Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА
удк 612.014.42:612.31:591.431.2
Роль ендоплазматичного ретикулуму
у регуляції внутрішньоклітинної Са+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози
.00.13 –фізіологія людини і тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент
Федірко Наталія Вікторівна,
Львівський національний університет імені Івана Франка
Міністерства освіти і науки України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Рибальченко Володимир Корнійович,
завідувач лабораторії мембранології
Київського національного університету імені
Тараса Шевченка
доктор біологічних наук
Янчій Роман Іванович,
провідний науковий співробітник відділу імунології та
цитотоксичних сироваток
Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України
Провідна установа: Науково-дослідний інститут фармакології та токсикології
АМН України, м. Київ
Захист відбудеться “ 26 ” грудня 2005 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 321.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.
Автореферат розісланий “ 13 ” листопада 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради К 35.051.14,
кандидат біологічних наук, доцент _____________________________ Манько В.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Основною функцією слинних залоз є синтез та секреція слини –секрету, який забезпечує підтримання фізіологічного стану органів ротової порожнини, нормальний перебіг процесу травлення, містить біологічно-активні речовини, а відтак відіграє важливу роль у життєдіяльності організму людини і тварин. Зменшення слиновиділення та патологічні зміни складу слини підвищують ризик патологій слизової оболонки ротової порожнини та органів травлення, захворювань зубів, порушення мовлення та ін. Внутрішньоклітинні механізми, які опосередковують процеси пов’язані із слиновиділенням, залишаються остаточно не з’ясованими, тому дослідження шляхів регуляції функцій слинних залоз має важливе значення для сучасної фізіології та медицини.
Функціонування слинних залоз перебуває під контролем симпатичної та парасимпатичної іннервації, а секреція білкового та рідинного компонентів слини реалізуються різними сигнальними механізмами: цАМФ-генеруючим та Са+-мобілізуючим (Ambudkar et al., 2000; Melvin et al., 2005). Зокрема, секреція рідкого компоненту слини ацинарними клітинами підщелепної слинної залози знаходиться виключно під холінергічним контролем, який опосередковується шляхом підвищення концентрації іонізованого кальцію у цитоплазмі ([Са+]i)клітин (Putney, 1986; Baum et al., 1993; Cook et al., 1999; Skryma, 2000). В екзокринних клітинах основним механізмом підвищення [Са+]i є його вивільнення із внутрішньоклітинних депо, зокрема, ендоплазматичного ретикулуму (ЕР), та, як наслідок, активації надходження Са+ ззовні (Park et al., 1999; Williams, 2001; Федірко Н.В. та співавт., 2001; Petersen, 2002). Таким чином, оскільки первинною ланкою в ініціації [Са+]i-сигналів, які запускають секрецію, є вивільнення Са+ з ЕР, актуальною проблемою сучасної фізіології є детальне дослідження механізмів активації та регуляції цього процесу.
Необхідною умовою вивільнення Са+ з ЕР, що відіграє ключову роль у [Са+]i-сигналізації, є підтримання високої концентрації Са+ в ЕР ([Са+]EР). Відомо, що зменшення [Са+]EР призводить до розвитку „ЕР-стресу”, що проявляється порушенням [Са+]i-сигналізації, накопиченням секреторних білків внаслідок припинення їх виведення з ЕР та пригніченням синтезу і процессінгу білків, що може бути причиною загибелі клітини (Skryma, 2000; Siman et al., 2001; Waris et al., 2002). Однак, на сьогодні остаточно не з’ясованими є не лише механізми виникнення „ЕР-стресу”, але і особливості перебігу Са+-сигналізації в ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози за фізіологічних умов. Для виявлення ролі ЕР у [Са+]i-сигналізації важливим є проведення комплексного дослідження механізмів її перебігу в ЕР на пермеабілізованих клітинах та вкладу депонованого Са+ у [Са+]i-сигналізацію в інтактних клітинах підщелепної слинної залози.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у рамках науково-дослідної держбюджетної теми БЛ-114Ф “Механізми Са+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872 та за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні функціонування Са+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та з’ясуванню особливостей їх регуляції.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
Об’єкт досліджень –[Са+]і-сигналізація в екзокринних секреторних клітинах.
Предмет досліджень –функціонування та регуляція Са+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са+ ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів.
Методи досліджень –для досягнення поставленої мети використовували біофізичні, біохімічні, статистичні методи досліджень, а також метод електронної мікроскопії.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження механізмів функціонування Са+-каналів мембрани ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів та їх взаємодії з іншими Са+-транспортними системами. Розроблено експериментальні моделі для проведення прямої реєстрації концентрації Са2+ всередині внутрішньоклітинних органел пермеабілізованих ацинарних клітин і доведено адекватність їх використання для дослідження механізмів функціонування Са+-транспортних систем. Вперше проведено реєстрацію зміни [Са+]ЕР в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози при активації InsP-чутливих рецепторів та досліджено механізми модуляції їх активності. Зареєстровано зменшення [Са+]ЕР в ацинарних клітинах при активації ріанодин-чутливих рецепторів та вперше доведено їх вклад у [Ca+]i-сигналізацію у досліджуваних клітинах. Виявлено наявність процесу швидкого захоплення Са+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, за участю мітохондрій (МХ). На основі змін [Ca+]iта [Са+]ЕР, а також даних електронної мікроскопії постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації МХ, Са+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів [Ca+]i-сигналізації. Встановлено, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози транслоконовий комплекс є основним шляхом пасивного витоку Са+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози і вперше виявлено роль МХ у його регуляції. Показано локалізацію МХ безпосередньо під плазматичною мембраною (ПМ) у базальному полюсі ацинарних клітин, що визначає їх важливу роль у підтриманні депо-керованого входу Са+.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють уявлення щодо механізмів функціонування Са+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин слинних залоз. Вони можуть бути теоретичною основою для подальших досліджень механізмів Са+-сигналізації у секреторних клітинах, причин і розвитку патологій травних залоз та розробки методів їх фармакологічної корекції, тому мають значення для медицини і ветеринарії. Отримані дані використовуються при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і тварин”, „Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні механізми регуляції обміну речовин” у Львівському національному університеті імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукового керівника, у плануванні напрямків досліджень, розробці методик пермеабілізації ПМ ацинарних клітин, вимірювання концентрацій іонізованого кальцію у цитоплазмі та ЕР, аналізі одержаних результатів, формулюванні висновків.
