-18 - в 10%, выявление HPV-31 и HPV-45 при раке достигает 4%, HPV-33 - в 2% случаев. Таким образом, инфицирование HPV-16 и HPV-18 значительно чаще приводит к развитию рака шейки матки.

Типирование ВПЧ позволяет также выявить персистенцию онкогенных папилломавирусов, на которую указывает неоднократное повторное обнаружение одного и того же генотипа вируса. Длительная персистенция HPV-16 и HPV-18 является маркером повышенного риска развития рака шейки матки.

Определение формы персистенции ВПЧ

Известно, что ВПЧ может присутствовать в зараженной клетке в виде эписомальной ДНК (доброкачественная форма персистенции ВПЧ) или в виде ДНК, интегрированной в хромосому клетки-хозяина (злокачественная форма персистенции). Форма персистенции ВПЧ в инфицированном эпителии может быть определена с помощью ПЦР в режиме реального времени по относительному соотношению генов е2 и е6. Интеграция сопровождается делецией большого сегмента вирусного генома, что приводит к разрушению генов el и е2. Целостность генов е6 и е7 не нарушается (рис. 7).

Рис. 7. Формы персистенции ДНК ВПЧ и их соотношение при разных стадиях ПВИ.

Выявление формы персистенции важно для прогноза заболевания. При ЦИН I ДНК ВПЧ выявляется преимущественно в эписомальной форме, а соотношение генов е2/е6 составляет в среднем 0,91 (диапазон разброса показателя 0,54-1,02). При выраженной дисплазии ДНК ВПЧ выявляется или в смешанной форме, или только в интегрированной, соотношение е2/е6 составляет в среднем 0,61 (0-1,08). При карциноме ДНК ВПЧ интегрирована в хромосому зараженной клетки, соотношение е2/е6 - 0,02 (0-0,17).

Определение вирусной нагрузки

Еще одним критерием для прогноза развития рака является определение титра высокоонкогенных ВПЧ на фоне дисплазии эпителия. Изменения титра вируса хорошо изучено на примере канцерогенеза, индуцированного HPV-16. Титр HPV-16 (ДНК копии на клетку) возрастает при прогрессии ЦИН, но уменьшается при карциноме. Для репликации вирусного генома необходима активность генов el и е2. При карциноме вирус существует в виде интегрированной ДНК, репликация геномной ДНК резко снижается (рис.8).

Рис. 8. Изменение вирусной нагрузки HPV-16 при канцерогенезе, логарифмическая шкала.

Наиболее оптимальным методом для определения титра вируса признается ПЦР в режиме реального времени.

Однократное определение титра малоинформативно. По данным М. Cricca и соавторов (2007 г.) диапазон варьирования титра HPV-16 составляет: при ЦИН I - 2.40х101-2.74х106 копий ДНК на клетку; при ЦИН П/Ш - 1.25х103-1.49хЮ9; при карциноме - 3.54х102-2.60х104. Использование тестов по определению вирусной нагрузки высокоонкогенных ВПЧ в качестве маркеров высокого риска развития рака оправдано только в режиме мониторинга.

Определение полноразмерной мРНК генов е6 и е7 ВПЧ

Молекулярные механизмы канцерогенеза при ВПЧ-инфекции связаны с активностью онкогенов е6 и е7, кодирующих белки Е6 и Е7, соответственно. Об активности генов можно судить по интенсивности считывания с них генетической информации (транскрипции) в виде синтеза на матрице ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности генов, информационной или матричной РНК (мРНК).

Присутствие в клиническом материале полноразмерной мРНК генов е6 и е7 онкогенных ВПЧ ассоциировано с повышенным риском неопластической прогрессии (рис.9).

Рис. 9. Частота обнаружения ДНК и мРНК ВПЧ при цервикальной интраэпителиальной дисплазии.

Для выявления полноразмерной мРНК генов еб и е7 ВПЧ разработано несколько вариантов методов детекции: HPV OncoTect1M (Invirion Diagnostics LLC), PreTect™ HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Hurum, Norway), APTIMA® HPV assay (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA, USA).

HPV OncoTect -тест

HPV OncoTectTM – тест; является разработкой фирмы Invirion Diagnostics LLC. Этот тест позволяет с помощью проточной цитометрии выявлять мРНК генов е6 и е7 ВПЧ в инфицированных клетках. В отличие от ПЦР или ВПЧ Digene-теста, при которых инфицированные клетки разрушают для выделения ДНК вируса, при постановке HPV OncoTect-теста используют суспензии инфицированных неразрушенных клеток. Клетки получают из биопсийного материала или цитологических мазков. После подготовки клеточной суспензии, включающей флуоресцентное мечение поверхностных антигенов клеток (этап необходим для идентификации эпителиальных клеток при цитометрии), клетки фиксируют и обрабатывают специальным пермебиализирующим раствором (способствует проникновению реактивов внутрь клетки). Далее проводят гибридизацию со смесью олигонуклеотидных зондов, удаляют несвязавшиеся компоненты и анализируют образцы с помощью проточного цитометра (рис. 10).

Рис. 10. Положительный результат HPV OncoTect™ - теста

(из клинического протокола HPV OncoTect Test Kit, Invirion Diagnostics, 2006).

PreTect HPV-Proofer -тест

PreTect HPV-Proofer-тест - это вариант обнаружения полноразмерной мРНК генов е6 и е7 ВПЧ, разработанный фирмой NorChip. В 2007 году благодаря сотрудничеству фирмы NorChip и фирмы BioMerieux (Франция) появился полностью автоматизированный вариант постановки теста, который объединил технологию обнаружения мРНК ВПЧ, развитую и запатентованную NorChip и технологию NASBA в реальном времени от BioMerieux. NASBA (от англ. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) или NASBA является разновидностью изотермической амплификации РНК. Метод был разработан в качестве альтернативы ПЦР и позволяет при постоянной температуре амплифицировать 109 - 1012 копий РНК за 60-90 минут. С помощью такого подхода можно одновременно выявлять мРНК нескольких типов ВПЧ из группы высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45). При необходимости количество типов ВПЧ может быть увеличено.

Определение состояния клеток, инфицированных ВПЧ

Методом ранней диагностики предраковых клеток и прогнозирования высокого риска развития рака при папилломавирусной инфекции является выявление маркеров озлокачествления клеток, инфицированных ВПЧ. Пример - тест на белок pl6INK4a.

