Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ
ОСВІТИ імені П.Л. ШУПИКА
ДУБІНІНА ВЛАДЛЕНА ГЕННАДІЇВНА
УДК 618.145-006-07
ПРОГНОЗУВАННЯ ТА РАННЯ ДІАГНОСТИКА ПУХЛИННИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ЕНДОМЕТРІЯ
14.01.01 –акушерство та гінекологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Київ–
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України
Науковий консультант доктор медичних наук, академік АМН України, професор Запорожан Валерій Миколайович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри акушерства та гінекології № 1
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, чл.-кор. АМН України, професор Маркін Леонід Борисович, Львівський державний медичний університет
імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри акушерства та гінекології № 2
доктор медичних наук, професор Вовк Іраїда Борисівна, Державна установа „Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України”, керівник відділення планування сімґї та статевого розвитку дітей та підлітків
доктор медичних наук, професор Камінський В'ячеслав Володимирович, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика
МОЗ України, завідувач кафедри акушерства, гінекології та репродуктології
Захист відбудеться “07” грудня 2007 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.02 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112, м. Київ,
вул. Дорогожицька, 9)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112,
м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)
Автореферат дисертації розіслано “06 ” листопада 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
д.мед.н., професор Т.Г.Романенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На сьогоднішній день рак тіла матки (РТМ) є найбільш частою інвазійною злоякісною пухлиною жіночого генітального тракту в розвинутих країнах (Бохман Я.В., 1992; Коханевич Є.В. 1998; Воробйова Л.І., 2005; Запорожан В.М., 2005; Козаченко В.П., 2005; Щепотін І.Б., 2006; Moore M.M., 1998). Найбільш високі показники захворюваності на РТМ на 100 тис. населення зареєстровані в Італії (16,5), США (15,5), Швеції (15,2), Фінляндії (14,2) (Ferley G., 2001). Стандартизований показник захворюваності на РТМ у Великій Британії виріс з 14,3 до 15,3 з 1999 р. по 2002 р. (George L., 2002). З 1998 р. по 2004 р. в Україні спостерігається ріст показника захворюваності РТМ з 14,9 до 25,7 на
тис. населення, в Одеській області має місце аналогічна тенденція (з 23,2 до 29,9 на 100 тис. населення) (Воробйова Л.І., 2005; Запорожан В.М., 2005; Щепотін І.Б., 2006). Незважаючи на численні дослідження, спрямовані на вивчення етіології і патогенезу передракової патології та РТМ у більшості країн світу, число хворих на рак даної локалізації продовжує неухильно зростати (Коханевич Є.В., 1999; Запорожан В.М., 2005; Classbum J.R., 1995; Emons G., 2000). Протягом останніх 10 років значно знизився середній вік пацієнток з уперше виявленим РТМ, дозволивши ряду авторів говорити про феномен “омолодження”цієї патології (Неспрядько С.В., 2000; Венцківський Б.М., 2002; Чайка В.К., 2003; Dahlgren E. et al., 1996). У Росії за 10-річний період (1989-1998) захворюваність у віковій групі до 29 років зросла на 47 %, причому 10 % від загальної кількості захворілих на РТМ становлять пацієнтки віком до 40 років. Значні темпи приросту захворюваності на РТМ спостерігаються у вікових групах 40-49 років (на 12,3 %) і 50-56 років (на 15,6 %) (Чіссов В.І.,2000; Козаченко В.П., 2005). Обтяжливим є факт відсутності достовірного неінвазійного скринінгового методу діагностики пухлинної патології ендометрія, що був би простим у виконанні і рівноцінним за точністю, наприклад, цитологічному дослідженню раку шийки матки (Берштейн Л.М., 2005; Махсон А.Н. и соавт., 2005). Незважаючи на існуючий комплекс заходів з вторинної профілактики раку, дотепер все ще не створена навіть теоретична модель загальної системи ранньої діагностики і профілактики РТМ по причині полігенної природи пухлин ендометрія, що унеможливлює індивідуальне прогнозування виникнення і перебігу захворювання (Адамян Л.В., 1998; Антипова С.В., 2001; Сметник В.П., 2001; Чернуха Г.Е., 2003). Задачі, пов’язані з розробкою нових технологій ранньої діагностики і профілактики раку органів жіночої репродуктивної системи, набувають першорядного значення в усьому світі (Акуленко Л.В., 2005). Подолати дану проблему дозволяє генотипування пухлин шляхом застосування високопродуктивних скринінгових тестів, що здатні одночасно виміряти картину експресії і присутність специфічних мутацій у тисячах індивідуальних генів з урахуванням популяційних особливостей (Баришніков А.Ю., 2005; Берштейн Л.М., 2005; Козаченко В.П., 2005; Хансон К.П., 2005). Зменшити індивідуальний ризик розвитку злоякісної патології можна шляхом виявлення індивідуумів з підвищеним генетичним ризиком розвитку раку, аналізу генів метаболізму канцерогенних речовин і генів репарації ДНК, а також уроджених мутацій у генах-супресорах, онкогенах (Запорожан В.М., 2003; Хансон К.П., 2005). Незважаючи на часткову реалізацію заходів державної програми “Онкологія 2002-2006 рр.”, затверджену Кабінетом Міністрів 29 березня 2002 р. (№ 392), а також формування Концепції загальнодержавної програми боротьби з онкологічними захворюваннями на 2007-2016 рр. (розпорядження Кабінету Міністрів України від 10 липня 2006 р. № 393-р), у доступній літературі дані щодо проведення подібних досліджень у нашій країні відсутні. Отже, дослідження генетичного профілю пацієнток з пухлинною патологією ендометрія на різних етапах її формування з урахуванням стану основних регуляторних систем організму, факту сімейної онкообтяженості і популяційних особливостей генома є актуальним у світлі пошуку індивідуальних критеріїв прогнозування виникнення пухлинного процесу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконане дослідження є фрагментом науково-дослідної роботи Одеського державного медичного університету МОЗ України “Молекулярно-генетичні та екологозалежні механізми розвитку пухлин репродуктивної системи: шляхи удосконалення діагностики, лікування і профілактики”(№ держреєстрації 0102U006588). Дисертант є співвиконавцем цієї роботи.
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є підвищення ефективності індивідуальної профілактики і прогнозування виникнення пухлинних захворювань ендометрія у жінок зі спадковою детермінацією та хворих з верифікованою патологією ендометрія, а також формування теоретичної бази впровадження молекулярно-генетичних методів як фундаменту моделі загальної системи ранньої діагностики і профілактики онкозахворювань.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
Об’єкт дослідження: пухлинні захворювання ендометрія.
Предмет дослідження: стан тканинних регуляторів та рецепторного апарату ендометрія, показники клітинного імунітету, гормональний профіль, стан хромосомного апарату, зміни в основних групах генів та саногенетичний профіль у хворих з різними видами пухлинної трансформації ендометрія.
Методи дослідження: загальноклінічні, функціональні, лабораторні, генеалогічні, інструментальні, морфологічні, імуногістохімічні, цитогенетичні, імунологічні, імуноферментні, молекулярно-біологічні, статистичні, біофізичні.
Наукова новизна отриманих результатів. На підставі проведених комплексних досліджень вперше запропоновані тканинні маркери для прогнозу ймовірності малігнізації пухлинної патології ендометрія.
Вперше на основі порівняльного аналіза показників клітинного імунітету у групах хворих із різними видами пухлинної трансформації ендометрія запропоновано індекс пухлиноспецифічної реактивності (ІПР), як критерій прогнозу розвитку злоякісної трансформації слизової оболонки матки.
Вперше проведено порівняльний аналіз гормонального статусу пацієнток з різними гістологічними формами трансформації ендометрія і корелятивний аналіз їх гормонального та імунного статусу.
Вперше проведено порівняльний аналіз родоводів пацієнток з різними формами трансформації ендометрія і результатів цитогенетичного дослідження лімфоцитів периферичної крові з урахуванням наявності чи відсутності онкообтяженості.
Вперше у хворих з обтяженим онкоанамнезом виявлено 4 нових фрагільних (ламких) сайти (раніше не описаних в літературі), що є відображенням процесу дестабілізації генома.
Вперше проведено секвенування поліморфних внутрішніх простих повторюваних послідовностей ДНК (ISSR) з метою визначення порушень їх повторів як найбільш ефективного маркера ранньої діагностики пухлин.
Вперше на підставі аналізу генів детоксикації, генів стероїдогенезу, генів репарації, онкогенів, генів –супресорів пухлинного росту, генів стероїдних рецепторів, гену інтерлейкіну-6 у хворих на РТМ встановлено їх популяційний поліморфізм і різноманітність структурних та функціональних порушень.
Вперше запропоновано концепцію патогенетичного підходу до лікування пацієнток з різними видами пухлинної трансформації ендометрія на підставі оцінки їх індивідуальних санотипів.
Вперше обґрунтовано необхідність розробки та впровадження в Україні повногеномної ДНК-чипової діагностики пухлин з урахуванням популяційного поліморфізму з метою предиктивного тестування для поліпшення результатів профілактики і ранньої діагностики пухлинної патології ендометрія.
Науковий пріоритет за визначеними напрямками закріплено у 6 патентах на винахід.