У роботі використано обладнання, надане старшим науковим співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України д.б.н. Войтенко Н.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України к.б.н. Півневою Т.А.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, включені до дисертації, були представлені на: VII міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2003 р.), I з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), науково-практичній конференції “Сечєнов та Одеська школа фізіологів” (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO “Receptors, Channels, Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській науковій конференції “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики” (Xapків, 2004 р.), Міжнародній конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004 р.), регіональному біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), XXXV Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Сан-Дієго, США, 2005 р.), III Конференції товариства нейронаук (Донецьк, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному конгресі (Монтпельєр, Франція, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології людини і тварин (2002-2005 рр.), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету у липні 2005 р.
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200 сторінках і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновки та список використаної літератури з 313 джерел. Робота ілюстрована 81 рисунком і 7 таблицями.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 1,5 міс. Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком експерименту тварину наркотизували ін’єкцією кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали канюлею, якy впритул підводили до проток підщелепної слинної залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, α-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка та концентрації Са+.
Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 270 од/мг), протягом 25-30 хв (35 оС). Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (у ммоль/л): NaCl –; KCl –,7; CaCl –,3; MgCl –,0; гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) –; глюкоза –ммоль/л; рН 7,4.
Визначеннясумарного вмісту Са+ у клітинах та секреції ними білка. Сумарний вміст Са+ в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу полягає у тому, що Са+ утворює з арсеназо III комплекс синього кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са+ у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.
Вимірювання [Са+]iв ацинарних клітинах. [Са+]i в ацинарних клітинах реєстрували з використанням мембранно-проникної форми флуоресцентного Са+-барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкмоль/л фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35ºС, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника. Для точного визначення [Ca+]i використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd · B · (R –Rmin) / (Rmax–R).
Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9, Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нмоль/л (Grynkiewicz et al., 1985).
Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Ацинарні клітини пермеабілізували дигітоніном та -есцином. Робочу концентрацію детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально. Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до внутрішньоклітинного середовища (НДВ), який містив (у ммоль/л): KCl –; NaCl –; MgSO –; HEPES –; АТР –; EGTA –; CaCl –,75; рН 7,2. Концентрація іонізованого Са+, розрахована за допомогою програми “WinMAXC v2.10”, у такому НДВ-розчині становила ~250 нмоль/л. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах, за виключенням окремо згадуваних, з -есцином (40 мкг/мл) –-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом, а у випадку маг-фура 2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са+-барвника.
Визначення [Ca+]ЕР у секреторних клітинах. Для моніторингу концентрації Са+ в ЕР, ацинарні клітини завантажували мембранно-проникною формою низько-афінного флуоресцентного Са+-барвника маг-фура 2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60 хв при 37С, що забезпечує компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Зміни [Ca+]ЕР виражали не як абсолютне значення, а як співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F/F) і оцінювали як прямо пропорційні до змін співвідношення F/F(Hofer & Machen, 1994).
Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували протягом 12 год при 20С у суміші розчинів глютаральдегіду (2 %) та параформальдегіду (2 %), приготовлених на 0,1 моль/л фосфатному буфері (рН 7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1 % розчині OsOу фосфатному буфері протягом 1 год при кімнатній температурі. Зразки зневоднювали у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із збільшенням 5000 –40000.
Оригінальні записи [Ca+]і та [Ca+]ЕР опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичну обробку результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення F/Fпроводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
1. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів при активації холінорецепторів
Для з’ясування кальцієвої залежності функціональних відповідей секреторних клітин слинних залоз ми досліджували ефекти активації холінорецепторів in vivo та in vitro. Встановлено (табл.1) виражене зростання швидкості слиновиділення та білково-ферментного вмісту слини після внутрішньочеревного введення тваринам М-холіноміметиків –карбахолу (2 мкг/кг) та пілокарпіну (2 мг/кг). Агоніст Н-холінорецепторів цитизин (2 мг/кг) спричиняв підвищення лише амілолітичної активності слини на 88 ± 9 % (n=10; р<0,01), тоді як швидкість слиновиділення зменшувалась на 51 ± 8 % (n=12; р<0,001). Блокування холінорецепторів атропіном (2 мкг/кг) супроводжувалось зменшенням швидкості слиновиділення на 74 ± 6 % (n=17; р<0,001) та амілолітичної активності слини –на 73 ± 9 % (n=13; р<0,001), а при попередньому його введенні атропін повністю елімінував стимулюючий ефект агоністів.
Одержані результати підтверджують важливу функціональну роль М-холінорецепторів у стимуляції секреції рідинного компоненту слини підщелепною слинною залозою, а також вперше показують фізіологічну роль Н-холінорецепторів, при активації яких відбувається пригнічення секреції рідкої слини, а виділяється невелика кількість слини з високим вмістом ферментів.
Виведення Са+ є важливим компонентом стимульованої секреції екзокринними клітинами і може бути зумовлено як активацією секреції електролітів, так і виведенням Са+ разом із вмістом секреторних гранул (Liu et al., 1998). Підтвердженням цього є підвищення концентрації Са+ у секретованій слині на 245 ± 21 % (n=8, p<0,001) при стимуляції пілокарпіном, яке не спостерігалось після попередньої атропінізації тварин. В той же час активація М-холінорецепторів in vitro супроводжувалась підвищенням сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах, яке також повністю елімінувалось атропіном. Зокрема, при дії АХ (5 мкмоль/л) вміст кальцію у клітинах підвищувався на 80 ± 8 % (n=7; р<0,01), карбахолу (5 мкмоль/л) –на 60 ± 7 % (n=7; р<0,01), пілокарпіну (5 мкмоль/л) –на 22 ± 3 % (n=6; р<0,01). Отже, зміни слиновиділення in vivo та вмісту кальцію у клітинах in vitro свідчать про те, що холінергічна стимуляція слиновиділення підщелепною слинною залозою опосередковується змінами Са+-гомеостазу в ацинарних клітинах.
2. Пермеабілізовані клітини як модель для вивчення Са+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел
Оскільки секреція екзокринними клітинами ініціюється підвищенням [Са+]і, опосередкованим, в основному, вивільненням Са+ з ЕР, то для дослідження функціонування Са+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ми пермеабілізували ПМ клітини з використанням неіонних детергентів дигітоніну та -есцину. Виявилось, що ефекти дигітоніну на вміст сумарного кальцію у пермеабілізованих клітинах та білка у середовищі їх інкубування (як інтегрального показника секреції) виражено залежали від концентрації детергенту та часу його дії.