Тест Cervatec™

Разработка фирмы «mtm laboratories AG», Германия - тест CervatecTM pl6INK4a ELISA представляет собой вариант иммуноферментного анализа, который позволяет выявлять белок pl6ink4a непосредственно в цитологических мазках.

Белок pl6INK4a, циклинзависимый ингибитор киназы, играет ключевую роль в pRB-опосредованном контроле перехода Gl-S-фаз жизненного цикла клетки (pRB-тумор-супрессирующий белок ретинобластомы). Гиперэкспрессия гена pl6ink4a происходит вследствие инактивации гена туморсупрессирующего белка pRB онкогенным белком Е7 ВПЧ. Белок pl6INK4a накапливается в клетках при выраженной дисплазии. Использование данного биомаркера для диагностики ЦИН помогает значительно снизить количество неясных цитологических мазков при скрининге и способствует более точной диагностике.

ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Профилактическая иммунизация против ВПЧ доказала высокую эффективность в клинических исследованиях и дает обоснованную надежду быть эффективным орудием  первичной профилактики рака шейки матки и другой ВПЧ ассоциированной патологии.

1. Иммунный механизм вакцинации против ВПЧ.

Между естественным иммунитетом к ВПЧ и индуцированным вакцинами существует значительная разница. Естественный иммунитет вызывает клеточный иммунный ответ, который приводит к рассасыванию генитальных кондилом и интраэпителиальных поражений низкой степени. У людей концентрация антител бывает низкой, у многих женщин сероконверсия не развивается. ВПЧ ограничивает свою пролиферацию в базальных кератиноцитах и завершает жизненный цикл в полностью дифференцированных клетках, находящихся в процессе естественного умирания. В результате, они не вызывают реакции иммунной системы с помощью воспаления или лизиса клеток хозяина и некоторое время могут от нее ускользать, особенно от представляющих антиген клеток Лангерганса.

В то время как ВПЧ при естественном инфицировании ускользает от иммунной системы, ВПЧ в виде вакцины являются доступными для иммунной системы и стимулируют здоровый иммунный ответ. В противоположность естественному, механизм защиты вакцины происходит за счет сывороточных антител. Поскольку вакцина вводится внутримышечно, находящиеся в вакцине вирусоподобные частицы быстро попадают в кровоток, что имитирует виремию. Антигены капсида обрабатываются и захватываются представляющими антиген клетками (АПК). Эти АПК переносят антигены в лимфатические узлы, где они активируют T-хелперы и косвенно B-клетки, вырабатывающие антитела. Вакцина стимулирует образование высоких концентраций антител, как минимум в 100 раз превышающих их концентрацию при естественном иммунитете. В клинических исследованиях сероконверсия развивалась практически у всех пациентов.

Хотя известно множество типов ВПЧ, только несколько из них вызывают большинство аногенитальных заболеваний. Низкоонкогенные типы 6 и 11 ответственны за > 90% всех аногенитальных кондилом у женщин и мужчин и постоянно определяются как этиологический фактор возвратного респираторного папилломатоза (RRP). ВПЧ 16-го и 18-го типов ответственны за, как минимум, 70% случаев рака шейки матки. ВПЧ-инфекция также тесно связана с раком вульвы и влагалища, а также раком ануса. ВПЧ 18-го типа часто ассоциируется с аденокарциномой шейки матки, которая  плохо выявляется с помощью мазков из шейки матки.

Некоторые мужчины могут иметь анальные или генитальные поражения связанные с ВПЧ 16-го или 18-го типов, также у мужчин-потомков может развиваться RRP с ювенильным началом вследствие передачи материнского ВПЧ типов 6 и 11. Однако большинство мужчин служит «носителями» или «переносчиками» онкогенных ВПЧ. Партнеры-мужчины действительно могут вносить значительный вклад в риск развития рака шейки матки у своих партнеров-женщин. В мире проводятся исследования, расширяющие показания для применения квадривалентной вакцины у мужчин до 26 лет. Такие показания уже зарегистрированы в США.

Данные, полученные за 5 лет после введения вакцины свидетельствуют, что  антительный ответ на квадривалентную вакцину является продолжительным. У реципиентов наблюдался интенсивный иммунный ответ, указывающий на иммунологическую память в течении 5 лет после иммунизации. Женщины из стран Скандинавского региона, включенные в исследования фазы III по оценке эффективности, будут находиться под наблюдением как минимум в течение 10 лет с 2003 года. Это даст представление о долгосрочной безопасности и продолжительности эффективности вакцины за несколько лет до наблюдения за первыми вакцинированными после выпуска вакцины на рынок. Сейчас срок успешного международного наблюдения составляет 7 лет.

Поскольку большинство заболеваний связано с ВПЧ типов 6,11,16 и 18, квадривалентная вакцина, направленная на эти типы ВПЧ, как ожидается, значительно уменьшит ущерб, причиняемый заболеваниями, связанными с ВПЧ.

2. Международные данные по применению вакцинации.

В Европейском Союзе были получены лицензии на две вакцины против вируса папилломы человека (ВПЧ): на квадривалентную вакцину (Гардасил®) - в сентябре 2006 г., и бивалентную вакцину (Церварикс®)  - в сентябре 2007 г.. Обе вакцины показаны для профилактики, их цель предупредить предраковые поражения (CINII +) и раки вследствие персистирующей инфекции ВПЧ 16 и 18 типов у женщин, которые ранее не были инфицированы этими типами ВПЧ.

Квадривалентная вакцина также предупреждает инфицирование ВПЧ 6 и 11 типов, ответственными за 80-90% генитальных бородавок. Это вакцина, состоящая из вирусоподобных частиц (VLP) 6, 11, 16 и 18 типов ВПЧ. VLP получены путем экспрессии вирусных капсидных белков L1 в дрожжевых клетках  Saccharomyces cerevisiae, очищены и  адсорбированы в алюминиевом адъюванте- amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate.

Квадривалентная вакцина Гардасил зарегистрирована в 109 странах мира, в то числе в  Российской Федерации с 2006 года.