Практичне значення отриманих результатів. Запропонована і впроваджена у практику індивідуальна, ефективна у прогностичному плані методика оцінки імунного статусу пацієнтки шляхом обчислення індексу пухлиноспецифічної реактивності. Розроблені і впроваджені у практику методи прогнозування виникнення пухлинної патології ендометрія і результатів її лікування на підставі аналізу імуногістохімічних характеристик тканини. Запропоновано і впроваджено у практику методику виявлення груп високого ризику розвитку спадкового і спорадичного раку ендометрія на підставі проведеного цитогенетичного аналізу фрагільних сайтів хромосом лімфоцитів периферичної крові хворих на пухлинні захворювання ендометрія з урахуванням наявності або відсутності онкологічної обтяженості. Вперше запропоновано методику визначення нестабільності мікросателітних повторів у геномі в ролі маркерів канцерогенезу. Вперше запропоновано методику пошуку нових ділянок ДНК, відповідальних за розвиток пухлинної патології ендометрія, за допомогою секвенування поліморфних внутрішніх простих повторюваних послідовностей (ISSR), порушення повторів яких є найбільш ефективним маркером ранньої діагностики пухлин. Вперше у практиці клінічної діагностики в Україні створено параметри повногеномного ДНК-мікрочипа, який може використовуватися для предиктивного моніторингу пухлинних захворювань ендометрія, що у подальшому повинно враховуватися при удосконаленні загальноприйнятих скринінгових заходів.
Теоретичні положення і практичні рекомендації дисертаційної роботи використовуються на лекціях для студентів, лікарів-інтернів, лікарів акушерів-гінекологів, курсантів. Результати досліджень впроваджені в роботу гінекологічних та ендохірургічних відділень лікарень м. Одеси: МКЛ № 2, Університетської клініки ОДМУ, Одеського обласного онкологічного диспансеру, Одеської обласної клінічної лікарні, Військового медичного клінічного центру Південного регіону, НДІ молекулярно-генетичної та клітинної медицини МОЗ України, пологових будинків № 1 та № 2 м. Одеси.
Особистий внесок здобувача. Здійснено патентно-інформаційний пошук, визначено мету і завдання дослідження, відпрацьовано профіль досліджень, зібрана основна частина клінічного матеріалу, виконана переважна частина діагностичних та лікувальних заходів. Відпрацьовано методики забору матеріалу і методики досліджень, які в Україні проводилися вперше. Виконано статистичну обробку результатів дослідження, оформлено таблиці та графіки, сформульовано висновки, опубліковано основні положення роботи, сформульовані та підготовлені матеріали для отримання патентів. Автор висловлює подяку за співробітництво колективу НДІ молекулярно-генетичної та клітинної медицини МОЗ України (керівник –провідний науковий співробітник, к.мед.н. Бубнов В.В.).
Апробація результатів дослідження. Матеріали дослідження доповідалися на III науково-практичній конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти”(Київ, 2002); 1st World congress of World Association of Reproductive Medicine “New advances in reproductive technologies and genetics”(Italy, Sabaudia, 2002); науково-практичній конференції “Актуальні питання сучасного акушерства”(Тернопіль, 2003); IV Всеукраїнській конференції з гінекологічної ендоскопії (Одеса, 2003); III з’їзді онкологів та радіологів країн СНД (Білорусь, Мінськ, 2004); науково-практичній конференції “Вагінальна хірургія –сьогодні і завтра”(Вінниця, 2005); на засіданнях та днях спеціаліста Одеського та Львівського обласних товариств акушерів-гінекологів.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 44 наукових роботи, в тому числі статей у профільних виданнях, ліцензованих ВАК України –, тез –; отримано 6 патентів України.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 380 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 49 таблицями та 53 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, п’яти розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій і списку використаної літератури, що нараховує 582 джерела, з яких 269 вітчизняних і російськомовних та 313 іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи дослідження. За період з 2001 по 2006 р. у гінекологічному відділенні Одеського обласного онкологічного диспансеру, а також у відділенні інвазивних методів діагностики і лікування Університетської клініки Одеського державного медичного університету під наглядом перебували 260 пацієнток репродуктивного віку з гістологічно верифікованою пухлинною патологією слизової оболонки матки, що проходили обстеження і лікування на зазначених клінічних базах. Мінімальний вік відповідав 18 рокам, максимальний –. Середній вік хворих склав 35,7±3,2 роки. Дослідження виконані у відповідності до сучасних біоетичних вимог щодо поінформованої згоди да конфіденційності особистих медичних даних (протокол засідання Комісії з питань біоетики Одеського державного медичного університету № 23В від 23.02.2007 р.).
У відповідності з наведеними класифікаціями усі пацієнтки з гістологічно верифікованою пухлинною патологією ендометрія були поділені на чотири групи.
У першу групу дослідження ввійшли 80 пацієнток із залозистою гіперплазією ендометрія (проста гіперплазія), другу групу склали 70 жінок із залозисто-кістозною гіперплазією ендометрія (складна гіперплазія), 50 хворих з атиповою гіперплазією ендометрія (як простою, так і складною) були віднесені до третьої групи. Четверту групу склали 60 пацієнток з морфологічно верифікованим раком тіла матки. У п’яту групу (контролю) увійшли 100 практично здорових жінок, що проходили обстеження за програмою “Безплідність”для підготовки до екстракорпорального запліднення.
Оцінка клініко-анамнестичних характеристик у досліджуваних групах здійснювалася згідно зі шкалою факторів ризику розвитку патології ендометрія (шкала Кульбака).
Обстеження та лікування хворих здійснювалося згідно наказу № 620 МОЗ України від 29.12.2003 р. та наказу № 676 від 31.12.2004 р. “Про затвердження клінічних протоколів з акушерської та гінекологічної допомоги”(частина 2,
пункт 13). Ендоскопічні втручання проводили за типовою методикою (J. Phillips, 1991) на обладнанні виробництва Karl Storz (Німеччина).
Клініко-генеалогічний метод. На кожну хвору заповнювалася клініко-генеалогічна карта згідно з методикою, запропонованою Бажорою Ю.І. і співавт. (2001). Агрегацію пухлинної патології в родинах пробандів оцінювали за методикою Акуленко Л.В. і співавт. (2000).
Морфологічний метод. Дослідження видалених зразків проводили за стандартною методикою Ліллі Р.Д. (1969).
Імуногістохімічний аналіз зразків ендометрія проводили за допомогою наборів антитіл фірми DAKO Cytomation (Данія) згідно протоколу, запропонованого фірмою-виробником.
Цитогенетичний метод. Для культивування лімфоцитів периферичної крові використовували напівмікрометод, запропонований Захаровим А.В. і співавт. (1982). Хромосомний аналіз проводили на системі каріотипування MetaSystems (Німеччина) з використанням програми “Ikaros”.
Імунологічний метод. Імунофенотипування лімфоцитів периферичної крові проводилося відповідно до інструкцій фірм-виробників моноклональних антитіл Caltag Laboratories Inc. (США) та проточного цитометра GALAXY фірми DAKO (Данія).
Методики оцінки стану генетичного апарату пацієнток:
Виділення ДНК здійснювали зі зразків венозної крові, нормальної та патологічно зміненої тканини ендометрія за допомогою протеїнази К, згідно рекомендаціям Maніатіс Т. (1984). Кількість і якість виділених препаратів ДНК оцінювали електрофорезом в агарозному гелі за допомогою системи відеодокументації Imago та спектрофотометрично за допомогою спектрофотометра MicroWave –X, Biotech (Німеччина).
Ампліфікацію ДНК проводили з SSR та ISSR праймерами. Для ампліфікації використовували прилад Primus (MWG, Німеччина) та iCycler (Bio-Rad, Німеччина). За допомогою градієнтного блоку для ПЛР (іСycler, Bio-Rad, Німеччина) були відпрацьовані умови гібридизації праймерів з матрицею ДНК та концентрація іонів Мg2+ для досліджуваних праймерів. Продукти ампліфікації фракціонували електрофорезом в агарозних та поліакриламідних гелях. Фрагменти ДНК в гелі забарвлювали бромистим етидієм, або AgNO3 за Maniatis Т. (1984).
Фрагментний аналіз проводили на секвенаторі MWG Biotech (Німеччина) згідно інструкції до прибору.
Секвенування ДНК проводили за допомогою реактивів Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit Amersham Pharmacia Biotech Inc. (Німеччина) на секвенаторі MWG Biotech (Німеччина). Документування та аналіз результатів здійснювалися за допомогою комп’ютерної програми MWG “Sequence Analysis”.
Аналіз промоторного регіону гена IL-6 здійснювали піросеквенуванням на піросеквенаторі PSQ 96MA (Pyrosequencing AB) згідно з інструкцією виробника.
Оцінку саногенетичного стану організму на основі аналізу регуляторних процесів провідних саногенетичних систем (Комаров Г.Д. і співавт., 2001, Носкін Л.А. і співавт., 2005) проводили за допомогою спіроартеріокардіоритмографа (САКР) та комп’ютеризованого вимірювача рухів (КВР-3), рекомендованих до застосування в медичній практиці згідно з протоколами № 2 від 9.07.03 та № 4 від 11.09.02 відповідно. Виробник пристроїв –ООО “Интокс”, Росія.
Статистична обробка проводилася методами дисперсійного та кореляційного аналізу. На всіх етапах проведення статистичного аналізу для підготовки первинних таблиць спряженості та групування ознак використовувалися стандартні функції пакету Excell 7.0. Визначення критеріальних значень та основні обчислення проводилися за допомогою статистичних пакетів програми Statistica 6.0.