Дигітонін викликав двохфазне підвищення вмісту загального білка: у концентрації 20 мкг/мл –на 10 1,3 % (n=7; p<0,05) та у концентрації 100 мкг/мл і вище –на 17 2 % (n=7; p<0,01). Динаміка змін сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка мала дзвоноподібний вигляд з максимумом при концентрації дигітоніну 20-50 мкг/мл протягом перших 5 хв його дії. Вже через 2,5 хв дії 20 мкг/мл дигітоніну вміст білка зростав на 21 ± 0,2 % (n=6, p<0,001), сумарний кальцій –на 48 ± 16 % (n=6; р<0,05). Таке підвищення обумовлено дигітонін-індукованим порушенням ПМ та вивільненням вмісту секреторних гранул, а також накопиченням кальцію в ЕР за рахунок роботи Са+-АТФази у АТФ-вмісному НДВ-розчині. Низхідна гілка кривої, отримана при більш тривалій інкубації клітин з дигітоніном (5-15 хв) чи високими його концентраціями (50-200 мкг/мл), обумовлена порушенням цілісності мембран внутрішньоклітинних органел та втратою ними білків і Са+.
Підтвердженням ефективної пермеабілізації ПМ дигітоніном (20 мкг/мл) є вимивання флуоресцентних Са+-барвників із цитоплазми та зниження інтенсивності флуоресцентного сигналу у пермеабілізованих клітинах. У випадку фура 2/АМ сигнал падав практично до фонового рівня, у випадку маг-фура 2/АМ –зменшувався в середньому на 60-80 % від початкового, решта (40-20 %) відображає світіння барвника всередині депо Са+ (рис.1). Подальша перфузія клітин НДВ-розчином, який містив 3 ммоль/л АТФ, супроводжувалась зростанням співвідношення F/F (рис.1), що відповідає підвищенню [Ca+]ЕР, тоді як за відсутності АТФ, як і при дії тапсигаргіну, спостерігалось зменшення [Ca+]ЕР. Таким чином, тапсигаргін-інгібована АТФ-залежна акумуляція Са+ у депо ЕР свідчить про функціональну цілісність ЕР після обробки клітин дигітоніном.
Для вивчення процесів [Ca+]і-сигналізації при активації рецепторів ПМ ми розробили модель пермеабілізації клітини за допомогою b-есцину. Так, пермеабілізовані b-есцином клітини, як і оброблені дигітоніном, здійснюють АТФ-залежне накопичення Са+ в ЕР, а підтвердженням того, що b-есцин не порушує цілісності рецептор-зв’язаних сигнальних шляхів, є зареєстрований [Ca+]ЕР-транзиєнт при дії АХ (рис.2). Отже, пермеабілізовані клітини є адекватною моделлю як дослідження механізмів підтримання гомеостазу Са+ у внутрішньоклітинних депо (дигітонінова модель), так і ролі ЕР у [Ca+]і-сигналізації (b-есцинова модель).
3. Функціонування тапсигаргін-чутливого та -нечутливого депо Са+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
Для виявлення гетерогенності внутрішньоклітинних депо Са+ в ацинарних клітинах ми підібрали умови максимального спустошення ЕР тапсигаргіном та АХ. При дослідженні динаміки тапсигаргін-індукованих змін сумарного вмісту кальцію в інтактних клітинах виявлено підвищення вмісту кальцію у кальцієвмісному середовищі та зменшення –у безкальцієвому. Максимальним ефект тапсигаргіну (0,1 мкмоль/л) був після 20-ти хвилин його дії як в інтактних, так і у пермеабілізованих ацинарних клітинах. При цьому кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні Са+-АТФази ЕР, складало ~ 30 % від загального його вмісту у депо. АХ (5 мкмоль/л), як і тапсигаргін, викликав подібні зміни сумарного вмісту кальцію в інтактних та пермеабілізованих клітинах, однак ефект АХ максимальним був після 10 хв його дії.
Для з’ясування того, чи мішенню дії тапсигаргіну і АХ є одне і те ж депо Са+, клітини попередньо преінкубували 20 хв з тапсигаргіном, після чого інкубували 10 хв з АХ. Виявилось, що після спустошення депо тапсигаргіном АХ (5 мкмоль/л) викликав додаткове підвищення сумарного вмісту кальцію ще на 38 3 % (р<0,01; n=8) в інтактних клітинах (рис.3А) і зменшення ще на 38 7 % (р<0,01; n=9) –у пермеабілізованих (рис.3Б), яке повністю елімінувалось гепарином –блокатором ІnsР-чутливого вивільнення Са+.
У зафарбованих фура 2/AM клітинах тапсигаргін викликав підвищення [Ca+]і, максимальне на 20 хв дії, яке у кальцієвмісному середовищі було платоподібним з амплітудою 112 ± 11 нмоль (n=8, рис.4), а у безкальцієвому –транзиєнтного характеру (амплітуда 51 ± 14 нмоль/л (n=6). При аплікаціях АХ на фоні тапсигаргіну зареєстровано градуальне зменшення амплітуди [Ca+]і-транзиєнтів у кальцієвмісному (рис. 4) та безкальцієвому розчинах. Додаткове підвищення Са+ (сумарного та іонізованого), свідчить про те, що тапсигаргін не повністю спустошує ІnsР-чутливе депо Са+.
Прямим доказом наявності тапсигаргін-нечутливого депо Са+ є зменшення [Ca+]ЕР при дії окремо АХ, ванадату (блокатору Са+-АТФаз широкого спектру дії) чи іономіцину (іонофору, який призводить до вивільнення Са+ у рецептор- та енергонезалежний спосіб) після попереднього спустошення ЕР тапсигаргіном. Зокрема, тапсигаргін (3 мкмоль/л) викликав зменшення [Ca+]ЕР на 0,045 ± 0,006 (n=12), а наступна аплікація 100 мкмоль/л ванадату на фоні тапсигаргіну супроводжувалась подальшим зменшенням F/Fще на 0,042 ± 0,008 (n=6). Характерно, що ефекту АХ не спостерігалось після спустошення депо тапсигаргіном та ванадатом, тоді як на фоні лише тапсигаргіну АХ (5 мкмоль/л), як і іономіцин (10 мкмоль/л), викликав виражене зменшення [Ca+]ЕР.
Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонує тапсигаргін-чутливе та тапсигаргін-нечутливе депо Са+, обоє з яких є ІnsР-залежними.
4. Властивості та регуляція інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів ацинарних клітин підщелепної слинної залози
У незбудливих клітинах вивільнення Ca+ через InsP-рецептор відіграє основну роль у визначенні просторово-часових параметрів Ca+-сигналізації (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002). Для з’ясування механізмів ІnsР-чутливого вивільнення Са+ ми провели реєстрацію зміни [Са+]ЕР при активації холінорецепторів ПМ АХ та безпосередньо InsP-рецепторів екзогенним InsP.
Амплітуда АХ-індукованого [Ca+]ЕР-транзиєнту становила 0,1 ± 0,02, розрахований час напівспаду –± 2 с (n=23, р<0,001, рис.2). Викликана InsP [Ca+]ЕР-відповідь прямо залежала від концентрації агоніста з ефективною концентрацією InsP(ЕС) –,3 мкмоль/л. Зменшення [Ca+]ЕР при дії АХ та InsP ефективно блокувалось гепарином, отже, опосередковане активацією тільки InsP-рецепторів. Для дослідження залежності ІnsР-індукованого зменшення [Ca+]ЕР від цитозольного кальцію [Ca+]і у НДВ-розчині фіксували на рівні 30, 100, 400 і 2000 нмоль/л. Викликане ІnsР (1, 3, 5 мкмоль/л) зменшення [Ca+]ЕР потенціювалося Ca+ при фізіологічних його концентраціях (100-400 нмоль/л), а подальше підвищення [Са+]і інгібувало вивільнення Ca+ (табл. 2).
Для багатьох об’єктів показано, що активність ІnsР-рецептора, подібно до [Са+]і,модулюється АТФ (Ferris & Snyder, 1992; Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). З’ясувалось, що в ацинарних клітинах ефект АТФ на ІnsР-індуковане зменшення [Ca+]ЕР залежить від концентрації АТФ: є позитивно кооперативним при низьких концентраціях та негативно кооперативним –при високих. Зокрема, за наявності у НДВ-розчині 0,5, 1 та 2 ммоль/л АТФ амплітуда ІnsР-індукованого [Са+]ЕР-транзиєнту зростала на 14 ± 1 %, 27 ± 5 % та 28 ± 6 % (n=6), порівняно з таким при 3 ммоль/л АТФ. У присутності 10 і 20 ммоль/л АТФ спостерігалось, навпаки, зменшення [Са+]ЕР-відповіді на 5 ± 0,3 % (p<0,05) та 15 ± 3 % (n=6, p<0,01).
Виявлено також здатність кофеїну (4 ммоль/л) пригнічувати InsP-індуковане вивільнення Са+ на 11 ± 3 % (n=9, p<0,05), що, однак, не спостерігалось при дії InsP у субмаксимальній концентрації (20 мкмоль/л). Пригнічуючого ефекту кофеїну не спостерігалось і в присутності АТФ (1 ммоль/л), навпаки –потенціювання InsP-індукованого зменшення [Ca+]ЕРна 65 ± 12 % (р<0,01; n=8), порівняно до такого без АТФ.
Отже, активація ІnsP-рецепторів індукує дозозалежне вивільнення Ca+ з ЕР, яке є максимальним при значенні [Са+]і у фізіологічних межах, пригнічується кофеїном та модулюється АТФ.
5. [Cа+]і-сигналізація при активації ріанодинових рецепторів секреторних клітин підщелепної слинної залози
Молекулярно-біологічними дослідженнями виявлено (Giannini et al., 1995) наявність у тканині підщелепної слинної залози мРНК, відповідальної за експресію ріанодинових рецепторів та доведено (Lee et al., 1997) їх наявність в ацинарних клітинах цієї залози. З іншого боку, при активації ріанодинових рецепторів не виявлено змін [Cа+]і (Seo et al., 1997), тому питання їх функціональної активності в ацинарних клітинах слинних залоз залишається відкритим.
Підтвердження функціонування ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах. З’ясувалось, що у пермеабілізованих ацинарних клітинах кофеїн викликає дозозалежне зменшення в них сумарного вмісту кальцію на 20 5 %, 31 7 % та 42 7,5 % (p<0,05; n=10) при дії відповідно 0,2, 0,5 та 1 ммоль/л кофеїну та 77 5 %, 81 10 %, 86 11,5 %, 89 3 % (p<0,01; n=3) при підвищенні концентрації кофеїну до 10, 20, 30 та 40 ммоль/л. Шляхом реєстрації зміни [Ca+]ЕР нами показано кофеїн-індуковане зменшення [Ca+]ЕР (ЕС по кофеїну становить 7,3 ммоль/л), яке було нечутливим до гепарину, а, отже, не опосередковується активацією ІnsP-рецепторів. Кофеїн-індуковане зменшення [Ca+]ЕР блокувалося високими концентраціями ріанодину (100 мкмоль/л, рис.5А) та потенціювалось ріанодином у середніх концентраціях (10 мкмоль/л, рис.5Б), що є класичними ознаками ріанодинового рецептора. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально-активні ріанодин-чутливі рецептори.
Зміни [Cа+]і при активації ріанодинових рецепторів. При аплікації кофеїну (10-40 ммоль/л) до інтактних ацинарних клітин нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не виявлено достовірних змін [Ca+]i, причому, відсутність [Ca+]і-відповіді не пов’язана із спустошенням депо Ca+, оскільки наступна аплікація АХ супроводжувалась генерацією [Ca+]і-транзиєнту значної амплітуди. Змін [Ca2+]i не спостерігалось також при аплікації кофеїну на фоні блокування Са+-АТФаз ПМ чи Са+-АТФаз ЕР, лише при заблокованих МХ кофеїн (30 ммоль/л) викликав незначне підвищення [Ca+]i на 48 4 нмоль/л (n=8, p<0,001). Оскільки таке підвищення [Ca+]i не відповідало кофеїн-індукованому [Ca+]ЕР-транзиєнту, ми припустили можливість швидкого виведення Са+ із цитоплазми системами активного його транспорту. Дійсно, генерація [Ca+]i-транзиєнту при дії кофеїну спостерігалась лише при одночасному попарному блокуванні МХ разом з Са+-АТФазою ПМ чи МХ і Са+-АТФазою ЕР. Амплітуда кофеїн-індукованого [Ca+]i-транзиєнту на фоні ванадату (10 мкмоль/л) та СССР (10 мкмоль/л) становила 176 68 нмоль/л (n=6, p<0,001), тапсигаргіну (3 мкмоль/л) та СССР – 40 нмоль/л (n=6, p<0,001).
