Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
План: (не печатать)
1 сторінка
1. Вступ: «Чому збуджувачі ботулізму і стовбняку краще знають про SNARE ніж люди ?))»
- К.Гольджи, Д.Палад…їх роль у дослідженнях везикулярного транспорту.
- Великий вклад у розуміння роботи системи внутрішньоклітинної логістики було зроблено лауреатами 2013 року…
2. Чому це так важливо ?
- асиметрія біомембран, асиметрія компартментів, потреба у наявності механізму сортування і контролю специфічності доставки продуктів трансляції у компартменти.
- глобальна логістична система: центральна догма + апарат Гольджі.
2 сторінка
3. Ренді Шекман:
- Дослідження мутантних дрожів і комплекс генів
- білки антеро- и ретроградного транспорту
3-4 сторінка
4. Джеймс Ротман
- опис cell-free системи та переший дослід – ферментні групи АГ у різних фракціях, будова АГ.
- модель транспорту в межах АГ.
- VSV-G та встановлення структури білку, що направляється до плазмалеми, переривання синтезу на різних етапах та дослідження структури білку.
- Везикулярний транспорт – енергозалежний. Іншим блокатором є NEM, відкриття NSF, характеристика NSF.
- будова SNARE-комплексу (= #tag),забезпечення специфічного а не випадкового злиття мембран, молекулярний механізм процесу.
5 сторінка
5. Томас Зюдоф :
- синаптогамін-1 і комплексини як регулятори синхронності Са-залежного викиду нейротрансмітерів у синаптичну щілину.
- Молекулярні механізми керованого екзоцитозу.
6. Дякую за увагу…матеріали
1Доброго дня, шановні. Від імені цитологічного гуртка я сьогодні презентую вам доповідь про Нобелевських Лауреатів 2013 року: Джеймса Ротмана, Ренді Шекмана та Томаса Зюдофа, які своїми відкриттями внесли значний вклад у розуміння везикулярного транспорту та внутрішньоклітинного транспорту.
Чому ця тема так важлива ?
Саме дослідження системи внутрішньоклітинної логістики дає не тільки фундаментальні знання – змогу пояснити точність внутрішньоклітинного адресування білків, асиметрії біомембран. Будь яке знання дає силу, можливість оперувати, використовувати природні механізми на користь людини.
Впродовж ХХ сторіччя людство накопичувало все більше інформації про те, як функціонує клітина – і чим більше тих знань становилось, тим більше виникало питань. Центральна догма молекулярної біології пояснила як з матриці ДНК утворюється інформаційна РНК, що потрапивши крізь ядерні пори в цитоплазму, утворює комплекс з рибосомами та синтезує білок.
Але як білки потрапляють у місця саме свого призначення ?
Як у лизосому потрапляють саме її, лизосомні гідролітичні ферменти, а не гликозил-трансферази ЕПР і навпаки ? Клітина являє собою систему компартментів, що відрізняються за складом середовища – по різні сторони мембран різні концентрації йонів та органічних речовин. На слайді представлені основні компартменти клітини, кожен із котрих має свою специфічну функцію і забезпечується відповідно за функціоналом. На схемі поряд ми бачимо схему переходу речовин клітини між компартментами. Зеленим тут позначений везикулярний транспорт, тобто транспорт речовин що знаходяться всередині везикул або вбудовані гідрофобними взаємодіями всередину мембран цих ліпідних двошарових бульбашок.
Як видно, везикулярний транспорт не тільки займає більшу частину схеми, а й є ключовим посередником між клітиною та зовнішнім середовищем.
Головну роль у цьому процесі відіграють Апарат Гольджі та хімічні властивості речовин, що транспортуються.
Апарат, або Комплекс Гольджі було відкрито у 1898 році італійським вченим Каміло Гольджі, на слайді зліва – рисунок з його Нобелевської роботи 1906 року. Перехопив естафету Джордж Палад, який у 1960і роки довів, що секреторні, експортні клітинні білки проходять крізь Апарат Гольджі на своєму шляху до плазмалеми.
2Тепер до першого дослідника. На слайді Ренді Шекман, який вивчав мутантних пекарських дрожів, везикулярна система яких була термочутливою, і колапсувала при підвищенні температури. Перший відкритий ген, що мав відношення до колапсу, був названий sec 1, але з часом Шекманом було знайдено аж 23 гена, відповідальних за нормальну роботу системи. Головними генами, продукти яких будут фігурувати далі у докладі є sec 17 та sec 18, які продукують N-етилмалемід чутливий фактор та розчинний білок, що з ним зв’язувається.
Також Шекман вивчав білки облямівки везикул, що транспортуються. Два з трьох типів цих білків: СOP1 та COP2 облямовують везикули під час ретроградного транспорту між Комплексом Гольджі та ЕПР та антероградного транспорту відповідно. Також COP2 облямовує пухирці, що переміщуються між діктіосомами Апарату Гольджі. У транспорті, що пов’язаний з плазма лемою, бере участь інший білок облямівки – клатрин.