Результати досліджень та їх обговорення. Порівняльний аналіз основних клініко-анамнестичних характеристик, а також факторів ризику розвитку патології ендометрія серед досліджуваних жінок показав наявність достовірних відмінностей між групами пацієнток з різними варіантами пухлинної патології ендометрія і практично здоровими пацієнтками за критерієм екологічно несприятливих умов виробничого середовища. На факт роботи з хімічно шкідливими виробничими речовинами вказували 8 (10,0 %) і 6 (8,7 %) жінок I і II груп відповідно, при цьому в III і IV групах даний показник був достовірно вищим (16,0 % і 15,0 % відповідно), а в контрольній групі достовірно нижчим –жінка (1,0 %). Несприятливі умови праці з перевтомою відзначали 43 (53,8 %), 32 (45,7 %), 28 (56,0 %), 25 (41,7 %) і
(46,0 %) пацієнток першої, другої, третьої, четвертої та п’ятої груп відповідно. Отримані нами результати узгоджуються із даними ряду вітчизняних і зарубіжних авторів про те, що професійні шкідливості є одним із найбільш значущих факторів ризику виникнення і розвитку усякої дизрегуляційної патології, у тому числі і пухлинних захворювань ендометрія. Аналіз анамнестичних характеристик пацієнток досліджуваних груп достовірно показав, що факт травматизації слизової оболонки матки підвищує у майбутньому ймовірність розвитку пухлинної патології останньої. Аналогічні результати були отримані С.В. Антиповою (2001), І.І. Зибенко (2004), Silverberg S. (1986), Sironi S. (1992) і свідчать про те, що травматизація слизової оболонки матки в анамнезі є одним із основних факторів ризику виникнення і розвитку пухлинної патології ендометрія надалі, викликаючи дисбаланс місцевих систем регуляції процесів росту й апоптозу. В ході оцінки результатів проведеного генеалогічного анамнезу виявлені достовірні розбіжності між досліджуваними групами. Так, наявність онкологічних захворювань у родичів відзначали 37 (46,3 %) хворих на просту гіперплазію ендометрія без атипії, 40 (57,1 %) жінок зі складною гіперплазією ендометрія без атипії, 23 (46,0 %) пацієнтки з атиповою гіперплазією ендометрія та 38 (63,3 %) осіб з РТМ. Усі показники достовірно перевищили аналогічний у групі контролю, де на факт наявності онкологічних захворювань у родичів вказували тільки 9 (9,0 %) пацієнток. Разом з тим, доброякісні пухлинні процеси органів репродуктивної системи по жіночій лінії були виявлені у
(53,8 %), 39 (54,3 %), 37 (74,0 %) і 44 (73,3 %) пацієнток першої другої, третьої і четвертої груп відповідно, достовірно перевищивши аналогічний показник у групі контролю –,0 % (15 жінок). Отримані нами результати узгоджуються із даними Л.В. Адамян і співавт. (1998), І.Б. Манухіна та співавт. (2001), В.П. Козаченко та співавт. (2004) щодо генетичного фактора як провідного у виникненні і розвитку пухлинних процесів ендометрія.
Результати проведених імуногістохімічних досліджень показали, що в ендометрії практично здорових жінок присутня висока або помірна активність
NO-синтази, тоді як при гіперпластичних процесах ендометрія активність даного ферменту у більшості випадків слабка і слідова, а при атиповій гіперплазії ендометрія та РТМ –слідова або практично відсутня. Розглядаючи нормальний ендометрій, просту і комплексну гіперплазію ендометрія без атипії та просту і комплексну гіперплазію ендометрія з атипією, а також РТМ як послідовні етапи формування патологічного процесу у тканині у світлі теорії дизрегуляційної патології, слід вказати на зниження активності NO-синтазної системи у слизовій оболонці тіла матки по мірі прогресування ступеня прояву атипових змін тканини. Участь NO у зазначених процесах розвитку пухлинної патології ендометрія є безсумнівною. При цьому активність оксиду азоту у слизовій оболонці матки пацієнток з пухлинними захворюваннями ендометрія ми розглядаємо тільки як показник стану саногенетичних процесів у тканині.
Враховуючи одержані нами дані про достовірні розходження в активності оксиду азоту у слизовій оболонці матки при різних варіантах пухлинної патології ендометрія, а також дані літератури про важливу роль стану рецепторного апарату ендометрія у виникненні і розвитку пухлинної патології в ньому, був проведений порівняльний аналіз стану рецепторів стероїдних гормонів у слизовій оболонці матки у сформованих групах дослідження. Порівняльний аналіз стану рецепторів естрадіолу у досліджуваних групах показав, що експресія рецепторів естрадіолу у слизовій оболонці тіла матки у пацієнток репродуктивного віку достовірно знижується по мірі прогресування пухлинного процесу від норми до атипової гіперплазії ендометрія. Порівняльний аналіз стану рецепторів прогестерону у досліджуваних групах показав, що експресія прогестеронових рецепторів в ендометріальній тканині пацієнток репродуктивного віку також достовірно знижується по мірі прогресування пухлинного процесу від норми до атипової гіперплазії ендометрія. При цьому необхідно підкреслити, що експресія рецепторів естрадіолу і прогестерону в епітеліальних клітинах корелює з такою у стромі.
З огляду на отримані нами дані, показники тканинної активності оксиду азоту,
а також стану рецепторної системи у слизовій оболонці матки, особливо досліджувані в динаміці, можуть бути критеріями прогнозу подальшого перебігу захворювання як убік його агресії, так і вбік регресії.
Відомо, що патологічні процеси в органах і тканинах можуть викликати значні зсуви в клітинному складі периферичної крові. Отже, вивчаючи особливості субпопуляційного складу лімфоцитів крові за умов наявності патології, можна спробувати зафіксувати зміни, характерні для того чи іншого захворювання, що мало б важливе діагностичне значення. Проведені дослідження з імунофенотипування лімфоцитів периферичної крові пацієнток з різними видами пухлинної патології ендометрія показали, що у 74 % обстежених виявляються різноманітні порушення імунограми, тоді як у контрольній групі відхилення від нормальних показників імунограми виявлені лише у 11 % жінок. Серед основних порушень відзначалися такі, як: збільшення відносного вмісту природних кілерів (ЕК); збільшення відносної кількості активованих Т-клітин; збільшення вмісту Т-супресорів / цитотоксичних клітин (Тс); зниження відносного вмісту Т-хелперів (Тх), що супроводжується зниженням регуляторного індексу Тх/Тс; зміна відносного вмісту В-клітин. Найчастішим відхиленням показників імунограми від норми в обстежених групах пацієнток виявилося підвищення відносного вмісту в крові природних кілерів і активованих Т-клітин, що несуть рецептор до інтерлейкіну 2: IL-2Rб. Сумарні відхилення від норми за процентним вмістом Т і В-клітин у крові обстежених пацієнток зустрічалися дуже рідко. При цьому найбільший відсоток порушень імунограми відзначали у групах хворих на аденокарциному ендометрія і комбіновані гіперпластичні процеси ендо- та міометрія.
Порівняльний міжгруповий аналіз отриманих результатів виявив певну кореляцію між характером змін середніх показників клітинного імунітету та типом патології. Так, наприклад, у групі пацієнток з верифікованою аденокарциномою ендометрія середній відносний вміст клітин з фенотипом CD3+CD8+ (Т-супресори / цитотоксичні клітини) і загальний відсоток лімфоцитів перевищують аналогічні показники в інших, включаючи контрольну, групах. У групах хворих на злоякісні пухлини ендометрія та у вибірці пацієнток, що страждають на комбіновані доброякісні пухлини ендо- і міометрія, середні цифри відносного вмісту ЕК-клітин у крові підвищено, а середній відносний вміст Т-хелперів знижено порівняно з контролем.
Виявлені зміни могли б розглядатися як критерії ризику пухлинного росту при діагностичних обстеженнях, але проблема полягає в тому, що зазначені зрушення чітко простежуються лише при розгляді середніх показників імунограми в досліджуваних групах пацієнтів. При аналізі ж індивідуальних показників, зробити коректні діагностичні і прогностичні висновки досить проблематично, оскільки відхилення зазначених показників у конкретних хворих, як правило, не виходять за межі загальноприйнятих нормальних значень (фізіологічних коливань). Цей висновок узгоджується з думкою Л. Йегера і співавт. (1990), Є.І. Соколова і співавт. (1998), В.А. Прокопчука (2000), Schondorf T.H. et al. (1995), Chang W.C. et al. (2005) про те, що імунологічні параметри у пацієнтів доцільно оцінювати індивідуально, на етапі діагностики і наступного спостереження, оскільки порівнювання із середньостатистичними показниками не передає реальний стан імунологічної реактивності внаслідок широкого діапазону показників у нормі. Таким чином, результати проведеного імунологічного дослідження свідчать про недостатню інформативність даних одноразового імунофенотипування лімфоцитів крові у пацієнток гінекологічної клініки при використанні стандартних підходів до їх трактування. Розроблений спосіб оцінки результатів імунофенотипування шляхом обчислення “індексу пухлиноспецифічної реактивності”ІПР дозволив виявити групу пацієнтів з підвищеним ризиком наявності пухлинного росту серед осіб з нормальною імунограмою або з діагностично малоінформативними змінами імунограми. Запропонований індекс являє собою частку від поділу добутку процентного вмісту ЕК і Тс-клітин (у чисельнику) і процентного вмісту Тх
(у знаменнику):
При аналізі результатів виявилося, що розподіл онкологічних хворих залежно від величини показника ІПР відрізняється від нормального і має 2 виражених максимуми: в районі 3 і 12 одиниць ІПР. Тому було вирішено поділити пацієнтів, що мають злоякісні пухлини матки (IV група), на 2 підгрупи: зі значеннями ІПР до
і більше 7 відповідно. Першій підгрупі (IV А) була привласнена умовна назва “підгрупа імунореактивності типу А”(значення ІПР нижче 7), а підгрупу IV В умовно назвали “підгрупа імунореактивності типу В”(значення ІПР вище 7).
Імунограми пацієнтів з підгрупи імунореактивності типу А характеризувалися високим вмістом Т-хелперів, низьким вмістом Тс і природних кілерів (рис. 1). Імунограми пацієнтів з підгрупи імунореактивности типу В, навпаки, відрізнялися відносно низьким вмістом Т-хелперів, високим відсотком Т-цитотоксичних/ супресорів і природних кілерів у периферичному кровотоці і заниженим імунорегуляторним індексом.