Согласно эпидемиологическим данным, ВПЧ - трансмиссия может случиться уже при первом половом контакте. Пик заболеваемости в большинстве популяций наблюдается в пределах 5-10 лет после сексуального дебюта (в возрасте 15-25 лет).  Принимая во внимание этот факт и тот, что вакцина против ВПЧ профилактическая и эффективна, если введена до воздействия вируса, ясно, что лучшая стратегия  - это вакцинация подростков и молодых женщин.

Исследования III фазы (FUTURE I и II), в которых участвовали около 15 000 женщин в возрасте 16-26 лет из Европы, Северной Америки, Азии и Латинской Америки, показали, что квадривалентная вакцина высоко эффективна в профилактике предраковых поражений - цервикальной, вульварной и вагинальной интраэпителиальной неоплазии, а также аденокарциомы in situ, ассоциированных с  ВПЧ 6, 11, 16 и 18, у женщин, наивных по отношению к этим типам при включении в исследование. Также была доказана высокая эффективность против генитальных кондилом, связанных с ВПЧ 6 и 11. Данные этих исследований показали, что женщины, наивные перед вакцинацией по отношению ко всем четырем вакцинным типам (серологически и ДНК негативные), получают от вакцинации полную пользу, т.е. защиту от заболеваний, вызванных всеми четырьмя типами.  

В то же время женщины, которые перед вакцинацией уже инфицированы одним или более вакцинными типами, получают частичную выгоду от вакцинации -  защиту от тех типов, с которыми они еще не встречались. На этом основании международные эксперты, помимо рутинной вакцинации подростков (первичная целевая популяция), рекомендуют массовую вакцинацию женщин до возраста 26 лет (дополнительная популяция), независимо от исходного ВПЧ статуса.

С возрастом риск  получения новой ВПЧ инфекции  снижается, но этот риск остается существенным на протяжении всей сексуально активной жизни женщины.   Второй пик распространенности был зафиксирован у женщин в четвертой и пятой декадах их жизни.

Эпидемиологический анализ демонстрирует, что  возрастная распространенность ВПЧ неодинакова в различных регионах мира. Результаты мета-анализа 78 опубликованных исследований, включавших 157 879 женщин с нормальными цитологическими мазками, согласуются с вышеизложенными данными. В Европе, Африке и Америке, второй пик распространенности вируса папилломы человека наблюдается у женщин 45 лет и старше.

Наряду с этим, женщины среднего возраста продолжают приобретать и клинически развивать доброкачественные ВПЧ-инфекции. Хотя наиболее часто генитальные кондиломы появляются в возрасте 20-24 лет, риск их возникновения  остается существенным и после 30.

Таким образом, женщины старше 25 лет остаются в зоне риска новых ВПЧ инфекций/заболеваний, а значит, они могут получить пользу от профилактической вакцинации. В мире завершены клинические исследования у женщин среднего возраста подтверждающие роль квадривалентной вакцины в предупреждении персистирующей инфекции и заболеваний, ассоциированных с 6/11/16/18 типами ВПЧ в популяции женщин 24-45 лет.

Квадривалентная вакцина продемонстрировала в международных исследованиях

- имеет  98% эффективность при CIN 2/3 и AIS, вызванных ВПЧ 16/18 типов и 100% эффективность при AIS, вызванной ВПЧ 16/18 типов

- имеет высокую эффективность при вызванных ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов наружных генитальных поражениях (остроконечных кондиломах, VIN, VaIN)

-перекрестную защиту против 10 дополнительных типов ВПЧ, вызывающих цервикальный рак и ответственных за  >20% наблюдающихся цервикальных раков.

- демонстрирует сильный иммунный ответ, указывающий на наличие иммунной памяти при стимуляции антигеном через 5 лет

- безопасна в применении

Применение Квадривалентной вакцины  рекомендовано:

- Всемирной Организацией Здравоохранения  с 2006 г.,

- Американской коллегией акушеров-гинекологов,

- Обществом медицины подросткового возраста,

- Экспертным советом по лекарственным средствам Австралии с 2006 г.

Вакцина  зарегистрирована в 117 странах мира.

Вакцинация квадривалентной вакциной включена в национальные календари для девочек следующих стран: Канада, США, Бельгия, Франция, Испания, Лихтенштейн, Греция, Дания, Австралия, Словакия, Израиль.

В Алжире, Кипре, Новой Зеландии, Австрии, Гренландии, Нидерландах прививают и девочек, и мальчиков.

В Аргентине, Бермудах, Чехии, Германии, Швеции и Нидерландах вакцинация осуществляется за счет средств страховых компаний.

В России вакцинация против ВПЧ осуществляется индивидуально на платной основе – для подростков обоих полов и женщин до 26 лет. Вакцинировать можно в лечебных учреждениях, имеющих лицензированный кабинет вакцинопрофилактики.

Организация вакцинопрофилактики у этих групп населения позволит существенно снизить заболеваемость раком шейки матки, раком половых органов, раком ротоглотки, вызванным ВПЧ 6,11, 16 и 18 типов, а также генитальным кондиломатозом.

3. Показания к вакцинации.

Квадривалентная вакцина против ВПЧ 6, 11, 16, 18 типов производится с использованием Saccharomyces cerevisiae. Содержит адъювант - аморфный алюминия гидроксифосфата сульфат (AAHS) – 225 мкг на дозу. Не содержит вирусной ДНК, поэтому не приводит к инфицированию.

Четырехвалентную вакцину следует назначать внутримышечно,  3 отдельных дозы по 0.5 мл по следующей схеме:

Первая доза: в выбранный день

Вторая доза: через 2 месяца после введения первой дозы

Третья доза: через 6 месяцев после введения первой дозы.

В клинических исследованиях была продемонстрированна эфективность у пациентов, получивших вакцинацию по гибким схемам в течении года

-укороченная схема 0-1-4 месяца,

-удлиненная схема – 0-3-9 месяцев

В России официально зарегистрированы показания к вакцинации против ВПЧ 6,11,16,18 типов:

- Детям и подросткам (девочкам и мальчикам): от 9 до 17 лет.

- Женщинам: от 18 до 26 лет.