3-4 Щодо роботи Джеймса Ротмана, який досліджував структуру і принцип роботи Апарату Гольджі. Об’єктами дослідження були клітини печінки кролика, клітини яєчників китайських хом’яків та клітини їхнього мозку. На їх основі була створена cell-free, тобто безклітинна система. Після руйнування міжклітинних контактів, клітини диференціально центріфугувалися у градієнті сахарози. Потім, фракції з різною щільністю розподіляли по пробірках. Апарат Гольджі попадав у три пробірки, разом з іншими компонентами вакуолярної системи клітини. Також у cell-free системі були присутні мРНК, тРНК, амінокислоти, АТФ, цитозоль з його білками і ферментами та ЕПР. Через різну масу, було зроблено припущення, що Комплекс Гольджі складається з щонайменше трьох фракцій з різними властивостями. Це було підтверджено біохімічними дослідженнями, які виявили різні групи ферментів у цих фракціях. На основі ціх даних була запропонована модель функціонування та будова диктіосоми – структурної одиниці апарату Гольджі, яка складається мінімум з трьох відділів: цис-АГ, що орієнтований в бік ядра та ЕПР, транс-АГ, що «дивиться» в бік плазмалеми та мід-АГ, між ними. У ролинних клітинах спостерігається до 20 цистерн Апарату Гольджі, що може бути пов’язано с більшою біохімічною спеціалізацію порівняно з клітинами ссавців, АГ яких складається з 3-4 цистерн.
На цьому слайді ми бачимо хімічні модифікації , що стосуються олігосахаридів, приєднаних до білків що тільки-но потрапили в АГ з ЕПР. За замовчуванням, дефолтною модифікацією цих білків є олігосахариди з 14 сахарів: два N-ацетилглюкозміну, дев’ять маноз, та три глюкози додаються до аспарагінових залишків білку по сигналу Asn-X-Ser або Asn-X-Tre, де Х – будь-яка амінокислота окрім проліну. Цей олігосахариди і модифікується під час проходження по Апарату Гольджі. В цис-відділі видаляються глюкозні залишки а до лізосомних білків додаються дві фосфатні групи, та видаляється одна маноза. Це робить олигосахарид недосяжним для подальших модифікацій. Для усіх інших експортних білків після видалення 3 глюкоз та 1 манози, в мід-АГ видаляють ще 5 маноз та додають 2 N-ацетилглюкозміни. В транс-АГ до експортних білків додається також галактоза і залишки сіалової кислоти. Потім рецептори в транс-АГ сортирують білки по везикулах, у яких вони і відправляються до місць призначення.
Наступним питанням була постійність структури Комплексу Гольджі у часі. Було запропоновано дві концепції, згідно з першою цис-, мід-, і транс-цистерни є однаковими структурами на різних етапах дозрівання. Вони формуються у перехідній зоні ЕПР-АГ, та розсмоктуються по мірі дозрівання у транс-сітці Апарату Гольджі. Друга концепція запропонувала існування всіх відділів Комплексу Гольджі як постійних та різних за складом структур, що лише обмінюються везикулами з продуктами, які підлягають подальшій обробці. Щоб перевірити це був проведений експеримент. Дві cell-free змішували. Перша мала нормальні діктіосоми , у другій використовували мутантні клітини, що не мали галактоз-трансферазної активності в транс-Апараті Гольджі. Як наслідок, у мутантів експортні білки накопичувались в цьому відділі АГ. Також, мутантов заражували вірусом везикулярного стоматиту (VSV), щоб перепрограмувати клітину на виробництво лише одного експортного білку – VSV-G, адже у сімдесяті-вісімдесяті роки не було ефективних методик «перепрограмування» синтетичних процесів клітин. Вірус VSV скаладається з нуклеїнової кислоти, ферментів реплікації та транскрипції, структурного N-білку, що поєднується за нуклеїновою кислотою, периферичного білку плазмалеми, та інтегрального білку плазмалеми – VSV-G. N-ацетилглюкозмін у мутантних клітинах був мічений радіоактивно, тому можна було детектувати шлях VSV-G. Через деякий час після змішування загальний cell-free екстракт обробляли детергентом та протеазами. Потім уся суміш проходила крізь галактозні рецептори. Якщо б радіоактивність спостерігалася у фракції, що залишилась на рецепторі, це б свідчило про те, що VSV-G з мутантних клітин перемістився до нормальних цистерн АГ і там набув подальших модифікацій. Тобто працює 2 гіпотеза – антероградного транспорту.