Рис. 1. Гістограми, що відображують вміст різних субпопуляцій лімфоцитів у крові пацієнтки М., яка страждає на аденокарциному ендометрія
Різниця за величиною критерію ІПР між підгрупами онкологічних пацієнтів (IVA і ІVВ) та іншими групами, за винятком пари “Рак, імунореактивність типу А –Атипова гіперплазія”, виявилася статистично достовірною (р<0,05). Відсутність достовірної різниці у показниках клітинного імунітету в єдиній парі “Рак, імунореактивність типу А –Атипова гіперплазія”є найбільш значимим фактом (рис. 2). З одного боку, це демонструє подібну загальноорганізмену відповідь на вже сформовану онкопатологію і на передпухлинний стан, яким є атипова гіперплазія ендометрія, що свідчить про спільність їх патогенетичних механізмів і дозволяє розцінювати атипову гіперплазію, як етап канцерогенезу.
Рис. 2. Співставлення середніх значень ІПР у групах обстежених пацієнток. Позначення “Рак, тип А”та “Рак, тип В”означають підгрупи онкологічних пацієнтів IVA та ІVВ відповідно
З іншого боку, нормалізація значень ІПР при динамічному визначенні показників клітинного імунітету у онкохворих, чи навпаки “стрибок”ІПР за межі “нормальних”значень 4<норма<9 у випадку консервативного лікування хворих на атипову гіперплазію ендометрія може бути сигналом до своєчасного використання хірургічних, але ще органозбережувальних методик, наприклад аблації або резекції ендометрія. “Аномальні”значення ІПР не виявлені у жодної з практично здорових жінок контрольної групи, тоді як відсоток “аномальних”ІПР у групах пацієнтів від гіперплазії до аденокарциноми зростає. Перевагою пропонованого нами підходу (визначення показника ІПР) є те, що даний показник дозволяє оцінювати функціональне взаємовідношення клітинних популяцій крові, що підвищує інформативну цінність навіть одноразового імунофенотипування.
Оцінка стану ендокринної системи здійснювалася шляхом визначення та співставлення концентрацій гормонів у сироватці крові пацієнток досліджуваних груп. Порівняльний аналіз рівнів стероїдних і гіпофізарних гормонів у першу фазу менструального циклу, так само як і у другу, у жінок з різними видами пухлинної трансформації ендометрія достовірної різниці не показав (p>0,05). Разом з тим у обстежених жінок була виявлена пряма кореляція між концентрацією ТТГ, Т3 і відносним вмістом певних субпопуляцій імунних клітин у периферичному кровотоці, що узгоджується із даними Горіна В.С. та співавт. (2000). Так, рівень трийодтироніну корелював з відносним вмістом природних кілерів (r=0,36, p<0,05), а концентрація тиреотропного гормону корелювала із вмістом Т-клітин (r=0,31, p<0,05).
Оскільки ЕК і Т-клітини є основними учасниками клітинного (у тому числі і протипухлинного) імунітету, отримані результати можна розглядати як додаткове свідчення ролі ендокринної системи як одного із чинників, що впливають на резистентність організму до пухлинного росту. Зокрема, наведені дані обґрунтовують доцільність додаткового вивчення ролі гормонів щитовидної залози у протипухлинній опірності організму. Даний аспект може мати як теоретичне, так і важливе практичне застосування в плані розробки методів і препаратів для спрямованої корекції гормонального фону з метою підвищення протипухлинної резистентності організму. З огляду на відсутність достовірних змін у функціональній активності інших залоз внутрішньої секреції, зміни у функціонуванні щитовидної залози слід трактувати як сигнальні і розцінювати стан щитовидної залози як маркер саногенезу.
Проведений аналіз родоводів пацієнток досліджуваних груп і цитогенетичного дослідження лімфоцитів їх периферичної крові продемонстрував наступне. У групі пацієнток з обтяженим сімейним онкоанамнезом частота зустріваності раку шлунка (19,3 %), раку матки (15,8 %) і раку молочної залози (15,6 %) вища, ніж частота зустріваності пухлинної патології іншої локалізації. Слід зазначити, що пацієнтки з пухлинною патологією ендометрія з групи з обтяженим сімейним онкоанамнезом більше контактували з мутагенами (45,5 %), ніж пацієнтки з пухлинною патологією без обтяженого сімейного онкоанамнезу (29,6 %). При цьому у пацієнток з обтяженим сімейним онкоанамнезом частіше спостерігалися порушення репродуктивної функції (спонтанні викидні і безплідність) (13,6 % і 9,0 %), ніж у пацієнток без обтяженого сімейного анамнезу по онкопатології (3,7 % і 3,2 %). Виявлено, що рівень спонтанних хромосомних аберацій у онкологічно обтяжених та необтяжених пацієнток із залозистою гіперплазією ендометрія (19,5±2,0 % і 7,1±2,5 % відповідно) достовірно нижчий, ніж у пацієнток з атиповою гіперплазією (29,1±6,5 % і 29,9±4,1 %) і аденокарциномою ендометрія (36,4±6,1 % і 36,4±6,1 %). Разом з тим, у хворих на пухлинну патологію ендометрія сумарно виявлено 31 сайт фрагільності хромосом (рис. 3); 4 сайти фрагільності (1q2.5-4.1; 2q2.4-31; 4q1.5; 5q1.4) виявлено у пацієнток з атиповою гіперплазією ендометрія й аденокарциномою ендометрія як з обтяженим сімейним онкоанамнезом, так і без нього. Слід зазначити, що у хворих з обтяженим сімейним анамнезом по онкопатології виявлено 4 фрагільних сайти (17q2.2; 1q2.2; 1q1.4; 2p1.5-2.2), які не зустрічаються у хворих без обтяженого сімейного онкоанамнезу.
Рис. 3. Каріотип лімфоцитів периферичної крові хворої на рак ендометрія
,ХХ, +mar; 11p-; FRA1q3.2; ламка ділянка хромосоми показана стрілкою
Отже, цитогенетичний метод обліку фрагільних сайтів хромосом лімфоцитів периферичної крові з використанням фолатдефіцитного середовища є додатковим методом виявлення груп високого ризику розвитку як спадкового, так і спорадичного раку; у динаміці відбиває процес стабілізації геному, тобто процес саногенезу; звужує поле пошуку мутантних генів, що призводять до формування ламких сайтів; полегшує вибір схем лікування, з можливим залученням препаратів, що стабілізують геном.
З метою пошуку молекулярно-генетичних маркерів виникнення пухлинної патології ендометрія були проаналізовані мутації і поліморфізм у генах, що обумовлюють процес канцерогенезу у тканині ендометрія, а також було здійснено пошук нових генів і молекулярно-генетичних маркерів патології.
Завдяки роботі ферментів детоксикації відбувається перетворення токсичних для клітини продуктів на водорозчинні нетоксичні похідні. Процес детоксикації включає дві послідовні фази. Ферменти першої фази пов’язують ксенобіотики з утворенням мутагенних проміжних метаболітів, таких як супероксид-аніон-радикал і ароматичні вуглеводні, які під дією ферментів другої фази перетворюються на нетоксичні продукти і виводяться з організму. В даний час встановлено, що ключову роль у другій фазі детоксикації ксенобіотиків виконують глутатіон-8-трансферази (GSTM), N-ацетилтрансферази (NAT). При вивченні поліморфізму гена детоксикації ксенобіотиків глутатіон-8-трансферази (GSTMI) достовірних відмінностей не виявлено у гомозигот по нульовому алелю. Аналіз співвідношення генотипів гена NAT2 зі швидким і повільним ацетилюванням у хворих на рак ендометрія виявив, що повільно ацетилюючий алель S2 (мутація 590 G-A) гена ариламін N-ацетил- трансферази 2 з високим ступенем достовірності (Р<0,001) присутній у хворих на рак ендометрія. У вивченій літературі ми не зустріли праці про зв’язок окремих алелей ариламін N-ацетилтрансферази 2 з ризиком виникнення раку ендометрія. Отримані результати вперше доводять участь гена NAT2 у патогенезі раку ендометрія і дозволяють розглядати молекулярний скринінг алелів NAT2 у якості важливого прогностичного тесту. З практичної точки зору це означає, що робота з будь-якими мутагенами для жінок з такою молекулярною патологією небажана, що підтверджується даними, отриманими нами при аналізі факторів ризику у хворих на рак ендометрія. Клінічно здоровим жінкам, які мають онкологічну обтяженість, доцільно при проведенні індивідуального генотипування звертати увагу на мутації в генах детоксикації з метою формулювання рекомендацій відносно стилю життя та контактів з мутагенами. Крім того, розбалансованість ферментів першої та другої фаз детоксикації може пояснювати відсутність очікуваних результатів в разі проведення гормонотерапії пухлинних станів ендометрія.