Для предупреждения вызываемых ВПЧ 16,18,6,11:

- Рака шейки матки, вульвы, влагалища

- Генитальных кондилом

- Предрака вульвы и влагалища, шейки матки (AIS, CIN 2/3, VIN 2/3, VaIN 2/3, CIN1)

Ученые  не располагают данными, что вакцинация обеспечивает защиту против заболеваний, вызванных входящими и не входящими в состав вакцины типами ВПЧ, с которыми женщины ранее сталкивались в процессе жизни. Вакцина не предназначена для лечения активных генитальных кондилом; цервикальных, вульварных и вагинальных раков; CIN, VIN или VaIN. Нет сведений, что вакцина защищает от болезней, вызываемых типами ВПЧ, не содержащимися в вакцине. Не все вульварные и вагинальные раки вызываются ВПЧ, а вакцина защищает только от тех раков, которые вызываются 16 и 18 типами ВПЧ. Вакцинация обеспечивает защиту не всем реципиентам.

Наиболее распространенной нежелательной реакцией является головная боль. Распространенными нежелательными реакциями, наблюдавшимися у реципиентов Гардасила с частотой как минимум 1.0% и большей, чем на плацебо, были лихорадка, тошнота, головокружение, а в месте инъекции - боль, опухание эритема, зуд и гематома. Кроме того, имеются сообщения о наблюдавшихся после вакцинации Гардасилом обмороках, иногда приводящих к падениям и травмам. Поэтому после вакцинации рекомендуется наблюдение в течение 15 минут.

Общие предостережения:

•  Следует продолжать выполнение Пап-тестов или программы цервикального скрининга и после иммунизации вакциной.

•  Следует избегать беременности во время курса вакцинации.

Не имеется причинной связи вакцины с нежелательными явлениями в отношении  плода или  нежелательными исходами беременности. Тем не менее, данные о вакцинации во время беременности ограничены. При наступлении беременности рекомендуется закончить вакцинацию после родов – по удлиненной схеме, завершив курс из 3 доз в течении года.

Четырехвалентная вакцина может применяться у кормящих женщин.

Противопоказана вакцинация в следующих случаях:

•  Непереносимость компонентов препарата,
•  Аллергическая реакция на предыдущую инъекцию этой вакцины,
•  Беременность,
•  Нарушения свёртываемости крови

Влияние на психосоциальные затраты

Снижение количества патологических изменений в мазках и случаев РШМ, вследствие внедрения программы вакцинации, окажет непосредственное влияние на психосоциальный затраты  РШМ и скрининга. За каждым патологическим мазком стоит женщина, чаще всего находящаяся в самом расцвете сил и имеющая экономические и семейные обязательства. Наличие эффективной вакцины против инфекций, вызванных  ВПЧ позволит предотвратить возникновение ассоциированных предраковых  цитологических и гистологических изменений (ASC-US, LSIL, HSIL), а также инвазивного РШМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении следует отметить, что проблема ВПЧ-инфекции еще далека от своего решения, и многие вопросы составляют предмет проводимых в настоящее время исследований. Сложность проблемы проистекает, главным образом, из-за значительной распространенности инфекции, появления новых генотипов ВПЧ и существенных различий в их злокачественной потенции, изменений напряженности противовирусного иммунитета организма пациентки, который, в конечном счете, определяет стабильность излечения или время наступления рецидива. Накопленные знания о механизме вирусного канцерогенеза в развитии дисплазии и рака шейки матки, определяют необходимость дальнейших исследований для разработки наиболее эффективных методов диагностики, эпиопатогенетических схем лечения.

Современные молекулярно-биологические методы диагностики, ПЦР-анализы позволяют не только обнаружить вирусы, но и определить степень онкогенности вируса, количество генотипов, присутствующих одновременно, вирусную нагрузку, форму персистенции вируса. Это является важным для определения тактики ведения пациента и прогнозирования злокачественной трансформации поражений. С внедрением в медицинскую практику обязательного регулярного цитологического обследования по Папаниколау (экспресс-тест), позволяющего выявлять атипичные клетки в эпителии слизистой оболочки шейки матки прежде, чем разовьется рак, удалось резко снизить смертность от рака шейки матки. Молекулярно-биологические методы дополняют цитологическое исследование, повышают эффективность диагностики предраковых состояний и прогноза развития рака.

Перспективы развития проблемы ПВИ

 

Перспективные направления работы в проблеме искоренения ПВИ и рака шейки матки включают в себя:

•  внедрение в практику жидкостной и компьютерной цитологии для повышения эффективности метода;
•  внедрение в практику скрининга ВПЧ тестирования (метод ПЦР);
•  оценка клинической значимости концентраций ВПЧ в тканях;
•  изучение роли молекулярных биомаркеров (белки Е6, Е7, маркер p16ink4a и др.), уровень которых в тканях помог бы предсказать, насколько активным является вирус и оценить перспективы прогрессии и процесса;
•  дальнейшее изучение, улучшение и внедрение в практику профилактических и терапевтических вакцин;
•  разработка и внедрение в практику противовирусных препаратов;

Приложение № 1

Информационное письмо «Новые лабораторные технологии»

Жидкостная онкоцитология представляет альтернативный метод диагностики обычной онкоцитологии, распространенной в настоящее время. Отличие жидкостной цитологии от обычной заключается в том, что взятый материал помещается в жидкую среду, из которой потом на специальной центрифуге образуются цито-препараты. Они состоят из «отмытых клеток», которые сконцентрированы на одном месте и образуют ровный слой. Это делает заключение врача-цитолога значительно более достоверным по сравнению с обычными мазками, когда материал сразу наносится на стекло. Жидкостная цитология признана многими мировыми организациями (FDA, Американское противораковое общество и др.), рекомендована международными консенсусами для эффективного скрининга рака шейки матки. Многочисленные исследования показали, что жидкостная цитология более информативна, чем обычная, а, следовательно, качественно улучшает скрининг рака шейки матки.

Жидкостная цитология, кроме онкоцитологического анализа, дает возможность выполнять молекулярные виды исследования, одним из которых является иммуноцитохимия. Она позволяет выявлять любой интересующий нас белок. На светооптическом уровне невозможно отличить опухолевую дисплазию (которая вызвана вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска и, при отсутствии соответствующего лечения, перейдет в рак) и неопухолевую, которая может быть следствием воспаления. Иммуноцитохимическое исследование онкомаркера pl6ink4a позволяет достоверно дифференцировать два вида дисплазий, тем самым, при назначении соответствующего лечения, предотвратить развитие рака шейки матки.