Для з’ясування загальної картини необхідно було дослідити процес синтезу білків починаючи з трансляції. Трансляція може відбуватися або на вільних рибосомах цитозолю, або у рибосомах, що зв’язані з ЕПР. У першому випадку синтезуються білки хатнього господарства (house-keeping), білки мітохондрій, пероксисом. VSV-G, що йде по експортному шляху, синтезується на мембрані ЕПР. Після синтезу перших 15-20 амінокислот поліпептиду, які являють собою сигнальну послідовність переміщення в ЕПС, частинка, що розпізнає сигнал (SRP) у цитозолі захоплює комплекс поліпептид-рибосома, та, призупинивши трансляцію (не дає з’єднатися факторам елонгації), з’єднується за SRP-рецептором на поверхні ЕПР, та гідролізуючи ГТФ протягує поліпептид в ЕПР крізь білковий водяний канал (транслокон) та перестає блокувати синтез. Далі весь ростучий білок потрапляє у люмен ЕПР, окрім гідрофобних стоп-послідовностей, які латерально переміщуються з транслокону в ліпідний бішар. Там, по вже згаданому сигналу білок первинно гликозилюється, та проходить фолдинг за участі шаперонів, N- сигнальна послідовність відрізається, та готовий (такий стан називається G1) білок транспортується до Комплексу Гольджі, де зазнавши вторинного гликозиолювання перетворюється на G2 – зрілу стадію білку. Під час дослідження, процес синтезу переривався на кожному з етапів у різних умовах, з’ясовуючи місця усіх зазначених вище структур.
На жаль, часу мало, і я не встигну розповісти про цю частину роботи детальніше.
Ротман також досліджував процеси блокування везикулярного транспорту. Першим виявленим блокатором стала відсутність АТФ – була доведена енергозалежність везикулярного транспорту. Наступним відкритим блокатором став NEM – N-етилмалемід. Разом із ним, було відкрито N-етилмалемід чутливий фактор( NSF) який і кодується геном sec 18. Це цитоплазматична АТФаза що з’єднується з SNAP – розчинний білок (ген sec 17), що зв’язується з NSF. Ці відкриття заклали основу для розуміння молекулярних механізмів везикулярного транспорту. Останнім було відкрито комплекс білків SNARE (SNAP-рецептор).
5Про SNARE і Са-залежні механізми регуляції була робота Томаса Зюдофа.
Саме SNARE і відповідають за специфічність злиття мембран різних компартментів. Окремий SNARE подібний до тегу у соцмережі. Такий маркер є присутній як на везикулі (v- SNARE) та на мембрані-мішені (t- SNARE). Існує більше 35 видів SNARE, кожний із котрих розташовано на «своєму» компартменту клітини. Гомологічні пари SNARE з’єднуються і стягують разом мембрани, об’єднуючи їхній зміст. Одна спіраль синапотбревіну (v- SNARE) роспізнає своій гомологічний комплекс (t- SNARE), що скаладається з синтаксину та 2хSNAP-25. Кожний білок SNARE-комплексу складається з двох доменів: С-домену, що заякорений у ліпідному бішарі та N-домену, який призначений для впізнання своїх гомологів. Після злиття мембран SNARE-комплекс залишається зв’язаним – для його рециклінг і використовуються NSF та SNAP. Сідаючи поверх та гідролізуючи АТФ, вони надають SNARE розкластися на окремі компоненти, v-SNARE потім ретроградно повертається назад.
Але як врегулювати цей процес ? Таку відповідальну справу як виброс експортних продуктів, наприклад, нейромедиаторів, не можна залишати без контролю. Для цього слугує інша група білків – синаптотагміни та комплексини. Розглянемо викидання нейромедиатора у синаптичну щілину. Після впливу на нервову клітину на плазмалемі відкриваються Na-канали, К-канали і Са-канали. Це призводить до деполяризації клітини та підвищенню внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Са зв’язується з синаптотагміном, який сприяє докінгу SNAP-25 та злиттю мембран. Білок комплексин інтегрується між синаптобревіном і синтаксином, стимулюючи взаємодію їх трансмембранних доменів. Це допомагає чітко контролювати злиття мембран, запобігаючи їх спонтанному злиттю, та посилючи Са-залежне злиття. На схемі ми бачимо два варіанти розвитку подій. Після того, як везикула досягла цільової плазматичної мембрани, SNARE-білки зв’язуються та докингують, тобто розміщують везикулу поряд з цільовою мембраною. Комплексин займає своє місце між спіралями комплексу та не дозволяє мембранам зливатися до деполяризації. Після зв’язування Са з синаптотагміном комплексин видаляється, синаптотагмін приєднується до SNAP-25 і (нарешті) зміст пухирців зливається. Це синхронний шлях. За асинхронного шляху комплексин не обов’язково взаємодіє з SNARE і викид вмісту може бути не синхронним, тобто не всі везикули викидають свій зміст після деполяризації. Потім комплекс рециклюється SNAP та NSF.
Саме за виявлення цих механізмів роботи, Джеймс Ротман, Ренді Шекман та Томас Зюдоф і були нагороджені Нобелевською премією з Фізіології і медицини.
Над доповіддю працювали першокурсники з цитологічного гуртка: Єгор Гороховський, Анастасія Галєєва, Денис Неграй та Станіслав Шибанов.
Дякую за увагу, на цьому слайді матеріали. Чи є у вас запитання ?