Дані про взаємозв’язок між особливостями метаболізму естрогенів, андрогенів і прогестерону та ризиком виникнення гормонозалежних пухлин, зокрема раку молочної залози, яєчників та ендометрія, не викликають жодних сумнівів. Естрогени, наприклад, утворюються шляхом конверсії андрогенів, в результаті складного ланцюга біохімічних перетворень. Саме тому деякі поліморфні варіанти генів, продукти яких беруть участь в синтезі андрогенів і естрогенів, можуть дещо збільшувати ризик новоутворень репродуктивної сфери. Зокрема, до кандидатів відносять гени групи цитохрому р450 (CYP1A1, CYP17, CYP1B1, Esr1 (ген рецепторів естрадіолу) і CYP19). Наприклад, ген CYP19 кодує фермент ароматазу, що займає ключову позицію на шляху перетворення андрогенів у естрогени, тобто каталізує реакцію, яка лімітує швидкість процесу в цілому. Реакція пухлини на гормони, як відомо, визначається наявністю відповідних рецепторів, з яких найбільш важливими є естрогенові (Esr) та прогестеронові (Pgr). Рецептори (цитоплазматичні протеїни) концентрують лише специфічні по відношенню до них стероїдні гормони з тих, що вільно проходять через клітинні мембрани. Комплекс, що утворився, переноситься в ядро клітини, де відбувається його взаємодія з ДНК, в результаті відбуваються зміни у функції гена клітини і, відповідно, у контролюванні її росту. У популяційних дослідженнях встановлено, що поліморфізм CYP19 може бути асоційований із підвищенним ризиком раку молочної залози, але його роль, так само як і роль решти кандидатних генів, у патогенезі раку ендометрія поки не вивчалась. Наведені дані свідчать про вирішальну роль молекулярно-генетичних чинників у виникненні гормонально-метаболічних порушень як основи для формування різноманітних патогенетичних варіантів захворювання і про необхідність ретельного дослідження подібних механізмів. Відповідний фрагмент роботи спрямований на пошук можливих асоціацій поліморфізму генів стероїдогенезу CYP17, CYP19, Esrб та Pgr з раком ендометрія. Проведено ампліфікацію ДНК за допомогою праймерів Cyp19, Cyp17, Pgr, Er2, Esrб на зразках раку ендометрія та здорової тканини. Детектований поліморфізм між зразками ДНК різних хворих на рак ендометрія відбивав природній поліморфізм у популяції. У гені естрогенового рецептора, досліженого за трьома екзонами (2, 7, 8), поліморфізму взагалі не виявлено. Дослідження екзона1 гена Cyp19, гена Cyp17, а також гена прогестеронового рецептора показало відсутність поліморфізму між контролями та тканинами раку ендометрія. Додатково проведено пошук нових мутацій, що можуть міститися у вказаних локусах, за допомогою температурного градієнтного гель-електрофорезу (TGGE). Отримані дані додатково підтвердили попередні дані щодо відсутності мінливості у досліджених регіонах геному. В результаті проведеного дослідження показано, що гени стероїдогенезу CYP19, Cyp17, Esrб, Pgr, патологічні зміни в яких за даними літератури обумовлюють виникнення пухлин в гормонозалежних тканинах жіночої репродуктивної системи, у межах досліджених локусів не містять очікуваних молекулярно-генетичних змін, які можна було б використати як прогностичні маркери виникнення пухлин ендометрія. Подібні дослідження є перспективними і повинні продовжуватися у напрямку вивчення решти ділянок гена і оточуючих повторюваних послідовностей, а також пошуку нових мутацій і детекції поодиноких нуклеотидних поліморфізмів.
Відомо, що людина має два види естрогенових рецепторів: ER-альфа та
ER-бета. Вони зв’язують естрогени і мають різну локалізацію та концентрацію. Для ER-альфа гена ідентифіковано 10 промоторних зон, три промоторні зони –A,B і C –найбільш вивчені. Дані промотори регулюють синтез специфічних транскриптів, відповідаючих ER-альфа А, ER-альфа B, ER-альфа С ізоформам. Ступінь експресії у різних ізоформ неоднаковий. Специфічні шляхи ER-експресії припускають диференційовану дію естрогенів на тканину-мішень. Крім епігенетичних змін у рівні експресії, зміни в експресії генів можуть мати місце і при генетичних порушеннях. Однонуклеотидний поліморфізм (SNP) є найбільш загальним типом варіацій у геномі людини. Так, у роботі продемонстровано генотипні розбіжності при аденокарциномі і нормі в кодоні 10 екзону 1 естрогенового рецептора альфа. Оскільки підтипи естрогенових рецепторів альфа і бета різні за функцією й експресією, то величина їх співвідношення характеризує як певну тканину, так і її стан. При аденокарциномі ендометрія співвідношення альфа і бета зменшене порівняно з контролем –нормальним ендометрієм у постменопаузі –і становить 3,3 до 6,8 відповідно. На даний час існує дуже мало праць про мутації або інші структурні перебудови ER-генів при пухлинах ендометрія. Мутації в зоні промоторних регіонів часто викликають або активацію, або втрату функції цих генів. З огляду на це було проаналізовано промоторні зони ER-альфа А, ER-альфа B, ER-альфа С та ER-бета з метою пошуку специфічних для пухлин ендометрія мутацій. В результаті ПЛР із вихідними праймерами були отримані амплікони промоторних зон ізоформ ER-альфа А-120 п.о., ER-альфа B-187 п.о., ER-альфа
С-119 п.о. та ER-бета-110 п.о. Скринінг промоторів генів ЕR-альфа В та ЕR-альфа С з BESS-T scan у 38 хворих на просту, складну, атипову гіперплазію та аденокарциному ендометрія і навіть поліпоз ендометрія, порівняно з 4 здоровими контрольними пацієнтками, показав ідентичність нуклеотидного складу в усіх випадках. Під час пошуку мутацій у промоторних зонах ЕR-альфа А та ЕR-бета нами були виявлені однонуклеотидні делеції Т-основи, заміна Т на G у промоторах при раку ендометрія у чотирьох пацієнтів з атиповою гіперплазією. Найбільш часто зустріваною зміною виявилася Т-делеція у положенні 81 амплікону ER-бета (у 56 % випадків). Додатково у промоторі ЕR-бета в одному випадку була виявлена делеція у 48 пар основ. У нормі таких змін не виявлено.
Поліморфізм у промоторній зоні рецепторів може порушувати їх експресію в той чи інший бік, змінюючи тим самим відповідь мішеней, і сприяти промоції пухлинного процесу. Одержані дані стосовно виявлення поліморфізму і навіть делеції у промоторній зоні дозволяють зробити подібне припущення виключно лише при аденоматозі та раку ендометрія. Оскільки естрогеновому рецептору бета приписується протективна роль у функції естроген-рецепторного апарату, то, можливо, мутації у промоторі ERb можуть нівелювати функцію цього гена.
З практичної точки зору скринінг експресії генів естрогенових рецепторів і детекція мутацій у промоторних зонах ERa та ERb, здійснювані для диференціювання хворих із різним статусом естрогенових рецепторів, можуть пояснювати, чому не у всіх хворих з імуногістохімічно визначеним адекватним до гормональної терапії профілем є позитивний ефект від призначеної терапії. Тобто, наявність рецептора не означає його функціональну здатність до виконання специфічних задач, а звідси і нечутливість тканини до гормональної терапії.
Враховуючи роль імунної системи в пухлинному рості і дані літератури про можливість впливу генетично обумовленого підвищення рівня інтерлейкіну-6 у сироватці крові на розвиток пухлинних захворювань жіночої репродуктивної сфери, метою наступного фрагменту дослідження було вивчення зв’язку між –G/C поліморфізмом у промоторній ділянці гена ІL-6 і схильністю до раку ендометрія. Інтерлейкін-6 є плейотропним цитокіном, його рівень у сироватці може обумовлюватись –G/C поліморфізмом у промоторній ділянці гена ІL-6, звичайно, він вищий у GG-гомозигот. У нашому дослідженні вперше в Україні було застосовано технологію піросеквенування. У випадку гомозиготності ДНК-матриці (генотип GG або СС) на пірограмі спостерігалась поява відповідно G- чи С-піку, висота яких пропорційна включенню у синтезований ланцюжок ДНК одного дНТФ. При гетерозиготній матриці на пірограмі присутні як G-пік, так і С-пік зі зниженою удвічі висотою, оскільки половина матриць містила G-алель, а інша половина –
С-алель (а точніше –комплементарні нуклеотиди), що призвело до зменшення виділюваного світлового сигналу у разі додавання в реакційну суміш певного дНТФ. Проведений нами аналіз не виявив статистично достовірних розбіжностей у розподілі частот генотипів між групами, що вивчалися (контроль та пацієнтки з аденокарциномою ендометрія). С-алель, що знижує рівень ІL-6 у сироватці, був присутній в обох групах приблизно з однаковою частотою: 0,46 у групі здорових жінок та 0,44 у групі хворих пацієнток. Як серед хворих, так і серед здорових пацієнток мали перевагу –G/С гетерозиготи: 61,54 % та 54,54 % відповідно. Отримані нами дані щодо співвідношення частот G та С-алелей узгоджуються з опублікованими раніше результатами популяційного аналізу –G/C поліморфізму у групах пацієнток з Центральної Європи та Північної Америки і свідчать про неможливість застосування окремих молекулярно-генетичних маркерів в якості прогностичних для популяції українських жінок. Цей факт підкреслює необхідність впровадження генетичної епідеміології з урахуванням популяційного поліморфізму населення України.
Ранньою і постійною ознакою малігнізації є нестабільність мікросателітів, мутації в яких можуть використовуватися у діагностиці пухлинного процесу. До мікросателітної нестабільності призводять порушення в системі репарації. Мікросателіти –особливий клас ДНК-маркерів. Вони є фрагментами ДНК з великою кількістю –до сотні і навіть більше –“повторів”. Мікросателіти високополіморфні, з десятками алелей у кожному локусі і високими темпами мутацій. Аллелі мікросателіта локуса відрізняються один від одного довжиною, переважно числом повторів. Невеликі розміри мікросателітних локусів дозволяють застосувати метод полімеразної ланцюгової реакції з метою генотипування і забезпечити високу відтворюваність результатів. У людини вони розподілені по всьому геному, що дозволяє використовувати їх, як і мононуклеотидні поліморфізми (SNP), для аналізу асоціацій, зчеплення і картування генів, а також як маркери спадкових захворювань. Нами досліджені послідовності мікросателітів генів TP53, THRAI, fes/fos, суp19, с-myc, DCC, shgc10061, shgc1071, wt1, при порівняльному ПЛР-аналізі ДНК з аденокарцином ендометрія і ДНК з лімфоцитів периферичної крові кожної пацієнтки (рис. 4). Результати вивчення ДНК 30 пацієнток показали, що в послідовностях мікросателітів генів DCC, wt1, с-myc виявляються додаткові алелі при карциномі ендометрія. Для мікросателіта shgc10701, навпаки, характерна втрата алеля при карциномі. Для TP53, THRA1, fes/fos, cyp19, shgc10061, змін не виявлено. Ці результати вказують на залучення протонкогенів с-myc, wt1, ДСС у процес канцерогенезу при раку ендометрія і на зацікавленість в ньому естрогенових рецепторів (shgc10701).