Отже, ріанодинові рецептори, очевидно, просторово колокалізовані з МХ та Са+-АТФазами. При цьому Са+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, практично повністю захоплюється МХ, оскільки прикладання 10 мкмоль/л СССР одразу після кофеїну супроводжувалось різким викидом Са+ з МХ і зростанням [Ca+]i на 184 39 нмоль/л (n=5, p<0,001, рис. 6).
Електронно-мікроскопічний аналіз розташування мітохондрій в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Дослідження ультраструктури клітин підщелепної слинної залози щурів виявило локалізацію МХ у безпосередній близькості до ЕР, більше того, оточення МХ ламелами ЕР (рис.7В). У 36 досліджуваних клітинах щільність МХ, розташованих біля ЕР, була вищою, ніж в інших регіонах клітини, а форма МХ, оточених ламелами, –більш витягнутою, порівняно з іншими МХ, що може бути обумовлено збільшенням площі контакту між мембранами органел. Таким чином, близьке розташування МХ біля ЕР підтверджує припущення про їх колокалізацію із структурами ЕР та свідчить про можливість контактів між Ca+-транспортними системами ЕР і МХ.
В ацинарних клітинах підщелепної слинної залози спостерігалося також характерне угрупування МХ у базальному полюсі клітини (рис.7Б). З огляду на те, що МХ переважно локалізуються в областях підвищення [Ca+]i, ми припускаємо, що група МХ в області між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca+ через депо-керовані Са+-канали ПМ.
6. Базальний витік Са+ з ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози
У стані спокою [Ca+]ЕР підтримується шляхом активного захоплення кальцію Са+-АТФазою ЕР на фоні його стаціонарного пасивного витоку (Hofer et al.,1999). Витік Са+ є характерною особливістю ЕР, однак у клітинах слинних залоз залишається невивченим. Для візуалізації та дослідження механізмів пасивного витоку Са+ ми провели: i) перфузію ацинарних клітин безкальцієвим НДВ-розчином (1 ммоль/л EГTA) для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму роботи Са+-АТФази ЕР; ii) блокування обох режимів роботи Са+-АТФази ЕР тапсигаргіном.
Сумарний вміст кальцію у пермеабілізованих клітинах зменшувався після тривалого (20 хв) інкубування їх у безкальцієвому НДВ-розчині на 30 4 %, з тапсигаргіном ([Ca+]і=100нмоль/л) –на 29 4 %, з тапсигаргіном у безкальцієвому НДВ-розчині –на 36 6,5 % (p<0,01; n=8). За цих умов зареєстровано також зменшення [Ca+]ЕР. Аналіз амплітуди зменшення F/F, характеристичного часу (), розрахованого шляхом апроксимації зміни F/Fза допомогою експоненти, та лінійної швидкості показав наявність SERCA-залежного та -незалежного компонентів пасивного витоку Са+ (табл.3). Причому, переважаючим є витік Са+ не опосередкований роботою Са+-АТФази ЕР, тоді як SERCA-залежне виведення Са+ шляхом реверсивного режиму роботи становить близько ~ 35 %.
Відповідно, можна припустити, що витік Са+ з ЕР здійснюється через Са+-канали InsP- і ріанодинового рецепторів, однак, зменшення [Ca+]ЕР було нечутливим до гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкмоль/л), але дозозалежно потенціювалося пуроміцином –інгібітором синтезу білка. Антибіотик пуроміцин від’єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу мембрани ЕР, в результаті чого транслоконова пора стає проникною для Са+ (Simon & Blobel, 1991). Викликане пуроміцином (500 мкмоль/л) зменшення [Ca+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного та тапсигаргіну, а характеристичний час достовірно не відрізнявся від викликаного тапсигаргіном ( = 244 ± 52 с), що свідчить про те, що SERCA-незалежний витік Са+ здійснюється через транслокон. Крім того, ефект пуроміцину не спостерігався на фоні 200 мкмоль/л анізоміцину, який селективно блокує такий механізм витоку Ca+ (рис.8).
Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози базальний витік Са+ з ЕР не опосередковується Са+-каналами чи порушенням роботи Са+-АТФази, а здійснюється через пору транслоконного комплексу.
7. Дослідження депо-керованого входу Са+ у секреторні клітини підщелепної слинної залози
Єдиним відомим механізмом входу Са+ у незбудливі клітини є активація депо-керованих Са+-каналів ПМ (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), механізми активації та інактивації якого залишаються остаточно нез’ясованими. Ми вивчали, чи існує залежність між способом спустошення депо ЕР і тривалістю дії агоністів та активацією входу Са+ ззовні. Для активації входу Са+ індукували різні шляхи спустошення ЕР кальцієм: і) блокування Са+-АТФази ЕР, іі) активація ІnsР- чи ріанодинових рецепторів. Згідно проколу експерименту інтактні ацинарні клітини інкубували у безкальцієвому зовнішньоклітинному середовищі з відповідним агоністом, після чого перфузували клітини кальцієвмісним розчином.
Блокування Са+-АТФази ЕР тапсигаргіном призводило до активації потужного входу Са+ у клітини з амплітудою 186 ± 50 нмоль/л (p<0,01; n=10, табл.4, рис.10), тоді як інкубування клітин у безкальцієвому середовищі без тапсигаргіну (незалежно від тривалості), не призводило до змін [Ca+]і. Свідченням того, що зареєстрований [Ca+]і-транзиєнт опосередкований активацією депо-керованих Са+-каналів ПМ, є його пригнічення на 69 12 % (n=3) 2-аміноетоксидифеніл боратом (50 мкмоль/л) –специфічним блокатором SOC-каналів ПМ (Bootman et al., 2002).
Вхід Са+, індукований InsP-чутливим спустошенням ЕР, залежав від тривалості дії/кількості аплікацій АХ –найбільшої амплітуди був при тривалому (5 хв) спустошенні депо АХ та сумісній дії АХ і тапсигаргіну. Спустошення ріанодин-чутливого депо Са+ також активувало вхід Са+, хоча й значно меншої амплітуди. При цьому кінетика розвитку депо-керованих [Ca+]i-транзиєнтів, яка вважається показником кількості відкритих SOC-каналів, достовірно не відрізнялась між собою, незалежно від способу спустошення ЕР (агоністами чи блокаторами), що свідчить про єдиний механізм активації входу Са+ ззовні (табл.4).