Таким образом, совместное использование жидкостной цитологии и иммуноцитохимии онкомаркера pl6ink4a в скрининге рака шейки матки позволит выявлять рак на ранних этапах развития и на стадиях ему предшествующих, когда излечимость данного заболевания близка к 100%.

Цитологическое исследование по методу Папаниколау (PAP-тест) является международным стандартом, признано наиболее информативным и используется в скрининговых программах диагностики рака шейки матки во всех странах Европы, СНГ и США. Окрашивание мазка по Папаниколау повышает качество цитологической диагностики: лучше дифференцируются зрелые и незрелые клетки, а также клетки, пораженные вирусами папилломы человека.

Область применения: исследование мазков шейки матки (гинекология).

Приложение № 2

Список литературы

1.  Берек Дж., Адаши И., Хиллард П. Гинекология по Эмилю Новаку, пер. с англ. - Ь., Практика, 2002. - 896 с.
2.  Бебнева Т.Н., Прилепская В.Н. Профилактика рака шейки матки: скрининг (обзор литературы) // Научно-практический медицинский журнал «Доктор.Ру». - № 6 (50) – 2009. С. 11-17.
3.  Грицко Г.М. Вирусные и клеточные гены, вовлеченные в HPV-ассоциированный канцерогенез шейки матки: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1999.- 21с.
4.  Дубенский В.В., Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Слюзарь Н.Н. Эффективность иммунокоррекции с помощью цитокинов в терапии папилломавирусной инфекции. ЖМЭИ. 2001, 5:54-8.
5.  Киселев В.И., Дмитриев Г.А., Кубанова А.А. Взаимосвязь вирусных инфекций, передаваемых половым путем, и онкологические заболевания урогенитального тракта. Вестн. Дерматол. и венерол. 2000, 6:20-22.8.
6.  Киселев Ф.Л. Вирусассоциированные опухоли человека: рак шейки матки и вирусы папиллом. Биохимия.2000, 65:1:79-91.9.
7.  Киселев Ф.Л., Мазуренко Н.Н., Волгарева Г.М., Киселев Н.П. Взаимодействие вирусных и клеточных генов при раке шейки матки. Мол. Биология. 2004, 38(2):224-32.
8.  Клиническая онкогинекология: руководство для врачей. Под ред. В.П.Козаченко. М.: ОАО "Издательство "Медицина". 2005. - 376 с.
9.  Патология шейки матки и генитальные инфекции. Под ред. В.Н.Прилепской. М.: «МЕДпресс-информ». 2008. – 384 с.
10.  Петров Р.В., Хаитов М.Р., Андреев С.М. и др. Иммуногенные свойства рекомбинантных и синтетических пептидов ВПЧ. Докл. Биох. Биофиз., 2008, 421:185-90.
11.  Полонская Н.Ю., Юрасова И.В., Егорова О.В. Профилактические осмотры и цитологический скрининг шейки матки. М.: «Академия». 2008. – 80 с.
12.  Профилактика рака шейки матки: руководство для врачей. М.: "Медпресс-информ", 2007.- 56 с.
13.  Роговская С.И. Папилломавирусная инфекция у женщин и патология шейки матки. М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2008. – 192 с.
14.  Семенов Д.М., Занько С.Н., Дмитраченко Т.И. Папилломавирусная инфекция. Санкт-Петербург: Диалект, 2008. – 84 с.
15.  Сильвия К. Роузвиа Гинекология. Пер. с англ. под ред. акад. Э.К.Айламазян. М.:"Медпресс-информ", 2004.- 520 с.
16.  Agoff S.N., Lin P., Morihara J. et al. pl6INK4a expression correlates with degree of cervical neoplasia: a comparison with Ki-67 expression and detection of high-risk HPV types. Mod.Pathol. 2003,16:665-73.
17.  Bernard H.U. Gene expression of genital human Papillomaviruses and considerations on potential antiviral approaches. Antivir.Ther. 2002, 7:219-37.
18.  Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J.Clin.Pathol. 2002, 55 (4):244-65.
19.  Bozzetti M., Nonnenmacher В., Mielzinska I. et al. Comparison between Hybrid Capture II and polymerase chain reaction results among women at low-risk for cervical cancer. Ann.Epidemiol. 2000, 10:466.
20.  Brown D. HPV type 6/11/16/18 vaccine: first analysis of cross-protection against persistent infection, cervical intraepithelial neoplasia (CIN), and adenocarcinoma in situ (AIS) caused by oncogenic HPV types in addition to 16/18. The 47th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2007, Sep. 17-20.
21.  Castellsagu'e X., Diaz M., de Sanjose S. et al. Worldwide human papillomavirus etiology of cervical adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention. J.Natl.Cancer.Inst. 2006, 98:303-15.
22.  Castellsagu e X., Mu~noz N. Chapter 3: Cofactors in human papillomavirus carcinogene-sis-role of parity, oral contraceptives, and tobacco smoking. J.Natl.Cancer Inst. Monogr. 2003, 20-8.
23.  Castle P.E., Giuliano A.R. Chapter 4: Genital tract infections, cervical inflammation, and antioxidant nutrients-assessing their roles as human papillomavirus cofactors. J.N Natl. Cancer Inst. Monogr. 2003, 31:29-34.
24.  Castle P.E., Lorincz A.T., Scott D.R. et al. Hybrid Capture 3 (HC3) measurements of HPV16, HPV18 and oncogenic cocktail HPV. In: Proceedings of the 21st International Papillomavirus Conference. 2004b. p. 386.
25.  Castle P.E., Schiffman M., Burk R.D. et al. Restricted cross-reactivity of Hybrid Capture 2 with nononcogenic human papillomavirus types. Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 2002, 11:1394-9.
26.  Castle P.E., Wheeler СМ., Solomon D. et al. Interlaboratory reliability of Hybrid Capture 2. AmJ.Clin.Pathol. 2004a, 22:238-45.
27.  Clifford G.M., Smith J.S., Plummer M. et al. Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a metaanalysis. Br.J.Cancer. 2003; 88:63-73.