Сьогодні вивчається можливість використовувати ці маркери при ранній діагностиці раку ендометрія по виявленню цих мутацій в ДНК, узятій з плазми крові у хворих при гіперплазії, атипії ендометрія і у хворих із ранньою стадією раку ендометрія. Нестабільність мікросателітніх повторів в геномі може бути використана для діагностичних цілей як самостійний маркер в некодуючих і кодуючих ділянках, так і у випадках асоціацій з альтерацією в інших генах (рис. 4).
А Б
1 2 2 M
В
1 2
Г
М М
Рис. 4. Мікросателітна нестабільність при раку ендометрія.
А –ДСС; Б –wt-1; В –shgc10701; Г –TP53
1 –пухлина; 2 –норма; М –маркер молекулярної ваги pUC18/Msp.
Стрілками позначено: – наявність додаткового амплікону;
–відсутність амплікону
Найефективнішими маркерами ранньої діагностики є порушення повторів мікросателітів. Метою наступного фрагмента дослідження був пошук нових ділянок ДНК (як експресуючих послідовностей, так і ділянок, що їх оточують), що можуть брати участь у розвитку раку ендометрія (або є маркерами для таких) за допомогою секвенування поліморфних ISSR-фрагментів ДНК (inter simple sequence repeat), які відрізняють зразки ДНК з тканини раку ендометрія від здорової тканини. Передбачалося встановити гомологію поліморфних фрагментів, отриманих методом ISSR-праймування, з певними послідовностями в геномі людини і, тим самим, визначити можливу функцію ділянок ДНК, що мають внесок у мінливість механізмів пухлиноутворення. В результаті роботи детектовано кілька поліморфних ISSR-фрагментів, що відрізняють зразки норми та раку в одному генотипі. Заслуговує на увагу той факт, що даний метод в Україні було використано вперше.
Проведено ампліфікацію 7 досліджених ISSR-праймерів з ДНК з нормальної і патологічної тканини і ДНК з крові кожної хворої. Всі праймери давали індивідуальний набір ампліфікованих фрагментів. Проте праймери, що містять двонуклеотидну крову (core) послідовність мікросателіта, давали яскравіші, більш чітко помітні смуги на електрофорезі порівняно з тринуклеотидними (рис. 5). Шість із семи праймерів не виявили відмінностей як між індівідуальними пацієнтками, так і між патологічною і нормальною тканиною. Праймер (СА) 10 G виявився дуже
варіабельним.
Ì 69ê 69ð 69í 62ê 62ð 62í 68ê 68ð 68í 57ê 57ð 57í 59ê 59ð
Рис. 5. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК за допомогою праймера ISSR27 Цифрами позначено зразки ДНК різних хворих на рак ендометрія та їх контрольні зразки: н –ДНК, виділена із здорової тканини; к –ДНК, виділена із крові; р –ДНК, виділена з тканини раку ендометрія. М –маркер молекулярної ваги pUC18/Msp. Стрілками показані поліморфні фрагменти ДНК.
Перший поліморфний фрагмент молекулярною вагою 100 п.н. детектовано в ДНК із зразка крові, тоді як в ДНК тканини раку ендометрія він відсутній. В результаті секвенування визначено нуклеотидну послідовність поліморфного фрагменту молекулярною вагою 100 п.н. детектованого у ДНК із зразка крові. Проведений пошук та ідентифікація у базі даних геному людини секвенованого фрагменту відносно відомих генів дозволили встановити наступну локалізацію поліморфної послідовності ДНК: хромосома 6 –,839,102-13,839,186. У групі зчеплення даного хромосомного регіону відомі три гени:
SIRT5 –функція невизначена, дріжджовий гомолог протеїну SIRT5, відомий як епігенетичний регулятор мовчазних генів, також є супресором рекомбінації рДНК; дослідницькі дані свідчать, що sirtuins-білки людини можуть функціонувати як міжклітинні регуляторні протеїни з моно-ADP-рибозилтрансферазною активністю;
RANBP9 –кодує білок, який є важливим для транслокації РНК і білків через комплекс ядерних пор, може змінювати транскрипційну активність кількох інших генів, зв’язуючись з їх білками, залучаючи met протоонкоген, гомеодомен-взаємодіючу протеїнкіназу 2, андрогенний рецептор і циклінзалежну кіназу 11;
CD83 –продукт CD83 антиген активує B-лімфоцити, може відігравати значну роль у представленні антигену чи у клітинних взаємодіях, що призводять до активації лімфоцитів.
Аналіз отриманих результатів показує, що кожен із цих генів може відігравати певну роль у формуванні будь-якої ракової пухлини. Розглянемо їх детальніше: отже, ми детектували певну послідовність ДНК, що присутня в нормальній тканині людини і зникає у злоякісно зміненій. Втрата певної послідовності звичайно могла вплинути на функцію певного гена, зокрема для SIRT5 це позначається на регуляції міжклітинних зв’язків, що, як відомо, є складовим етапу втрати клітинами певної тканини специфічності; для гена RANBP9 така зміна автоматично призводить до активізації його білком транскрипції протоонкогена Met, який, як відомо, експресується у багатьох типах клітин (тканинах гепатом, карциномах легень, шлунка, підшлункової залози, прямої кишки, нирок, яєчника, у клітинах раку шкіри), але з надзвичайно високою інтенсивністю –у клітинах епітеліального походження, до яких, зокрема, належить і ендометрій; мутація в гені CD83 порушує імунні реакції організму на невідомі клітини, що стає причиною безперешкодного розвитку ракових пухлин.
Другий поліморфний фрагмент молекулярною вагою 174 п.н. детектовано в ДНК із зразка пухлини, тоді як в ДНК крові він був відсутній. Пошук проводили за аналогічною методикою, локалізація поліморфної послідовності ДНК визначена у хромосомі 10 –, 576, 675-18, 576, 696. У групі зчеплення даного хромосомного регіону відомі три гени: RAI2, CDKL5, PPEF1. При аналізі даних результатів перш за все враховували той факт, що поліморфний фрагмент, у межах вивченої вибірки, зустрічається не лише в ДНК з пухлин, але й у зразках нормальної тканини. Низька вірогідність участі вивченої ділянки ДНК у формуванні раку ендометрія підтвердилася після визначення функцій найближчих генів. Лише для гена ретиноїдної кислоти (RAI2) можна припустити потенційну роль у розвитку пухлини, враховуючи його значення у дозріванні та набуванні специфічності. Останні дослідження внесли цей ген у список потенційних прогностичних маркерів для раку молочної залози. Що ж до родини протеїнкіназних генів –відомі їх мутації, пов’язані із розвитком різних типів раку людини, але за геном CDKL5 таких мутацій не виявлено.
Крім того, детектовано поліморфні послідовності на 1 та 3 хромосомах. Серед проаналізованих генів увагу привертають такі: PLK3, PTCH2, PRDX1 –можуть відігравати певну роль в регуляції клітинного циклу, розвитку та прогресії пухлин; DMAP1 –ген кодує субодиниці кількох окремих комплексів, залучених у репресію або активацію транскрипції. Білок є також компонентом нуклеосомної ацетилтрансферази H4 комплексу і взаємодіє із транскрипційним корепресором пухлино-чутливого гена 101 і проапоптозного летального білку.
В цілому, проведене дослідження дозволило виявити кілька генів, які прямо чи опосередковано беруть участь у розвитку раку ендометрія і які раніше у відомій літературі не обговорювалися. Оскільки не спостерігається популяційних закономірностей в успадкуванні за цими генами, результати, представлені у даній роботі, дозволять вивчати специфічні шляхи розвитку раку ендометрія асоційованого із поліморфізмом у межах окремого генотипу, що є найактуальнішим завданням сучасної медицини, яка сподівається вийти на рівень індивідуальної терапії, а тим більше запобігання захворюванню.
Підвищена нестабільність генома –найважливіша властивість пухлинних клітин, що забезпечує прогресію новоутворень. Відомо, що основною причиною виникнення та прогресії злоякісних новоутворень є порушення функціонування порівняно невеликої кількості генів, зокрема протоонкогенів та генів-супресорів пухлинного росту (антионкогенів). Крім того, існує велика група генів-модуляторів, які не відповідають за злоякісну трансформацію клітин, але сприяють поширенню пухлини в організмі. Суперечливість більшості доступних даних, а також зрозуміла мультифакторність хвороби не дають можливості впевнено користуватися відомими молекулярно-генетичними маркерами. Для підвищення надійності діагностики і прогнозу, внесення своєчасних змін в заходи індивідуального скринінга, а також зниження ризику небажаних наслідків лікування раку необхідно визначати у кожної пацієнтки “профіль”експресії генів, які найбільшою мірою “задіяні”при даному виді пухлини з урахуванням регіону мешкання індивідуума, тобто епідеміологія раку має бути молекулярно-генетичною. На сьогодні у масштабах генома основним інструментом пошуку діагностичних генних маркерів патології ендометрія є виключно технологія дослідження профілів транскрипції на основі ДНК-біочипів, підтвердженням чому є цей фрагмент дослідження.