Отже, спустошення ЕР активує вхід Са+ ззовні, незалежно від способу спустошення (InsP-залежного чи -незалежного), а рівень входу Са+ прямо визначається ступенем спустошення депо.
8. Роль мітохондрій у регуляції депо-керованого входу Ca+
Функціонування [Ca+]i-транспортних систем мітохондрій у стані спокою. Для з’ясування ролі Са+-уніпортеру МХ у підтриманні базального рівня [Ca+]i використовували роз’єднувач протонного градієнту на мембрані МХ карбоніл ціанід м-хлорфенілгідразон (СCCP). СССР (10 мкмоль/л) викликав підвищення [Ca+]i на 50 6,7 нмоль/л (n=8) у кальцієвмісному розчині і на 37 4 нмоль/л (n=5) –у безкальцієвому (рис.9). Для підтвердження того, що така зміна [Ca+]і обумовлена блокуванням Ca+-уніпортеру МХ, а не пригніченням роботи Ca+-АТФаз у результаті припинення МХ синтезу АТФ, використали ротенон (інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів) та олігоміцин (інгібітор АТФ-синтази), що запобігає активації реверсивного режиму роботи АТФ-синтази (Nicholls & Budd, 2000). Оскільки ефект 10 мкмоль/л ротенону та 1 мкмоль/л олігоміцину не відрізнявся від викликаного СССР, отже, підвищення [Ca+]i опосередковане блокуванням Са+-уніпортеру та вивільненням Са+ з МХ.
Основним шляхом транспорту Са+ з МХ є його виведення Na+/Ca+-обмінником (Badcock & Hille, 1998). Виявилось, що блокування Na+/Ca+-обмінника МХ селективним блокатором –CGP 37157 (20 мкмоль/л) не супроводжувалось змінами [Ca+]i(n=5). Змін [Ca+]i не виявлено також при одночасному прикладанні СССР і СGP 37157, що є свідченням того, що у спокої клітин є неактивною мітохондріальна пора проникного переміщення (permeability transition pore), яку вважають додатковим механізмом виведення Ca+ з матриксу МХ (Zoratti & Szabo, 1995).
Модуляція мітохондріями депо-керованого входу Са+. За умови блокування акумуляції Са+ мітохондріями виявлено пригнічення депо-керованого входу Са+ щонайменше вдвічі та сповільнення його кінетики, як у випадку тапсигаргін-індукованого, так і агоніст-опосередкованого спустошення ЕР (табл.4). Зокрема, на фоні СССР амплітуда депо-керованого підвищення [Ca+]i при спустошенні ЕР тапсигаргіном зменшувалась на 51 ± 15 % (p<0,01; n=5, рис. 10), АХ –на 73 ± 12 %.
При дослідженні ролі транс-мітохондріального транспорту Са+ у регуляції його входу ззовнівиявлено подібне зменшення рівня депо-керованого входу Ca+ на фоні CGP 37157. При цьому зменшувалась лише амплітуда [Ca+]i-транзиєнту (на 53 ± 11 % (p<0,01)), тоді як час напівзростання достовірно не змінювався (табл.4, рис.11). Очевидно, пригнічення входу Са+ при дії CGP 37157 не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів ПМ, а обумовлено припиненням виведення Са+ з МХ, що супроводжується відповідно пригніченням акумуляції Ca+ МХ і як наслідок –підвищенням [Ca+]i, яке, в свою чергу, призводить до Са+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ.
Отже, МХ належить важлива фізіологічна роль у підтриманні депо-керованого входу Са+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Аналіз результатів дослідження параметрів слиновиділення при активації холінорецепторів in vivo та вмісту кальцію in vitro дозволяє зробити висновок про те, що секреторна активність ацинарних клітин підщелепної слинної залози опосередкована змінами внутрішньоклітинного гомеостазу кальцію, що цілком узгоджується із даними літератури (Abe et al., 1987; Putney, 1986; Liu et al., 1998; Ambudkar, 2000). Про кальцієву залежність секреції слини свідчить як зростання концентрації Са+ у слині при холінергічній стимуляції тварин in vivo, так і підвищення сумарного вмісту кальцію у клітинах при інкубуванні їх in vitro з агоністами М-холінорецепторів. Виявлене нами виведення Са+ разом із вмістом секреторних гранул є важливим компонентом стимульованої секреції і, очевидно, служить для більш швидкого відновлення [Са+]і після завершення дії стимулу, що показано й іншими авторами (Gerasimenko et al., 1996; Martinez et al., 1996).
Основним механізмом підвищення [Ca+]і для запуску секреції ацинарними клітинами є вивільнення Са+ з ЕР, механізми якого остаточно нез’ясовані. Для дослідження перебігу та регуляції вивільнення Са+ з ЕР ми розробили методичний підхід для прямої реєстрації зміни [Ca+]ЕР. Падіння флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ при пермеабілізації клітин детергентами (дигітоніном та β-есцином) свідчить про опроникнення ПМ, тоді як підвищення [Са+]ЕР при наступній перфузії клітин АТФ-вмісним НДВ-розчином підтверджує інтактність мембрани ЕР. Більше того, зареєстрований [Ca+]ЕР-транзиєнт при аплікації АХ до β-есцин-пермеабілізованих клітин свідчить про цілісність рецептор-зв’язаних сигнальних механізмів при пермеабілізації, що показано і на пермеабілізованих панкреацитах (Lomax et al., 2000).
У секреторних клітинах основним депо Са+ є ЕР (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002), проте, здатністю депонувати та вивільняти Ca+ характеризуються також секреторні гранули, МХ (Martinez et al., 1996), ядро (Gerasimenko et al., 1995) і апарат Гольджі (Pinton et al., 1998). Виявлене нами функціонування в ацинарних клітинах тапсигаргін-нечутливого іономіцин-чутливого немітохондріального депо Са+ є фізіологічно доцільним, оскільки Са+, локалізований в інших субклітинних компонентах секреторного шляху, зокрема, апараті Гольджі, як і Са+ в ЕР, відіграє важливу роль у трансляції, транслокації та процессінгу секреторних білків (Lodish et al., 1992). Враховуючи це, ми припускаємо, що InsP-чутливе депо Са2+ наявне в апараті Гольджі.