28.  Cricca M., Morselli-Labate A.M., Venturoli S. et al.Viral DNA load, physical status and E2/E6 ratio as markers to grade HPV16 positive women for high-grade cervical lesions. Gynecologic Oncology, 2007, 106, 549-557.
29.  Cubie H.A., Seagar A.L., McGoogan E. et al. Rapid real-time PCR to distinguish between human papillomavirus types 16 and 18. J.Clin. Pathol. Mol. Pathol. 2001; 54:24-9.
30.  Cuschieri K.S., Whitley M.J., Cubie H.A. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence-implications for cervical disease progression and monitoring. J.Med.Virol. 2004, 73:65-70.
31.  Dalai S., Gao Q., Androphy EJ. et al. Mutational analysis of human papillomavirus type 16E6 demonstrates that p53 degradation is necessary for immortalization of mammary epithelial cells. J.Virol. 1996, 70(2):683-8.
32.  De Villiers E.M., Fauquet С, Broker T.R. et al. Classification of papillomaviruses. Virol-ogy. 2004, 324:17-27.
33.  Dillner J. The serological response to papillomaviruses. Semin.Cancer Biol. 1999, 9:423-30.
34.  Doorbar J. The papillomavirus life cycle. J.Clin.Virol. 2005, 32(Suppl. 1):S7-S15.
35.  Ferenczy A., Franco E. Persistent human papillomavirus infection and cervical neoplasia. Lancet Oncol. 2002, 3(1):11-6.
36.  Gambhira R., Gravitt P.E., Bossis I. et al. Vaccination of healthy volunteers with human papillomavirus type 16 L2E7E6 fusion protein induces serum antibody that neutralizes across papillomavirus species. Cancer Res. 2006,66(23):11120-4.
37.  Gambhira R., Jagu S., Karanam B. et al. Protection of Rabbits against Challenge with Rabbit Papillomaviruses by Immunization with the N Terminus of Human Papillomavirus Type 16 Minor Capsid Antigen L2. J.Virol. 2007, 81 (21): 11585-92.
38.  Gao Q., Singh L., Kumar A. et al. Human papillomavirus type 16 E6-induced degradation of E6TP1 correlates with its ability to immortalize human mammary epithelial cells. J.Virol. 2001, 75(9):4459-66.
39.  Garcia-Closas R., Castellsagu'e X., Bosch X. et al. The role of diet and nutrition in cervical carcinogenesis: a review of recent evidence. Int.J.Cancer. 2005; 117:629-37.
40.  Guo M., Hu L., Baliga M. et al. The predictive value of pl6INK4a and Hybrid Capture 2 human papillomavirus testing for high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am.J. Clin.Pathol. 2004, 122:894-901.
41.  Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu.Rev.Immunol. 2000, 18:927-74.
42.  Hariri J., Oster A. The negative predictive value of pl6INK4a to assess the outcome of cervical intraepithelial neoplasia 1 in the uterine cervix. Int.J.Gynecol. Pathol. 2007, 26:223-8.
43.  Harper D.M., Longacre M.R., Noll W.W. et al. Factors affecting the detection rate of human papillomavirus. Ann Fam.Med. 2003; 1:221-7.
44.  Hart K.W., Williams O.M., Thelwell N. et al. Novel method for detection, typing, and quantification of human papillomavirus in clinical samples. J.Clin.Microbiol. 2001; 39:3204-12.
45.  Hildesheim A., Hadjimichael O., Schwartz P.E. et al. Risk factors for rapid-onset cervical cancer. Amer. J.Obstet Gynecol. 1999, 180:571-7.
46.  Ho G.Y., Bierman R., Beardsley L. et al. Natural history of cervicov-aginal papillomavirus infection in young women. N Engl.J.Med. 1998, 338(7):423-8.
47.  Но G.Y., Studentsov Y.Y., Bierman R. et al. Natural history of human papillomavirus type 16 virus-like particle antibodies in young women. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004, 13(l):110-6.
48.  Josefsson A.M., Magnusson P.K., Ylitalo N. et al. Viral load of human papilloma virus 16 as a determinant for development of cervical carcinoma in situ: a nested case-control study. Lancet. 2000, 355:2189-93.
49.  Khan M.J., Castle P.E., Lorincz A.T. et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice. J.Natl.Cancer Inst. 2005, 97:1072-9.
50.  Klaes R., Friedrich Т., Spitkovsky D. et al. Overexpression of pl6NK4a as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int.J.Cancer. 2001, 92:276-84.
51.  Kreimer A.R., Clifford G.M., Boyle P. et al. Human papillomavirus types in head and neck SCCs worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 2005, 14:467-75.
52.  Lamarcq L., Deeds J., Ginzinger D. et al. Measurements of human papillomavirus transcripts by real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction in samples collected for cervical cancer screening. J.Mol.Diagn. 2002, 4(2):97-102.
53.  Leder C, Kleinschmidt J.A., Wiethe C. et al. Enhancement of capsid gene expression: preparing the human papillomavirus type 16 major structural gene LI for DNA vaccination purposes. J.Virol. 2001, 75(19):9201-9.
54.  Lie A.K., Risberg В., Delabie J. et al .DNA versus RNA based methods for HPV testing in screening evaluation of Hybrid Capture II and pretect HPV proofer in Norway 2004. In: Proceedings of the 21st International Papillomavirus Conference. 2004, p. 55.
55.  Lippman A., Melnychuk R., Shimmin С et al. Human papillomavirus, vaccines and women's health: questions and cautions. CMAJ. 2007, 177:484-7.
56.  Longworth M.S., Laimins L.A. Pathogenesis of human Papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2004, 68:362-72.
57.  Mao C, Balasubramanian A., Yu M. et al. Evaluation of a new

pl6INK4a ELISA test and a high-risk HPV DNA test for cervical cancer screening: Results from proof-of-concept study. IntJ.Cancer. 2007, 120:2435-8.