Алгоритм саногенетичного типування було розбито на кілька етапів. На першому етапі оцінювалася сума набраних балів. При цьому якщо сума не перевищувала 15 балів, такий санотип відносили до гранично-збалансованого
(з відповідним сприятливим прогнозом); якщо сума була у межах від 16 до 19 балів, такий санотип відносили до припустимо-збалансованого (з відповідним відносно сприятливим прогнозом). Нарешті, якщо сума перевищувала 20 балів, такий санотип відносили до дизрегуляторного. У цьому випадку аналізувалися ті системи, що мали гранично виражені 3-бальні оцінки, і на їх основі обговорювалася можлива природа виявленої дизрегуляції. Кожна з виділених референтних груп за наведеними співвідношеннями помітно відрізнялася: так, у контрольній групі частота зустріваності гранично-збалансованих санотипів складала 62 %, а дизрегуляторні стани були виявлені у 19 % жінок; у групі хворих із залозистою гіперплазією ендометрія частота зустріваності гранично-збалансованих станів помітно знижувалася (до 23 %), але частота зустріваності дизрегуляторних санотипів перебувала на рівні контрольної групи (20 %); у пацієнток зі залозисто-кістозною гіперплазією ендометрія спостерігалося помітне зростання дизрегуляторних санотипів, а при атиповій гіперплазії, хоча число гранично-збалансованих санотипів було рекордно низьким (11 %), частота дизрегуляторних санотипів була на рівні перших двох груп. Цей результат здається досить симптоматичним і підкреслює ту обставину, що прогностично несприятлива атипова гіперплазія формується на фоні мінімального вимкнення загальноорганізмених систем саногенезу (показник загальноорганізменої адинамії). Нарешті, винятково часто дизрегуляційний санотип зустрічається при верифікованій аденокарциномі ендометрія, що підкреслює найбільшу обтяженість цього патоморфозу на рівні цілісного організму.
У наведених результатах чітко визначається той факт, що у жінок з різними патологічними станами ендометрія, як і у практично здорових жінок контрольної групи, у системах регуляції ендокринного, імунного, серцево-судинного, дихального та нейросенсорного статусів організму з різною частотою і з різними варіаціями реєструються дизрегуляторні стани, що прогнозують ускладнюючі процеси на рівні цільного організму. За допомогою розробленого ранжиру центильних значень рівнів функціональної адекватності у кожній референтній групі були визначені інформативні критерії, що зустрічаються найбільш часто, на основі яких референтні групи певною мірою диференціюються залежно від патоморфозу ендометрія. З цією метою усі варіанти дизрегуляторних санотипів аналізувалися за внеском окремих регуляторних. Так, у контрольній групі дизрегуляторний санотип асоціювався з напруженням в регуляції переважно скоротливості серцевого м’яза і серцевого ритму, а сумарний бал був у межах 20–балів. При залозистій гіперплазії найбільш часто зрушення спостерігалися зі сторони гормональної системи, центрального і периферичного кровообігу, а сумарна оцінка була у межах 20-23 балів; при залозисто-кістозній гіперплазії підкреслений внесок спостерігався зі сторони імунної системи і нейросенсорної регуляції, а сумарний бал знаходився на рівні
-27 балів. Нарешті, при аденокарциномі ендометрія напруження асоціювалися паралельно з 1-6 регуляторними системами, і сумарний бал був у межах 23-28.
На заключному етапі аналізу санотипів з’явилася можливість диференціювати природу дизрегуляторних станів на рівні окремих внутрішньосистемних функцій, що можна проілюструвати на прикладі аналізу ендокринних дизрегуляцій. Ендокринний статус оцінювався за наступними зчепленими критеріями:
Частота зустріваності ендокринних дизрегуляцій досить висока (у кожного
-го пацієнта), при цьому в рівній пропорції визначаються процеси як підвищеної, так і зниженої функції. Важливою є також та обставина, що внесок в ендокринну дизрегуляцію вносять у близькій пропорції майже всі рівні регуляції. Оскільки ефективність комплексної терапії апріорно пов’язана з індивідуальними варіантами дизрегуляторних статусів, то можна стверджувати, що індивідуальне санотипування створює умову для реалізації адресної ендокринної корекції. Так само можна чекати підвищення ефективності терапії при корекції систем регуляції серцевої, судинної, дихальної і нейросенсорних функцій. Треба зазначити, що впровадження в гінекологічну практику методології полісистемного саногенетичного моніторування не ускладнить, а значно полегшить клінічну діагностику тяжкості перебігу захворювань ендометрія, оскільки пропонований інструментарій забезпечує експресне і висококваліфіковане обстеження і дозволяє обійтися без реферування до складно організованої і не завжди об’єктивної консультативної допомоги із залученням великого числа фахівців.
Порівняльний аналіз зустріваності дизрегуляторних станів у системі регуляції скоротності серцевого м’яза показав наступне. Найбільш часто з-поміж дизрегуляцій зустрічаються функціонально напружені стани з боку включення передсердного комплексу і гіпонапружені стани з боку останньої стадії реполяризації у шлуночковому комплексі. Таке сполучення, що зустрічається найбільш часто, обумовлює те, що брадикардичний ритм (гіпонапруження за ЧСС) зустрічається
в 3 рази частіше, ніж тахікардичний. У цілому інтегральна оцінка зрушень у
PQRST-комплексі з великою вірогідністю припускає, що основним ініціюючим фактором зазначених зрушень є гіподинамічний режим лікування хворих на гінекологічні захворювання. У плані рекомендацій, що поліпшують функціональний статус серцевого м’яза, необхідно передбачити застосування тренінгових фізіопроцедур, спрямованих на інтенсифікацію реполяризаційних процесів у м’язі серця: масажі, контрастні процедури, прогулянки, невисокої інтенсивності тренажери. Пропонований експресний метод детекції PQRST-комплексу дозволить адресно використовувати ЛФК-заходи й об’єктивно експертувати їх ефективність.
Порівняльний аналіз зустріваності дизрегуляторних станів у системі регуляції серцевого ритму пацієнток досліджуваних груп показав, що функціональний статус системи регуляції серцевого ритму відзначається переважним гіподинамічним станом: спектр потужності ритмів серця (ТР) у гіпофункціональних станах зустрічається більше ніж у 5 разів частіше, ніж у гіперфункціональних станах, причому за рахунок превалювання (більше ніж у 5 разів) парасимпатичного контуру (LF). Важливо підкреслити, що ці гіпофункціональні зрушення швидше за все не відносяться до патологічно значимих, оскільки співвідношення парасимпатичної і симпатичної (LF/HF) іннервації помітно зрушуються тільки у кожної 11-12-ї пацієнтки. Наведені результати підкреслюють інформативність кардіоритмографії при реєстрації преморбідних станів, що створює можливість їх корекції за допомогою ЛФК-терапії. У цілому дослідження функціонального стану систем регуляції серцевої діяльності у хворих на гінекологічні захворювання переконує нас у тому, що найбільш часто статус хворих ускладнюється коректованими функціональними напруженнями, а не фіксованими патологічними процесами.
У цьому випадку експресна, динамічна електрокардіоритмографія є більш інформативною, ніж спеціалізоване кардіоконсультування, оскільки вона діагностує порушення на стадіях преморбідного прояву, коли вони можуть ефективно нівелюватися комплексом цілеспрямованих ЛФК-заходів.
Порівняльний аналіз зустріваності дизрегуляторних станів у системах регуляції дихання у хворих на гінекологічні захворювання показав наступне. Значимі частоти напруження у обстежених нами хворих відзначаються тільки відносно наднизькочастотної і низькочастотної складових дихального спектра і тільки вбік гіпофункціональних зрушень. При цьому ані часові характеристики вдиху і видиху, ані обсяги спонтанного дихального акту не модифікуються. Звідси можна зробити припущення, що при досліджуваних варіантах гінекологічних захворювань регуляція спонтанного дихального акту практично не порушується. Але такий висновок не виключає, що сполучення процесів дихання і кровообігу може бути порушеним.
Таким чином, на основі наведених результатів досить обґрунтовано можна припустити, що при досліджуваних гінекологічних захворюваннях при збережувальному варіанті дихального акту чітко відслідковується порушення сполучень регуляції периферичного кровообігу і частоти серцевих скорочень на окремих етапах дихання. Так, практично у кожної третьої обстеженої різко підвищується обсяг депонованої в легені крові (за ростом амплітуди тиску) і знижується час, протягом якого відбувається підвищення ЧСС. У кожної 5-ї обстеженої амплітуда росту ЧСС помітно знижена. Таким чином, мікро- і макрорівневі взаємини розходяться за двома механізмами: зростає периферичний опір артеріальному тискові (внаслідок чого виникає необхідність у додатковому депонуванні крові в легенях) і підвищується гіпоксична стійкість периферичних тканин (внаслідок чого знижується час максимальної активації ЧСС і амплітуда ЧСС-зрушень на дихальній хвилі). Події розходження відбуваються у тій чи іншій мірі при залозисто-кістозній проліферації і злоякісній трансформації: при першому варіанті більш часто зустрічаються гіперфункціональні зрушення у СПА мм Hg
(у 53 %), а при другому варіанті майже у кожної другої обстеженої зустрічається гіпофункціонально спрямоване зрушення в СПТ max HRc (46 %) і частіше, ніж у кожної третьої (37 %), –гіпофункциональні зрушення по СПHR max. Необхідно підкреслити, що вказані функціональні сполучення виявляються тільки на рівні паралельної безперервної спіро-артеріо-кардіо-ритмографії, що свідчить про високу інформаційну значимість атестованого підходу у клініці гінекологічних захворювань. Практико-орієнтоване значення цього підходу полягає в тому, що на основі інтерпретацій диференціюючих напружень можна обґрунтовувати адресні методи їх корекції, що сприяють підвищенню функціональної стійкості організму в умовах формування верифікованої гінекологічної патології.
Отримані нами дані підтверджують сформульовану концепцію про те, що основою для виникнення патологічного ланцюга взаємозалежних процесів, що призводять врешті-решт до виникнення раку ендометрія, є поломки на генетичному рівні, і саме ці поломки є відображенням пухлинної патології ендометрія на мікрорівні. Що ж до порушень основних регуляторних систем, залучених у тій чи іншій мірі у патологічний процес, то вони є відображенням даного патологічного процесу на макрорівні, і є вже результатом сформованого порочного кола. І саме діагностика пухлинного процесу на мікрорівні допоможе проводити максимально ефективний індивідуальний скринінг пацієнток на наявність схильності або початкових проявів раку ендометрія, що дозволить впритул підійти до індивідуальної діагностики і розробки оптимальних схем індивідуального ведення і лікування пацієнток.
Виходячи з отриманих нами даних, планується проведення досліджень транскриптомів при раку ендометрія у жительок України з використанням технології повногеномних ДНК-біочипів. На підставі одержаних результатів і опублікованих даних планується впровадження на клінічних базах ОДМУ технології виготовлення спеціалізованих ДНК-біочипів для дослідження раку ендометрія. З використанням даних ДНК-біочипів заплановано аналіз репрезентативних вибірок пацієнток в Україні, хворих на рак ендометрія, з метою вибору і верифікації специфічних для української популяції генних маркерів для доклінічної діагностики. Обрані гени стануть основою для розробки і впровадження в клінічну практику діагностичних методів і систем на основі технології біочипів.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено теоретичне узагальнення наукових досліджень по вивченню патогенетичних механізмів розвитку пухлин ендометрія на молекулярно-генетичному, хромосомному, тканинному, системному та загальноорганізменному рівнях, що дозволяє кваліфікувати роботу як новий напрямок у вирішенні наукової проблеми в галузі акушерства і гінекології. Проведене дослідження створює теоретичну базу для розробки скринінгових програм із застосуванням молекулярно-генетичних методів, що є основним елементом стратегічної тактики боротьби з онкозахворюваннями.
Практичні рекомендації
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЯ
Дубініна В.Г. Прогнозування і рання діагностика пухлинних захворювань ендометрія. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.01.01 –акушерство та гінекологія. –Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупіка МОЗ України, Київ, 2007.
Представлена робота присвячена підвищенню ефективності індивідуальної профілактики і прогнозування виникнення пухлинних захворювань ендометрія у жінок зі спадковою детермінацією і хворих з верифікованою патологією ендометрія та формуванню теоретичної бази для впровадження молекулярно-генетичних методів як фундаменту моделі загальної системи ранньої діагностики і профілактики онкозахворювань. Виявлені порушення на генетичному, хромосомному, тканинному та системному рівнях дали можливість розглядати пухлинні захворювання ендометрія як дизрегуляційну патологію, а вперше запропоновані доклінічні діагностичні критерії їх розвитку (фрагільні сайти, мікросателітна нестабільність, індекс пухлинної реактивності, активність тканинної NO-синтази, стан рецепторного апарату ендометрія) поглиблюють уявлення про механізми канцерогенезу і можуть використовуватися в спеціалізованих клінічних закладах. Єдиною можливістю індивідуального прогнозування виникнення і варіанта розвитку пухлинних захворювань ендометрія є розробка і впровадження ДНК-біочипа, що включає гени, зацікавлені у формуванні та розвитку пухлинної патології ендометрія.
Ключові слова: діагностика, прогнозування, ендометрій, пухлинні захворювання.
АННОТАЦИЯ
Дубинина В.Г. Прогнозирование и ранняя диагностика опухолевых заболеваний эндометрия. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.01 –акушерство и гинекология. –Национальная медицинская академия последипломного образования им. П.Л. Шупика МЗ Украины, Киев, 2007.
Представленная работа посвящена повышению эффективности индивидуальной профилактики и прогнозирования возникновения опухолевых заболеваний эндометрия у женщин с наследственной детерминацией и больных с верифицированной патологией эндометрия и формированию теоретической базы для внедрения молекулярно-генетических методов как фундамента модели общей системы ранней диагностики и профилактики онкозаболеваний. Выявленные нарушения на генетическом, хромосомном, тканевом и системном уровнях дают возможность рассматривать опухолевые заболевания эндометрия как дизрегуляционную патологию, а впервые предложенные доклинические диагностические критерии их развития (фрагильные сайты, микросателлитная нестабильность, индекс опухолевой реактивности, активность тканевой
NO-синтазы, состояние рецепторного аппарата эндометрия) расширяют представления о механизмах канцерогенеза и могут быть использованы в специализированных клинических учреждениях. Единственной возможностью индивидуального прогнозирования возникновения и варианта развития опухолевых заболеваний эндометрия является разработка и внедрение ДНК-биочипа, включающего гены, заинтересованные в формировании и развитии опухолевой патологии эндометрия.
Ключевые слова: диагностика, прогнозирование, эндометрий, опухолевые заболевания.
SUMMARY
Dubinina V.G. Prognosis and early diagnosis of tumorous diseases of the endometrium. –Manuscript.
The thesis for getting the scientific degree of doctor of medical sciences in speciality 14.01.01 –obstetrics and gynecology. – The National medical academy of postdiploma education named after P.L. Shupik of Health Ministry of Ukraine, Kyiv, 2007.
The presented work deals with increase of efficacy of individual prevention and prognosis of development of tumorous diseases of the endometrium in women with hereditary determination and patients with verified pathology of the endometrium and formation of the theoretical base for introduction of molecular-genetic methods as a foundation of the model of the general system of early diagnosis and prevention of oncological diseases. It is established that the most influential risk factors of development and progressing of tumorous pathology of the endometrium are considered to be metabolism disturbance, complicated genealogical history, trauma of the uterine mucous membrane in the past history as well as dysfunction of the system “pituitary-ovaries-thyroid-uterine”. There is high or moderate activity of NO-syntase in the endometrium of practically healthy women while activity of this enzyme is weak and tracy in most cases in hyperplastic processes of the endometrium; it is tracy or practically absent in atypical hyperplasia of the endometrium and cancer of the uterine body. Expression of estradiol receptors in the mucous membrane of the uterine body in the patients of reproductive age is reliably reducing (p<0.05) in progressing of the tumorous process from the norm to atypical hyperplasia of the endometrium. Expression of progesterone receptors in the endometrium tissue of the patients of reproductive age is reliably reducing (p<0.05) during progressing of the tumorous process from the norm to atypical hyperplasia of the endometrium. Changes in the system of cellular immunity in different tumorous transformation of the endometrium do not give characteristic distinctions and go not reflect severity of the disease but correlations of fractions of immunocompetent cells are significant for evaluation of the disease prognosis. The proposed index of tumour-specific reactivity (ITSR) is a quotient of division the percentage content of natural killers (NK) and T-cells (in the numerator) and percentage contents of Tx (in the denominator). The comparative analysis of the immune response in patients with tumorous diseases of the endometrium showed that ITSR average meaning in a group of patients with tumors statistically reliably (p=0.0053) exceeded ITSR for a group of the examined patients who did not have a diagnosed tumor. A group of patients with oncological pathology have average relative contents of cells with the phenotype CD3+CD8+ (T-suppressors/cytotoxic cells) and general percentage of lymphocytes exceeding the same indices for patients with non-oncologic profile and patients of the control group. The presence of endometrium tumor correlated with increased amount of NK-cells in blood and reduction of relative content of T-helpers compared with control. In group of patients with the complicated family oncologic anamnesis the uterine cancer incidence rate is reliably (15.8 %) higher than the tumorous pathology of another localization incidence rate. The level of spontaneous chromosome aberrations in patients with the glandular hyperplasia is reliably lower (7.1 %) than in patients with atypical hyperplasia (29.9 %) and adenocarcinoma of the endometrium (26.5 %). On the ground of the carried out research of metaphase plates of peripheral blood lymphocytes of patients with different types of tumorous transformation 30 sites of chromosome fragility were revealed. There were found four sites of fragility 1q2.5-4.1; 2q2.4-31; 4q1.5; 5q1.4 in the chromosome apparatus of patients with atypical hyperplasia and adenocarcinoma of the endometrium both with complicated family oncologic history and without it while one site 17q2.2 was only in patients with complicated family oncologic history that was evidence of genetic determination and polygenic nature of tumorous pathology of the endometrium. The molecular-genetic studies give evidence of changes in the groups of oncogenes, genes-suppressors, genes of steroid receptors and steroid genesis and genes of the detoxication system. The comparative analysis of sanogenetic profile of patients with atypical hyperplasia and adenocarcinoma of the endometrium did not reveal reliable discrepancies between the groups. The sanogenetic profile of practically healthy women was reliably (p<0.05) higher than that in other studied groups. There were revealed disturbances at the genetic chromosome, tissue and systemic levels that gave a possibility to consider tumorous diseases of the endometrium as disregulation pathology, and proposed preclinical diagnostic criteria of their development (fragile sites, microsatellite instability, index of tumour reactivity, activity of NO-syntase, state of the receptor apparatus of the endometrium). They deepen conceptions of cancerogenesis mechanism and may be applied in specialized clinical institutions. The only possibility of individual prognosis of occurance and development variant of the tumorous process of the endometrium is application of DNA-biochip that combines all possible genes that effect the occurance and development of tumorous of the endometrium.
Key words: diagnosis, prognosis, endometrium, tumorous diseases.