Шляхом реєстрації [Ca+]ЕР нами показано, що АХ- та ІnsР-індуковане зменшення [Ca+]ЕР опосередковується тільки ІnsР-рецепторами. На основі цього ми вважаємо, що холінергічна стимуляція слиновиділення in vivo пов’язана виключно із активацією ІnsР-рецепторів, а опосередковане ними вивільнення Са+ з ЕР є основним механізмом запуску секреції рідкої слини. Таке ІnsР-індуковане вивільнення Са+ потенціюється цитозольним Са+ (100-400 нмоль/л), що зумовлено, очевидно, зростанням ймовірності перебування ІnsР-каналів у відкритому стані (Iino, 1990). АТФ також характеризується біфазним впливом на ІnsР-рецептор, оскільки у високих концентраціях АТФ, як і кофеїн, є конкурентним антагоністом ІnsР-зв’язуючого центру рецептора (Bezprozvanny & Ehrlich, 1993).
Ми довели наявність в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонально-активних ріанодинових рецепторів (RyR), участь яких у [Cа+]і-сигналізації залишалась нез’ясованою. Зареєстроване кофеїн-індуковане зменшення [Ca+]ЕР було транзиєнтного характеру, а його амплітуда залежала від [Cа+]і. Ріанодин (100 мкмоль/л) блокував вивільнення Ca+, а у концентрації 10 мкмоль/л –фіксував канал у відкритому стані, що є класичними характеристиками RyR (Buck et al., 1992). З іншого боку, при активації RyR не спостерігається зростання [Cа+]і в інтактних клітинах, що ми пов’язуємо із швидким захопленням Са+ мітохондріями, близька локалізація яких з ЕР виявлена електронно-мікроскопічно. Ґрунтуючись на отриманих даних, ми припускаємо скоординовану участь кількох Са+-транспортних систем у формуванні кофеїн-індукованого [Cа+]і-сигналу (рис.12): кофеїн активує RyR → Са+, що вивільняється, захоплюється МХ → виведення кальціюNa+/Са+-обмінником МХ починає переважати над процесом його захоплення Са+-уніпортером і МХ звільняються від накопиченого Са+ → активуються Са+-АТФази ПМ та ЕР, які підтримують низьку [Са+]і.
За відсутності стимуляції відбувається базальний витік Са+ з ЕР, який можна візуалізувати шляхом блокування Са+-АТФази ЕР (Hofer et al., 1996). Виявлене нами зменшення [Ca+]ЕР у безкальцієвому НДВ-розчині та при дії тапсигаргіну доводить наявність пасивного витоку Са+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Такий витік Са+ з ЕР потенціюється пуроміцином і блокується анізоміцином, а, отже, здійснюється через пору транслоконового комплексу, участь якої у забезпеченні пасивного витоку Са+ з ЕР показано на панкреацитах (Lomax et al., 2000).
Основним шляхом перезаповнення депо кальцієм після стимуляції клітин є вхід Са+ через депо-керовані Са+-канали ПМ та наступний транспорт всередину ЕР Са+-АТФазою (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), однак механізми активації та регуляції такого входу остаточно нез’ясовані. Припускають існування кількох типів SOC-каналів, які відрізняються способами активації (без зміни ІnsР та за участі ІnsР-каналів), з іншого боку, не виключають і можливості активації одного типу SOC-каналу різними шляхами (Ambudkar et al., 1992; Liu et al., 1998, 2000). На основі кількісної оцінки амплітуди та кінетики депо-керованого підвищення [Ca+]i ми дійшли висновку, що вхід Са+ в ацинарні клітини активується незалежно від способу спустошення ЕР (InsP-залежного чи -незалежного), а однакова кінетика розвитку депо-керованого [Ca+]i-транзиєнту може свідчити про єдиний механізм його активації.
Виявлене драматичне зменшення та сповільнення депо-керованого входу Са+ в ацинарні клітини при блокуванні Ca+-транспортних систем МХ доводять їх важливу фізіологічну роль у цьому процесі. На основі експериментальних даних, а також виявленого близького розташування МХ біля базальної ПМ, ми припускаємо, що Са+, який входить в ацинарні клітини при активації SOC-каналів, швидко захоплюється МХ (рис.12), що попереджує їх Са+-залежну інактивацію. Блокування Na+/Ca+-обмінника, як і Са+-уніпортеру МХ, викликає пригнічення входу Ca+, не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів. Причиною пригнічення депо-керованого входу Ca+ може бути зростання [Ca+] у МХ, що супроводжується припиненням акумуляції Са+ МХ, а це, в свою чергу, призводить до підвищення [Ca+]i та Са+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ.
На основі отриманих результатів ми пропонуємо комплексну схему (рис. 12) взаємоузгодженого функціонування Ca+-транспортних систем у забезпеченні Са+-сигналізації в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження функціонування Са+-транспортних систем мембран внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин підщелепної слинної залози та з’ясовано механізми вивільнення Са+ з ЕР, що дозволяє значно розширити уявлення про роль ЕР у Са+-сигналізації та функціонуванні секреторних клітин слинних залоз.
АНОТАЦІЇ
Копач О.В. Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції внутрішньоклітинної Са+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози. –Рукопис.
Дисертація присвячена комплексному дослідженню механізмів вивільнення Са+ із внутрішньоклітинних депо ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів.
В умовах досліду in vivo та in vitro показано кальцієву залежність секреторних відповідей ацинарних клітин підщелепної слинної залози при активації М-холінорецепторів. Розроблено експериментальні моделі для реєстрації [Са+]ЕР у пермеабілізованих ацинарних клітинах та доведено їх адекватність для дослідження гомеостазу Са+ у внутрішньоклітинних депо та Са2+-залежного екзоцитозу. Шляхом реєстрації зміни [Са+]ЕР досліджено властивості та регуляцію InsP-чутливих та ріанодинових рецепторів ЕР. Доведено участь ріанодинових рецепторів у [Ca+]i-сигналізації в ацинарних клітинах. Показано, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози основним шляхом пасивного витоку Са+ з ЕР є транслоконовий комплекс. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са+ в ацинарні клітини та виявлено важливу фізіологічну роль мітохондрій у його регуляції. Проведено ультраструктурний аналіз ацинарних клітин підщелепної слинної залози та виявлено локалізацію мітохондрій у безпосередній близькості до ЕР та у базальному полюсі клітини. Постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації мітохондрій, Са+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів [Ca+]i-сигналізації.
Ключові слова: [Са+]і-сигналізація, ендоплазматичний ретикулум, ІnsР-чутливі рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії, депо-керований вхід Са+, ацинарні клітини, підщелепна слинна залоза.
Копач О.В. Роль эндоплазматического ретикулума в регуляции внутриклеточной Са+-сигнализации и функционирования ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 –физиология человека и животных. –Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2005.
Дисертация посвящена исследованию механизмов высвобождения Са+ из внутриклеточных депо ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы крыс.
В експериментах in vivo и in vitro показано Са+-зависимость секреции ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы при активации М-холинорецепторов. Разработано экспериментальные модели для прямой регистрации [Са+]ЭР в пермеабилизированных ацинарных клетках и доказано их адекватность для исследования механизмов Са+-гомеостаза и Са+-зависимого экзоцитоза. Проведено измерение [Са+]ЭР при активации InsP- и рианодиновых рецепторов ЭР, исследовано их свойства и механизмы регуляции. Доказано участие рианодиновых рецепторов в [Ca+]i-сигнализации в ацинарных клетках. Показано, что пассивная утечка Са+ из ЭР ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы осуществляется через пору транслоконного комплекса мембраны ЭР. Проведено количественную оценку депо-управляемого входа Са+ в ацинарные клетки и установлено важную роль митохондрий в его регуляции. Электронно-микроскопический анализ ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы показал локализацию митохондрий вблизи ЭР и в базальном полюсе ацинарных клеток. Предполагается важная физиологическая роль колокализации митохондрий, Са+-АТФаз и рианодиновых рецепторов в определении пространственно-временных параметров внутриклеточной [Ca+]i-сигнализации.
Ключевые слова: [Са+]і-сигнализация, эндоплазматичний ретикулум, ІnsР-чувствительные рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии, депо-управляемый вход Са+, ацинарные клетки, подчелюстная слюнная железа.
Kopach O.V. Role of endoplasmic reticulum for the regulation of intracellular Са+signaling in acinar cells of rat submandibular salivary gland –Manuscript.
Thesis for Ph.D. degree on the specialty 03.00.13 –Human and Animals Physiology. –Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2005.
Dissertation is devoted to a complex study of Ca+ release from the intracellular Ca+ stores in acinar cells of rat submandibular salivary gland.
In vivo and in vitro experiments showed that activation of m-cholinoreceptors leaded to the complex of Ca+-dependent changes in the functioning of rat submandibular gland. Cholinergic stimulation in vivo leaded to rise of salivation rate, saliva amylase activity, protein content as well as secretion of Ca+. In vitro administration to m-cholinoreceptors agonists caused increase of total calcium content and [Ca+]i in isolated acinar cells.
Since activation of cholinoreceptors leads to release of Ca+ from the endoplasmic reticulum (ER) we have elaborated methods for direct measurements of Ca+ inside the ER. We have found that digitonin-permeabilized cells posses Са+-dependent protein secretion and ATP-dependent Са+ transport suggesting their acceptability for studying Са+-dependent exocytosis and functioning of Ca+ stores. Besides we have shown that β-escin permeabilized cells posses Ca+ release from ER upon the activation of m-cholinoreceptors.
We have elucidated heterogeneity of intracellular Ca+ stores in the acinar cells. Inhibition of Ca+ ATPase of the ER with thapsigargin (Tg) resulted in the release ~ 30 % of total ER Ca+ but subsequent application of Ach further release Ca+ from Tg-discharged stores in permeabilized cells. Thus, the acinar cells posses the ІnsP-dependent Tg-sensitive and -insensitive Ca+ stores. Exogenous ІnsP decreased [Ca+]ER with EC 1,3 0,21 M. Such a release was amplified by Са+ (100-400 nM), decreased by caffeine (2 mM). ATP (<1 mM) enhanced Ca+ release but in high concentrations –suppressed it. Inhibition of ІnsP-induced Ca+ release by caffeine was eliminated by high concentration of InsP (20 M) and ATP (1 mM) indicating caffeine competition with InsP receptor domains.
We also established a contribution of ryanodine receptors (RyRs) to the Са+ signaling in acinar cells. Caffeine-induced decrease of [Ca+]ER in permeabilized cells (ЕС = 7.3 ± 1.1 мМ) was insensitive to heparin and blocked by ryanodine (100 М). Although in the intact cells, caffeine (10-30 mM) did not cause any changes of [Ca2+]i. [Ca+]і transient appealed when caffeine was applied under the pair-blocked mitochondria and SERCA or PMCA. We also shown that addition of CCCP following the caffeine application leaded to a rapid increase [Ca+]і. Thus, on the base of data obtained and electron-microscopy data we suggest that mitochondria entirely captures Са+ released during activation of RyRs.
We elucidated passive Ca+ leak from the ER of acinar cells. Such Са+ leak is not mediated by InsP- or RyRs receptors. Puromycin (0,1–1 mM), that removes nascent polypeptides from ribosomes, increased Са+ leak independently of SERCA, InsP-or RyRs receptors. Thus, we conclude that passive Са+ leak from ER in acinar cells occurs through a translocon pore in ER membrane.
Store-operated Ca+ entry is a major pathway for refilling of ER that’s activated by emptying of intracellular Ca+ stores. We have shown that emptying the stores by Tg or ACh leaded to activation of Ca+ entry. We also found that mitochondria are required to support of Ca+ entry in the acinar cells. The rate of Ca+ influx and amplitude of [Ca+]і transient were significantly lower when mitochondrial Ca+ accumulated was prevented. Besides, inhibition of mitochondrial Ca+ release also suppressed of store-operated [Ca+]і rise. We concluded that trans-mitochondrial Ca+ transport could have a crucial physiological role for support store-operated Ca+ entry into acinar cells of rat submandibular salivary gland.
Кey words: [Са+]і signaling, endoplasmic reticulum, ІnsР-receptors, ryanodine receptors, mitochondria, store-operated Са+entry, acinar cells, submandibular salivary gland.
Підписано до друку 5.11. 2005 р.
Формат 60×90/16. Друк на різографі. Папір офсетний.
Умовних друк. арк. 1,0. Тираж 100 прим. Замовл. № 27
ПП „Арк-Сервіс”
м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, к.3