1.  Mayrand M.H., Coutl'ee F., Hankins С et al. Detection of Human Papillomavirus type 16 DNA in consecutive genital samples does not always represent persistent infection as determined by molecular variant analysis. J.Clin.Microbiol. 2000; 38:3388-93.
2.  Munger K., Baldwin A., Edwards K.M. et al. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J.Virol. 2004, 78:11451-60.
3.  Munger K., Basile J.R., Duensing S., Eichten A. et al. Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein. Oncogene. 2001, 20(54):7888-98.
4.  Munoz N., Bosch F.X., de Sanjose S. et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl.J.Med. 2003, 348(6)518-27.
5.  National Cancer Institute. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003. Bethesda, MD: National Cancer Institute. 2004.
6.  Park T.C., Kim C.J., Koh Y.M. et al. Human papillomavirus genotyping by the DNA chip in the cervical neoplasia DNA. Cell Biol. 2004, 23:119-25.
7.  Parkin D.M., Bray F., Ferlay J. et al. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J.Clin. 2005, 55(2):74-108.
8.  Pastrana D.V., Gambhira R., Buck C.B. et al. Cross-neutralization of cutaneous and mucosal Papillomavirus types with antisera to the amino terminus of L2. Virology. 2005; 337(2):365-72.
9.  Peng S., Ji H., Trimble С et al. Development of a DNA vaccine targeting human papillomavirus type 16 oncoprotein E6. J.Virol. 2004, 78(16):8468-76.
10.  Peng S., Tomson T.T., Trimble С et al. A combination of DNA vaccines targeting human papillomavirus type 16 E6 and E7 generates potent antitumor effects. Gene Ther. 2006,13(3):257-65.
11.  Pfister H. Chapter 8: Human papillomavirus and skin cancer. J.Natl Cancer Inst.Monogr.   2003; 31:52-6.
12.  Poljak M., Marin I.J., Seme K. et al. Hybrid Capture II HPV test detects at least 15 human papillomavirus genotypes not included in its current high-risk probe cocktail. J. Clin.Virol. 2002; 25(Suppl. 3):89-97.
13.  Roden R.B., Yutzy W.Ht, Fallon R. et al. Minor capsid protein of human genital Papillomaviruses contains subdominant, cross-neutralizing epitopes. Virology. 2000, 270(2): 254-7.
14.  Rousseau M.C., Pereira J.S., Prado J.C.M. et al. Cervical coinfection with human papillomavirus types as a predictor of acquisition and persistence of HPV infection. J. Infect. Dis. 2001, 184:1508-17.

72.Sataiya M., Ahmed F., Krishnan S. et al. Cervical cancer incidence in a prevaccine era in the United States., 1998-2002. Obstet Gynecol. 2007, 109:360-70.

Sato S., Maruta J., Konno R et al. In situ detection of HPV in a cervical smear with in situ hybridization. Acta. Cytol. 1998, 42:1483-5.

1.  Schiffman M., Castle P.E. Human papillomavirus: epidemiology and public health. Arch Pathol Lab.Med. Aug 2003, 127(8):930-4.
2.  Schlecht N.F., Trevisan A., Duarte-Franco E. et al. Viral load as a predictor of the risk of cervical intraepithelial neoplasia. Int.J.Cancer. 2003, 103:519-24.
3.  Sherman M.E., Schiffman M.H., Lorincz A.T. et al. Cervical specimens collected in liquid buffer are suitable for both cytologic screening and ancillary human papillomavirus testing. Cancer. 1997, 81:89-97.
4.  Smith J.S., Bosetti C, Munoz N. et al. Chlamydia trachomatis and invasive cervical cancer: a pooled analysis of the IARC multicentric case-control study. Int.J.Cancer. 2004, 111:431-9.
5.  Smith J.S., Green J., Berrington de Gonzalez A. et al. Cervical cancer and the use of hormonal contraceptives: a systematic review. Lancet. 2003, 361:1159-67.
6.  Smith J.S., Herrero R., Bosetti С et al. Herpes simplex virus-2 as a human papillomavirus cofactor in the etiology of invasive cervical cancer. J.Natl.Cancer Inst. 2002, 94: 1604-13.
7.  Snijders P.J., Steenbergen R.D., Heideman D.A. et al. HPV-mediated cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications. J.Pathol. 2006, 208(2):152-64.
8.  Snijders P.J., van den Brule A.J., Meijer C.J. The clinical relevance of human papillomavirus testing: relationship between analytical and clinical sensitivity. J.Pathol. 2003, 201: 1-6.
9.  Stanley M., Lowy D.R., Frazer I. Chapter 12: prophylactic HPV vaccines: underlying mechanisms. Vaccine. 2006, 24(Suppl 3):S106-13.
10.  Strauss S., Desselberger U., Gray J.J. Detection of genital and cutaneous human papillomavirus types: differences in the sensitivity of generic PCRs, and consequences for clinical virological diagnosis. Br.J.Biomed.Sci. 2000, 57:221-5.
11.  Syrjanen S., Shabalova I., Petrovichev N. et al. Acquisition of High-Risk Human Papillomavirus Infections and Pap Smear Abnormalities among Women in the New Independent States of the Former Soviet Union. J.Clin.Microbiol. 2004 February, 42(2): 505-511.
12.  Thomas M., Pirn D., Banks L. The role of the E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV. Oncogene. 1999, 18:7690-700.
13.  Trunk M.J., Dallenbach-Hellweg G., Ridder R. et al. Morphologic characteristics of pl6INK4a positive cells in cervical cytology. Acta Cytol. 2004; 48:771-82.
14.  Tucker R.A., Unger E.R., Holloway Б.Р. et al. Real-time PCR-based fluorescent assay for quantitation of human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18. Mol.Diagn. 2001, 6: 39-47.
15.  Van der Graaf Y., Molijn A.C., Doornewaard H. et al. Human papillomavirus and the long-term risk for cervical neoplasia. Am.J.Epidemiol. 2002, 156(2):158-64.
16.  Varnai A.D., Bollmann M., Bankfalvi et al. Predictive testing of early cervical precancer by detecting human papillomavirus E6/E7 mRNA in cervical cytologies up to high-grade squamous intraepithelial lesions: Diagnostic and prognostic implications. Oncology reports, 2008, 19: 457-465.
17.  Von Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur.J.Cancer. 2002, 38:2229-42.
18.  Walboomers J.M., Jacobs M.V., Manos M.M. et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J.Pathol. 1999, 189(l):12-9.
19.  Wallin K.L., Wiklund F., Angstrom T. et al. Type-specific persistence of human papillomavirus DNA before the development of invasive cervical cancer. N. Engl.J.Med.1999, 341:1633-8.
20.  Wang S.S., Trunk M., Schiffman M. et al. Validation of pl6INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epdemiol Biomarkers Prev. 2004, 8:1355-60.
21.  Wang-Johanning F., Lu D.W., Wang Y. et al. Quantitation of human papillomavirus 16 E6 and E7 DNA and RNA in residual material from ThinPrep Papanicolaou tests using realtime polymerase chain reaction analysis. Cancer. 2002, 94(8):2199-210.
22.  Wentzensen N., Bergeron C, Cas F. et al. Evaluation of a Nuclear Score for pl6INK4a-Stained Cervical Squamous Cells in Liquid-Based Cytology Samples. Cancer Cytopathol. 2005,105:461-7.
23.  Wentzensen N., Hampl M., Herkert M. et al. Identification of High-Grade Cervical Dysplasia by the Detection of pl6INK4a in Cell Lysates Obtained from Cervical Samples. Cancer. 2006,107:2307-13.
24.  Wentzensen N., Bergeron C, Cas F. et  al. Triage of Women With ASC-US and LSIL Cytology. Use of Qualitative Assessment of pl6INK4a Positive Cells to Identify Patients with High-Grade Cervical Intraepithelial Neoplasia. Cancer Cytopathol. 2007,111:58-66.
25.  Winer R.L., Kiviat N.B., Hughes J.P. et al. Development and duration of human papillomavirus lesions after initial infection. J.Infect. Dis. 2005, 191:731-8.
26.  Zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat.Rev.Cancer. 2002, 2(5):342-50.

Аннотация

Учебное издание «Папилломавирусная инфекция» посвящено вопросам этиологии, патогенеза, клиники и профилактики папилломавирусной инфекции.

Описаны различные клинические и морфологические формы папилломавирусной инфекции, представлена их современная классификация и оценены возможности прогрессии и развития. Основной акцент сделан на патогенетические механизмы возникновения рака шейки матки, где этиотропная роль вирусов не вызывает сомнений.

Одна из глав пособия представляет обзор литературных материалов по одной из актуальных проблем здравоохранения – профилактике рака шейки матки, обсуждаются проблемы цитологического скрининга в России, достоинства и недостатки цитологического исследования, новые скрининговые тесты в профилактике рака шейки матки, приводятся перспективы молекулярных биомаркеров.

Изложены возможности вакцинопрофилактики папилломавирусной инфекции.

Пособие предназначено для врачей клинической лабораторной диагностики, акушеров-гинекологов, дерматовенерологов, урологов, врачей общей практики и других специалистов. Изложенные материалы могут быть полезны клиническим ординаторам, аспирантам, студентам старших курсов медицинских вузов.

Рецензия на руководство К.Н. Конторщиковой, Л.Д. Андосовой

«Папилломавирусная инфекция»

Пособие К.Н. Конторщиковой, Л.Д. Андосовой «Папилломавирусная инфекция» продолжает серию учебных материалов, подготовленных сотрудниками кафедры клинической лабораторной диагностики факультета повышения квалификации врачей Нижегородской государственной медицинской академии Росздрава на основе обширного опыта преподавания разделов специальной инфектологии врачам клинико-диагностических лабораторий. Пособие нацелено на то, чтобы еще раз привлечь внимание врачей к такой актуальной проблеме, как папилломавирусная инфекция.

Папилломавирусная инфекция  широко распространена, контагиозна, способна вызывать злокачественную патологию, что делает диагностику и лечение заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, зоной интересов многих медицинских дисциплин.

В основном разделе авторы в доступной форме, на современном уровне рассматривают вопросы этиологии, патогенеза, клиники и профилактики папилломавирусной инфекции.

Одна из глав пособия представляет собой обзор литературных материалов по одной из актуальных проблем здравоохранения – профилактике рака шейки матки, обсуждаются проблемы цитологического скрининга в России, достоинства и недостатки цитологического исследования, новые скрининговые тесты в профилактике рака шейки матки, приводятся перспективы молекулярных биомаркеров.

Последняя глава пособия содержит сведения, обращающие наше внимание на проблему вакцинопрофилактики  папилломавирусной инфекции.

В пособии представлены 5 таблиц, 2 схемы, 10 рисунков, а также справочные материалы. Схемы и таблицы приведены с учетом терминологии, используемой в нашей стране и за рубежом.   

Главное достоинство рецензируемого пособия в том, что многочисленные факты изложены авторами последовательно, систематизировано, с использованием данных литературы и собственных наблюдений в доступной форме и наглядно.

Достаточный научный уровень и несомненная практическая значимость изложенного материала позволяют утверждать, что пособие будет востребовано врачами клинической лабораторной диагностики, широким кругом клиницистов, а также курсантами системы последипломного образования и студентами медицинских институтов.

1. устатку для аппетита при болях в желудке язве и т
2. Тема 1. Становлення філософської думки у Стародавньому світі План Передумови виникнення філософії.
3. Реферат- Поясничная область и забрюшинное пространство
4. Тема 1 лекція 1 Цивільний захист ~ основа безпеки у надзвичайних ситуаціях НС з дисципліни
5. тематического программирования посвященная теории и методам решения экстремальных задач характеризующих
6. Уран элемент
7. Теорія фінасів ЕКЗАМЕНАЦІЙНИЙ БІЛЕТ 1 Етапи становлення та розвитку фінансової науки
8. тема экологического права
9. Протоколы сионских мудрецов
10. реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук КІРОВОГ
11. й степени метод Феррари
12. .5 million in Northern Irelnd who re certinly not English However the people from Scotlnd Wles Northern Irelnd nd Englnd re ll British.
13. Урок литературного чтения по произведению Антуана де Сент Экзюпери «Маленький принц»
14.  Кручение бруса с круглым поперечнымсечением Здесь под кручением понимается такой вид нагружения при кот
15. либо государства то внешняя политика отношения между народами и государствами на международной арене
16. нибудь недорогую из них
17. История на 2013-2014 учебный год Восточные славяне в догосударственный период
18. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ КОНТРОЛЬНЫХ РАБОТ Выполнение контрольной работы является обязате
19. Управление персоналом Исходное понятие и главная цель управления персоналом
20. Пояснительная записка Преподаватель- Евстафьев Егор Pr

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе