Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
На правах рукописи
РЫВКИН Александр Михайлович
ЭЛЕКТРОННО-КОНФОРМАЦИОННАЯ ТЕОРИЯ СТОХАСТИЧЕСКОЙ ДИНАМИКИ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СЕРДЕЧНОЙ КЛЕТКИ
03.01.02 – Биофизика
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Пущино – 2013
|
[1] [2] Введение
[3] [3.1] 1.1 Механизмы сокращения клеток сердечной мышцы [3.2] 1.2 Рианодиновый рецептор – основной элемент управления кальциевой динамикой в клетке [3.3] 1.3 Эксперименты по изучению изолированных RyR-каналов [3.4] 1.4 Модели функционирования RyR-каналов [3.4.1] Стохастическая динамика и электронно-конформационные взаимодействия в белках [3.5] 1.5 Кооперативная динамика группы RyR-каналов. Са2+-высвобождающая единица [3.6] 1.6 Локальные высвобождения Са2+ в кардиомиоцитах [3.7] 1.8. Теория локального контроля [3.8] 1.9 Моделирование активности клеток водителей сердечного ритма [3.8.1] 1.9.1 Современные представления об авторитмической активности пейсмейкеров [3.8.2] 1.9.2 Концепция внутренних Са2+-«часов» [3.8.3] 1.9.3 Модель Мальцева-Лакатты
[4] [4.1] 2.1 Электронно-конформационная модель RyR-канала [4.1.1] 2.1.1 Гамильтониан канала [4.1.2] 2.1.2. Конформационный потенциал [4.1.3] 2.1.3 Влияние уровня trans[Ca] на форму конформационного потенциала RyR-канала [4.1.4] 2.1.4. Структурные изменения канала в электронно-конформационной модели [4.1.5] 2.1.5 Динамика конформационной координаты [4.1.6] 2.1.6 Динамика электронной степени свободы [4.1.7] 2.1.7 Инактивационое состояние RyR-канала [4.1.8] 2.1.8. Зависимость вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-части [4.1.9] 2.1.9 Эффекты туннелирования [4.1.10] 2.1.10 Проницаемость RyR-канала [4.2] 2.2 Математическая модель Са2+ высвобождающей единицы [4.2.1] 2.2.1 Электронно-конформационная модель решетки RyR-каналов [4.2.1.1] 2.2.1.1 Гамильтониан решетки RyR-каналов [4.2.2] 2.2.2 Схема динамики RyR-каналов в решетке высвобождающей единицы [4.2.3] 2.2.3 Сопряжение динамики RyR-каналов с динамикой кальция в отделах высвобождающей единицы [4.2.4] 2.2.4 Модель Са2+-высвобождающей единицы [4.3] 2.3 Методы численной реализации модели [4.3.1] 2.3.1 Метод Эйлера-Марайамы [4.3.2] 2.3.2 Реализация электронных и туннельных переходов. Метод Монте-Карло [4.3.3] 2.3.3 Численная схема для ЭК-модели RyR-канала [4.4] 2.4 Описание программного комплекса [4.5] 2.5 Заключение
[5] [5.1] 3.1 Анализ временных зависимостей конформационной координаты Q [5.2] 3.2 Медленная конформационная динамика RyR-канала [5.2.1] 3.2.1 Параметр эффективного трения Г. Конформационная динамика RyR-канала [5.2.2] 3.2.2 Влияние коэффициента упругости канала K на форму конформационного потенциала [5.2.3] 3.2.3 Зависимость конформационного потенциала от параметра электронно-конформационного взаимодействия а [5.3] 3.3 Стохастическая динамика RyR-канала. Быстрые переходы [5.3.1] 3.3.1 Кинетические характеристики динамики RyR-канала [5.3.2] 3.3.2 Зависимость вероятности электронных переходов от cis[Ca] [5.4] 3.4 Активация одиночного канала [5.5] 3.5 Исследование процесса закрытия RyR-канала [5.6] 3.6 Процесс адаптации RyR-каналов к продолжительной стимуляции [5.7] 3.7 Динамика одиночного RyR-канала при установившемся уровне cis[Ca] [5.7.1] 3.7.1 Зависимость активности RyR-канала от времени [5.7.2] 3.7.2 Зависимость активности RyR-канала от уровня cis[Ca] [5.7.3] 3.7.3 Влияние ионов Mg2+ на динамику одиночного RyR-канала [5.8] 3.8 Заключение
[6] [6.1] 4.1 Анализ модели высвобождающей единицы [6.1.1] 4.1.1 Процессы открытия и закрытия каналов в высвобождающих единицах. [6.1.2] 4.1.2 Анализ кооперативной динамики RyR-каналов в кластере [6.1.3] 4.1.3 Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+ [6.1.4] 4.1.4 Анализ модели динамики ионов Са2+ между компартментами клетки
[6.2] [6.2.1] 4.2.1 Высвобождающая единица как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор [6.2.2] 4.2.2 Моды динамики Са2+-«часов» [6.2.3] 4.2.3 Влияние взаимодействия между RyR-каналами на стабильность осцилляций системы [6.2.4] 4.2.3 Эффект случайной остановки автоколебаний [6.2.4.1] 4.2.3.1 Форма и устойчивость кластеров открытых каналов [6.2.4.2] 4.2.3.2 Характерное время перехода в стационарное состояние [6.2.4.3] 4.2.3.3 Влияние стимула на Са2+-«часы», находящихся в стационарном режиме [6.3] 4.3 Заключение
[7]
[8]
[9] |
Природа — сфинкс. И тем она верней
Своим искусом губит человека,
Что, может статься, никакой от века
Загадки нет и не было у ней.
Ф. И. Тютчев
Актуальность исследования. Проблема сердечно-сосудистых заболеваний в развитых странах носит глобальный характер. Так, по данным Федеральной службы государственной статистики в год более 56,9% всех случаев смертности трудоспособного населения в РФ вызваны болезнями системы кровообращения.
Деятельность сердца включает в себя сложнейшие биологические, химические и физические процессы. Их изучение требует совместных усилий специалистов из различных областей науки – биологов, физиков, химиков, математиков.
Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одной из основных причин возникновения хронических заболеваний сердца (аритмия, сердечная недостаточность и пр.) является нарушение внутриклеточной динамики ионов кальция [1]. По современным представлениям именно динамика ионов Са2+ является центральным звеном электро-механического сопряжения в рабочих кардиомиоцитах и формирования сердечного ритма в клетках синусно-предсердного узла. Известно, что активность сердечных клеток инициируется повышением концентрации внутриклеточного Са2+ на порядок величины за счет периодического высвобождения из внутриклеточных накопителей (саркоплазматического ретикулума, СР) через специфические ион-активируемые кальциевые каналы, сопряженные с рианодиновыми рецепторами (RyR-каналы). Связывание ионов Са2+ с активными центрами рецептора изменяет конформационное (структурное) состояние канала, переводя его в проводящее состояние, в результате этого возникают трансмембранные ионные токи по градиенту концентрации. Эти гигантские биологические нанообъекты являются одним из основных регуляторов динамики ионов кальция в сердечных клетках. Свое название рианодиновый рецептор получил благодаря способности связываться с алкалоидом рианодином, ингибирующим активность канала.
Выяснение и исследование механизмов функционирования RyR-каналов, определяющих динамику ионов Са2+, является одной из первоочередных задач современной биофизики. Ее успешное решение связывается не только с развитием современных экспериментальных методов исследования наноскопических биосистем, но и, прежде всего, с перспективами математического моделирования.
Решение сложнейшей задачи математического моделирования RyR-канала предполагает выбор биофизически обоснованной модели канала, способной описать совокупность ключевых процессов в наноскопической молекулярной системе. Разработанная теория должна включать адекватный математический аппарат и компьютерную модель, обеспечивающих достоверное описание как биофизической модели, так и экспериментальных данных, и имеющих предсказательный потенциал. Теория должна объяснить важнейшие эффекты, связанные с кальциевой динамикой в сердечных клетках в норме и патологии на супрамолекулярном уровне и проанализировать роль различных молекулярных механизмов в макроскопических проявлениях (электрофизиологических, биомеханических, биохимических) функции сердечных клеток, а также обозначить задачи для новых экспериментальных исследований.
Однако до сих пор традиционным подходом к описанию динамики RyR-канала является использование сугубо феноменологических марковских моделей [2], которые фактически никак не учитывают реальной структуры наноскопической молекулярной системы, что делает спорным вопрос об их адекватности.
Цель работы. Основной целью диссертационной работы является развитие электронно-конформационной теории наноскопических белковых систем – одиночных RyR-каналов и кластеров RyR-каналов, а также разработка биофизически обоснованной физико-математической модели стохастической динамики Са2+-высвобождающей системы в клетках рабочих кардиомиоцитов и формирования сердечного ритма в клетках водителей сердечного ритма.
Для реализации поставленной цели в данной работе были сформулированы следующие задачи:
Научная новизна работы.
Теоретическая и практическая значимость. Разработанная электронно-конформационная модель предназначена для описания динамики супрамолекулярных комплексов RyR-каналов в сердечных клетках и может быть объединена с моделями, описывающими электромеханическое сопряжение в клетках рабочего миокарда и электрическую активность клеток водителей сердечного ритма.
Модель позволяет на молекулярном уровне выявить роль RyR-каналов в процессах кальциевой динамики, ответственных за нарушение электрической и механической активности в сердечных клетках. Предсказания модели позволяют сформулировать программу дальнейших экспериментальных исследований, направленных на научно-обоснованный поиск внутриклеточных мишеней для терапевтического воздействия при патологии сердца.
Разработанная модель электронно-конформационной динамики молекулярных нанокластеров может найти широкое применение при решении задач фазовых переходов и стохастической динамики применительно к разнообразным биологическим и физическим объектам, способным менять свою структуру, конформационное состояние и физические свойства вследствие внешнего воздействия, а также квантовых или термофлуктуаций. В частности, представленная в данной диссертационной работе, электронно-конформационная модель RyR-канала уже использована при исследовании хаотического и устойчивого поведения нелинейных двухкомпонентных систем (Коньков и др., Нелинейная динамика, 2008).
Разработанный комплекс программ для реализации модели стохастической динамики RyR-канала и модели Са2+-динамики в сердечной клетке имеет практическую ценность для решения более широкого круга физических задач для объектов с индуцированными структурными переходами (например, двухуровневых электронных центров с учетом электронно-решеточного взаимодействия) и может быть использован в учебных и исследовательских целях.
Основные положения, выносимые на защиту:
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на 52-ом съезде Американского биофизического общества (Лонг Бич, США, 2008), конференции «Новые горизонты в кальциевой сигнализации», (Пекин, КНР, 2010), международной конференции Европейского общества по молекулярной биологии «PhysCell: От клетки к органу», (Примоштень, Хорватия, 2009), ежегодном симпозиуме теоретического отдела Института Макса Планка коллоидов и поверхностей (Потсдам, ФРГ, 2006), 13й Международной зимней школе физиков-теоретиков "Коуровка", (Новоуральск, 2010), ежегодной межвузовской научной конференции по проблемам информатики «СПИСОК-2009» (Екатеринбург, 2009), российской школе-конференции молодых ученых (с международным участием) «Физиология и биофизика миокарда», памяти проф. В. Я. Изакова (Екатеринбург, 2011), всероссийской научной конференции студентов физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 2005, 2012), . 6-ом, 8-ом, 13-ом Семинаре по проблемам физики конденсированного состояния (Екатеринбург, 2005, 2007, 2012), 3-я международная школа «Молекулярное переключение и функциональные материалы» и 5-й международный симпозиум по молекулярным материалам: «Электроника, фотоника, спинтроника» (Ренн, Франция, 2009), международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальная и прикладная наука» (Пущино, 2012).
Публикации. Результаты, представленные в диссертации, опубликованы в 18 работах. В их числе три статьи в ведущих рецензируемых российских научных журналах, рекомендованных ВАК, четыре статьи – в ведущих зарубежных журналах и изданиях и 11 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях.
Благодарности: д. ф.-м. н., проф. Москвину А.С.; д. ф.-м. н. Соловьевой О.Э.; д.б.н., чл.-кор. РАН, проф. Мархасину В.С.
В настоящее время моделированием сердечной активности занимается большое количество исследователей: биологов, биофизиков, физиков-теоретиков и математиков. Плодотворное сотрудничество учёных, работающих в различных областях знаний, позволило продвинуться в направлении понимания основных механизмов работы сердечных клеток и миокарда в целом. Физико-математическое моделирование в этой области исследований позволяет более четко объяснить многочисленные экспериментальные данные по изучению функции сердца.
Сердечная мышца относится к возбудимым тканям, клетки которых в ответ на тот или иной раздражитель (электрический, химический, механический) могут генерировать электрические потенциалы действия – характерные изменения мембранного потенциала клетки, приводящие к ее возбуждению [1, 7]. Более того, некоторые виды клеток могут возбуждаться самопроизвольно. В основе механизма генерации потенциала действия клетками лежит изменение проницаемости мембран клеток для некоторых ионов (натрия, кальция, калия), активирующие ионные токи через специальные структуры клеточной мембраны — ионные каналы. Процессы, обеспечивающие сокращение клетки в ответ на электрическую стимуляцию объединяются понятием электромеханического сопряжения в сердечных клетках. Для мышечного сокращения необходимо повышение внутриклеточной концентрации Са2+ от уровня покоя (около 0.1 мкМ) до 1 мкМ [8].
Сердечные мышечные клетки (кардиомиоциты) включают в себя два основных типа по структуре и функциям: кардиомиоциты рабочего миокарда и клетки водителей сердечного ритма. Первый тип отвечает за механическое сокращение сердца, второй – за формирование устойчивого ритма сердечных сокращений [9].
Структура сердечной клетки является достаточно сложной [9, 10]: каждая клетка состоит из нескольких десятков повторяющихся сократительных единиц – саркомеров, длина которых около 2 мкм; поперечных трубочек (Т-трубочки, Т-тубулы), представляющих собой глубокие впячивания мембраны, опоясывают весь кардиомиоцит и локализуются у концов каждого саркомера. Сокращение саркомера обеспечивается мышечными волоконами (миофибриллами), расположенными вдоль саркомера и опоясанными сложной сетью внутриклеточных хранилищ ионов кальция, включающих продольный саркоплазматический ретикулум (СР), терминальные цистерны (ТЦ) (или люмен), примыкающие к мембране T-тубул (см. рис. 1.1б, рис. 1.3).
На мембране СР в местах контакта СР с Т-тубулами располагается группа специализированных Са2+-высвобождающих каналов, сопряженных с рианодиновыми рецептороами (RyR-каналы), через которые происходит высвобождение Са2+ из СР. Высвобождение носит триггерный характер, так как открытие RyR-каналов происходит в ответ на приток относительно небольшого количества Са2+ через ионные каналы, расположенных на мембране клетки –каналы L-типа или дигидропиридиновые рецепторы (см. рис.1.2, 1.3)[8, 10].
На мембране СР RyR-каналы образуют группы (кластеры), состоящие из нескольких сотен каналов. Существуют структуры, состоящие из кластера RyR-каналов вместе с несколькими L-каналами клеточной мембраны, люменом СР и диадным пространством между мембранами СР и примыкающими Т-тубулами. Данные структуры называются Са2+ высвобождающими единицами (Release Unit) (ВЕ, рис.1.2). В кардиомиоците насчитывается несколько десятков тысяч ВЕ; они формируют кальций-высвобождающую систему клетки (рис. 1.3).
В связи с тем, что высвобождение Са2+ из СР осуществляется через группы RyR-каналов, исследование их динамических свойств является важной задачей в изучении процессов электромеханического сопряжения.
RyR-канал является гигантским макромолекулярным комплексом (рис. 1.4), тетрамером, объединяющим четыре субъединицы (полипептидные цепи) с молекулярной массой 567 кДа каждая [2, 13]. Активность RyR модулируется под действием растительного алкалоида рианодина из коры Ryania speciosa, что и определило его название «рианодиновый рецептор». Существуют три изоформы RyR-каналов: RyR1 (клетки скелетной мускулатуры и мозжечка), RyR2 (клетки сердечной мышцы и мозга), RyR3 (клетки гладкой мускулатуры). Они различаются по своей структуре и динамическим параметрам.
Как уже было сказано выше, RyR-каналы располагаются на мембране СР; при переходе в открытое состояние через них происходит высвобождение ионов Са2+ из просвета ТЦ (люмена). Согласно данным электронной микроскопии [12], RyR-канал имеет форму четырехлистника со стороной 27 нм (рис. 1.4).
В процессе открытия RyR-канала изменяется его конформационное (структурное) состояние: данный белок изменяется по форме и структуре, переходя в проводящее состояние (рис. 1.5).
На рисунке 1.6 приведены результаты экспериментальных исследований структуры мембраны СР [13]; видно, что на мембранах RyR-каналы объединены в кластеры (решетки) (от 100 до 300 каналов в каждой). Каналы в решетке упорядочены и находятся под определенным углом друг к другу, также экспериментальные данные многих исследовательских групп говорят о существовании взаимодействия между каналами в кластере благодаря наличию между ними специфических связывающих белков [12-15].
Из всего вышесказанного можно сделать следующие выводы:
Изучая динамические особенности изолированных RyR-каналов независимо друг от друга несколько авторов исследовало поведение RyR-каналов в лабораторных условиях в липидных бислоях при постоянных концентрациях ионов Са2+ в растворе в условиях отсутствия кальциевой стимуляции [17-19]. Схема типичной установки представлена на рис. 1.7. В экспериментах раствор разделяется на две части липидным бислоем, имитирующим клеточную мембрану, в котором закрепляется RyR-канал. Та часть, которая соответствует люменальной стороне канала называется trans, цитозольной стороне – cis.
В работах [17-19] помощью подобных установок была проведена серия экспериментов по регистрации ионных токов, проходящих через одиночный канал при различных концентрациях Са2+ в растворе. Отсутствие тока указывало на нахождении канала в закрытом состоянии, а их присутствие – на его открытие.
Первым важнейшей особенностью RyR-канала как нанообъекта является стохастический характер процессов открытия/закрытия при постоянных значениях концентраций и [17-19].
Важной кинетической характеристикой поведения RyR-канала является вероятность пребывания канала в открытом состоянии (), равная отношению суммы времен пребывания в открытом состоянии к длительности эксперимента: . При разбиении сигналов на небольшие промежутки времени Т<500 мс в работе [19] исследовалась временная зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии. Исследования показали неоднородность функции (рис.1.8).
График зависимости активности канала от времени можно разбить на участки (так называемые пучки (bursts)) с различной вероятностью нахождения канала в открытом состоянии. Данный эффект получил название модовой проводимости (Modal Gating) [21-23]. Так в работе [21] выявлены следующие моды проводимости RyR-канала: H (high ) – мода высокой активности, >0.1, L (low ) – мода низкой активности, 0<<0.1, I (inactivated mode) – мода нулевой активности, =0 (рис. 1.9).
Исследование зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от значения концентрации Са2+ в trans-части показало [15, 24, 25], что в ответ на повышение увеличивалась частота открытий канала и вероятность (рис. 1.10). Из данного экспериментального факта можно сделать непосредственный вывод, что вероятность открытия RyR-канала увеличивается с ростом концентрации Са2+ в люмене.
В ряде работ [15, 21, 24], исследовавших влияние концентрации на активность RyR-канала, показано, что при повышении концентрации Са2+ в цитозоле (< 10 мкM) наблюдается резкое повышение частоты открытий канала и, соответственно, увеличение вероятности открытия одиночного канала. Далее, при достижении определенного значения концентрации (> 100 мкM) происходит спад , то есть наблюдается процесс инактивации RyR-канала при повышенной концентрации цитозольного кальция (рис.1.11).
Уменьшение значения при высоких значениях cis[Ca] объясняется многими исследователями [12, 15, 21, 26] тем фактом, что, являясь Са2+-активируемым рецептором, RyR-канал имеет на cis-стороне два типа активных центров, способных связаться с ионами Са2+: активационный и инактивационный [26-28]. На рисунке 1.12 изображена классическая схема активации/инактивации канала [27].
Сложная регуляция RyR-канала кальцием впервые была обнаружена в работе [29] при проведении экспериментов в плоском липидном бислое. Показано, что резкое увеличение cis[Ca] (~ 1 мс) сначала быстро активирует одиночный RyR-канал до высокого уровня вероятности , а затем значение медленно уменьшается со временем при фиксированной концентрации Са2+ (рис. 1.13). Этот эффект получил название адаптации канала к продолжительной стимуляции.
Следует отметить, что в экспериментальных работах повышение уровня cis[Ca] проводилось двумя способами: резкое повышение с помощью лазерного флэш-фотолиза [29-33] и постепенное повышение в растворе вблизи RyR-канала [34, 35]. Второй способ подразумевает градуальное повышение уровня вблизи активных частей канала вследствие диффузионных процессов.
Результаты экспериментов [35] по наблюдению эффекта адаптации при градуальном повышении говорят о том, что только в 30% реализаций обнаруживался эффект адаптации, в остальных 70% случаях понижения вероятности пребывания канала в открытом состоянии со временем не происходило (рис. 1.14). На основании этих фактов был сделан вывод: понижение со временем зависит от скорости увеличения уровня .
На основе приведенных данных можно сделать следующие выводы:
Стохастический характер поведения RyR-каналов при стационарных условиях является основной причиной описания данного наноскопического объекта в терминах дискретных по времени однородных марковских процессов.
Простейшей моделью, описывающей стохастическую динамику RyR-канала, является так называемая модель «дыра в стене» (“Hole in the Wall”) [36], которая ограничивает всю совокупность состояний канала двумя состояниями: открытым О и закрытым С. Марковская схема данной модели имеет простейший вид: , где и – вероятности открытия и закрытия канала, соответственно. Следует отметить, что данные вероятности зависят от концентраций и , однако динамика канала представляется как процесс случайного блуждания между состояниями, которые характеризуются различными средними временами нахождения в них. Другими словами, модели, основанные на марковских схемах, являются чисто феноменологическими.
Для более подробного моделирования процессов открытия/закрытия канала применялись более сложные марковские схемы с большим количеством состояний. Состояния канала были сгруппированы в два класса по характеру проводимости: закрытые состояния и открытые . На рисунке 1.15 представлено несколько типичных модельных схем с различным количеством основных состояний канала, на базе которых проводилось моделирование [37].
Для описания всех известных эффектов, связанных с кинетическими процессами, происходящими в канале (модовая проводимость, адаптация к продолжительной стимуляции), некоторыми исследователями было введено так называемое инактивационное состояние [21, 30, 37-39]. Существование такого состояния объясняется присоединением ионов Са2+ к инактивационному центру RyR-канала. Пример марковской схемы с инактивационным состоянием представлен на рисунке 1.16.
Моделирование на основе марковских схем с инактивационным состоянием позволило исследователям воспроизвести результаты экспериментов по наблюдению эффектов адаптации и модовой проводимости.
Однако модели, основанные на марковских цепях, имеют ряд существенных недостатков, таких как:
С учетом всего вышеизложенного возникла потребность создания новых физически и биологически обоснованных моделей для устранения эти недостатков.
Отдельно следует рассмотреть целый класс стохастических моделей динамики белков, и, в частности, ионных каналов, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках [41-46].
Белковые комплексы рассматривается как вязкоупругие объекты [46], обладающие большим количеством степеней свободы.
Перераспределение химических связей в ходе взаимодействия активных центров белковых соединений с ионами изменяет распределение электронной плотности в реагирующих молекулах, изменяя тем самым баланс сил внутри белка, что приводит к тому, что равновесная конформация белка до и после реакции различны. Это явление называется электронно-конформационным взаимодействием, а соответствующее изменение структуры – электронно-конформационным переходом [45, 47]. Этот переход можно также рассматривать и как конформационную релаксацию под действием нескомпенсированных сил, возникающих после акта перераспределения электронной плотности или иных изменений в активном центре белка. Присоединение очень небольшого по размерам иона к активному центру ионного канала вызывает существенные изменения конформации белка – поворот субъединиц на расстояние порядка 10 А. Этот пример показывает, насколько тонким является баланс сил, стабилизирующих конформацию белковой структуры.
Ярким примером являются непрерывные модели, к примеру, модель процессов открытия Са2+-активируемых K+-каналов [45]. При разработке данной математической модели авторы основывались на ряде важнейших фактов, выявленных экспериментально и характеризующих кинетику активности ионных каналов, таких как:
1) распределение кинетических параметров может иметь не экспоненциальное, а степенное распределение.
2) распределения имеют фрактальную структуру (самоподобны в различных временных масштабах [47, 48]);
3) существует скоррелированность событий ("память") в активности канала [48].
4) кинетика переходов канала между различными состояниями определяется не только случайными, но и детерминированными силами [48].
В модели [41] конформационное состояние канала и, соответственно, его проводимость определялись с помощью введения угла отклонения подвижных трансмембранных сегментов канала от центральной оси поры (рис. 1.17). Предполагалось, что канал при отсутствии внешних воздействий может находиться в двух устойчивых состояниях (открытое и закрытое). Переходы между состояниями осуществляются благодаря воздействию тепловых флуктуаций на подвижные части сегментов. Потенциальная энергия воротного механизма (структуры) описывается функцией с двумя локальными минимумами, соответствующими открытому и закрытому состояниям канала (рис. 1.17г).
Таким образом, существует альтернатива теориям, основанных на марковских процессах, описывающих процессы открытия/закрытия ионных каналов. Вышеописанные модели позволяют более детально описать динамику биомолекул и предполагают использование энергетического подхода к описанию конформационных изменений различных биофизических объектов.
Начальное возрастание концентрации внутриклеточного кальция в ответ на электрическое возбуждение происходит благодаря поступлению ионов извне через L-каналы, однако такого повышения концентрации недостаточно для сокращения клетки [1, 11, 50, 51]. Внешний приток Са2+ активирует группы RyR-каналов, являясь стимулом для последующего высвобождения Са2+ из СР и повышения уровня Са2+ в цитозоле на порядок величины. Данный триггерный процесс носит название «кальцием вызванное высвобождение кальция» (КВВК) [1]. После высвобождения Са2+ из СР в диадное пространство и дальнейшей его диффузии в цитозоль увеличивается концентрация Са2+ вблизи миофибрилл, что приводит к сокращению саркомера. Относительная однородность повышения концентрации Са2+ в клетке обеспечивается особым устройством СР с небольшим расстоянием (не более 1 мкм) от любой точки клетки до ближайшей высвобождающей единицы [10].
Являясь одним из ключевых процессов электромеханического сопряжения, процесс КВВК требует тщательного экспериментального анализа и соответствующего математического моделирования.
Важным этапом в исследовании динамики Са2+ в кардиомиоцитах являются эксперименты по изучению локальных высвобождений Са2+ в клетках при помощи конфокальной микроскопии и Са2+-чувствительного индикатора fluo-3, fluo-4, или rhod-2 [51]. Резкое локальное повышение концентрации цитозольного Са2+ в покоящейся клетке, называется Са2+ спарком [52-54]. Спарки в клетке наблюдаются с частотой около 100 в секунду [53].
На рисунке 1.18 приводятся результаты продольного сканирования сердечной клетки крысы, которая загружена индикатором fluo-3. Каждый Са2+ спарк является по форме почти сферическим с приблизительным диаметром 2 мкм. Как видно из рисунка 1.18в, значение концентрации покоя Са2+ около 100 нM, а значение локальных пиков концентрации от 200 до 300 нM.
Поскольку Са2+ спарки формируются кластерами RyR-каналов, они преимущественно наблюдаются вдоль саркомера и T-тубулы. На рисунке 1.18б представлено усредненное изображение спарков перпендикулярно Т-тубулы.
1.7 Модели «общего пула»
Одной из самых распространенных теорий для описания процесса КВВК на протяжении долгого времени являлась так называемая «теория общего пула» [55-57]. Она основана на усреднении концентрации Са2+ в сарколемме и в субклеточных пространствах. В рамках этой модели огромное количество Са2+-высвобождающих единиц описывались одной обобщенной модельной высвобождающей единицей. При этом поток Са2+ через L-каналы объединен в общий стимулирующий поток, а поток высвобождающегося Са2+ – в общий поток высвобождения. Оба этих потока направлены в один обобщенный отдел клетки, называемый субпространством (объединенное диадное пространство), причём процесс высвобождения зависит от концентрации Са2+ в субпространстве. Следовательно, однажды запущенное высвобождение Са2+ из СР должно повышать концентрацию Са2+ в субпространстве по принципу "всё или ничего". Согласно этой модели количество высвободившегося Са2+ не зависит от величины стимулирующего мембранного тока, что противоречит экспериментальным данным [58].
С помощью этого обобщения в целом ряде других математических моделей, использующих теорию общего пула, исследователи пытались описать изменение концентрации Са2+ внутри клетки в течение сократительного цикла – кальциевый переход. Эти модели опирались на кинетические характеристики процессов накопления Са2+ во внутриклеточных структурах и взаимодействие с буферами [59, 60].
Объединение модели общего пула с интегративными моделями кардиомиоцитов позволило с хорошей степенью точности предсказать динамические процессы активности клетки [61].
Однако модель общего пула имеет ряд недостатков. В частности, она не способна описать следующие экспериментальные факты [29-33 ]:
Как уже отмечалось, запуск процесса КВВК в сердечной клетке стимулируется незначительным повышением концентрации Са2+ в цитозоле вследствие поступления внеклеточного Са2+ через L-каналы [1].
Явление градуальности отклика обнаружено экспериментально и заключается в том, что при увеличении количества Са2+, поступающего извне, происходит возрастание количества высвободившегося Са2+. Кроме того, отклик высвобождающей системы сильно зависит от скорости повышения стимулирующего Са2+ тока [1]. Этот феномен невозможно описать в рамках модели общего пула.
Весте с тем, целый ряд экспериментов указывает на то, что в процессе высвобождения СР после его завершения концентрация Са2+ в СР не падает до нулевого уровня [52]. В модели же общего пула высвобождение Са2+ завершается при полном опустошении СР по принципу «все или ничего».
Опираясь на данные расхождения, можно сделать вывод о неспособности модели общего пула с хорошей точностью описать динамические процессы ионов Са2+ в кардиомиоците.
В связи с недостатками модели общего пула, описанными ранее, возникла необходимость разработки более обоснованных моделей электромеханического сопряжения. Изучение механизмов стимуляции высвобождения Са2+ посредством токов через L-каналы стало возможным с развитием экспериментальной техники, позволившей детально изучить одновременно потоки ионов Са2+ внутри клетки и ионные токи через L-каналы, что нашло свое применение в модели локального контроля электромеханического сопряжения [60].
В рамках этой модели утверждается, что открытие отдельного L-канала на мембране Т-тубулы стимулирует высвобождение Са2+ через кластер RyR-каналов малого размера, расположенный вблизи данного L-канала. Таким образом, согласно этой гипотезе происходят локальные высвобождения Са2+ по принципу "все или ничего", при этом кластеры RyR-каналов пространственно удалены и функционируют практически независимо друг от друга [61].
С помощью данной теории в полной мере описывается феномен градуальности высвобождения, который достигается статистическим объединением локальных событий высвобождения Са2+ в независимых диадных пространствах. Другими словами, в теории локального контроля основным утверждением является то, что взаимное близкое расположение L-каналов и отдельных кластеров RyR-каналов лежит в основе градуального высвобождения Са2+ и развития силы сокращения клетки в целом [62].
Существование локального контроля было подтверждено при проведении экспериментов с использованием конфокальной микроскопии по наблюдению локальных событий высвобождений из СР – Са2+-спарков [49-51].
Исследования количественных соотношений между L-каналами и RyR-каналами [4] также подтвердило предположения данной теории. Было выявлено, что соотношение числа RyR-каналов к числу L-каналов равно 1 : 2 для клеток скелетной мышцы и 1 : 6 для кардиомиоцитов.
До настоящего времени в литературе ведутся дискуссии по вопросу процесса закрытия RyR-каналов и последующего завершения процесса высвобождения Са2+ из СР. Как уже было отмечено ранее, эксперименты указывают на тот факт, что завершение локальных процессов высвобождения могут происходить при сохранении достаточно высокой концентрации Са2+ в люмене.
Существует несколько предположений касательно закрытия групп RyR-каналов в ВЕ. Одна из теорий основана на экспериментальных данных по изучению динамики изолированных RyR-каналов в липидных бислоях [34] и связана с предположением существования инактивационного состояния RyR-канала – состояние, при котором ионы Са2+ связываются с так называемым инактивационным центром, что приводит к переходу канала в непроводящее состояние. Переход в инактивационное состояние, как и выход из него, характеризуется достаточно малой вероятностью. Данная гипотеза была обобщена и для кластера взаимодействующих каналов в клетке в целом. В численных моделях, представленных в работах [17, 18, 25], RyR-каналы переходят в инактивационное состояние с течением времени, что и обеспечивает завершение локальных высвобождений.
Вторая гипотеза носит название стохастического истощения (stochastic attrition) канала и основана на идеях случайности переходов канала из одного состояния в другое. Предполагается, что существует вероятность перехода всего кластера в закрытое состояние. Было показано [60], что эта модель может работать с относительно небольшим количеством RyR-каналов в кластере (<10), так как с увеличением числа каналов резко падает вероятность одновременного перехода в закрытое состояние и растет время ожидания этого события. Экспериментальные данные, приведенные в [63-66], говорят о достаточно резком завершении локальных высвобождений.
Следующая теория связана с истощением люмена (luminal Ca2+ depletion effect) в процессе высвобождения и основана на большом количестве экспериментальных данных, подтверждающих зависимость вероятности открытия RyR-каналов от концентрации Са2+ в люмене [20, 21]. Как уже было сказано в разделе 1.3, вероятность пребывания канала в открытом состоянии зависит от уровня trans[Ca] в липидных бислоях, однако в живых клетках при физиологических условиях зависимость от концентрации Са2+ люмене не столь существенна для того, чтобы считать истощение люмена единственной причиной завершения процесса высвобождения.
На основе анализа приведенных выше гипотез можно заключить следующее: ни один из механизмов этих моделей не был признан как единственный и первоочередной. Тем не менее, при моделировании кластера RyR-каналов необходимо учитывать такие особенности, как стохастическое поведение каналов и кооперативную динамику кластера каналов. Также следует учитывать влияние ионов Са2+ в trans и cis-частях.
Автоматизм сердца, то есть способность сердечной мышцы к периодическому сокращению без внешней стимуляции за счёт собственных внутренних механизмов, играет одну из ключевых ролей в обеспечении непрерывной циркуляции крови, поддержании постоянства артериального давления и функционирования сердечно-сосудистой системы в целом.
Единый ритм сокращения сердца формируется в так называемом синоатриальном узле (САУ) (Sinoatrial Node) сердца, находящемся в стенке правого предсердия, откуда волна возбуждения распространяется по всему миокарду [67]. Единый ритм возможен вследствие взаимной синхронизации огромного количества (десятков тысяч) [3] автоколебательных пейсмейкеров, клеток САУ.
Вопрос о природе автоколебательной динамики клеток водителей сердечного ритма является открытым многие годы, и по поводу причин возникновения автоосцилляционного режима этого рода клеток до сих пор нет единого мнения [68-70].
Способностью к спонтанной генерации потенциала действия в той или иной степени обладают кардиомиоциты всех отделов проводящей системы, однако, их собственная ритмическая активность подавлена возбуждением, зарождающимся в синоатриальном узле, и снижается по мере пространственной удалённости от САУ, что позволяет говорить о явлении «градиента автоматии» [71]. Такие кардиомиоциты получили название латентных водителей ритма, поскольку роль пейсмейкеров они приобретают только в случае повреждения ритмогенных структур синоатриального узла, либо утраты связи с ними.
Клетки САУ существенно отличаются от клеток рабочего миокарда видом потенциала действия. В состоянии покоя сердечной мышцы (в диастолу) значения мембранного потенциала рабочего миокарда приближаются к значениям потенциала покоя (- 80 мВ). Кардиомиоциты САУ, напротив, отличаются наличием особой фазы потенциала действия – «медленной диастолической деполяризацией» (ДД) (рис. 1.19). После окончания потенциала действия мембранный потенциал не стабилизируется на уровне максимального диастолического (-60/-70 мВ), а медленно снижается с почти постоянной скоростью до тех пор, пока он не достигнет критического значения, после чего возникает очередной потенциал действия.
Фаза (ДД) [72] считается одной из важнейших причин, обусловливающих периодически повторяющуюся активность миокарда, и, соответственно, определяющих сердечный ритм. По этим причинам она закономерно стала объектом множества исследований, целью которых стало выяснение тонких клеточных механизмов, лежащих в основе её генерации.
На протяжении долгого времени многие исследователи [67, 69] при моделировании клеток водителей сердечного ритма основывались на предположении, что единственной причиной наличия фазы ДД служат внешние мембранные ионные токи. Действительно, существуют экспериментальные доказательства существования в пейсмейкерах специфических мембранных токов, названных “funny” (от англ. «забавный», «необычный»), [5, 73, 74].
Также экспериментально продемонстрировано участие тока в запуске процесса ДД и в регуляции скорости протекания этого процесса под влиянием химических агентов [74]. Показано, что снижение величины тока снижает скорость ДД и увеличивает время достижения пороговых значений мембранного потенциала, что обусловливает снижение частоты сердечных сокращений.
В работах [73, 75] был предложен следующий механизм возникновения ДД. Ток инактивируется во время начала ПД и активируется во время реполяризации, когда напряжение достигает порогового значения (-40мВ). Медленная активация заставляет потенциал мембраны медленно деполяризоваться до порогового уровня с последующей активацией входящего кальциевого тока и генерацией нового ПД [73].
Следует отметить, что до недавнего времени представление о формировании ПД в пейсмейкерных клетках посредством мебранных токов было главенствующим и в теориях, и в математических моделях [67, 76].
Еще в 1943 г. Бозлер [77] предсказал существование внутренних химических осцилляторов в клетках ритмоводителей, однако их природа до сих пор остается предметом дискуссий [78-81].
Недавние эксперименты по изучению кальциевой динамики в клетках водителей ритма [79, 82-84] показали, что даже при отсутствии стимуляции со стороны внешних мембранных токов наблюдаются спонтанные периодические высвобождения из терминальных цистерн СР. Данный факт напрямую подтверждает существование внутренних кальциевых осцилляторов, так называемых кальциевых «часов». Роль Са2+-«часов» выполняет система Са2+- высвобождающих единиц. События высвобождения Са2+ из СР являются периодическими и запускают Na2+-Ca2+ обменный ток, играющий триггерную роль в формировании ПД в клетках САУ.
Авторы работ [81, 85-89] высказали предположение, что самосогласованное взаимодействие внутреннего осциллятора с мембранными «часами» (периодическими изменениями мембранного потенциала) обеспечивают надежность работы ритмоводителей в достаточно широком диапазоне динамических параметров.
Сравнительно недавно в 2009 году Мальцев и Лакатта [87] разработали модель клеток САУ (ML-модель), которая описывает самосогласованное взаимодействие внутренних Са2+-«часов» и внешнего мембранного осциллятора и позволяет исследовать механизмы формирования и устойчивости колебаний концентрации в различных отделах сердечной клетки.
В своих работах авторы основывались на широко известной модели структуры клетки (рис. 1.20), состоящей всего из четырех основных компонентов: диадного пространства, цитозоля, сети СР и просвета ТЦ (люмена) СР.
Была использована "теория эффективного среднего поля", в которой концентрации в диадном пространстве и в люмене СР (,, соответственно) являются главными управляющими величинами. Проводимость RyR-каналов рассматривалась в упрощенном виде как некая функция концентрации высвобождающегося в диадном пространстве. Для описания внешнего мембранного осциллятора авторы применили теорию мембранных токов ионов Са2+, Na2+, Mg2+ и K+ (модель Кураты) [85], а для описания кинетики внутриклеточного модель Шэннона [90], что при объединении дало систему 29 дифференциальных уравнений. Было показано, что изолированный СР действительно может вести себя как самоподдерживающийся осциллятор, который можно описать простейшим механизмом «накопление-сброс». В ML-модели малое “первичное” спонтанное высвобождение из люмена в диадное пространство является своеобразным триггером, инициирующим колебательную динамику всей системы. Когда концентрация достигает некоторого критического значения, она усиливает процесс «вторичного» высвобождения посредством механизма КВВК. Это достаточно сильное высвобождение в свою очередь резко уменьшает уровень , а высвобожденный поглощается сетью СР (). Длительность задержки между высвобождениями определяется скоростью закачки из цитозоля в сеть СР, диффузии из сети СР в люмен, высвобождения из люмена в диадное пространство и диффузии из диадного пространства в цитозоль. В процессе заполнения люмена и достаточно медленного увеличения происходит постепенное открытие RyR-каналов, затем имеет место следующее высвобождение и т.д.
ML-модель самосогласованных осцилляторов, казалось бы, способна описать все недавно обнаруженные особенности функционирования клеток ритмоводителей, однако, будучи чисто феноменологической, она, как и все интегративные модели, не учитывает ряд важнейших биофизических особенностей субклеточных элементов, в частности, структуру RyR-каналов огромных наноскопических белков, их кооперативное взаимодействие, пространственно-временную структуру -высвобождений, формируемых системой высвобождающих единиц. Спорным представляется и основное предположение ML-модели относительно как основного активатора RyR-каналов. Это представление противоречит многочисленным экспериментальным фактам, свидетельствующим о важной роли «люменальной» активации [14, 20]. Очевидно, что более реалистичное моделирование -осцилляторов в клетках САУ должно включать в себя биофизически обоснованную модель изолированных RyR-каналов и соответствующих кластеров, а также стохастический механизм локальных -высвобождений, учитывающий как cis- (со стороны диадного пространства), так и trans- (со стороны люмена) механизм активации RyR-каналов. Эти задачи решаются в данной работе.
В данном разделе описано построение математической модели одиночного RyR-канала.
RyR-каналы представляют собой гигантские нанокластеры; они обладают сложнейшей молекулярной структурой и огромным количеством внутренних степеней свободы.
С точки зрения моделирования Са2+-динамики в клетке основными характеристиками RyR-канала являются его проницаемость, то есть способность пропускать через себя ионы Са2+, и активируемость – способность связывания активных центров канала с ионами Са2+ с последующим конформационным (структурным) изменением, то есть переходом в проводящее или, наоборот, в непроводящее состояние [91, 92]. Эти особенности как основополагающие были учтены при разработке электронно-конформационной (ЭК) модели RyR-канала [93-95].
Основные положения электронно-конформационной модели базируются на представлениях теории фотоиндуцированных структурных фазовых переходов [96, 97], которая нашла широкое применение в алгоритмах метода молекулярной динамики для компьютерного моделирования состава, структуры и свойств различных сложных сред [98, 99].
В рамках ЭК модели огромное количество степеней свободы канала как молекулярного нанокластера сводится всего к двум – быстро изменяющейся условно называемой «электронной» и медленной конформационной, которые управляются токами через L-каналы и концентрацией кальция в люмене высвобождающей единицы кардиомиоцитов.
При разработке модели динамики RyR-канала выдвинуты следующие предположения:
Вышеизложенные положения ЭК-модели можно описать с помощью примитивной схемы эластичной трубки с переменным сечением и легкой крышкой. В данной схеме конформационная координата Q характеризует степень упругой деформации (сечение) трубки, а положению «крышки» соответствует электронная степень свободы RyR-канала. Переключение положения легкой «крышки» влечет за собой медленное конформационное изменение канала.
Динамические процессы RyR-канала условно осуществляются в два этапа: сначала при фиксированной конфигурационной степени свободы быстро перестраивается активационный центр, а затем идет медленная перестройка конформационной степени свободы с переходом в полное равновесие в данном электронном состоянии.
Разработка ЭК-модели основывалась на прямой аналогии между изменением конформации RyR-каналов как супрамолекулярных комплексов и изменением конфигурации многоатомной молекулы [100].
Основные приближения ЭК-модели модели базируются на представлениях теории электронно-колебательного взаимодействия в физике твердого тела [101]. Детали проведенной аналогии представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Аналогия между теорией электронно-колебательного взаимодействия в молекулах и электронно-конформационной теорией динамики RyR-канала.
|
Теория электронно-колебательного взаимодействия |
Электронно-конформационная теория динамики RyR-канала |
|
|
Адиабатическое приближение |
Электроны успевают адиабатически следовать за ядрами, и их распределение в пространстве определяется мгновенной конфигурацией ядер. Существует возможность разделения электронных и ядерных координат. |
Разделение динамики канала на медленную конформационную и быструю электронную. |
|
Медленная степень свободы |
Конфигурационная координата ядер |
Конформационная координата RyR-канала |
|
Быстрая степень свободы |
Электронная степень свободы, малая масса электрона, достаточно большой масштаб электронных энергий |
Электронная степень свободы канала, определяемая связыванием Са2+ с активационными центрами канала |
|
Взаимодействие между степенями свободы |
Кулоновское взаимодействие электронов с ядрами и межъядерное отталкивание |
Электронно-конформационное взаимодействие: изменения конформации канала как следствие электронных переходов |
|
Устойчивость состояний |
Существование двух устойчивых состояний молекулы, соответствующих высокосимметричной и низкосимметричной конфигурациям молекулы (псевдоэффект Яна-Теллера). |
Существование двух устойчивых состояний канала, соответствующих открытому и закрытому состояниям канала (аналог псевдоэффекта Яна-Теллера). |
Два положения электронной степени свободы (открытое и закрытое) можно описать в рамках псевдоспинового формализма S=1/2 c состояниями «вверх» и «вниз» (). Изменение конформационной координаты Q в ЭК-модели описывается в классическом континуальном приближении.
По аналогии с теорией электронно-колебательного взаимодействия в конденсированном состоянии вводилось понятие адиабатического приближения, базирующегося на следующем факте: ядра значительно массивнее электронов и, следовательно, движутся медленнее, чем электроны. Движение ядер приводит лишь к изменению электронного распределения без переходов между различными электронными состояниями.
По аналогии с вышеизложенной теорией моделирование поведения одиночного RyR-канала проводится в условиях адиабатического приближения, то есть в предположении возможности разделения динамики электронного и конформационного состояний канала.
При описании свойств RyR-канала предполагается, что на его энергетическое состояние оказывают влияние следующие основные факторы:
Используя псевдоспиновый формализм[101], в рамках энергетического подхода к описанию состояний канала вводится модельный гамильтониан:
(2.1)
где , – матрицы Паули.
В (2.1) первое слагаемое описывает разницу энергий двух электронных состояний канала («открыт» и «закрыт» ), второе слагаемое описывает «перемешивание» и состояний; параметры h и Δ являются аналогами некоторого «эффективного поля». Третий член описывает эффекты воздействия на канал со стороны внешних сил, которые условно можно связать с эффективным давлением (p – параметр «эффективного давления» Са2+ в люмене СР). Четвертый член характеризует электронно-конформационные взаимодействия, возникающие в каналах, где – постоянная взаимодействия. Последнее слагаемое описывает упругую энергию конформационного состояния канала с константой упругости K.
Для описания динамики электронного состояния были найдены собственные значения гамильтониана (2.1):
(2.3)
которые определяют две ветви адиабатического конформационного потенциала (КП) (рис. 2.2а) и характеризуют энергию состояний канала в зависимости от координаты Q. – верхняя ветвь, – нижняя ветвь потенциала.
Можно ввести новую переменную , описывающую электронное состояние канала, которая принимает только два значения (=0 – закрытое, =1 – открытое состояния). Это позволяет переписать собственные значения (2.3) в следующем виде:
(2.4)
На рисунке 2.2а представлен вид адиабатического конформационного потенциала RyR-канала, на котором обозначены основные состояния канала в электронно-конформационной модели. сС– канал закрыт электронно и конформационно, оC – открыт электронно и закрыт конформационно, оO – канал открыт электронно и конформационно, сO – закрыт электронно и открыт конформационно.
Если пренебречь квантовыми эффектами () и положить , то формула, описывающая КП упрощается следующим образом:
. (2.5)
В этом случае график зависимости конформационного потенциала представляет собой две пересекающиеся параболы (рис. 2.2б) (диабатический режим), тогда собственные значения можно разделить согласно состоянию электронной степени свободы: ветвь – электронно открытое, – электронно закрытое состояния.
Форма КП определяет устойчивость того или иного фазового состояния канала (стабильность или метастабильность). Как видно из рисунка 2.2 минимум oO является метастабильным, а сС – глобальным. Предполагается, что при внешних воздействиях на систему возможно изменение формы КП, а, следовательно, стабильности локальных минимумов и устойчивости фазовых структурных состояний.
Основываясь на экспериментальных данных in vitro, указывающих на то, что вероятность пребывания канала в открытом состоянии увеличивается с ростом уровня концентрации Са2+ в trans-части ()[20], в рамках электронно-конформационной модели предполагается, что устойчивость состояний RyR-канала зависит от , то есть в клетке – от концентрации Са2+ в люмене СР.
Во многих экспериментальных работах высказано предположение о наличии так называемого активационного центра RyR-канала со стороны trans. В терминах кинетики ферментативных процессов реакции фермента Е (активационного центра канала) с субстратом S (ионами Са2+) образуется комплекс фермент-субстрат ES [103, 104]. Если реакция обратима, и известны константы прямой и обратной реакции k+ и k-, соответственно, то схема процесса образования комплекса ES имеет вид:
Предполагается, что активационный центр разделен на определенное количество мест связывания с ионами. Согласно формуле Хилла доля мест связывания активационного центра, занятых субстратом выражается как:
,
где – коэффициент диссоциации субстрата от активного центра, k+ – константа скорости связывания молекулы субстрата с одним из активных центров, k- – константа распада, n – коэффициент Хилла, который определяет количество активных мест связывания и другие кооперативные механизмы регуляции функции канала.
Относительное число активных мест связывания варьируется в диапазоне [0;1], а при значение равно ½.
Для описания внешнего воздействия со стороны ионов Са2+ в trans-части в ЭК-модели вводится параметр «эффективного давления» p, зависящий от . Для удобства зависимость p() приводится к такому виду, что значения р лежат в диапазоне (-1;1) в соответствии с формулой [95]:
(2.6),
где – уровень , при котором p принимает нулевое значение, n – параметр, определяющий нелинейность зависимости p(trans[Ca]). В гамильтониане (2.1) параметр р определяет энергию внешнего воздействия на систему.
График зависимости p(trans[Ca]) представлен на рисунке 2.3а. На графике 2.3б изображены формы КП при трех различных значениях параметра p. Как видно из рисунка, при p<0 (малый уровень trans[Ca]) наблюдается устойчивость закрытого состояния RyR-канала, при p=0 закрытое и открытое состояния находятся на одном энергетическом уровне, а при p>0 (высокий уровень trans[Ca]) наблюдается устойчивость открытого состояния.
Таким образом, в ЭК-модели параметр «эффективного давления» вводится для описания зависимости устойчивости состояний исследуемого макромолекулярного комплекса от внешних условий.
На основе представлений ЭК-модели можно рассмотреть возможные варианты процессов открытия и закрытия канала при постоянстве формы КП, связанные с взаимодействием ионов Са2+ с активационным центром канала и последующим изменением конформационного состояния. Простейшие схемы открытия и закрытия канала показаны на рисунке 2.3.
Схема 1. Открытие канала. Вначале канал находится в закрытом состоянии на левой ветви конформационного потенциала в минимуме (С), при этом имеют место следующие изменения степеней свободы RyR-канала:
1 – ионы Са2+ связываются с активационным центром канала, происходит переход на более высокий энергетический уровень, то есть изменение электронной степени свободы и переход на правую ветвь КП.
2 – происходит изменение конформационной координаты Q: релаксация канала со временем в минимум правой ветви КП (О). Соответственно, канал оказывается в электронно и конформационно открытом состоянии.
Схема 2. Закрытие канала. В начальный момент времени канал находится в открытом состоянии в минимуме (О) на ветви КП . Наблюдаются следующие изменения степеней свободы RyR-канала:
1 – ионы Са2+ отсоединяются от активационного центра канала, происходит переход на более высокий энергетический уровень, т.е. изменение электронной степени свободы и переход на ветвь КП .
2 – происходит изменение конформационной координаты Q, релаксация в минимум левой ветви КП (С). В итоге RyR-канал электронно и конформационно закрыт.
Переходы между состояниями на вышеприведенных схемах в рамках рассматриваемой модели будут подробно описаны далее.
Изменение конформационной координаты канала Q можно описать с помощью уравнения Ланжевена [105]:
(2.7)
где M – параметр эффективной массы RyR-канала (для упрощения принимается М=1);
– переменная, описывающая электронное состояние канала ( – электронно-закрытое, и – электронно-открытое); – параметр конформационного «трения» (параметр диссипации); – сила случайных температурных флуктуаций в конформационной динамике RyR-канала.
Если пренебречь случайными тепловыми флуктуациями (), то уравнение Ланжевена является вторым законом Ньютона. В этом случае (2.5) описывает процессы релаксации конформационной координаты по ветвям конформационного потенциала к их минимумам: – для электронно-закрытого, – для электронно-открытого канала (рис.2.2).
Как уже отмечалось ранее, процесс активации RyR-каналов напрямую зависит от концентрации Са2+ в cis-части и является результатом связывания ионов Са2+ с активационными центрами RyR-канала. Результаты экспериментальных исследований [106, 107] говорят о том, что переходы в открытое состояние наблюдаются при достаточно малом уровне Са2+ в cis-части (~0.1 мкM).
Электронная степень свободы, в отличие от конформационной, является дискретной и в ЭК-модели описывается как марковский процесс с двумя состояниями (0 и 1).
Описание электронных переходов в ЭК-модели строится на предположении, что они обусловлены взаимодействием Са2+ с активными центрами канала, а их интенсивность зависит от энергии ионов Са2+ и энергии канала в текущем конформационном состоянии.
По аналогии с теорией неупругого рассеяния предполагается, что взаимодействие Са2+ с активными центрами рассматривается как резонансное рассеяние. В связи с этим, такие переходы носят резонансный характер, причем вероятность перехода может быть аппроксимирована спектральной функцией Лоренца (формулой Брейта-Вигнера) [109]:
(2.8)
Где Е энергия ионов, энергия возбуждения (разность энергий двух ветвей конформационного потенциала), полуширина резонансного пика, амплитуда вероятности, зависящая от концентрации ионов в диадном пространстве.
Таким образом, описанные выше электронные переходы являются следствием взаимодействия активных центров канала с ионами Са2+, и их интенсивность зависит не только от концентрации данного субстрата, но и от энергии ионов Са2+, способных связываться с активными центрами.
Как отмечалось ранее, в работах [22-24] предполагается, что у RyR-канала наряду с активационными существуют так называемые инактивационные центры; на этом предположении основано большое количество моделей по исследованию кинетических свойств канала [24, 33, 34]. Экспериментально выявлено [25], что связываясь с активационным центром канала ионы Са2+ переводят канал в конформационно открытое состояние, и наоборот, связываясь с инактивационным центром – закрывают канал.
Ранее в электронно-конформационной модели учитывались только электронные переходы, связанные с присоединением ионов Са2+ к активационному центру [93-95]. C целью более подробного описания процессов взаимодействия ионов Са2+ с каналом проведена модификация электронно-конформационной модели RyR-канала. В данной работе впервые введено третье электронное так называемое инактивационное состояние, электронный переход в который соответствует присоединению ионов Са2+ к инактивационному центру канала.
Предположительно, связываясь с инактивационным центром, ионы Са2+ переводят систему на более высокий энергетический уровень, которое является адсобционным. Другими словами, вероятность перехода в это состояние и вероятность выхода из него должна быть достаточно мала.
Одна из типичных схем динамики RyR-канала при стационарных условиях, основанная на этом предположении, приводится на рисунке 2.4а.
При описании ЭК-модели конформационная координата Q рассматривается как классическая переменная, однако, ее квантовое обобщение можно связать с эффектами, вызванными квантованием конформационного движения [86]. При этом полученные в результате квантования энергетические спектры могут быть сгруппированы в две перекрывающиеся полосы, образованные из открытых электронных "вверх" и "вниз" состояний. Спектры этих состояний можно условно разделить на две ветви конформационного потенциала [108]. Такой подход часто используется в квантовой механике. На рисунке 2.4б изображены энергетические уровни открытого, закрытого и инактивационного состояния. Как уже отмечалось, энергетические уровни инактивационного состояния лежат выше уровней, соответствующих открытому и закрытому состояниям.
Открытие канала (стрелки 1 и 2) происходит так же, как представлено на схеме 1 (рис. 2.3). Однако согласно новым предположениям, находясь в состоянии (O), канал может перейти в инактивационное состояние (I) с достаточно малой вероятностью (штрихпунктирная стрелка 3). Следует отметить, что переход в инактивационное состояние также возможен и из состояния (С).
Для предложенного инактивационного состояния предполагается, что вероятность электронного перехода в это состояние, также как и электронная активация, должна зависеть от cis[Ca], в то время как вероятность отсоединения ионов Са2+ в значительно меньшей степени зависит от концентрации Са2+.
Таким образом, переходы в инактивационное состояние, введенное в данной работе, являются чисто электронными, и вследствие того, что вероятности перехода в это состояние и выхода из него малы, оно является адсорбционным.
В данной работе электронные переходы разделяются на два вида (активация и инактивация), в связи с этим можно ввести несколько вероятностей электронных переходов, обозначенных на рисунке 2.5.
(activation site binding) – вероятность изменения электронной степени свободы из-за связывания ионов Са2+ с активационным центром.
(activation site unbinding) – вероятность изменения электронной степени свободы из-за отсоединения ионов Са2+ от активационного центра.
(inactivation site binding) – вероятность изменения электронной степени свободы из-за связывания ионов Са2+ с инактивационным центром.
(inactivation site unbinding) – вероятность изменения электронной степени свободы из-за отсоединения ионов Са2+ от инактивационного центра.
Существуют экспериментальные данные по изучению процессов активации/инактивации RyR-каналов ионами Са2+, которые показывают, что активационный центр канала обладает более высоким сродством к ионам Са2+, чем инактивационный [24]. На основе анализа этих исследований в данной работе сделано предположение о том, что для осуществления инактивации RyR-канала необходимо бόльшее количество ионов Са2+ для связывания с инактивационным центром, чем количество ионов, связывающихся с активационным центром в процессе активации (предположительно 3-4 для активационного и 7-8 для инактивационного центров [23, 35]). Исходя из всего этого, процесс активации/инактивации в электронно-конформационной теории может быть описан в рамках упрощенной модели «качелей со сдвинутой осью» (рис. 2.6).
Данная упрощенная схема наглядно показывает процесс изменения состояния системы в ту или иную сторону при конкурирующих процессах, причем для изменения состояния на активационную часть требуется меньшее воздействие, чем на инактивационную.
На рисунке 2.7 представлена схема изменения состояния RyR-канала согласно упрощенной схеме «качели со сдвинутой осью». На схеме отмечены основные состояния «качелей» и соответствующие им положения на конформационном потенциале. Как и на рисунке 2.6, левая сторона «качелей» соответствует активационному центру канала (A), правая – инактивационному (I).
Звездой (*) отмечены центры, заполненные ионами. Открытому состоянию канала соответствует правый минимум конформационного потенциала, то есть состояние A*I, а инактивированному – состояния A*I и A*I*.
В настоящей работе активационный и инактивационный центры каналов рассматриваются как дискретные комплексы, состоящие из определенного числа активных мест связывания (za и zi, соответственно), в которые могут попадать ионы Са2+. Зависимость амплитуды вероятности электронных переходов от концентрации cis[Ca] определяется в статистических терминах [A12].
Примитивная схема, описывающая процесс попадания ионов в места связывания активационного и инактивационного центров RyR-канала ионами Са2+ представлена на рисунке 2.8. При попадании на активный центр более чем k ионов должно произойти дальнейшее изменение конформационного состояния канала в ту или иную сторону в зависимости от того, с активационным или инактивационным центром происходит связывание.
Распределение вероятности присоединения ионов Са2+ к активным центрам на активационном и инактивационном центрах RyR-канала имеет биномиальный вид. Соответственно, вероятность попадания более чем k ионов в z секторов активного центра равна:
, (2.10)
где z – число активных мест связывания центра, k – число ионов Са2+, – относительная концентрация Са2+ в cis-части, – максимальное значение cis[Ca].
При большом значении параметра z и при достаточно малой вероятности с биномиальное распределение преобразуется в распределение Пуассона:
. (2.11)
Вероятность электронных переходов из электронно открытого в электронно закрытое состояние, связанная с незаполненностью активационного центра ионами Са2+, пропорциональна вероятности реализации более чем z-k пустых активных мест связывания в текущий момент времени:
, (2.12)
а при больших значениях z:
. (2.13)
Применение статистического подхода к описанию процессов, связанных с взаимодействием ионов Са2+ с активными центрами RyR-канала, позволило в данной работе провести параметрический анализ предложенной модели и дать физическое обоснование выбору параметров вероятностей переходов между состояниями RyR-канала.
Наряду с электронными переходами и конформационной динамикой в ЭК-модели рассматривается возможность квантовых туннельных “не-франк-кондоновских” переходов через энергетический барьер между различными электронными состояниями с одинаковой энергией. Квантовое туннелирование часто определяют как низкотемпературный предел вероятности перехода через потенциальный барьер (рис. 2.9).
Строго говоря, конформационная координата Q может быть проквантована, и также как для колебания атомов в молекулах и кристаллических решетках, вместо классического вида конформационного потенциала можно перейти к дискретному спектру конформационных состояний (рис. 2.9). Однако, учитывая гигантскую массу RyR-канала можно считать эффекты квантования относительно несущественными и пользоваться классическим пределом.
При описании динамики RyR-канала в ЭК-модели рассматривается возможность квантовых туннельных переходов через энергетический барьер между различными электронными состояниями, энергии которых равны (рис. 2.10).
Как видно из рисунка 2.10 потенциальный барьер имеет почти треугольный вид. Для потенциального барьера вероятность туннелирования зависит от высоты и ширины барьера и подчиняется эффективному закону Гамова:
, (2.14)
где – ширина барьера, – высота энергетического барьера, – безразмерный параметр, определяющий неоднородность зависимости .
В данной работе под термином «туннелирование» понимается суперпозиция квантового эффекта резонансного туннелирования и классических переходов через энергетический барьер посредством термофлуктуаций [110].
Проводимость RyR-канала, то есть способность пропускать через себя ионы Са2+, напрямую зависит от степени его «открытости». Как уже отмечалось, в ЭК-модели эта характеристика обусловлена конформационным состоянием (значением конформационной координаты Q). Этот факт позволяет исследовать активность канала и моделировать изменение потока ионов Са2+ через RyR-канал.
Для электронно открытого состояния зависимость проницаемости от конформационной координаты описывается формулой:
, (2.15)
а для электронно закрытого:
,
где – максимальная проводимость RyR-канала, – некоторое критическое значение конформационной координаты, при которой , – параметр, определяющий утечку Са2+ через закрытый канал: , (), n – коэффициент Хилла, характеризующий нелинейность зависимости (рис. 2.11).
В простейшем приближении проводимость RyR-канала можно аппроксимировать ступенчатой функцией, пренебрегая промежуточными значениями проводимости канала:
, (2.16)
В этом случае при Q>0 проводимость канала сразу достигает своего максимального значения.
Таким образом, построена модель, которая в дальнейшем используется для проведения численных экспериментов и объяснения основных эффектов, обнаруженных экспериментально и связанных с процессами активации RyR-каналов ионами Са2+ . В отличие от ранее предложенных многочисленных феноменологических моделей динамики RyR-канала она является физически и физиологически обоснованной.
В данном разделе рассмотрено обобщение электронно-конформационной модели одиночного RyR-канала для кластера взаимодействующих RyR-каналов в высвобождающей единице.
Для описания динамики внутриклеточного Са2+ использовалась теория высвобождающих единиц [90], которая позволяет описать зависимости концентрации Са2+ от времени в различных отделах (компартментах) высвобождающей единицы. Модификация теории высвобождающих единиц заключается в подробном описании динамики кластера RyR-каналов в рамках электронно-конформационной модели.
Интеграция электронно-конформационной модели взаимодействующих RyR-каналов в модель высвобождающих единиц позволила разработать объединенную теорию, в рамках которой проводилось моделирование автоосциляционных процессов динамики ионов Са2+ в кардиомиоцитах.
Применительно к особому типу кардиомиоцитов – клеткам водителей сердечного ритма данная объединенная теория позволяет описать автоволновую активность этого типа клеток. Проявление авторитмической активности клеток водителей сердечного ритма объяснено на основе существования внутренних Са2+-осцилляторов, самосогласованно взаимодействующих с внешним мембранным осциллятором.
2.2.1.1 Гамильтониан решетки RyR-каналов
Кластер RyR-каналов на мембране СР в высвобождающей единице представляется как квадратная решетка RyR-каналов с общим числом каналов до 100, каждый из которых описывается электронно-конформационной моделью одиночного RyR-канала.
В данной работе рассмотрение сопряжения каналов в кластере ограничивалось приближением, учитывающим взаимодействия только ближайших соседних каналов с «упругой» константой взаимодействия . С учетом этих условий гамильтониан канала с номером m в решетке может быть представлен в виде:
(2.17),
где , – матрицы Паули; и – номер канала в решетке (каналы пронумерованы от 1 до 81). При этом предполагается, что конформационные взаимодействия испытывают только соседние RyR-каналы, поэтому если и – номера ближайших соседей, то , и в остальных случаях.
Две ветви конформационного потенциала каждого канала решетки определяется формулой:
. (2.18)
Для частного диабатического случая ( при , ) конформационный потенциал (2.5) с учетом взаимодействия в приближении ближайших соседей принимает вид:
. (2.19)
Как и в случае изолированного канала (2.5), конформационный потенциал в диабатическом случае имеет форму двух пересекающихся парабол.
2.2.1.2 Влияние концентрации Са2+ в люмене на вид конформационного потенциала RyR-канала
При рассмотрении влияния ионов Са2+ на канал со стороны trans-части в модели изолированных RyR-каналов введен параметр эффективного давления p (2.6). Можно провести аналогию между уровнем в липидном бислое in vitro и значением концентрации Са2+ в люмене СР () in vivo:
, (2.20)
где – уровень , при котором параметр имеет нулевое значение, – коэффициент Хилла. Параметр эффективного давления, как отмечалось ранее, лежит в интервале: . В терминах уровня заполнения люмена ионами Са2+ значение соответствует минимальному, а р=1 – максимальному заполнению люмена.
Как уже отмечалось в предыдущей главе, эффективное давление является одним из важнейших параметров, определяющих форму конформационного потенциала и устойчивость того или иного состояния RyR-канала.
Для моделирования динамики RyR-каналов в решетке высвобождающей единицы можно пренебречь существованием инактивационного состояния, подробно описанного во второй главе данной работы, в связи с тем, что характерные времена работы внутриклеточных Са2+-«часов» малы по сравнению с характерными временами перехода RyR-канала в инактивационное состояние [24]. В дальнейшем использована простейшая схема открытия/закрытия RyR-каналов в процессе заполнения/высвобождения Са2+.
Данная схема (рис. 2.12) включает в себя процессы электронной активации (стрелка 1), медленную конформационную динамику (стрелка 2) и, наконец, туннелирование из метастабильного состояния в глобальный максимум (стрелка 3).
Для упрощения в формуле вероятности электронных переходов (2.8) предполагалось , так что и не зависит от энергии ионов . Зависимость вероятности электронной активации от концентрации полагалась “пороговой”:
, (2.21)
где – амплитуда вероятности электронных переходов, α – параметр, – некоторое критическое значение уровня . Для наглядности зависимость приведена на рисунке 2.13.
Для создания замкнутой модели высвобождающей единицы с учетом стохастической динамики RyR-каналов была установлена связь между параметрами теории высвобождающей единицы и ЭК-моделью.
В модели высвобождающей единицы поток высвобождающегося Са2+ в диадное пространство зависит от числа открытых каналов в кластере.
, (2.22)
где – «открытость» канала, где – значение конформационной координаты точки локального максимума нижней ветви C конформационного потенциала (3.3.3) (см. рис. 2.3).
Таким образом, динамика концентрации кальция в отделах высвобождающей единицы вызывает изменение параметра , который влияет на динамику состояний RyR-каналов, и как следствие, на число открытых RyR-каналов Nopen. Переменная Nopen, в свою очередь, определяет скорость высвобождения кальция из люмена СР.
На основе вышеизложенных положений получена замкнутая объединенная модель, на базе которой в данной работе проводилось численное моделирование динамики Са2+ в отделах кардиомиоцитов.
Разработка модели Са2+-высвобождающей единицы основана на широко известной модели структуры клетки (рисунок 2.14) [90, 112, 113], состоящей из четырех основных компонентов: диадного пространства, цитозоля, сети СР и просвета ТЦ (люмена) СР. Особенностью данного представления является рассмотрение обобщенной Са2+ высвобождающей единицы.
Основываясь на схеме динамики Са2+ в клетке, введены четыре кальциевых потока между отделами клетки:
1. Поток заполнения люмена (от англ. refill – заполнять), его значение зависит от параметра скорости заполнения и разности концентраций Са2+ в сети СР и в люмене и определяется как:
. (2.23)
2. Поток высвобождения Са2+ из люмена (от англ. release – высвобождать), величина которого зависит от числа открытых каналов в кластере высвобождающей единицы и от величины потока Са2+ через одиночный открытый канал :
. (2.24)
Значение потока Са2+ через одиночный канал определяется формулой:
, (2.25)
где – параметр скорости высвобождения, – концентрация Са2+ в люмене, – концентрация Са2+ в диадном пространстве.
3. Диффузионный поток между диадным пространством и цитозолем , значение которого зависит от градиента концентраций Са2+ в диадном пространстве и в цитозоли и определяется как:
, (2.26)
где – параметр скорости диффузии.
4. Поток заполнения сети СР (от англ. uptake – накачка). Процесс накачки СР кальцием против градиента концентрации требует энергетических затрат (фосфорилляция молекул АТФ), значение потока зависит от концентрации Са2+ в цитозоле и от параметров Са2+-насоса: (скорость накачки) и (чувствительность насоса). Для зависимости потока от концентрации Са2+ была использована формула, заимствованная из модели [54]:
. (2.27)
Кальциевые потоки в упрощенной модели сердечной клетки (рис. 2.14) с учётом квазистационарного взаимодействия с кальциевыми буферами описываются стандартной системой дифференциальных уравнений [91]:
(2.28)
В модели учитывается связывание ионов Са2+ с регуляторными глобулярными белками – буферами, которые участвуют в процессе мышечного сокращения. Были учтены следующие Са2+-связывающие буферы, содержащиеся в кардиомиоците: кальсеквестрин, кальмодулин, тропонин.
Параметры концентраций буферов, учитывающиеся в модели, взяты из работы [85]: CQtot = 10-2 М полная концентрация кальсеквестрина, CMtot = 45·10-6 М полная концентрация кальмодулина, TCtot = 31·10-6 М - полная концентрация тропонина C. константы отношений объемов и отделов клетки (рис. 2.14) ( = 40, = 9.7, = 0.12, = 0.022). = 833·10-6 M, = 2.4·10-6 M, = 5·10-6 M – константы диссоциации соответствующих буферов. Следует отметить, что все эти параметры выбраны как типичные для интегративной модели, а не для модели одиночной высвобождающей единицы.
Другими словами, было предположено, что все RyR-каналы формируют систему идентичных высвобождающих единиц, функционирующих согласованно. Параметры ЭК модели (2.5, 2.7, 2.8) при проведении численных экспериментов имели следующие значения: a = 5, K = 12, , Г = 7. Параметры туннелирования: A = 1, = 0.01 [A2].
Электронно-конформационное состояние RyR-канала описывается стохастическим дифференциальным уравнением (2.7) со случайным изменением правой части и с переключением вследствие электронных и туннельных переходов (2.8, 2.10).
В формулах (2.4, 2.5) переменная электронного состояния является дискретной и принимает два значения: 0 (электронно закрытое) и 1 (электронно отрытое состояние). Слагаемое в уравнении (2.7) отвечает за аддитивные шумы в виде случайного винеровского процесса. Таким образом, компьютерная реализация ЭК модели должна быть основана на численных методах интегрирования стохастических дифференциальных уравнений и методах реализации марковских процессов. Сочетание этих методов позволило построить две численные схемы для получения наборов реализаций.
Наиболее известным методом решения дифференциальных уравнений со случайными членами является явный метод Эйлера, обобщенный для стохастических уравнений Марайамой (Maruyama) в 1955 году, поэтому этот метод иногда называют методом Эйлера-Марайамы [114, 115].
Стохастическое дифференциальное уравнение Ито, описывающее изменение со временем некоторой переменной , имеет вид [115]:
, (2.29)
Пусть оно задано на интервале времени [0; T] с начальными условиями , где и – измеримые функции, а отвечает за винеровский процесс. Данный интервал времени можно дискретизировать с шагом , где L – число шагов на выбранном интервале. Дискретный набор моментов времени на интервале обозначается как: , – приближенное решение уравнения (2.29) на каждом i-ом шаге.
Согласно схеме Эйлера-Марайамы решение на последующем шаге находится как:
, (2.30)
где – приращение винеровского процесса, для которого справедливо соотношение [115]:
,
где – нормально распределенная случайная величина с нулевым средним и единичной дисперсией. С учетом этого схема метода принимает вид:
где - нормально распределенная случайная величина (N(0,1)), вычисленная методом Монте Карло на i-ом шаге интегрирования системы уравнений.
Если обозначить скорость изменения координаты Q как , то для уравнения Ланжевена (2.7) в ЭК-модели, описывающего изменение конформационной координаты RyR-канала, метод Эйлера-Марайамы имеет вид:
(3.31)
Электронные и туннельные переходы в ЭК-модели можно представить в терминах дискретного марковского процесса с различными вероятностями переходов между состояниями марковской цепи. Для описания случайных марковских процессов обычно используют метод Монте-Карло, который заключается в применении генератора псевдослучайных чисел для моделирования случайного процесса переходов между состояниями.
Простейшим способом описания инактивационного состояния является введение новой переменной μ, принимающей два значения: μ=1, если канал инактивирован, μ=0 в остальных случаях. Если ввести функцию Хэвисайда , то с учетом новой переменной адиабатический конформационный потенциал (2.4) имеет следующей вид:
, (2.32)
где – энергия инактивационного состояния.
Диабатический конформационный потенциал (2.5) может быть описан следующей формулой:
. (2.33)
Для инактивационного состояния, была введена новая переменная μ.
Рассмотрим состояние канала 1: в определенный момент времени . В следующий момент времени система может оказаться в состояниях 2: или 3: или 4: (рис. 2.15).
Предполагается, что потоки событий электронных и туннельных переходов между состояниями являются пуассоновскими. Опираясь на это предположение, дискретизируем марковский процесс с таким малым шагом по времени , что за этот промежуток времени может произойти только одно событие перехода.
На каждом шаге интегрирования случайного процесса вероятности туннельного, электронного перехода между ветвями КП и вероятность перехода в инактивационное состояние определялись следующим образом:
(3.34)
Так как события туннельных и электронных переходов являются независимыми, то вероятность покинуть состояние 1 за время равна .
Однако для построения цепи нужно знать еще вероятности переходов в «состояние 2» и «состояние 3» при условии, что канал покинет «состояние 1». Эти вероятности могут быть вычислены по следующим формулам:
(2.35)
В данной работе предполагается, что при осуществлении быстрых переходов не происходит изменения конформационной координаты по уравнению Ланжевена. Медленная конформационная динамика в течение промежутка времени реализуется только в отсутствии быстрых переходов.
На основе сделанных предположений была получена марковская цепь, которая реализовывалась с помощью метода Монте-Карло. В рамках этого метода нормально распределенная случайная величина задается на i-том шаге реализации процесса в момент времени на отрезке [0,1] и сравнивается с вычисленной вероятностью электронных переходов между ветвями КП. Если выполняется условие , реализуется электронный переход между ветвями КП. В ином случае определялась следующая случайная величина , которая сравнивалась с условной вероятностью туннельного перехода. По аналогии с предыдущим случаем, если , то реализуется туннельный переход, в другом случае определяется случайная величина . При моделируется инактивационный переход, в противном случае вычисляется конформационная координата на текущем шаге по уравнению Ланжевена.
Повторяя описанную процедуру раз, где Т – длительность эксперимента, и вычисляя конформационную динамику на отрезках , на которых отсутствуют переходы, можно получить одну реализацию случайного процесса, которая является приближением исходного марковского процесса электронных и туннельных переходов.
Объединяя методы Эйлера-Марайамы для реализации конформационной динамики, метод марковских цепей и метод Монте-Карло для реализации туннельных и электронных переходов, была получена численная схема для реализации электронно-конформационной модели рианодинового канала, которая выглядит следующим образом:
7.1 Вычисление вероятности электронного перехода ;
7.2 Вычисление вероятности туннельного перехода ;
7.3 Если , то
7.4 Определение случайного числа , подчиненное равномерному распределению на этом отрезке;
7.5 Если , то
7.6 Если , то , иначе:
7.7 Определение случайного числа , подчиненное равномерному распределению на этом отрезке;
7.8 Если , то , иначе:
7.9 Если , то
7.9.1 Определение случайного числа , подчиненное равномерному распределению на этом отрезке;
7.9.2 Если , то
8. Если =1:
8.1 Определение случайного числа , подчиненное равномерному распределению на этом отрезке;
8.2 Если , то , и
9. Изменение счетчика цикла ;
10. Если , то переход к (4), иначе вычисление закончено.
В результате реализации численной схемы формируются векторы , , являющиеся приближениями решения начальной задачи для ЭК-модели в моменты времени .
Система обыкновенных дифференциальных уравнений (2.28), описывающая зависимости концентраций Са2+ в отделах кардиомиоцитов от времени решалась в данной работе с помощью обыкновенного метода Эйлера, причем концентрации в каждом из отделов определялись в каждый момент времени .
Преимуществом данной схемы численной реализации является ее универсальность. Схема подразумевает возможность изменения вида конформационного потенциала и упрощение в связи с пренебрежением некоторыми переходами на больших интервалах времени.
Для численных экспериментов на базе модели высвобождающей единицы с интегрированной в нее ЭК моделью динамики RyR-каналов были разработаны алгоритмы, позволяющие производить расчет при различных условиях экспериментов и различных наборах параметров. Эти алгоритмы реализованы в виде комплекса программ, состоящего из двух частей. Первая часть является расчетно-демонстрационной, вторая предназначена для обработки результатов численных экспериментов.
Первая часть представляет собой вычислительную систему, ядро которой реализовано в программной среде Borland C++ Builder 6 (рис. 2.16) и является большим программным комплексом с удобными для пользователя интерфейсом и аппаратом управления моделируемыми процессами.
Особенностью, разработанного в данной диссертационной работе, программного комплекса является его многозадачность. Этот комплекс называется ReleaseUnit.exe и при определенном выборе опций в программе позволяет независимо проводить следующие эксперименты:
При проведении данного типа экспериментов в программе исследуются кинетические характеристики RyR-каналов при различных параметрах ЭК-модели. В программе осуществляется усреднение по ансамблю таких кинетических характеристик, как вероятность пребывания канала в открытом состоянии, времена пребывания в открытом и закрытом состояниях и др.
В данном классе экспериментов исследуется влияние взаимодействия между RyR-каналами на кинетические характеристики всего кластера.
Частично обработка и аппроксимации результатов экспериментов проводились во второй части комплекса программ, реализованных в системе Wolfram Mathematica 5.0-8.0 (рис. 2.17), пакете символьной математики с огромными возможностями вычислений и обработки данных.
Первичный параметрический анализ модели и апробация численных методов для оптимального решения уравнений модели проводились в данной среде. Однако в связи с большими затратами времени для расчетов среда Wolfram Mathematica не удовлетворяла потребностям при решении поставленных задач при проведении длительных экспериментов (10-15 мин для 20000 итераций для каждого набора параметров модели).
Программный комплекс включает в себя более десяти программ, позволяющих решить задачи численного моделирования и обработать результаты экспериментов.
Дан краткий обзор электронно-конформационной модели RyR-канала, предложенной ранее в работах [A2, A3, 93, 94].
В развитие модели дан детальный анализ различных параметров и факторов, влияющих на динамику канала, таких как концентрация Са2+ в cis и trans-частях вблизи канала и кооперативная динамика кластера RyR-каналов.
Впервые в ЭК-модели предложено введение инактивационного состояния, соответствующего взаимодействию ионов Са2+ с инактивационными центрами RyR-канала.
Впервые в рамках электронно-конформационной теории предложена модель взаимодействия ионов Са2+ с активационным центром RyR-канала, учитывающая вероятности заполнения мест присоединения активационного центра ионами Са2+.
Дана детализация модели туннельных переходов, включающая введение «зоны разрешенного туннельного перехода» вблизи минимума конформационного потенциала RyR-канала.
ЭК-модель кластера RyR-каналов объединена с моделью Са2+-высвобождающей единицы с целью детального изучения работы внутренних Са2+-«часов» в клетках водителя сердечного ритма на макромолекулярном уровне.
Разработан многоцелевой компьютерный комплекс, реализующий алгоритмы численного решения уравнений электронно-конформационной модели, на базе которого проводились серии экспериментов, результаты которых представлены в главах 3 и 4 данной работы.
Моделирование динамики RyR-канала проводилось в рамках схемы, представленной на рисунке 3.1. Данная схема предполагает наличие трех энергетических уровней (E+, E-, I), двух типов переходов между ними и медленной конформационной динамики к минимумам конформационного потенциала.
В ходе проведения численных экспериментов изучались зависимости конформационной координаты Q RyR-канала от времени при постоянном значении cis[Ca] для различных значений основных параметров ЭК модели (рис. 3.2).
Варьирование параметров модели меняет характер динамики RyR-канала. Как видно из графиков, коэффициент упругости канала К влияет на максимальное и минимальное значения конформационной координаты Q. Параметр эффективного трения Г влияет на скорость релаксации RyR-канала к локальному минимуму КП. Видно, что при достаточно малых значениях Г наблюдается колебательный характер динамики RyR-канала вблизи конформационного минимума, а при достаточно больших Г колебаний вблизи минимума не наблюдается.
В ЭК модели, согласно формуле (2.10), вероятность электронных переходов зависит от концентрации Са2+ в cis-части, в связи с этим, при изменении cis[Ca] меняется частота переходов канала из одного состояния в другое и длительность пребывания в открытом и закрытом состояниях.
Подробно влияние параметров модели на характер динамики RyR-канала рассмотрено в данной работе далее (см. п.п. 3.2.1, 3.2.2).
При проведении численных экспериментов исследовалась динамика одиночного RyR-канала. В начальный момент времени канал находился в электронно- и конформационно-закрытом состоянии. Результаты экспериментов по изучению зависимости конформационной координаты Q от времени обрабатывались с помощью метода нормированного размаха (R/S-анализ или метод Херста) [43, 116].
Этот метод позволяет выявить скоррелированность определенного ряда данных на больших интервалах времени и определить фрактальную размерность временного ряда – размерность Хаусдорфа-Безиковича: , где Н – показатель Херста.
Согласно [116], значения Н>0.5 указывают на положительную корреляцию (персистентный процесс), а Н<0.5 на отрицательную корреляцию (антиперсистентный процесс) измеряемой величины со временем. И тот и другой процессы являются процессами с «памятью», когда последующие события определяются предшествующими. Величина Н=0.5 характеризует случайный процесс.
Среднее значение координаты Q на промежутке времени τ определяется как:
, (3.1)
где t – дискретное время с шагом dt. В данной работе dt выбиралось равным 0.05 c, длительность эксперимента: =1 с.
Накопившееся отклонение конформационной координаты от среднего значения определяется как: . Разность между максимальным и минимальным значениями Q(t) в выборке (кумулятивное отклонение от среднего) на интервале времени τ описывается формулой:
, (3.2)
Стандартное отклонение Q(t) от :
. (3.3)
Величина R/S носит название нормированного размаха. Как показал Херст [116], для многих временных рядов наблюдаемый нормированный размах хорошо описывается эмпирическим соотношением: .
Показатель Херста Н определяется через тангенс наклона прямой , полученной в результате аппроксимации точек прямой методом линейной регрессии в логарифмических координатах. Этот показатель характеризует скоррелированность членов исследуемого ряда.
При анализе результатов численных экспериментов по изучению зависимости Q(t) на интервале времени , вводилась новая переменная – число шагов dt на интервале времени . На рисунке 3.3 приведен пример ()-зависимостей (графиков Херста), построенных в логарифмических координатах, для дискретного временного ряда Q(t) при двух различных значениях параметра эффективного трения Г (рис. 3.3а) и при двух значениях коэффициента упругости канала К (рис. 3.3б).
На основании полученных зависимостей можно сделать вывод, что динамика RyR-канала в рамках ЭК-модели является сильно коррелированной (H ≈ 1.0) на относительно коротком промежутке времени, сравнимом с длительностью конформационной релаксации канала в метастабильный минимум потенциала, соответствующий открытому состоянию, и слабо коррелированной на длительных промежутках времени (H ≈ 0.5).
Основываясь на результатах проведенного R/S-анализа, можно заключить, что в рамках электронно-конформационной модели динамика координаты Q канала является не только стохастической, но и детерминированной, причем на коротких интервалах времени, и при этом исследуемая система обладает «памятью».
Следует отметить, что на сегодняшний день в литературе отсутствуют экспериментальные данные, указывающие на фрактальные свойства RyR-каналов, поэтому необходим более детальный экспериментальный анализ конформационных изменений RyR-канала с целью подтверждения результатов, полученных с помощью представленной здесь модели.
Для предсказания поведения исследуемой системы требуется детальный параметрический анализ как медленной конформационной динамики, так и быстрых переходов RyR-канала в рамках ЭК модели.
На первоначальном этапе с целью изучения активности одиночного RyR-канала исследовалось влияние основных констант конформационного потенциала (2.4) и коэффициентов, входящих в уравнение Ланжевена (2.7) на характер динамики канала.
Коэффициент эффективного трения Г, входящий в уравнение Ланжевена (2.7), влияет на характер изменения конформационной координаты Q со временем. Приведенное уравнение (М=1) изменения конформационной координаты при отсутствии тепловых возмущений () может быть записано в терминах затухающего гармонического осциллятора:
, (3.4)
где – характерная частота колебаний гармонического осциллятора.
При малом трении (Г<2) общее решение может быть представлено в виде [118]:
, (3.5)
где – частота свободных колебаний; А, φ – амплитуда и фаза затухающих колебаний, соответственно.
При Г=2 затухание называется критическим. Начиная с этого значения коэффициента трения, система совершает так называемое неколебательное движение. В этом случае движение происходит по закону:
, (3.6)
где А и В – константы.
Критическое затухание примечательно тем, что именно в этом случае осциллятор быстрее всего стремится к положению равновесия, причем, если коэффициент трения Г меньше критического, то он дойдет до положения равновесия быстрее, однако, при этом «проскочит» его по инерции. В этом случае осциллятор будет совершать колебания вблизи точки минимума.
При значениях Г больше критического (Г>2) решение выглядит следующим образом:
, (3.7)
где . В этом случае осциллятор будет экспоненциально стремиться к положению равновесия, причем тем медленнее, чем больше трение.
Поскольку в электронно-конформационной модели , то критическое значение трения определяется как:
. (3.8)
Величина коэффициента Г варьировалась выше и ниже критического значения . При фиксированном значении параметра К=12 значение Гcrit≈6.8. При Г< Гcrit наблюдались колебания системы вблизи минимума потенциала (рис. 3.4а, колебания отмечены пунктирным прямоугольником). При Г> Гcrit наблюдался неколебательный случай динамики RyR-канала (рис. 3.4б)
При проведении дальнейших численных экспериментов параметр Г выбирался по значению больше критического (Г=7).
Конформационный потенциал (2.4) имеет два локальных минимума со следующими конформационными координатами:
. (3.9)
Первый минимум соответствует закрытому, второй - открытому состоянию канала. Положение этих минимумов зависит от величины коэффициента упругости К.
Варьируя значения К в широком интервале [1; 20] при фиксированном наборе остальных коэффициентов в (2.4), можно исследовать влияние этого параметра на свойства конформационного потенциала. Типичные графики конформационного потенциала представлены на рисунке 3.5.
Как видно из рисунков 3.5 и 3.6, с увеличением значения коэффициента K уменьшается расстояние между минимумами КП и крутизна ветвей КП. При изучении конформационной динамики канала исследовалось среднее время релаксации канала из точки, соответствующей одному минимуму КП в другой минимум ().
Как показывает график, представленный на рисунке 3.7, с ростом К уменьшается значение . Другими словами, варьируя параметр К, можно менять скорости конформационной релаксации канала в ЭК-модели. В дальнейших экспериментах значение К выбиралось равным 12.
Выбор интервала значений параметра а, характеризующего электронно-конформационное взаимодействие, а также изучение влияния этого параметра на форму потенциала (2.4) необходимы для успешного проведения компьютерных экспериментов.
При анализе влияния параметра а на свойства КП выбирался случай при , который соответствует условиям глобального минимума закрытого состояния канала. При этом значении p построены конформационные потенциалы при различных значениях параметра а и при К=12 (рис. 3.8).
Как видно из графика, при а < 2 минимум правой ветви КП лежит левее точки пересечения ветвей КП, а это означает отсутствие локального минимума, отвечающего за открытое состояние RyR-канала.
Необходимо оценить интервал значений параметра а, при котором наблюдается стабильность правого локального минимума потенциала. Это условие выполняется в том случае, когда минимум находится правее точки пересечения ветвей потенциала. Данная точка имеет координаты (0;0). Правый минимум имеет координаты (; ), вследствие чего должно выполняться неравенство:>0.
Отсюда следует, что при минимальном значении параметра р=-1 безразмерный параметр а должен принимать значение больше 2. При проведении численных экспериментов, приведенных в данной работе, параметр а принимался равным 5.
Как видно из рисунка 3.8, расстояние между минимумами КП увеличивается с ростом а, вследствие этого уменьшается время релаксации канала из одного локального минимума КП в другой (trelax) (рис. 3.9).
При проведении численных экспериментов с достаточно большой длительностью, исследуя стохастическую динамику RyR-канала, можно пренебречь медленной конформационной динамикой. Быстрые электронные и туннельные переходы можно описать в рамках традиционной марковской схемы, имеющей ряд преимуществ. Во-первых, марковские схемы обладают достаточной простотой математического аппарата; во-вторых, алгоритмы численной реализации являются быстрыми, и с помощью них можно оценить средние времена пребывания канала в открытом, закрытом и инактивационном состояниях при различных значениях интенсивностей электронных и туннельных переходов.
В связи с тем, что в ЭК-модели электронные переходы связаны с взаимодействием ионов Са2+ с активными центрами RyR-канала, можно
В связи с тем, что в ЭК-модели электронные переходы связаны с взаимодействием ионов Са2+ с активными центрами RyR-канала, можно
Как и на рисунке 2.7, введено обозначение A – активационный центр, I – инактивационный центр канала. Знаком * обозначена связанность ионов Са2+ с тем или иным центром, например, A*I означает то, что активационный центр канала заполнен ионами Са2+, а инактивационный – нет.
В терминах аппарата марковских цепей, были введены четыре основных состояния:
Применяя схему, представленную ранее на рисунке 2.5, и пренебрегая на больших интервалах времени, переходные процессы:
, (3.10)
где , , , и – интенсивности переходов. Как и на рисунке 2.7, AI соответствует закрытому (С), A*I – открытому состоянию канала (О). AI* и A*I* – инактивационному состоянию ( и , соответственно, ).
Изменение вероятностей пребывания в различных состояниях от времени описывается с помощью системы дифференциальных уравнений (уравнения Колмогорова):
, (3.11)
где – вероятности пребывания в том или ином состоянии.
Зависимости вероятности пребывания канала в различных состояниях от времени являются решениями системы (3.11). Исследование решений системы (3.11) позволит оценить значения вероятностей электронных и туннельных переходов RyR-канала, что необходимо для проведения численных экспериментов.
Графики зависимости активности RyR-канала представляют собой последовательность чередующихся интервалов, указывающих на пребывание канала в открытом или закрытом состояниях (рис. 3.10). При анализе процессов открытия и закрытия RyR-канала исследовались такие кинетические характеристики активности как средние времена пребывания канала в открытом и закрытом состояниях (, ). Среднее время пребывания канала в открытом состоянии определяется как сумма длительностей интервалов пребывания в открытом состоянии (), отнесенная к числу открытий в процессе проведения эксперимента (nopen): . Для закрытого состояния, соотвтетсвенно: , где nclosed – число закрытий канала, – времена пребывания канала в закрытом состоянии (см. рис. 3.11). В процессе моделирования динамики RyR-канала изучалось влияние вероятностей электронных переходов на эти кинетические характеристики.
В рамках предложенной схемы проведены численные эксперименты по изучению кинетических характеристик виртуального статистического ансамбля RyR-каналов, состоящего из восьмидесяти одного объекта при одинаковых условиях. Выбирался некоторый фиксированный набор параметров ЭК модели, при котором глобальный минимум КП соответствует закрытому состоянию: , , , .
На рисунке 3.12 представлены графики распределений времен пребывания канала в открытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от активационного центра (). Стрелками на графиках обозначены средние времена пребывания канала в открытом состоянии (). Как видно из рисунка, с увеличением происходит уменьшение . Этот факт подтверждает и рисунок 3.13, на котором представлена зависимость .
Согласно марковской схеме (3.10), плотность распределения времен пребывания в открытом состоянии можно оценить как [118]:
, (3.12)
где – интенсивность выхода канала из открытого состояния.
Среднее время пребывания канала в открытом состоянии (математическое ожидание) определяется как:
. (3.13)
На рисунке 3.12 гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в открытом состоянии аппроксимируются по формуле (3.13). Как видно из рисунков, марковское приближение хорошо согласуется с компьютерным экспериментом.
Представленные на рисунке 3.13 графики зависимостей от интенсивности электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от активационного центра RyR-канала показывают, что с ростом сокращается среднее время пребывания канала в открытом состоянии. Сплошные линии на графике соответствуют марковскому приближению , которое совпадает с результатами численных экспериментов.
При анализе результатов численных экспериментов по изучению активности RyR-каналов исследовалось влияние интенсивности электронных переходов на времена пребывания канала в закрытом состоянии (). Гистограммы распределений по временам пребывания в закрытом состоянии представлены на рисунке 3.14.
Плотность распределения времен пребывания в закрытом состоянии описывается суммой двух экспоненциальных функций:
. (3.14)
Плотность распределения определяется двумя характерными средними временами, которые в случае данной марковской схемы соответствуют средним временам пребывания в закрытом () и инактивационном состояниях (). Эти времена соответственно равны: и .
Среднее время пребывания канала в закрытом состоянии определяется как среднее данных времен:
. (3.15)
На рисунке 3.15 представлены графики зависимости среднего времени пребывания RyR-канала в закрытом состоянии от интенсивности переходов при различных интенсивностях электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от инактивационного центра канала (). Сплошные линии соответствуют марковскому приближению (3.10).
Как видно из графика, с увеличением интенсивности уменьшается среднее время пребывания канала в закрытом состоянии. В этом случае марковское приближение также хорошо согласуется с численным экспериментом.
Согласно экспериментальным данным [15] с ростом cis[Ca] от 0.05 до 50 мкМ среднее время пребывания канала в закрытом состоянии уменьшается от 87 мс до 47 мс, что согласуется с результатами численных экспериментов в рамках электронно-конформационной модели.
При разработке электронно-конформационной модели было сделано предположение о зависимости вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-части (cis[Ca]) в терминах вероятности присоединения ионов к активным центрам канала. Считалось, что электронный переход может быть совершен в случае присоединения более чем k ионов Са2+ к активным центрам RyR-канала, состоящим из z активных мест присоединения, согласно формуле (2.10). На рисунке 3.16 изображены в логарифмических координатах графики зависимостей интенсивностей электронных переходов от cis[Ca] при различных значениях числа z (мест присоединения активного центра канала), и при различных значениях концентрации Са2+ в cis-части, достаточной для заполнения всех мест связывания на активном центре (cis[Ca]max). Как видно из графиков, насыщение зависимости достигается быстрее при малых значениях z и малых значениях cis[Ca]max.
В модели вводились переменные kab – минимальное число ионов Са2+, необходимых для связывания с активационным центром; kib – минимальное число ионов Са2+, необходимых для связывания с инктивационным центром для изменения состояния канала. Расчеты проводились при kab=4, kib=7, что соответствует предположительному числу ионов, необходимых для связывания с активационным и инактивационным центрами, соответственно. Максимальное число мест связывания активационного и инактивационного центров: z=50. Максимальная концентрация кальция: cis[Ca]max =4 мМ [20]. Зависимости интенсивностей электронных переходов представлены на рисунке 3.17.
На первом этапе проведения численных экспериментов проведено моделирование процесса активации канала при резком увеличении уровня цитозольного кальция. В начале эксперимента все каналы, входящие в статистический ансамбль, находятся в минимуме конформационного потенциала С, то есть в электронно и конформационно закрытом состоянии.
Для ансамбля, состоящего из 81 RyR-канала, вероятность пребывания в открытом состоянии в текущий момент времени равна:
, (3.16)
где – число открытых каналов в текущий момент времени.
На рисунке 3.18 представлены зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии (Popen) от времени при резком увеличении уровня cis[Ca] от 0 до 1 мкМ в момент времени t=0. Данные результаты получены из численных экспериментов при различных значениях интенсивности электронной активации канала . Этот параметр варьировался с целью определения влияния вероятности электронных переходов на длительность процесса открытия RyR-канала.
Анализируя графики, можно сделать вывод, что зависимость носит экспоненциальный характер, причем скорость увеличения Popen зависит от .
Для всех физических, биологических и химических характеристик, изменяющихся во времени экспоненциально, вводится понятие постоянной времени τ [117]. Физический смысл этого параметра следующий: он соответствует времени, за которое значение исследуемой величины увеличивается ровно в е раз, то есть τ характеризует скорость изменения исследуемой временной зависимости.
При изучении процесса открытия одиночного канала введена постоянная времени открытия . Эта величина соответствует моменту времени t, при котором Popen достигает уровня:
=. (3.17)
На рисунке 3.18 величина вероятности пребывания в открытом состоянии оценивается как(пунктирная линия).
Зависимость значения τopening от интенсивности электронных переходов представлена на рисунке 3.19.
Из рисунка видно, что при величина τopening сначала уменьшается, а затем достигает некоторого стационарного значения 1.22 мс. Это значение соответствует длительности медленной конформационной релаксации RyR-канала в открытое состояние.
В ряде работ процесс активации RyR-канала при повышении уровня cis[Ca] в липидном бислое исследован экспериментально [24]. Для резкого повышения уровня cis[Ca] в основном применяются две методики. Первая из них заключается в высвобождении связанного Са2+ из сложных структур, находящихся в растворе, с помощью лазерного (или ультрафиолетового) флэш-фотолиза [25, 29, 106], во второй методике уровень cis[Ca] повышается механически, то есть увеличивается концентрация Са2+ вблизи канала в растворе [31, 119].
Результаты, полученные с помощью методики лазерного флэш-фотолиза, говорят о том, что постоянная времени активации канала составляет ~1 мс [25]. При механическом увеличении уровня кальция в растворе эта величина была немного больше и варьируется в интервале 2-20 мс [31].
Проведя анализ результатов численных экспериментов, можно сделать вывод, что они с хорошей степенью точности согласуются с этими экспериментальными данными.
На следующем этапе проведены численные эксперименты с целью изучения процесса закрытия RyR-канала вследствие резкого понижения уровня cis[Ca].
Согласно формуле (2.10), при малом значении cis[Ca] вероятность присоединения ионов Са2+ к активационному центра RyR-канала становится малой по сравнению с вероятностями процессов закрытия RyR-каналов, связанных с отсоединением ионов от активационного центра (с интенсивностью ) и туннелированием в закрытое состояние (с интенсивностью ).
В начале численного эксперимента все каналы в статистическом ансамбле находятся в открытом состоянии A*I (О). В момент времени t=0 уровень cis[Ca] уменьшается ступенчатым образом от 1 мкМ до нулевого значения (cis[Ca] =0) .
В результате проведения экспериментов получены графики зависимостей вероятности пребывания в открытом состоянии при различных значениях интенсивностей вероятности отсоединения ионов от активационного центра (рис. 3.19). В данной серии экспериментов параметр варьировался с целью исследования влияния вероятности отсоединения ионов Са2+ от активационного центра на процесс закрытия RyR-канала.
Видно, что зависимость носит экспоненциальный характер, причем по мере возрастания увеличивается скорость спадания . Из графика этой зависимости можно определить постоянную времени закрытия , ей соответствует момент времени t, при котором Popen уменьшается в е раз и достигает уровня 0.368 (пунктирная линия на рисунке).
На рисунке 3.21 изображена зависимость среднего времени закрытия канала от интенсивности закрытий канала .
Как видно из рисунка, величина падает с увеличением , при этом, с учетом процесса туннелирования в эксперименте канал закрывается быстрее.
Этот эксперимент проводился на малых интервалах времени (t = 15 мс). Пренебрегая процессами переходов в инактивационное состояние, процесс закрытия канала можно описать с помощью простейшей марковской схемы:
, (3.18)
где C – закрытое состояние, O – открытое состояние.
Рассмотрим случай при =0. Вероятности пребывания канала в состояниях О и С описываются системой дифференциальных уравнений Колмогорова:
(3.19)
где и – вероятности пребывания канала в состояниях О и С, соответственно.
В начальный момент времени все каналы находятся в открытом состоянии, поэтому начальные условия для уравнений (3.19) следующие: , .
С учетом этих начальных условий решение системы (3.19) выглядит как:
. (3.20)
На рисунке 3.22 представлены графики зависимости при =0.2 мс-1 ( мс, =0.2 мс-1), полученные по результатам численных экспериментов, а также кривая, соответствующая аналитическому решению уравнений Колмогорова (3.20).
Как видно из графика, результаты численных экспериментов хорошо согласуются с простейшим марковским приближением.
Экспериментальные данные по изучению закрытия RyR-каналов указывают, что среднее время закрытия имеет порядок 5 мс [119], что также хорошо согласуется с данными численных экспериментов, представленных на рисунке 3.22.
Согласно экспериментальным данным отношение постоянной времени закрытия канала к постоянной времени открытия ~5, в связи с этим в терминах ЭК-модели можно сделать вывод, что вероятность электронных переходов, связанных с присоединением Са2+ к активационному центру выше вероятности переходов, связанных с отсоединением Са2+ от активационного центра ().
Далее в данной работе проведено моделирование динамики одиночных RyR-каналов, а именно, изучение поведения каналов при продолжительной стимуляции.
Впервые явление медленного понижения активности канала при длительном стимуле было обнаружено экспериментально в 1993 году [25] и получило название адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции. Результаты исследований из работы [25] представлены на рисунке 3.23б. Подробно этот эффект описан ранее в первой главе настоящей работы.
В рамках данной работы исследована вероятность пребывания канала в открытом состоянии при учете всех видов электронных переходов, включая переходы в инактивированное состояние, на больших интервалах времени (t > 3 c).
Также как и в экспериментах, описанных выше, исследовалась динамика ансамбля независимых RyR-каналов, в начальный момент времени все каналы находились в закрытом состоянии.
В момент времени t=0 уровень cis[Ca] резко повышается до 1 мкМ, при этом, вероятности электронных переходов становятся больше нуля.
На рисунке 3.23 представлены графики зависимости и cis[Ca] от времени.
Условно график зависимости можно разбить на три участка (рис. 3.23а). На первом из них (0<t<100 мс) происходит активация каналов в ансамбле, то есть резкое повышение до 0.85 с постоянной времени мс (участок I). Подробно процесс активации рассмотрен в разделе 3.4.
Далее в интервале 100 мс < t < 2.5 с наблюдается медленный спад , до стационарного значения (участок II). После этого система приходит в динамическое равновесие (участок III).
На больших интервалах времени (~3c) можно пренебречь медленной конформационной динамикой, поэтому на участке II переходы RyR-канала из одного состояния в другое можно описать с помощью марковского процесса (3.10). Уравнения (3.11) имеют следующие начальные условия:
.
Точные решения этих уравнений (аналитический вид здесь не приводится) представлены в виде графиков на рисунке 3.24а, 3.24б. Для сравнения с точным решением (сплошная линия) на рисунке 3.24а также приведены данные численных экспериментов. Эти результаты изображены ранее на рисунке 3.23а.
Из анализа рисунка 3.24а можно сделать вывод, что результаты моделирования хорошо согласуются с точными решениями уравнений Колмогорова в марковском приближении.
Вероятность сначала после достижения пика уменьшается экспоненциально, затем при t3 c вероятности Popen, Pclose и Pinact выходят на стационарный уровень. Уменьшение при t<2.5 с указывает на медленный спад активности канала на этом промежутке времени. При анализе данных численных экспериментов было выявлено, что стационарный уровень проявляется в связи со стремлением канала к динамическому равновесию между переходами в состояния: O, C и I, что подтверждает выход на стационарный уровень вероятностей переходов в состояние О и I (рис. 3.24б).
При последующих резких повышениях уровня cis[Ca] в экспериментальных работах также наблюдался эффект адаптации (рис.3.25б).
Серия численных экспериментов, проведенных в данной работе на основе ЭК-теории показала, что данная модель позволяет воспроизвести вышеописанные экспериментальные данные (рис. 3.26).
Видно (рис. 3.26), что при повторном повышении cis[Ca] наблюдается медленное понижение до стационарного уровня (), при этом следует указать на тот факт, что эффект адаптации проявляется даже в том случае, когда уровень cis[Ca] перед резким повышением принимает достаточно большие значения (0.25 мкМ).
Вышеописанный эффект имеет большое значение для сердечной клетки, так как RyR-канал адаптируется к установившемуся уровню cis[Ca], сохраняя свою способность реагировать на следующее повышение cis[Ca]. Процесс КВВК должен быть самовосстанавливающимся, так как Са2+, высвобожденный из СР должен быть возвращен в СР и активировать следующее высвобождение Са2+, при этом адаптация является своеобразным эффектом негативного контроля (проверяет отсутствие нежелательных явлений и/или их повторения).
Как показывает большинство экспериментов в сердечных клетках [32, 120], на завершение процесса высвобождения Са2+ в диадное пространство в большей степени влияет опустошение СР, но по мнению некоторых исследователей [52], понижение активности RyR-каналов во времени вследствие адаптации также вносит вклад в завершение высвобождения.
Введение впервые в данной работе в электронно-конформационную модель высокоэнергетического адсорбционного инактивационного состояния позволило описать процессы связывания ионов Са2+ с инактивационным центром RyR-канала, которые имеют меньшую вероятность, чем связывание с активационным центром. Возможность перехода в инактивацинное состояние объясняет существование длительных интервалов, наблюдаемых в эксперименте, на которых проводимость RyR-канала равна нулю [18].
На следующем этапе данной работы исследовалось поведение изолированных RyR-каналов при установившемся уровне cis[Ca] после выхода в динамическое равновесие (участок III на рисунке 3.23а).
Динамическое равновесие определяется постоянным значением средней вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии на больших интервалах времени. Как показывают результаты экспериментов по изучению кинетических свойств RyR-канала при стационарных условиях, средняя вероятность пребывания канала в открытом состоянии напрямую зависит от уровня cis[Ca] [13, 17, 20].
В связи с этим в настоящей работе необходимо было исследовать активность одиночного RyR-канала при стационарных условиях и установить способность электронно-конформационной теории объяснить эффекты динамики RyR-канала при постоянном уровне cis[Ca], ранее выявленные экспериментально.
В начале эксперимента по исследованию активности RyR-каналов все каналы в ансамбле были закрыты, а в момент времени t=0 при cis[Ca]>0 происходил быстрый процесс активации и дальнейшей процесс медленной адаптации каналов. Регистрация активности канала в численных экспериментах проводилась, после выхода на стационарный режим, начиная с момента t=3 c.
На рисунке 3.26 представлены результаты численных экспериментов по наблюдению активности RyR-канала при стационарных условиях. Данный эксперимент проводился при следующих значениях интенсивностей переходов: мс-1, мс-1, мс-1, мс-1, мс-1. Эти значения соответствуют значению cis[Ca]=0.5 мкМ согласно формуле (2.6). Активность канала исследовалась на малых интервалах длительностью 10 мс, что позволило построить график зависимости вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии от времени (рис. 3.27б).
Как видно из графика, зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии является неоднородной, и динамика RyR-канала при стационарных условиях носит стохастический характер.
Гистограмма распределения вероятности пребывания канала в открытом состоянии (рис. 3.28) имеет два локальных максимума в точках, соответствующих и . Локальный минимум соответствует значению и определяет граничное значение вероятности пребывания канала в открытом состоянии [121], которое разделяет так называемые моды активности RyR-канала на текущем интервале. При значении интервал характеризуется высокой активностью (мода Н), при канал находится в моде низкой активности L. Значение вероятности определяет нулевую активность канала (мода I). Зависимость положения канала в модах H, L и I в зависимости от времени изображена на рисунке 3.27в. Информация о положении канала в той или иной моде позволяет более детально описать его активность в текущий момент времени.
На рисунке 3.29 изображены зависимости активности RyR-канала от времени при различных значениях cis[Ca] (открытое состояние соответствует значению 1).
Для сравнения результатов численных реализаций с экспериментальными данными, на рисунке 3.30 представлены графики экспериментальные регистрации активности RyR-канала при различных значениях cis[Ca] [15].
Сравнивая рисунок 3.30а с результатами моделирования (рис. 3.30б), можно сделать вывод, что результаты численных экспериментов находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными.
В работе при проведении анализа кинетических характеристик динамики RyR-канала в рамках модели, были построены графики зависимости от концентрации Са2+ в cis-части при различных значениях числа кластеров в активных центрах канала, представленные на рисунке 3.31.
Зависимость активности RyR-канала при стационарных условиях от концентрации цитозольного Са2+ носит колоколообразный характер: растет с увеличением cis[Ca] в интервале от 0 до 100 мкМ и спадает при cis[Ca]>100 мкМ.
Эффект понижения при достаточно больших значениях cis[Ca] получил в литературе название Са2+-зависимой инактивации [24] и является одним из ключевых феноменов тонкой регуляции RyR-канала ионами Са2+. Однако следует отметить, что концентрации cis[Ca]>100 мкМ не являются физиологическими и представляют интерес только для экспериментов in vitro.
Приведенные на рисунке 3.31б графики зависимости вероятности пребывания в инактивационном состоянии () от cis[Ca] говорят о том, что с ростом cis[Ca] увеличивается частота электронных переходов в инактивационное состояние, в связи с этим повышается .
При исследовании динамических рядов активности RyR-канала при различных значениях cis[Ca] были изучены моды активности канала и построена гистограмма распределения по пребываниям в той или иной моде, представленная на рисунке 3.32.
Были введены следующие моды активности:
Как ясно из рисунков 3.31 и 3.32, с ростом cis[Ca] наблюдается увеличение вероятности нахождения системы в инактивационном состоянии, и оно становится превалирующим после значения cis[Ca]=100 мкМ, которое соответствует максимуму зависимости .
Согласно экспериментальным данным [20], активность RyR-каналов в кардиомиоцитах становится нулевой при очень высоких значениях концентрации цитозольного Са2+ (5-10 мМ), которые, предположительно, недостижимы в клетках. Однако, Са2+-зависимая инактивация также как и адаптация, является механизмом негативного контроля, обеспечивающим своевременное завершение процесса высвобождения Са2+ из СР во время клеточного цикла.
Ионы Mg2+ как и ионы Са2+ обладают сильным сродством с активационной частью RyR-канала, однако, занимая вакантные места на активационных частях, они не приводят к открытию канала [122, 123].
Как и в случае взаимодействия ионов Са2+с активными центрами, в настоящей диссертационной работе предлагается статистический подход к рассмотрению конкурентного присоединения ионов Mg2+ и Са2+ к активным центрам канала.
На рисунке 3.33а схематично представлен процесс присоединения ионов Са2+ и Mg2+ с активному центру канала. Заполнение ионами активных мест связывания активного центра описано с помощью диаграммы Эйлера (рис. 2.31б).
Было сделано предположение, что если в кластер активного центра попадают оба типа ионов, то вероятность присоединения того или иного типа ионов к свободному центру равняется ½.
Пусть – относительная концентрация ионов Mg2+ вблизи канала, где – максимальная концентрация магния, при которой заполнены все места связывания активного центра канала; – относительная концентрация ионов Са2+.
Далее определялась вероятность нахождения более чем k ионов Са2+ в активном центре канала с учётом присутствия на нем ионов Mg2+.
Относительное число активных мест, в которых находятся только ионы Са2+ в кластере: ; относительное число секторов, в которых находятся ионы Са и Mg, но присоединяются ионы Са: . Соответственно, относительное число «сработавших» ионов Са2+ равно . Число комбинаций k ионов Са2+ в z частях кластера равно . Наконец, вероятность обнаружения более чем k ионов Са2+ в кластере активной части равняется:
. (3.21)
В численных экспериментах значение cis[Ca] варьировалось в диапазоне от 0.05 до 1000 мкМ. В первой части экспериментов не учитывалось влияние ионов Mg2+, и интенсивность электронных переходов в зависимости от cis[Ca] рассчитывалась по формуле (см. формулу 2.10), где с – относительная концентрация ионов Са2+ в cis-части.
Во второй серии экспериментов учитывалось присутствие Mg2+ в растворе (Mg=3 мМ), и и рассчитывались согласно формуле (3.21). Графики зависимостей интенсивностей электронных переходов с учетом и без учета Mg2+ представлены на рисунке 3.33.
Как видно из рисунка, учет Mg2+ сдвигает зависимость вниз, то есть статистический подход хорошо описывает ингибирующие свойства ионов Mg2+.
На рисунке 3.35 представлены графики зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от концентрации Са2+ в cis-части в отсутствии и в присутствии ионов Mg2+ .
Как видно из графика, зависимости имеют колоколообразную форму с максимумом, соответствующим значению cis[Ca]=50 мкМ (без учета Mg2+) и cis[Ca]=100 мкМ (с учетом Mg2+). Другими словами, при учете ионов Mg2+ происходит сдвиг вправо зависимости . Для сравнения на рисунке 3.35б приведен график из работы [20]. Анализ представленных кривых говорит о том, что результаты моделирования с высокой степенью точности совпадают с экспериментальными данными.
В присутствии ионов Mg2+ в растворе, в котором находится RyR-канал, график зависимости сдвигается вниз и вправо, то есть максимум достигается при больших значениях и максимум функции меньше, чем в отсутствие ионов Mg2+, конкурирующих с активными ионами Са2+.
Ионы Mg2+ являются потенциальными ингибиторами RyR-каналов, в связи с этим находят активное применение в фармакологии и терапии для понижения частоты высвобождений Са2+ для предотвращения аритмии и других патологий.
Модификация электронно-конформационной модели и введение инактивационного состояния позволили описать не только основные свойства изолированных RyR-каналов, но и важнейшие тонкие эффекты взаимодействия каналов с ионами Са2+, которые являются механизмами негативного контроля и должны учитываться при моделировании процесса КВВК.
В данной главе приведены результаты параметрического анализа электронно-конформационной модели одиночного RyR-канала, сравнения результатов ЭК-модели с традиционными теориями, основанными на марковских цепях.
В рамках ЭК-модели проведена серия численных экспериментов по исследованию:
Сравнительный анализ показал, что результаты проведенных численных экспериментов хорошо согласуются с известными экспериментальными данными, и ЭК-модель дает адекватное описание стохастической динамики RyR-канала.
В данной главе диссертационной работы описаны эффекты, связанные с кооперативной динамикой RyR-каналов в кластере высвобождающей единицы. Также представлены результаты параметрического анализа модели динамики ионов Са2+ между отделами клетки водителя сердечного ритма.
При динамике ионов Са2+ в высвобождающих единицах изменяются условия функционирования RyR-каналов в кластере на мембране СР. Для описания процессов открытия/закрытия каналов в кластере требуется исследовать особенности динамики RyR-каналов при заполнении/высвобождении Са2+ из люмена СР, кроме этого необходим анализ уравнений высвобождающих единиц для выявления возможных вариантов поведения системы.
В модели, рассматриваемой в данной работе, поток высвобождения Са2+ в диадное пространство, а также количество высвободившегося Са2+ зависят от числа открытых каналов в кластере. Предполагается, что завершение процесса высвобождения напрямую связано с процессом закрытия каналов вследствие истощения люмена. В связи с этим необходимо исследовать процессы открытия и закрытия каналов в процессе Са2+-динамики в высвобождающей единице.
В процессе заполнения люмена или высвобождения в диадное пространство изменяется параметр эффективного давления , который влияет на форму КП RyR-канала и на вероятности переходов из одного состояния в другое.
На рисунке 4.1 представлены графики конформационного потенциала при различных значениях параметра эффективного давления . Правый минимум (О) отвечает за открытое состояние, а левый – за закрытое состояние канала (С).
Как видно из рисунка:
Спонтанные туннельные переходы из одного конформационного состояния в другое могут происходить, как уже было описано ранее, при метастабильности текущего состояния.
На рисунке 4.2 представлен график зависимости вероятностей туннелирования от значений параметра .
Из рисунка видно, что туннелирование из состояния С в состояние O может происходить только при и, наоборот, из О в С при (то есть при понижении концентрации Са2+ в люмене ниже значения ).
При анализе модели особенно важным является изучение изменения динамики канала в зависимости от конформационного состояния его соседей при учете взаимодействия между каналами в кластере. В связи с этим была проведена серия численных экспериментов на квадратном кластере взаимодействующих RyR-каналов размерностью 9х9.
На рисунке 4.3а представлены графики конформационного потенциала RyR-канала, ближайшие соседи которого находятся в закрытом состоянии, при двух значениях параметра конформационного взаимодействия (k=0 и k=1). При сравнении этих графиков можно сделать вывод, что при включенном взаимодействии (пунктирная линия) закрытое состояние является более устойчивым, чем в случае при нулевом значении параметра k (без учёта взаимодействия) (сплошная линия).
На рисунке 4.3б представлены конформационные потенциалы канала с учетом взаимодействия с закрытыми соседями и без его учета при p=0.
В отсутствие взаимодействия наблюдается равновесие локальных минимумов. В этом случае возможно туннелирование каналов из закрытого состояния в открытое. При включенном взаимодействии (штрихованная линия) закрытое состояние остается глобальным минимумом, и туннельный переход в открытое состояние запрещен.
При определенном значении параметра эффективного давления p устанавливается равновесие локальных минимумов КП. Условия, при которых возможно это равновесие, можно рассчитать аналитически.
Пусть канал находится в закрытом состоянии. Конформационная координата соседних каналов взаимодействующих с ним каналов равна минимуму при закрытом состоянии: . Две ветви конформационного потенциала (3.8) одиночного канала с учётом взаимодействия описываются формулами:
. (4.1)
Подставляя значение , получим:
. (4.2)
Далее можно найти положение минимумов конформационного потенциала с учетом взаимодействия: и . (рис. 4.3). Приравнивая производную функций (3.13) по Q к нулю, получим систему уравнений:
, (4.3)
при решении которой находятся значения минимумов конформационного потенциала: , .
Разность энергий минимумов открытого и закрытого состояний равна: . (4.4)
Приравняв к нулю (3.15) можно получить зависимость параметра p от параметра взаимодействия k, при котором наблюдается равновесие локальных минимумов КП:
(4.5).
График зависимостей p(k) и представлен на рисунке 4.4.
Как видно из рисунка, с ростом параметра k увеличивается пороговое значение . Это означает, что при сильном взаимодействии между каналами необходим более высокий уровень , при котором начинается процесс открытия каналов, чем в случае слабого взаимодействия.
Для изучения процесса туннелирования каналов в открытое состояние при заполнении люмена ионами Са2+ была проведена серия численных экспериментов в рамках электронно-конформационной модели.
В начальный момент времени все каналы находились в закрытом состоянии, уровень равнялся 0.05 мМ, значение параметра эффективного давления: . С течением времени происходило заполнение люмена с константой скорости заполнения мс-1. Значение уровня концентрации , при котором параметр достигает нулевого значения: . Взаимодействие между каналами не учитывалось.
На рисунке 4.5 приведены временные зависимости параметра р и относительного числа открытых каналов в кластере ().
Как видно из рисунка, параметр достигает нулевого уровня в момент времени 39 мс (стрелка 1), однако каналы начинают открываться только в момент времени 67 мс с начала эксперимента (стрелка 2).
По представлениям модели в момент, когда достигает нулевого значения, минимум конформационного потенциала, соответствующий закрытому состоянию, становится метастабильным, и должно начинаться туннелирование каналов в открытое состояние. Однако в эксперименте наблюдалась задержка процесса туннелирования.
При анализе экспериментов было выявлено, что данную задержку открытия каналов определяют особенности конформационной динамики RyR-канала. Необходимо рассмотреть более подробно процесс изменения конформационного потенциала при заполнении люмена, схематично изображенный на рисунке 4.6.
Процесс туннелирования может совершаться только если система находится в малой окрестности ε вблизи точки локального минимума. Пусть в момент времени t (пунктирная линия) конформационная координата канала Q соответствует локальному минимуму. В момент времени (сплошная линия) координата будет той же, но вследствие увеличения параметра при заполнении люмена минимум сдвинется вправо. Как видно из рисунка, канал будет находиться левее минимума, то есть вне зоны, где разрешены туннельные переходы. Другими словами, системе требуется время для медленной конформационной «подстройки» под новые условия, то есть под новую форму конформационного потенциала.
На рисунке 4.7 представлены временные зависимости параметра эффективного давления р и расстояния от конформационной координаты Q до минимума конформационного потенциала (). Зависимости приведены при различных значениях скорости заполнения люмена.
Как видно из рисунка сначала расстояние растет со временем до определенного момента, затем канал, «подстраиваясь» под новые условия стремится к новому минимуму, расстояние сокращается. Чем быстрее изменяется КП, тем больше максимальное расстояние до минимума.
Данный эффект определяет некоторую инерцию нашей системы при «подстраивании» под новые физические условия.
В представленной в диссертационной работе модели внутриклеточных Са2+-«часов» предполагается следующая схема динамики ионов Са2+:
Длительность задержки между высвобождениями определяется скоростью закачки из цитозоля в сеть СР (), диффузии из сети СР в люмен (), высвобождения из люмена в диадное пространство () и диффузии из диадного пространства в цитозоль ().
Анализируя данную схему, можно провести параллель между моделью Са2+-«часов» и гидродинамической моделью типа «накопление-сброс» на примере сосуда, медленно заполняемого водой (рис. 4.8а). Эта модель подробно исследована в работе [124].
В модели «накопление-сброс» происходит заполнение резервуара водой с постоянной скоростью. Когда уровень жидкости достигает порогового уровня, сосуд быстро опорожняется через сифон, и начинается новый цикл его заполнения. Процесс опорожнения является повторяющимся, то есть при постоянной подкачке с определенной скоростью заполнения извне данная система может вести себя как релаксационный осциллятор с характерным периодом колебаний T (рис. 4.8б). Форма таких колебаний очень далека от синусоидальной; она скорее напоминает последовательность импульсов. На графике зависимости уровня воды в сосуде от времени хорошо видны два характерных интервала времени t1 и t2, связанных с медленным заполнением и быстрым опорожнением, соответственно.
Если представить процесс с достаточно быстрым заполнением резервуара или с достаточно медленным опорожнением (времена t1 и t2 – соизмеримы), то колебания уровня воды, стекающей через сифон, будут иметь гармонический характер. При скорости заполнения большей по значению скорости сброса уровень жидкости будет держаться выше порогового, и будет происходить постоянное высвобождение воды из резервуара.
Роль «порога» в модели Са2+-«часов» играют несколько факторов. Во-первых, критический уровень концентрации Са2+ в люмене, выше которого вероятность туннелирования RyR-каналов в открытое состояние становится ненулевой. Во-вторых, критическое значение концентрации Са2+ в диадном пространстве, выше которого начинаются электронные переходы каналов в открытое состояние, вследствие чего начинается вторичное высвобождение Са2+ из ретикулума.
С другой стороны, рассматривая электронные переходы, мы сделали предположение, что их вероятность является Са2+-зависимой. В ЭК-модели, интегрированной в модель ВЕ, эти вероятности будут зависеть от уровня , в чём и состоит процесс КВВК в нашей теории.
Рассмотрим один цикл работы Са2+-«часов» (рис. 1.20). В начальный момент времени каналы в кластере находятся в закрытом состоянии и уровень лежит ниже значения , то есть . При заполнении люмена происходит перенормировка КП; в определенный момент времени значение достигает нулевого уровня. Вследствие этого закрытое состояние становится метастабильным, начинается туннелирование небольшого числа каналов в открытое состояние. Данный процесс получил называние первичное высвобождение, вследствие которого повышается уровень . Данное повышение увеличивает вероятность электронных переходов, что приводит к процессу открытия большего количества каналов. Происходит процесс вторичного (усиленного) высвобождения.
Высвобождение вызывает достаточно резкое понижение концентрации Са2+ в люмене, понижается значения , так оно зависит от разности концентраций . Понижается уровень , в связи с этим уменьшается вероятность электронной стимуляции каналов.
При понижении уровня ниже значения начинается туннелирование каналов из открытого состояния в закрытое.
В этом разделе диссертационной работы приведены основные результаты компьютерных экспериментов в рамках электронно-конформационной теории и модели высвобождающей единицы. Эти эксперименты проводились с целью изучения динамики ионов Са2+ в высвобождающей единице клеток водителей сердечного ритма.
В рамках рассматриваемой модели исследовано влияние таких факторов, как скорости перетекания ионов Са2+ между компартментами клетки и взаимодействие между каналами, на стабильность авторитмических колебаний внутренних Са2+-«часов».
В программном комплексе, разработанном на базе рассматриваемой модели, исследовалась динамика ионов Са2+ в высвобождающая единице, включающей в себя кластер 9х9 RyR-каналов. Как уже отмечалось, процессы открытия/закрытия каналов в течение кальциевого цикла носят стохастический характер, и вероятность их открытия зависит от концентраций Са2+ в люмене СР и диадном пространстве. Из этого следует, что их активность должна меняться в течение Са2+-цикла в клетке.
Данный программный комплекс позволил исследовать внутренние Са2+-«часы» и получить временные зависимости таких величин, как концентрация Са2+ в люмене (), эффективное давления (), концентрация Са2+ в диадном пространстве (), концентрация Са2+ в цитозоле клетки () и число открытых каналов в кластере (). Подробно предположительный цикл работы кальциевых «часов» описан ранее в пункте 3.2.4 настоящей работы.
На рисунке 4.9 представлены результаты численного моделирования Са2+-«часов» при следующих значениях параметров динамики : =0.0012 М·с-1, = 6·10-7 М, = 25·103 с-1, = 50 с-1, =1 с-1. Параметры концентраций буферов, учитывающихся в модели, выбирались согласно работе [80]: CQtot = 10-2 М, CMtot = 45·10-6 М, TCtot = 31·10-6 М.
На данном этапе моделирование проводилось без учета конформационного взаимодействия между RyR-каналами в решетке (k=0). Параметры ЭК модели (2.5-2.8) выбирались такими же, как и в работе [A1]: a = 5, K = 12, , Г = 7, n = 6, ·10-6 M. Параметры туннелирования: A = 1, = 0.01.
Как видно из рисунка, Са2+- высвобождающая единица действительно ведет себя как самоподдерживающийся осциллятор в определенном диапазоне динамических параметров.
Зависимость представляет собой последовательность отдельных сигналов несинусоидальной формы с практически постоянной амплитудой (0.5±0.075 мкМ). На основании этого можно сделать вывод, что высвобождающая единица при данном значении динамических параметров ведет себя как релаксационный осциллятор. Число открытых каналов также меняется периодически. В начале эксперимента все каналы решетки закрыты (рис. 4.9б(1)), затем происходит открытие малого числа каналов, вызывая тем самым первичное высвобождение (рис. 4.9б(2)). Затем открывается большее число каналов (рис. 4.9б(3)), в связи с чем резко понижается концентрация в люмене, что стимулирует перезагрузку системы и закрытие каналов (рис. 4.9б(4, 5)). Высвобожденный кальций диффундирует сначала в цитозоль, затем возвращается в сеть ретикулума. После этого в процессе заполнения попадает обратно в люмен, и процесс высвобождения повторяется.
Отличительной особенностью релаксационного осциллятора является независимость его кинетических параметров от начальных условий [124, 125]. Для проверки этого эффекта построены зависимости и в повторяющемся цикле работы Са2+-«часов» при различных начальных условиях (рис. 4.10).
Из графиков ясно, что выбор начальных условий не влияет на характер дальнейшей динамики системы, что подтверждает устойчивость релаксационных колебаний осциллятора при данных значениях параметров.
Важно отметить, что в ходе моделирования при варьировании параметра и при учете кооперативной динамики RyR-каналов были выявлены и другие типы колебаний внутренних Са2+-«часов».
На рисунке 4.11 изображены зависимости концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях параметра скорости заполнения люмена.
При варьировании параметра в широком диапазоне (0.05÷500 мс-1) выявлено пять основных мод динамики высвобождающей единицы, которые подробно будут описаны далее.
В ходе исследования зависимости частоты и амплитуды высвобождающегося Са2+ от скорости заполнения люмена и параметра взаимодействия между каналами построена –k фазовая диаграмма, совмещенная с графиками плотности, на которых выделены различные моды поведения системы в зависимости от параметров k и :
На рисунке справа от диаграмм представлены цветовые шкалы, отображающие значения частоты и амплитуды в различных модах.
Мода 0: Статическое равновесие: при сильном взаимодействии между каналами происходит перенормировка ветвей конформационного потенциала в направлении стабильности закрытого состояния. Так, при k > 2.3 даже при максимальном заполнении люмена закрытое состояние остается стабильным, и в связи с этим не происходит туннелирования каналов в открытое состояние.
Мода 1: Релаксационные осцилляции. (рис. 4.11(1)). При достаточно малой скорости заполнения (<10 с-1) система ведет себя как устойчивый релаксационный осциллятор. После завершения высвобождения уровень понижается до нулевого уровня вследствие низкой частоты высвобождений. В данной моде частота осцилляций варьируется в достаточно широком интервале (от 1 до 6.8 Гц), как показывает градация цвета от белого к черному на графике плотности. Также следует указать на увеличение амплитуды концентрации высвободившегося Са2+ (от 5·10-7 до 1.5·10-6 М), что видно из рис. 4.11(1).
Мода 2: Гармонические высокочастотные осцилляции. (рис. 4.11(2)). При увеличении скорости заполнения увеличивается частота высвобождений, однако, уровень не успевает понизиться до нулевого уровня. Как видно из рисунка, осцилляции системы носят гармонический характер.
Мода 3: Динамическое квазиравновесие. (рис. 4.11(3)). При дальнейшем увеличении скорости заполнения люмена (>50 с-1) наблюдались осцилляции высокой частоты и достаточно малой амплитуды вблизи определенного значения концентрации (M). Данные осцилляции вследствие малой амплитуды можно рассматривать как динамическое квазиравновесное состояние системы.
Мода 4: Динамическое равновесие. (рис. 4.11(4)). При большом значении параметра скорости заполнения (>200 с-1) открывается весь кластер RyR-каналов. В этом случае наблюдается стабильное вытекание ионов в диадное пространство с постоянной скоростью.
На рисунке 4.13 представлены графики зависимостей и в модах 1 и 2 при различных значениях .
Как видно из рисунка, при увеличении происходит рост амплитуды концентрации высвободившегося Са2+. Следует отметить, что в модах 1 и 2 (оптимальный режим) наблюдается эффект увеличения амплитуды концентрации высвобождающегося с ростом частоты осцилляций (рис. 4.14). Одновременно с этим происходит увеличение амплитуды колебаний в люмене и увеличение амплитуды осцилляций числа открытых каналов .
Детальный анализ [А2] показал, что данный эффект может быть объяснен как результат задержки туннелирования каналов в открытое состояние. Это явление подробно описано ранее в пункте 4.1.3 настоящей работы. При большей скорости заполнения, как было показано, эффект задержки проявляется сильнее, чем при малой скорости заполнения люмена.
Данный эффект приводит к тому, что большей скорости заполнения соответствует больший уровень концентрации , при котором достигаются оптимальные условия туннелирования между ветвями конформационного потенциала. В связи с этим в процессе высвобождения открывается бόльшее число каналов и высвобождается бόльшее количество ионов в диадное пространство.
Если учесть прямую связь силы сокращений кардиомиоцитов с концентрацией высвободившегося [4, 70], то данный факт на молекулярном уровне объясняет давно известный принцип Боудича работы клеток водителей ритма «чаще-сильнее». Другими словами, внутренний СР-осциллятор в ЭК-модели может работать индивидуально как источник устойчивых сердечных сокращений.
Как уже отмечалось ранее, представления о динамике ионов Са2+ и о принципах работы внутренних Са2+-«часов» в данной работе основываются на модели Мальцева-Лакатты (ML) [87, 88]. Эта модель адекватно описывает кальциевую кинетику, но обладает рядом недостатков, в частности, пренебрежением кооперативной динамикой RyR-каналов в кластере высвобождающей единицы. Следует отметить, что ML-модель демонстрирует обратное «анти-Боудич» поведение -«часов» («выше частота, меньше амплитуда»), однако, эффект Боудича в этой модели воспроизводится только с учетом взаимодействия внутренних и мембранных -«часов» [89].
Автором данной диссертационной работы с помощью объединения модели кальциевой динамики с ЭК-моделью RyR-каналов впервые учтены кооперативные механизмы кинетики RyR-каналов и описан стохастический характер поведения этих каналов в процессе заполнения/высвобождения СР.
В отличие от ML-модели эффекты, связанные со стохастическим характером динамики каналов в модифицированной модели, позволяют объяснить причину увеличения амплитуды высвобождающегося Са2+ в диадное пространство с ростом частоты осцилляций изолированных внутренних Са2+-«часов», что в свою очередь позволяет на молекулярном уровне впервые описать эффект Боудича.
ЭК-модель также естественным образом вводит флуктуации частоты и амплитуды колебаний системы и шумы, нарушающие гармонический режим в модах 1 и 2. Следует отметить, что эти флуктуации заметно подавляются с ростом константы k конформационного взаимодействия между соседними RyR-каналами.
Далее в ходе моделирования динамики Са2+-«часов» варьировался параметр взаимодействия между каналами в диапазоне от 0 до 2.5, и исследовалось влияние этого параметра на устойчивость осцилляций Са2+-«часов».
Результаты наблюдений авторитмических осцилляций изолированных внутренних Са2+-«часов» в виртуальном эксперименте представлены на рисунке 4.15.
Как показано на рисунке, при увеличении параметра без учета взаимодействия нарушается постоянство амплитуды зависимости . Эти нарушения проявляются в частотных и амплитудных флуктуациях и внеочередных высвобождениях, нарушающих гармонический или релаксационный режим колебаний. Под внеочередными высвобождениями (обозначены на графиках красными стрелками) подразумеваются высвобождения при достаточно малой концентрации и, соответственно, при отрицательном значении параметра эффективного давления p, как видно из временных зависимостей p(t) на вставках к графикам (рис.4.15).
Данные внеочередные высвобождения возникают вследствие электронной активации RyR-каналов и объясняются тем, что при достаточно большой скорости заполнения СР увеличивается частота высвобождений и не успевает диффундировать в цитозоль из диадного пространства. В связи с этим вероятность электронных переходов не успевает уменьшиться до нуля, инициируя спонтанные высвобождения. Однако, как видно из рисунка, наблюдается следующая закономерность: при увеличении параметра конформационного взаимодействия соседних RyR-каналов уменьшается уровень шумов и также количество внеочередных всплесков CaSS пример, при =10 с-1 на первой секунде происходит восемь внеочередных высвобождений при k=0, в то время как при k=1 их число снизилось до двух. Следовательно, усиление кооперативности привносит стабильность осцилляций Са2+-«часов».
Как было установлено экспериментально [126, 127], кооперативность RyR-каналов обеспечивает группа специфических белков FKBP 12.6, расположенных между каналами и стабилизирующих их динамику. При ослаблении действия данного белка с помощью различных препаратов было обнаружено нарушение самосогласованной динамики всего кластера [128], увеличение продолжительности локальных высвобождений Са2+ в диадное пространство (длительность спарков) и нарушения ритма сокращений [129, 130].
Изучение этих нарушений играет огромную роль в исследованиях возникновения аритмии. Внеочередные колебания внутренних Са2+-«часов», также как и флуктуации могут являться причиной нарушения автоволновой активности клеток водителя сердечного ритма в целом, что может стать аритмогенным фактором для всего миокарда.
Таким образом, на основе интеграции ЭК-модели RyR-каналов в модель кальциевой динамики можно сделать вывод, что введенная в рассмотрение кооперативная динамика RyR-каналов является стабилизирующим фактором, предотвращающим нежелательные сбои в активности клеток водителей сердечного ритма.
На следующем этапе моделирования динамики Са2+-«часов» в настоящей работе исследовалось влияние скорости высвобождения Са2+ через одиночный RyR-канал на характер осцилляций системы.
Временные зависимости относительного числа открытых каналов и концентрации высвободившегося кальция () при различных значениях (от 1 до 100 с-1) без учета и с учетом взаимодействия между RyR-каналами показаны на рисунке 4.16.
Эти зависимости показывают, что без учета взаимодействия при достаточно больших (>50 с-1) наблюдаются устойчивые релаксационные колебания Са2+-«часов», в то время как в интервале от 10 до 50 с-1 проявляются как гармонические колебания, так и спонтанные переходы к высокочастотным стохастическим осцилляциям с малой амплитудой вблизи определенного среднего значения (~0.2 мкМ). Дальнейшее уменьшение параметра (5 с-1) приводит к переходу осциллятора в квазиравновесное состояние.
При учете взаимодействия между каналами наблюдается стабилизация осцилляций концентрации Са2+ в диадном пространстве при >15 с-1 (рис. 4.16б). Дальнейшее уменьшение параметра приводит к спонтанным переходам осциллятора в стационарное состояние, то есть к постоянному току Са2+ из СР.
Таким образом, в численных экспериментах, проведенных в данной работе, впервые наблюдался принципиально новый эффект случайной остановки Са2+-осциллятора. Детальный анализ этого явления показал, что он заключается в появлении в процессе высвобождения/заполнения устойчивого кластера открытых каналов (2х2, 3х2 и проч.), через который и осуществляется стационарное высвобождение ионов Са2+ в диадное пространство. На рисунке 4.17 приведен пример данного перехода в состояние стационарного высвобождения на графиках зависимостей и , и изображен вид решетки RyR-каналов при переходе в данное состояние (светлыми квадратами обозначены открытые, темными – закрытые каналы).
Анализ этого рисунка позволяет сделать вывод, что формирование устойчивого кластера 3х2 RyR-каналов не является мгновенным, а происходит следующим образом: каналы, неокруженные открытыми соседями, при понижении CajSR в процессе высвобождения туннелируют в закрытое состояние. Вероятность туннелирования отрытых каналов с открытыми соседями достаточно мала, что приводит к появлению стабильного кластера в системе, стабильность которого обеспечивает конформационное взаимодействие между RyR-каналами.
Возвращаясь к рисунку 4.16, можно заключить, что необходимыми условиями для проявления обнаруженного эффекта являются достаточно сильное взаимодействие между соседними каналами и высокий уровень критического значения по сравнению со средним значением . В этом случае концентрация Са2+ в диадном пространстве не достигает критического значения, в связи с этим не происходят электронные переходы, которые способны нарушить стационарность системы.
Для объяснения причин устойчивости открытого состояния каналов в кластере на рисунке 4.18 изображены конформационные потенциалы группы шести открытых каналов и соседних закрытых. Взаимодействие между открытыми каналами приводит к перенормировке конформационного потенциала в сторону стабильности открытого состояния. В связи с этим, канал, окруженный открытыми соседями, не может быть инактивирован даже при отрицательном значении параметра эффективного давления р, так как процесс туннелирования возможен только в случае глобального минимума обратного состояния.
В связи с тем, что случайные остановки Са2+-«часов» ранее не наблюдались, возникла необходимость более детального исследования данного эффекта, а также изучение влияния динамических параметров на размеры и устойчивость кластеров открытых каналов.
4.2.3.1 Форма и устойчивость кластеров открытых каналов
Параметр определяет скорость высвобождения Са2+ через одиночный канал, являясь характеристикой только самого канала, эта величина не зависит от параметров Са2+ высвобождающей системы. В связи этим было выдвинуто предположение, что именно этот параметр может влиять на форму кластеров открытых каналов в момент остановки осцилляций. В численных реализациях параметр варьировался в интервале от 1 до 15 с-1; параметры динамики Са2+ в системе: =0.0012 М·с-1, = 6·10-7 М, = 25·103 с-1, = 50 с-1, =10 с-1. Данные значения выбраны в связи с анализом результатов раздела 3.3.3.
На основе численных реализаций построен график зависимости числа открытых каналов в устойчивом кластере от скорости высвобождения через одиночный канал (рис. 4.19).
Численные эксперименты показали, что размер кластера открытых каналов уменьшается с ростом параметра , тем самым обеспечивается постоянство значения потока ионов Са2+ в диадное пространство, которое прямо пропорционально произведению (2.24).
Наблюдения за виртуальными Са2+-«часами» показали, что самыми устойчивыми являются кластеры квадратной (2х2, 3х3, 5х5 и т.д.) и прямоугольной формы (2х3, 2х4), особенно, если они возникают на краю решетки. Для одного и того же значения существует вероятность появления кластеров различной формы. Например, при =7.5 с-1, в различных экспериментах возможно появление одного кластера формы 2х4, двух кластеров размером 2х2 и кластера непрямоугольной формы, состоящего из 8 открытых RyR-каналов (рис. 4.19б).
На рисунке 4.20 приведены результаты исследования формы кластеров открытых каналов в двух модельных экспериментах при =6 с-1. При данном значении стабильное высвобождение происходило при десяти открытых каналах.
В первом случае (рис. 4.20а) сформировался единый непрямоугольный кластер открытых каналов, состоящий из десяти каналов, а во втором случае – два кластера 2х2 и 2х3 (рис. 4.20б).
При анализе полученных результатов был сделан важный вывод – кластеры непрямоугольной формы не являются в полной мере устойчивыми, их размеры колеблются в небольшом диапазоне около среднего значения . Зависимости и также флуктуируют около среднего значения (рис. 4.20а). Возникновение кластеров прямоугольной формы (например, 2х2 и 2х3) приводит к устойчивому высвобождению Са2+ из СР (рис. 4.20б).
На основании вышеизложенного следует вывод, что форма устойчивых кластеров, зависит от скорости высвобождения Са2+ через одиночный канал, к тому же при одинаковых значениях параметров системы могут образовываться кластеры различной формы и различной степени стабильности.
4.2.3.2 Характерное время перехода в стационарное состояние
Как уже отмечалось ранее, обязательным условием для проявления эффекта случайной остановки осциллятора, обнаруженного в данной работе, является достаточно сильное взаимодействие между RyR-каналами в кластере высвобождающей единицы. В связи с этим необходимо было более подробно исследовать влияние параметра взаимодействия между каналами на процесс формирования устойчивых кластеров, ведущего к переходу в стационарный режим.
Как видно из графиков зависимостей при различных значениях k, представленных на рис. 4.21, процессу перехода в стационарное состояние предшествовал переход в состояние колебаний с малой амплитудой вблизи определенного среднего значения Nopen (моменты времени, при которых происходят переходы «часов» в стационарное состояние, обозначены на рисунке стрелками).
Было замечено, что при увеличении параметра k сокращается время пребывания системы в состоянии устойчивых колебаний. Тот факт, что появление устойчивого кластера открытых RyR-каналов осуществляется быстрее при повышенном значении k доказывают и формы гистограмм распределений по временам переходов в стационарный режим (, от англ. stationary dynamics – стационарная динамика).
Данные гистограммы, построенные по результатам двадцати экспериментов, проведенных при каждом значении k, позволяют сделать вывод, что при увеличении k максимум распределения сдвигается влево, то есть среднее время функционирования осцилляционной системы перед переходом в стационарное состояние уменьшается. Другими словами, чем сильнее взаимодействие, тем быстрее система переходит в стационарный режим.
4.2.3.3 Влияние стимула на Са2+-«часы», находящихся в стационарном режиме
При исследовании эффекта случайной остановки также рассмотрено влияние внешнего стимула со стороны L-каналов на поведение системы. Данный стимул моделировался кратковременным повышением уровня в определенные моменты времени.
В численных экспериментах на данном этапе стимул включался только в тот момент, когда система уже перешла в стационарный режим. На рисунке 4.22 представлены зависимости Nopen(t) в случае стимуляции в момент t=2 с после перехода Са2+-«часов» в стационарное состояние (моменты переходов отмечены стрелками), а также показаны формы устойчивых кластеров открытых каналов.
На основе вышеприведенных результатов сделан важный вывод: кратковременная стимуляция выводит Са2+-«часы» из стационарного режима в авторитмический, однако, через некоторое время (0.6÷1.7 c) система вновь спонтанно возвращается в стационарный режим. Из данных наблюдений следует, что именно самосогласованное взаимодействие внутренних и мембранных Са2+-«часов» способствует проявлению стабильной автоволновой динамики всей клетки в целом.
Впервые вышеописанные спонтанные переходы автоколебательной кальциевой системы в стационарный режим были выявлены только в рамках математической модели, представленной в данной диссертационной работе. Обнаруженный эффект показывает способность перехода высвобождающей единицы в отсутствие внешнего стимула в гибернированное (спящее) состояние, позволяющее системе адаптироваться к внешним условиям.
Стоит отметить, что в реальных сердечных клетках существует несколько сотен высвобождающих единиц. Случайный переход некоторых из них в гибернированное состояние не может нарушить автоколебательной активности клетки в целом. Однако при большом количестве «остановившихся» высвобождающих единиц есть вероятность перехода всего кардиомиоцита в гибернированное состояние, что влечет за собой нарушения в ритмической активности сердца.
Проведен анализ предложенной объединенной математической модели, включающей в себя электронно-конформационную теорию кластера RyR-каналов и модель Са2+-высвобождающей системы в пейсмейкерных клетках. Предложена простая схема, иллюстрирующая специфическую динамику функционирования высвобождающей единицы в клетках водителя сердечного ритма.
Численные эксперименты в рамках объединенной модели показали, что внутриклеточная Са2+-высвобождающая система при отсутствии внешнего стимула может вести себя как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор (Са2+-«часы»). Выявлены и исследованы различные моды поведения изолированных Са2+-«часов» при различных значениях параметров модели. Отмечено, что в физиологическом режиме при повышении частоты увеличивается амплитуда осцилляций Са2+-«часов», что на молекулярном уровне объясняет принцип Боудича «чаще-сильнее» работы сердечных клеток.
Исследовано влияние кооперативности динамики взаимодействующих RyR-каналов на характер осцилляций Са2+-«часов». Показано, что взаимодействие между каналами влияет на стабильность осцилляций.
Обнаружен и исследован принципиально новый эффект внезапной остановки Са2+-«часов», связанный с недостаточно быстрым заполнением люмена СР и сильным взаимодействием между каналами в кластере ВЕ.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Дано дальнейшее развитие электронно-конформационной модели RyR-канала и кластера RyR-каналов на мембране саркоплазматического ретикулюма в высвобождающей единице. Впервые в ЭК-модели предложено введение дополнительного, инактивационного состояния. Предложена новая модель взаимодействия ионов Са2+ с активационным центром RyR-канала, учитывающая вероятности заполнения мест присоединения активационного центра ионами Са2+. Дана детализация модели туннельных переходов, включающая введение «зоны разрешенного туннельного перехода» вблизи минимума конформационного потенциала RyR-канала.
2. Разработан многоцелевой компьютерный комплекс, реализующий алгоритмы численного решения уравнений электронно-конформационной модели и единой модели Са2+ высвобождающей единицы, на базе которого проводились серии экспериментов по изучению динамики одиночного RyR-канала, кластера RyR-каналов и Са2+ высвобождающей единицы.
3. Впервые в рамках электронно-конформационной модели воспроизведены и объяснены основные экспериментально наблюдаемые особенности функционирования одиночного RyR-канала:
- экстремальная зависимость вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии от концентрации Са2+;
- влияние ионов Mg2+ на процесс активации RyR-канала;
- эффект адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции.
4. Разработана единая модель Са2+ высвобождающей единицы, объединяющая электронно-конформационную модель функционирования кластера RyR-каналов с моделью динамики ионов Са2+ между отделами высвобождающей единицы.
5. Впервые в рамках ЭК-модели исследована изолированная Са2+ высвобождающая единица в клетках водителя сердечного ритма (Ca2+-«часы»). Численные эксперименты показали, что изолированная ВЕ в широком диапазоне параметров может вести себя как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор. Выявлена различные режимы функционирования изолированной ВЕ. Отмечено, что в физиологическом режиме при повышении частоты увеличивается амплитуда осцилляций Са2+-«часов», что на молекулярном уровне объясняет принцип Боудича «чаще-сильнее» работы сердечных клеток.
7. Впервые исследовано влияние взаимодействия между RyR-каналами на стабильность работы Са2+-«часов». Показано, что включение конформационного взаимодействия между каналами приводит к стабилизации осцилляций по частоте и амплитуде.
8. Впервые обнаружен и исследован эффект случайной остановки осцилляций Са2+-«часов» при достаточно сильном взаимодействии между RyR-каналами в ВЕ.
1. Bers, D., Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. Vol. 237. 2001: Kluwer Academic Pub.
2. Wehrens, X.H. and A.R. Marks, Ryanodine Receptors: Structure, function and dysfunction in clinical disease. Vol. 254. 2004: Springer.
3. Moskvin, A.S., et al., Electron-conformational model of ryanodine receptor lattice dynamics. Progress in biophysics and molecular biology, 2006. 90(1): p. 88-103.
4. Moskvin, A.S., et al. Electron-conformational model of nonlinear dynamics of the ryanodine channel lattice in cardiomyocytes. Doklady Biochemistry and Biophysics. 2005. Springer.
5. Moskvin, A.S., et al. Biophysical adaptation of the theory of photo-induced phase transition: model of cooperative gating of cardiac ryanodine receptors. in Journal of Physics: Conference Series. 2005. IOP Publishing.
6. Коньков Л. Е. и др. Нелинейная динамика клеточного рианодинового канала //Нелинейная динамика. – 2008. – Т. 4. – №. 2. – С. 181-192.
7. Беркинблит, М.Б. and Е.Г. Глаголева, Электричество в живых организмах. 1988: Наука.
8. Гоффман, Б., и др., Электрофизиология сердца: Пер. с англ. 1962: Изд-во иностр. лит.
9. Морман, Д., Хеллер Л., Физиология сердечно-сосудистой системы. СПб.: Питер, 2000. 250: стр. 15.
10. Katz, A.M., Physiology of the Heart. 2010: Lippincott Williams & Wilkins.
11. Bers, D.M., Cardiac action potential and ion channels, in Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. 2001, Springer. p. 63-100.
12. Williams, A.J., D.J. West, and R. Sitsapesan, Light at the end of the Ca2+-release channel tunnel: structures and mechanisms involved in ion translocation in ryanodine receptor channels. Quarterly reviews of biophysics, 2001. 34(1): p. 61.
13. Yin, C.-C., L.M. Blayney, and F. Anthony Lai, Physical coupling between ryanodine receptor–calcium release channels. Journal of molecular biology, 2005. 349(3): p. 538-546.
14. Marx, S.O., et al., Coupled gating between cardiac calcium release channels (ryanodine receptors). Circulation research, 2001. 88(11): p. 1151-1158.
15. Wehrens, X.H.T., et al., FKBP12. 6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 2003. 113(7): p. 829-840.
16. Copello, J., et al., Differential activation by Ca2+, ATP and caffeine of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors after block by Mg2+. Journal of Membrane Biology, 2002. 187(1): p. 51-64.
17. Laver, D., et al., Cytoplasmic Ca2+ inhibits the ryanodine receptor from cardiac muscle. The Journal of membrane biology, 1995. 147(1): p. 7-22.
18. Fabiato, A., Time and calcium dependence of activation and inactivation of calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of a skinned canine cardiac Purkinje cell. The Journal of general physiology, 1985. 85(2): p. 247-289.
19. Zahradnikova, A., J. Bak, and L.G. Meszaros, Heterogeneity of the cardiac calcium release channel as assessed by its response to ADP-ribose. Biochemical and biophysical research communications, 1995. 210(2): p. 457-463.
20. Malev, V., et al., Kinetics of opening and closure of syringomycin E channels formed in lipid bilayers. Membrane & cell biology, 2001. 14(6): p. 813.
21. Zahradnikova, A., J. Bak, and L.G. Meszaros, Heterogeneity of the cardiac calcium release channel as assessed by its response to ADP-ribose. Biochemical and biophysical research communications, 1995. 210(2): p. 457-463.
22. Fill, M., et al., Ryanodine receptor adaptation. The Journal of general physiology, 2000. 116(6): p. 873-882.
23. Armisen R., Sierralta J., Vélez P., Naranjo D., Suarez-Isla B.A. Modal gating in neuronal and skeletal muscle ryanodine-sensitive Ca2+ release channels. Am J Physiol Cell Physiol, 1996. 271: р. 144–153.
24. Gyorke, I. and S. Gyorke, Regulation of the Cardiac Ryanodine Receptor Channel by Luminal Ca2+ Involves Luminal Ca2+ Sensing Sites. Biophysical journal, 1998. 75(6): p. 2801-2810.
25. Gyorke, S. and D. Terentyev, Modulation of ryanodine receptor by luminal calcium and accessory proteins in health and cardiac disease. Cardiovascular research, 2008. 77(2): p. 245-255.
26. Bordner, A.J., Predicting small ligand binding sites in proteins using backbone structure. Bioinformatics, 2008. 24(24): p. 2865-2871.
27. Bertram, R., et al., Tutorials in Mathematical Biosciences II: Mathematical Modeling of Calcium Dynamics and Signal Transduction. Vol. 2. 2005: Springer.
28. Fill M., C.J., Ryanodine Receptor Calcium Release Channels. Physiol Rev, 2002. 82: p. 893-922.
29. Gyorke, S. and M. Fill, Ryanodine receptor adaptation: control mechanism of Ca (2+)-induced Ca2+ release in heart. Science, 1993. 260(5109): p. 807-809.
30. Fill, M. and J.A. Copello, Ryanodine receptor calcium release channels. Physiological reviews, 2002. 82(4): p. 893-922.
31. Keizer, J. and L. Levine, Ryanodine receptor adaptation and Ca2+ (-) induced Ca2+ release-dependent Ca2+ oscillations. Biophysical journal, 1996. 71(6): p. 3477-3487.
32. M. Fill, A.Z.e.a., Ryanodine Receptor Adaptation. J. Gen. Physiol., 2000. 116: p. 873-882.
33. Valdivia, H.H., et al., Rapid adaptation of cardiac ryanodine receptors: modulation by Mg2+ and phosphorylation. Science, 1995. 267(5206): p. 1997-2000.
34. Laver, D.R., Ca2+ stores regulate ryanodine receptor Ca2+ release channels via luminal and cytosolic Ca2+ sites. Clinical and experimental pharmacology and physiology, 2007. 34(9): p. 889-896.
35. Laver, D.R. and B.A. Curtis, Response of ryanodine receptor channels to Ca2+ steps produced by rapid solution exchange. Biophysical journal, 1996. 71(2): p. 732-741.
36. Sobie E. A. et al. Termination of Cardiac Ca2+ Sparks: An Investigative Mathematical Model of Calcium-Induced Calcium Release //Biophysical journal. – 2002. – Т. 83. – №. 1. – С. 59-78.
37. Rosales, R.A., M. Fill, and A.L. Escobar, Calcium regulation of single ryanodine receptor channel gating analyzed using HMM/MCMC statistical methods. The Journal of general physiology, 2004. 123(5): p. 533-553.
38. Zahradnikova, A. and I. Zahradnik, A minimal gating model for the cardiac calcium release channel. Biophysical journal, 1996. 71(6): p. 2996-3012.
39. Zahradnikova, A. and I. Zahradnik, Analysis of calcium-induced calcium release in cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles using models derived from single-channel data. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1999. 1418(2): p. 268-284.
40. Bassingthwaighte, J.B., L.S. Liebovitch, and B.J. West, Fractal physiology. Vol. 2. 1994: Amer Physiological Society.
41. Гриневич, А., М. Асташев, and В. Казаченко, Мультифрактальная кинетика воротного механизма ионных каналов в биологических мембранах. Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2007. 24(4): p. 316-332.
42. Liebovitch, L.S., J. Fischbarg, and J.P. Koniarek, Ion channel kinetics: a model based on fractal scaling rather than multistate Markov processes. Mathematical Biosciences, 1987. 84(1): p. 37-68.
43. Oswald R.E., Millhause G.L., Carter A.A. Diffusion model in ion channel gating. Extension to agonist-acti-vated ion channels // Biophys. J. 1991. V. 59. P. 1136–1142.
44. Liebovitch L.S. Analysis of fractal ion channel gating kinetics: Kinetics rates energy levels and activation energies // Math. Biosci. 1989. V. 93. P. 97–115
45. Шайтан, К., К. Терешкина, Молекулярная динамика белков и пептидов. 2004: Ойкос М.
46. Шайтан, К., Конформационная подвижность белка с точки зрения физики. Соросовский образовательный журнал, 1999. 5: p. 8-13.
47. Liebovitch L.S., Lullivan J.M. Fractal analysis of a voltage-dependent potassium channel from cultured mouse hippocampal neurons // Biophys. J. 1987. V. 52. P. 979–988.
48. Liebovitch L.S., Krekora P. The physical basis of ion channel kinetics: the impotance of dynamics // Proc. Inst. Math. and its Appl. Univer. Minnessota. 2002. V. 129. P. 27–52.
49. Varanda W.A., Liebovitch L.S., Figueiroa J.N., Nogueira R.A. Hurst analysis applied the study of single calcium-activated potassium channel kinetics // J. íheor. Biol. 2000. V. 206. P. 343–353.
50. Bers, D.M., Cardiac excitation-contraction coupling. Nature, 2002. 415(6868): p. 198-205.
51. Bers, D.M., Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu. Rev. Physiol., 2008. 70: p. 23-49.
52. Tsugorka A., Rios E., Blatter L. A. Imaging elementary events of calcium release in skeletal muscle cells //Science. – 1995. – Т. 269. – №. 5231. – С. 1723-1726.
52. Cheng H., Lederer W. J., Cannell M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle //Science. – 1993. – Т. 262. – №. 5134. – С. 740-744.
53. Wier, W.G. and C.W. Balke, Ca2+ release mechanisms, Ca2+ sparks, and local control of excitation-contraction coupling in normal heart muscle. Circulation research, 1999. 85(9): p. 770-776.
54. Shirokova, N., et al., Calcium sparks: release packets of uncertain origin and fundamental role. The Journal of general physiology, 1999. 113(3): p. 377-384.
55. Stern, M., Theory of excitation-contraction coupling in cardiac muscle. Biophys J, 1992. 63: p. 497–517.
56. Winslow, R.L., Rice, J.J., Jafri, M.S., Marban, E. and O’Rourke, B., Mechanisms of Altered Excitation-Contraction Coupling in Canine Tachycardia-Induced Heart Failure. II. Model Studies. Circ. Res., 1999. 84: p. 571–586. 104, 105, 106, 108, 122, 123
57. Noble, D., Varghese, A., Kohl, P. and Noble, P., Inproved Guinea-pig ventricular cell model incorporating a diadic space, Ikr and Iks, and length- and tension-dependent processes. Can. J. Cardiol., 1998. 14: p. 123–134. 104
58. Puglisi, J.L., Wang, F. and Bers, D.M., Modeling the isolated cardiac myocyte. Prog Biophys Mol Biol, 2004. 85(2-3): p. 163–78. 104
59. Faber, G.M. and Rudy, Y., Action potential and contractility changes in (i) overloaded cardiac myocytes: a simulation study. Biophys J, 2000. 78: p. 2392–404. 104
60. Luo, C.H. and Rudy, Y., A dynamic model of the cardiac ventricular action potential: I. Simulations of ionic currents and concentration changes. Circ Res, 1994. 74: p. 1071–1096. 104, 105, 106
61. Priebe, L. and Beuckelmann, D.J., Simulation study of cellular electric properties in heart failure. Circ Res, 1998. 82(11): p. 1206–23. 104
62. Rice, J.J., Jafri, M.S. and Winslow, R.L., Modeling short-term interval-force relations in cardiac muscle. Am J Physiol, 2000. 278: p. H913
63. Stern, M.D., Song, L.S., Cheng, H., Sham, J.S., Yang, H.T., Boheler, K.R. and Rios, E., Local control models of cardiac excitation-contraction coupling. A pos-sible role for allosteric interactions between ryanodine receptors. J Gen Physiol, 1999. 113: p. 469–89. 107, 114
64. Soeller C., Cannell M. B. Analysing cardiac excitation–contraction coupling with mathematical models of local control //Progress in biophysics and molecular biology. – 2004. – Т. 85. – №. 2. – С. 141-162.
65. Polyakova, E., et al., Local calcium release activation by DHPR calcium channel openings in rat cardiac myocytes. The Journal of physiology, 2008. 586(16): p. 3839-3854.
66. Santana, L.F., E.G. Kranias, and W.J. Lederer, Calcium Sparks and ExcitationContraction Coupling in Phospholamban‐Deficient Mouse Ventricular Myocytes. The Journal of physiology, 1997. 503(1): p. 21-29.
67. Cannell, M.B. and C. Soeller, Mechanisms underlying calcium sparks in cardiac muscle. The Journal of general physiology, 1999. 113(3): p. 373-376.
68. Ferrier, G.R., R.H. Smith, and S.E. Howlett, Calcium sparks in mouse ventricular myocytes at physiological temperature. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2003. 285(4): p. H1495-H1505.
69. Zima, A.V., et al., Termination of cardiac Ca2+ sparks role of intra-SR [Ca2+], release flux, and intra-SR Ca2+ diffusion. Circulation research, 2008. 103(8): p. e105-e115.
70. Мазуров, М., Ритмогенез в синоатриальном узле сердца. Биофизика, 2006. 51(6): p. 1092-1099.
71. Tsien, R.W., R.S. Kass, and R. Weingart, Cellular and subcellular mechanisms of cardiac pacemaker oscillations. The Journal of experimental biology, 1979. 81(1): p. 205-215.
72. Irisawa, H., H.F. Brown, and W. Giles, Cardiac pacemaking in the sinoatrial node. Physiological reviews, 1993. 73(1): p. 197-227.
73. Krebs, J. and M. Michalak, Calcium: A Matter of Life or Death: A Matter of Life or Death. Vol. 41. 2007: Elsevier Science.
74. Покровский В. М. Формирование ритма сердца в организме человека и животных. – Кубань-Книга, 2007.
75. Барабанов С. В. и др. Физиология сердца //СПБ, Специальная литература. – 1998.
76. Verkerk, A.O., A.C.G. van Ginneken, and R. Wilders, Pacemaker activity of the human sinoatrial node: Role of the hyperpolarization-activated current,If. International journal of cardiology, 2009. 132(3): p. 318-336.
77. Baruscotti M., Bucchi A., DiFrancesco D. Physiology and pharmacology of the cardiac pacemaker (“funny”) current //Pharmacology & therapeutics. – 2005. – Т. 107. – №. 1. – С. 59-79.
78. Wilders, R., Computer modelling of the sinoatrial node. Medical & biological engineering & computing, 2007. 45(2): p. 189-207.
79. Priebe, L. and D.J. Beuckelmann, Simulation study of cellular electric properties in heart failure. Circulation Research, 1998. 82(11): p. 1206-1223.
80. Bozler, E., Tonus changes in cardiac muscle and their significance for the initiation of impulses. American Journal of Physiology--Legacy Content, 1943. 139(3): p. 477-480.
81. Rosen, M.R., et al., Genes, stem cells and biological pacemakers. Cardiovascular research, 2004. 64(1): p. 12-23.
82. Vinogradova, T.M., et al., Rhythmic ryanodine receptor Ca2+ releases during diastolic depolarization of sinoatrial pacemaker cells do not require membrane depolarization. Circulation research, 2004. 94(6): p. 802-809.
83. Kurata, Y., et al., Roles of L-type Ca2+ and delayed-rectifier K+ currents in sinoatrial node pacemaking: insights from stability and bifurcation analyses of a mathematical model. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2003. 285(6): p. H2804-H2819.
84. Lakatta, E.G., V.A. Maltsev, and T.M. Vinogradova, A coupled SYSTEM of intracellular Ca2+ clocks and surface membrane voltage clocks controls the timekeeping mechanism of the heart’s pacemaker. Circulation research, 2010. 106(4): p. 659-673.
85. Vinogradova, T.M., et al., High Basal Protein Kinase A–Dependent Phosphorylation Drives Rhythmic Internal Ca2+ Store Oscillations and Spontaneous Beating of Cardiac Pacemaker Cells. Circulation research, 2006. 98(4): p. 505-514.
86. Bogdanov, K.Y., et al., Modulation of the transient outward current in adult rat ventricular myocytes by polyunsaturated fatty acids. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 1998. 274(2): p. H571-H579.
87. Bogdanov, K.Y., T.M. Vinogradova, and E.G. Lakatta, Sinoatrial Nodal Cell Ryanodine Receptor and Na+-Ca2+ Exchanger Molecular Partners in Pacemaker Regulation. Circulation research, 2001. 88(12): p. 1254-1258.
88. Kurata, Y., et al., Dynamical description of sinoatrial node pacemaking: improved mathematical model for primary pacemaker cell. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2002. 283(5): p. H2074-H2101.
89. Maltsev, V.A., T.M. Vinogradova, and E.G. Lakatta, The emergence of a general theory of the initiation and strength of the heartbeat. Journal of pharmacological sciences, 2006. 100(5): p. 338-369.
90. Maltsev, V.A. and E.G. Lakatta, Synergism of coupled subsarcolemmal Ca2+ clocks and sarcolemmal voltage clocks confers robust and flexible pacemaker function in a novel pacemaker cell model. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2009. 296(3): p. H594-H615.
91. Maltsev, V.A. and E.G. Lakatta, Dynamic interactions of an intracellular Ca2+ clock and membrane ion channel clock underlie robust initiation and regulation of cardiac pacemaker function. Cardiovascular research, 2008. 77(2): p. 274-284.
92. Maltsev, A.V., et al., Synchronization of Stochastic Ca2+ Release Units Creates a Rhythmic Ca2+ Clock in Cardiac Pacemaker Cells. Biophysical journal, 2011. 100(2): p. 271-283.
93. Shannon, T.R., et al., A mathematical treatment of integrated Ca dynamics within the ventricular myocyte. Biophysical journal, 2004. 87(5): p. 3351-3371.
94. Hamilton, S.L. and I.I. Serysheva, Ryanodine receptor structure: progress and challenges. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(7): p. 4047-4051.
95. Ashley, R.H. and A.J. Williams, Divalent cation activation and inhibition of single calcium release channels from sheep cardiac sarcoplasmic reticulum. The Journal of general physiology, 1990. 95(5): p. 981-1005.
96. Koshino, K. and T. Ogawa, Domino effects in photoinduced structural change in one-dimensional systems. Journal of the Physical Society of Japan, 1998. 67: p. 2174.
97. Koshino, K. and T. Ogawa, Photoinduced nucleation theory in one-dimensional systems. Physical Review B, 1998. 58(22): p. 14804.
98. Fujimoto, M., The physics of structural phase transitions. 2005: New York: Springer.
99. Nasu, K., Photoinduced phase transitions. 2004: World Scientific Publishing Company.
100. Шайтан, К., et al., Динамический молекулярный дизайн био-и наноструктур. Российский химический журнал, 2006. 50(2): p. 53-65.
101. Moskvin A. S. Photo-induced phase separation effect in cuprates //Journal of Physics: Conference Series. – IOP Publishing, 2005. – Т. 21. – №. 1. – С. 106.
102. Левич, В.Г., В.А. Мямлин, and Ю.А. Вдовин, Курс теоретической физики. Vol. 1. 1969: Наука.
103. Рубин, А., Биофизика: В 2-х кн. Учеб. для биол. спец вузов. Кн. 1. Теоретическая биофизика. М.: Высш. шк, 1987.
104. Иваницкий Г. Р., Кринский В. И., Сельков Е. Е. Математическая биофизика клетки. – Наука, 1978.
105. Coffey W. T., Kalmykov Y. P., Waldron J. T. The Langevin equation: with applications to stochastic problems in physics, chemistry, and electrical engineering. – World Scientific Publishing Company, 2004. – Т. 14.
106. Zahradnikova, A., et al., Rapid activation of the cardiac ryanodine receptor by submillisecond calcium stimuli. The Journal of general physiology, 1999. 114(6): p. 787-798.
107. Zahradnikova, A., M. Dura, and S. Gyorke, Modal gating transitions in cardiac ryanodine receptors during increases of Ca2+ concentration produced by photolysis of caged Ca2+. Pflugers Archiv, 1999. 438(3): p. 283-288.
108. Ландау, Л. and Е. Лифшиц, Квантовая механика. нерелятивистская теория, т. 3. ЛД Ландау, ЕМ Лифшиц–М.: Наука, 1989.
109. Atkins P. W., Friedman R. S. Molecular quantum mechanics. – Oxford : Oxford university press, 1997. – Т. 3.
110. Шайтан, К. and А. Рубин, Изотопные эффекты в реакциях туннелирования электронов в биологических системах и конформационная подвижность белков. Молекуляр. биология, 1981. 15(2): p. 368.
111. Keener, J.P. and J. Sneyd, Mathematical physiology. Vol. 8. 1998: Springer. 112. Greenstein, J.L., R. Hinch, and R.L. Winslow, Mechanisms of excitation-contraction coupling in an integrative model of the cardiac ventricular myocyte. Biophysical journal, 2006. 90(1): p. 77-91.
113. Greenstein, J.L. and R.L. Winslow, An Integrative Model of the Cardiac Ventricular Myocyte Incorporating Local Control of Ca2+ Release. Biophysical journal, 2002. 83(6): p. 2918-2945.
114. Maruyama, G., Continuous Markov processes and stochastic equations. Rendiconti del Circolo Matematico di Palermo, 1955. 4(1): p. 48-90.
115. Kloeden, P.E. and E. Platen, Numerical solution of stochastic differential equations. Vol. 23. 1992: Springer Verlag.
116. Федер Е., Данилов Ю. А., Шукуров А. Фракталы. – Мир, 1991. – Т. 254.
117. Иродов И. Е. Основные законы механики. – М. : Высш. шк., 1997.
118. Вентцель А. Д. Курс теории случайных процессов. – М. : Наука. Физматлит, 1975.
119. Sitsapesan, R., R.A. Montgomery, and A.J. Williams, New insights into the gating mechanisms of cardiac ryanodine receptors revealed by rapid changes in ligand concentration. Circulation research, 1995. 77(4): p. 765-772.
120. Terentyev, D., et al., Luminal Ca2+ controls termination and refractory behavior of Ca2+-induced Ca2+ release in cardiac myocytes. Circulation research, 2002. 91(5): p. 414-420.
121. Magleby, K.L. and B.S. Pallotta, Calcium dependence of open and shut interval distributions from calcium-activated potassium channels in cultured rat muscle. The Journal of physiology, 1983. 344(1): p. 585-604.
122. Laver, D.R. and B.N. Honen, Luminal Mg2+, a key factor controlling RYR2-mediated Ca2+ release: cytoplasmic and luminal regulation modeled in a tetrameric channel. The Journal of general physiology, 2008. 132(4): p. 429-446.
123. Copello, J., et al., Differential activation by Ca2+, ATP and caffeine of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors after block by Mg2+. Journal of Membrane Biology, 2002. 187(1): p. 51-64.
124. Pikovsky, A., M. Rosenblum, and J. Kurths, Synchronization: a universal concept in nonlinear sciences. Vol. 12. 2003: Cambridge university press.
125. Kut, C., V. Golkhou, and J.S. Bader, Analytical approximations for the amplitude and period of a relaxation oscillator. BMC systems biology, 2009. 3(1): p. 6.
126. Wehrens, X.H.T., et al., FKBP12. 6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 2003. 113(7): p. 829-840.
127. Chen, W., J.A. Wasserstrom, and Y. Shiferaw, Role of coupled gating between cardiac ryanodine receptors in the genesis of triggered arrhythmias. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2009. 297(1): p. H171-H180.
128. Vest, J.A., et al., Defective cardiac ryanodine receptor regulation during atrial fibrillation. Circulation, 2005. 111(16): p. 2025-2032.
129. Jiang, D., et al., Enhanced store overload induced Ca2+ release and channel sensitivity to luminal Ca2+ activation are common defects of RyR2 mutations linked to ventricular tachycardia and sudden death. Circulation research, 2005. 97(11): p. 1173-1181.
130. Lehnart, S.E., et al., Stabilization of cardiac ryanodine receptor prevents intracellular calcium leak and arrhythmias. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006. 103(20): p. 7906-7910.
Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях:
А1. Рывкин А.М. Электронно-конформационная теория функционирования рианодиновых каналов в клетках водителей сердечного ритма // Вестник уральской медицинской академической науки, 2013. – №2. – С. 54-58
А2. Рывкин А.М. Моделирование автоволновой кальциевой динамики в кар-диомиоцитах в рамках электронно-конформационной теории / А.М. Рывкин, А.С. Москвин, О.Э. Соловьева, В.С. Мархасин // Доклады Академии Наук, 2012. – Т. 444, №5. – С. 572-579
А3. Moskvin A.S. Electron-Conformational Transformations in Nanoscopic RyR Channels Governing Both the Heart’s Contraction and Beating / Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solo-vyova O.E., Markhasin V.S. // Pis’ma v ZhETF, 2011. – Vol. 93 (7). – P. 446-452
Статьи в ведущих зарубежных научных журналах и изданиях:
А4. Ryvkin A. M. Electron-Conformational Model of SR-Based Ca2+ Clock Mode / A. M. Ryvkin, A. S. Moskvin, O. E. Solovyova, V. S. Markhasin // Biophysical Journal, 2010. - Vol. 98(3). - P. 336a
А5. Ryvkin A.M. Analysis of the RyR-Channel Stochastic Dynamics in the Electron-Con-formational Model / A.M. Ryvkin, A.S. Moskvin, O.E. Solovyova // Proceedings of The Physiological Society, 2009. – Vol. 15. P. D1
А6. Moskvin A.S. Stochastic Dynamics of Release Unit in a Cardiac Cell in Electron-Con-formational Model / A.S. Moskvin, A.M. Ryvkin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin // Biophysical Journal, 2009. - Vol. 96(3) - P. 518a
А7. Moskvin A.S. Spark Generating Stochastic Dynamics of Release Unit in a Cardiac Cell / A.S. Moskvin, A.M. Ryvkin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin, P. Kohl // Biophysical Journal, 2008. - Vol. 94 (2) - P. 312a
Материалы конференций:
А8. Рывкин А.М. Моделирование динамики ионных каналов в кардиомиоците в рамках электронно-конформационной теории / А.М. Рывкин, Н.М. Зорин, А.С. Москвин // XIII Всероссийская школа-семинар по проблемам физики конденсированного сос-тояния вещества: тезисы докладов. - Екатеринбург, 2012. - С. 256
А9. Ryvkin A.M. Modelling the Autooscillatory Calcium Dynamics in Sinoatrial Node Cell in the Framework of Electron-Conformational Model / A.M. Ryvkin, A.S. Moskvin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin // “Biological Motility – Fundamental and Applied Science”: Abstracts. - Puschino, 2012. - P. 172-174
А10. Рывкин А. М. Электронно-конформационная модель молекулярных нанокластеров / А. М. Рывкин, А.С. Москвин // 13я Международная зимняя школа физиков-теоретиков "Коуровка": сборник тезисов. – Екатеринбург, 2010. - С. 87
А11. Рывкин А. М. Моделирование автоволновой динамики клеток сердечного ритма / А.М. Рывкин // 17я Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых ученых: сборник тезисов. – Екатеринбург, 2011. - С. 407
А12. Ryvkin A.M. Electron-Conformational Model of SR-based Ca2+ Clock Mode in Sinoatrial Cells / A.M. Ryvkin, A.S. Moskvin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin // «New Horizons in Calcium Signaling»: Abstracts. - Beijing, China, 2010. - P. 175
А13. Ryvkin A.M. RyR-Channel Stochastic Dynamics in the Electron-Conformational Model. Kinetic Parameters / A.M. Ryvkin, A.S. Moskvin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin// International Conference "PhysCell 2009 - From the edge to the heart": Abstract Book. - Primoshten, Croatia, 2009. – P. 222
А14. Ryvkin A.M. Electron-Conformational Model of the Ryanodine Channel in a Cardiac Cell. Kinetic Properties / Ryvkin A.M., Moskvin A.S. // International Conference on Interdisciplinary Mathematical and Statistical Techniques: Abstract book. - Plzen, Czech Republic, 2009. - P. 68
А15. Рывкин А. М. Анализ результатов моделирования стохастической динамики ионных каналов в кардиомиоците в рамках электронно-конформационной теории / А. М. Рывкин, А.С. Москвин, О.Э. Соловьева // Межвузовская конференция "СПИСОК-2009", УрГУ: тезисы докладов. - Екатеринбург, 2009. – С. 93-96
А16. Moskvin A.S. Modelling the Gating of the Cardiac Ryanodine Channel / A.S. Moskvin, A.M. Ryvkin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin // Conference “Mathematics. Computing. Education”: Abstract book. - Pushchino, 2009. - P. 116
А17. Moskvin A.S. Electron-Conformational Model of Molecular Nanoclusters / A.S. Moskvin, A.M. Ryvkin, A.V. Korolev // 3rd International Advanced Scool: Molecular Switching and Functional Materials & 5th International Symposium on Molecular Materials: Electronics, Photonics and Spintronics: Abstract book. - Universite de Rennes, France, 2009. - P. 96
А18. Moskvin A.S. Novel Stochastic Model for Calcium Release Unit in Cardiomyocite / A.S. Moskvin, A.M. Ryvkin, O.E. Solovyova, V.S. Markhasin // Biological Motility. Achievements and Perspectives: Abstracts. - Pushchino, 2008. - P. 176
Рис. 1.20. Схема EMBED Equation.DSMT4 потоков между отделами кардиомиоцитов.
i – цитозоль клетки;
nSR (sarcoplasmic reticulum network) – сеть СР;
jSR (junctional SR) – терминальные цистерны (люмен) СР;
SS (subspace) – субпространство.
Рис. 1.19. Спонтанные изменения мембранного потенциала клетки водителя сердечного ритма.
Рис.1.18. Кальциевые спарки в изолированных кардиомиоцитах мыши. а. Двумерное изображение, полученное при помощи конфокальной микроскопии с применением специальных красителей. Стрелками обозначены повышения концентрации Са2+, возникающие вследствие локальных высвобождений ионов Са2+. б. Одиночный Са2+-спарк и график зависимости EMBED Equation.DSMT4 от времени, полученный из анализа интенсивности свечения красителя. в. Трехмерный поверхностный график EMBED Equation.DSMT4 во время наблюдения спарка, отображающий временное и пространственное распространение EMBED Equation.DSMT4 . Адаптировано из [4].
Рис.1.17. Модель Гриневича К+-каналов. а. Структура канала с ионами К+ и молекулами воды внутри поры. . б. Схема модельного ионного канала, построенного на основе структуры К+-канала. в Упрощенная схема воротного механизма модельного канала, EMBED Equation.DSMT4 –максимальный угол, на который отклоняются подвижные части трансмембранных сегментов (ТМ2) канального белка при его открывании, Dтах - максимальный диаметр внутриклеточного устья канала, L - длина подвижной части сегмента ТМ2. г. Профиль безразмерной потенциальной энергии, которая описывает внешние воздействия на трансмембранные сегменты ТМ2 . Ec и E0 – глубины потенциальных ям в закрытом и открытом состояниях.
Рис.1.16. Марковская схема динамики RyR-канала. С – закрытые состояния, O – открытые, I – инактивированное состояние. Звездочками обозначены Са2+-зависимые переходы. Рисунок адаптирован из работы [35].
Рис. 1.15. Марковские схемы динамики RyR-каналов в различных моделях. Рисунок адаптирован из работы [33].
Рис. 1.14. Изменение вероятности EMBED Equation.DSMT4 со временем при градуальном увеличении уровня EMBED Equation.DSMT4 (две различные реализации). На верхнем графике адаптация не наблюдается. Нижний график показывает присутствие эффекта адаптации к продолжительной стимуляции.
Адаптировано из работы [31].
Рис. 1.13. Эффект адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции. а. Временная зависимость вероятности EMBED Equation.DSMT4 при ступенчатом увеличении уровня EMBED Equation.DSMT4 (б.) Рисунок адаптирован из работы [25].
Рис. 1.12. Диаграмма связывания ионов Са2+ с активационным (1) и инактивационным центрами канала. Из покоящегося (закрытого) состояния в активированное (открытое) RyR-канал может вывести быстрое связывание Са2+ с активационным центром. Процессы связывания с инактивационным центром, имеющим более высокое сродство к Са2+, считаются медленными относительно процессов активации.
Рис. 1.11. Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состо-янии от значения EMBED Equation.DSMT4 . Рисунок адаптирован из работы Gyorke S. [20]
Рис. 1.10. Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии ( EMBED Equation.DSMT4 ) от значения EMBED Equation.DSMT4 . Рисунок адаптирован из работы [24].
Рис. 1.9. Ионные токи Са2+ через одиночный RyR-канал в липидном бислое при различных значениях EMBED Equation.DSMT4 . Пустыми прямоугольниками обозначены моды нулевой активности, штрихованными – моды низкой активности, черными – моды высокой активности. Адаптировано из работы [21].
Рис.1.8. Зависимость вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии от времени при стационарных условиях.
Рис. 1.7. Схема установки по изу-чению динамики изолированных ионных каналов в липидном бислое. Рисунок адаптирован из: [16].
INCLUDEPICTURE "http://www.cytspb.rssi.ru/lab_schagina/schagina_fig1.jpg" \* MERGEFORMATINET
Рис.1.6. Кластеры RyR-каналов на мембране СР. (а) Изображение, полученное с помощью электронной микроскопии. (б) Увеличенное и обработанное изображение. (в) Схематическое изображение расположения RyR-канал в кластере.
а. б. в.
Рис. 1.5. Открытое (слева) и закрытое (справа) конформационное состояние RyR-канала. Штрихованной линией обозначены трансмембранные сегменты канала, угол между которыми увеличивается при переходе в открытое состояние. Адаптировано из [7].
Рис. 1.4. Трехмерная реконструкция рианодинового канала. а. Вид сбоку. б. Вид со стороны саркоплазмы. в. Вид со стороны ТЦ саркоплазматического ретикулюма.
Рис. 1.3. Схема кальциевой динамики в сердечной клетке. Схема сопряжения L и RyR-каналов. Адаптировано из [6]
Рис. 1.2. Схема Са2+-высвобождающей единицы.
Рис. 1.1 Структура сердечной клетки. а. Снимок кардиомиоцита, полученный при помощи электронной микроскопии. б. Трехмерная реконструкция кардиомиоцита. Обозначения: 1 — сарколемма; 2 — саркоплазматический ретикулум; 3 — миофибриллы.
а. б.
Рис. 4.22. Гистограммы распределений времен переходов Са2+-«часов» в стационарный режим при двух различных значениях параметра взаимодействия между каналами.
Рис. 4.21. Зави-симости относи-тельного числа открытых каналов в кластере при различных значе-ниях параметра взаимодействия между RyR-каналами.
а. б.
Рис. 4.20. Зависимости концентраций Са2+ в диадном пространстве и в люмене от времени в случае формирования квазиустойчивых (а) и устойчивых (б) кластеров открытых каналов при случайной остановке Са2+-часов.
Рис. 4.19. а Зависимость числа открытых каналов и относительного числа открытых каналов в устойчивых кластерах от скорости высвобождения. б. Зависимость формы устойчивых кластеров открытых RyR-каналов от скорости высвобождения.
Рис. 4.18. Конформационные потенциалы открытых каналов (желтые квадраты) в устойчивом кластере, окруженном закрытыми каналами (красные квадраты).
Q
E
Q
E
Q
E
Q
E
Q
E
Q
E
Q
E
Q
E
Q
Рис. 4.17. Процесс формирования устойчивого кластера открытых каналов в процессе динамики ВЕ при достаточно сильном взаимодействии между каналами.
а.
б.
Рис. 4.23. Зависимость относительного числа открытых каналов в кластере в случае случайной остановки осцилляций и влияния внешнего стимула со стороны каналов L-типа.
Рис. 4.16. Зависимости относительного числа открытых каналов в кластере и концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях скорости высвобождения (а.) при k=0; (б.) при k=2. Эксперименты проводились при EMBED Equation.DSMT4 =0.5 10-6 М.
Рис. 4.15. Влияние взаимодействия между каналами на стабильность осцилляций Са2+-часов. Зависимости концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях скорости заполнения люмена и параметра взаимодействия между каналами. На вставках представлены временные зависимости параметра эффективного давления. Стрелками обозначены внеочередные высвобождения из СР. EMBED Equation.DSMT4 =0.0012 М·с-1, EMBED Equation.DSMT4 = 6·10-7 М, EMBED Equation.DSMT4 = 25·103 с-1, EMBED Equation.DSMT4 = 50 с-1.
Рис. 4.14. Зависимость амплитуды EMBED Equation.DSMT4 от частоты осцилляций, иллюстрирующая закон Боудича.
Рис. 4.13. Зависимости относительного числа открытых каналов (а) и концентрации Са2+ в диадном пространстве (б) от времени при различных значениях скорости заполнения люмена.
а. б.
Рис. 4.12. Частота и амплитуда осцилляций Са2+-«часов». Фазовые ( EMBED Equation.DSMT4 –k) диаграммы, совмещенные с графиками плотности частоты осцилляций (а.) и амплитуды концентрации высвобождающегося кальция EMBED Equation.DSMT4 (б.).
Рис. 4.11. Типичные графики зависимости EMBED Equation.DSMT4 в различных модах динамики ВЕ.
Рис. 4.10. Зависимости EMBED Equation.DSMT4 и EMBED Equation.DSMT4 в процессе динамики высвобождающей единицы в численных экспериментах при различных начальных условиях. Начальные условия обозначены черными квадратами.
а. б.
Рис. 4.9. Динамика Са2+-«часов» а. Зависимости EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 и EMBED Equation.DSMT4 и EMBED Equation.DSMT4 в процессе заполнения/высвобождения СР при включении процесса КВВК.
б. Динамика решетки RyR-каналов в процессе заполнения/высвобождения. Красным цветом обозначены закрытые, желтым цветом– открытые каналы.
Рис. 4.8. Гидродинамическая модель релаксационного осциллятора «накопление-сброс». б. Графики зависимостей уровня воды в сосуде и уровня высвобождающейся жидкости от времени.
а.
б.
Рис. 4.7. Зависимости значений параметра EMBED Equation.DSMT4 (пунктирная линия) и расстояния положения канала на конформационном потенциале относительно его локального минимума (сплошная линия) от времени.
Рис. 4.6. Изменение конформационного потенциала при заполнении люмена. Кругом отмечена текущая координата канала.
E(Q)
Q
Рис. 4.5. Зависимости значений параметра EMBED Equation.DSMT4 (пунктирная линия) и относительного числа открытых каналов в кластере (сплошная линия) от времени.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 4.4. Зависимости параметра эффективного давления p и концентрации Са2+ в люмене EMBED Equation.DSMT4 , при которых наблюдается равновесие минимумов КП, от значения параметра взаимодействия k .
а.
б.
Рис. 4.3. Конформационный потенциал RyR-канала, окруженного закрытыми соседями, при отсутствии взаимодействия (сплошная линия) и при включении взаимодействия (штрихованная линия) при p=-0.8 (а.) и при p= 0 (б.). Левый минимум соответствует закрытому состоянию канала, правый – открытому.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 4.2. Зависимость вероятностей туннельных переходов от значения параметра EMBED Equation.DSMT4 . Сплошная линия – вероятность туннелирования из закрытого в открытое состояние, штрихованная – из открытого в закрытое состояние.
Рис. 4.1. Вид конформационного потенциала при различных значениях параметра р. Левый минимум соответствует закрытому конформационному состоянию (С), правый – открытому (О). Параметры конформационного потенциала: EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 .
Рис. 3.35. а. Зависимость вероятности EMBED Equation.3 обнаружения RyR-канала в открытом состоянии от цитозольной концентрации кальция ( EMBED Equation.3 ), построенная по данным численных экспериментов на ЭК-модели RyR-канала в отсутствие ионов Mg2+ и с учетом Mg2+ (3 мМ).
б. Экспериментальная зависимость вероятности обнаружения RyR-канала в открытом состоянии от цитозольной концентрации кальция ( EMBED Equation.3 ). Рисунок адаптирован из работы [20].
а.
EMBED Origin50.Graph б.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.34 Зависимости интенсивностей электронных переходов канала от уровня cis[Ca] с учетом ионов Mg2+ и без учета. Параметры модели для активационного центра: k = 4, z=25. Для инактивационного центра: k = 7, z=25 (см. п. 2.1.8).
Рис. 3.33 Присоединение ионов Са2+ и Mg2+ к активным центрам. а. Схема активных центров RyR-канала, занятых ионами Са2+, Mg2+, либо двумя типами ионов. б. Диаграмма Эйлера, показывающая заселенность кластеров активных центров канала.
б.
а.
|
Ca2+ |
|
Ca2+/ |
Mg2+ |
Ca2+ |
|
|
Mg2+ |
Ca2+ |
|
Ca2+/ |
Mg2+ |
|
|
|
Mg2+ |
|
Ca2+ |
Ca2+ |
|
|
Mg2+ |
Ca2+/ |
Ca2+/ |
Mg2+ |
|
Mg2+ |
|
|
Ca2+ |
|
|
Ca2+ |
|
|
|
Mg2+ |
|
Ca2+/ |
|
Mg2+ |
Рис. 3.32. Гистограммы распределений по пребываниям в модах H, L и C/I. Первый столбец – мода H, второй – мода L, третий – мода C/I. Верхняя часть третьего столбца – мода I, нижняя – мода С.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.31. Влияние цитозольного Са2+ на активность RyR-канала. а. Зависимости пребывания канала в открытом состоянии от cis[Ca] при различных значениях количества секторов активных центров RyR-канала.
б. Зависимости вероятности пребывания в инактивированном состо-янии от времени при трех значениях числа секторов в активных центрах канала.
а.
EMBED Origin50.Graph б.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.30. Активность RyR-канала при стационарных услових при трех различных значениях концентрации цитозольного кальция cis[Ca]. а. Результаты численных экспериментов. б. Результаты экспериментов, адаптированные из работы [15]. Нулю соответствует закрытое состояние. Участки с высокой вероятностью EMBED Equation.DSMT4 обозначены черными сплошными линиями, с малой – пунктирными линиями, длительные пребывания в закрытом состоянии – белыми сплошными линиями.
а. б.
Рис. 3.29. Активность RyR-канала при стационарных услових для трех различных значений концентрации цитозольного кальция cis[Ca]. Нулю соответствует закрытое состояние.
Мода H выделена черными сплошными линиями, мода L – пунктирными линиями. Белыми сплошными линиями обозначена мода нулевой активности канала I.
Рис. 3.28. Распределение по вероятности пребывания в открытом состоянии.
EMBED Origin50.Graph
а.
б.
в.
Рис. 3.27. а. Зависимость активности RyR-канала при стационарных условиях от времени. Нулевому уровню соответствует закрытое состояние. б. Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии от времени (вычислялась на временном шаге 10 мс). в. Представление активности канала в различных модах (H, L и I) от времени.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.26. Адаптация RyR-канала при повторной стимуляции. Временные зависимости вероятности нахождения канала в открытом состоянии (а) и уровня cis[Ca] (б). Интенсивности электронных переходов при 0<t<2.5 c: EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 мс-1, EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 при t>2.5 c: EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 мс-1, EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 . EMBED Equation.DSMT4 .
а.
б.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.25. Экспериментальное исследование влияния двух последовательных увеличений уровня cis[Ca] на активность одиночного RyR-канала. а. Реализации кальциевого тока через RyR-канал. Верхний уровень соответствует открытому состоянию канала. б. Временная зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии. в. Уровень концентрации Са2+ в cis-части. Адаптировано из работы [25].
Рис. 3.24. Эффект адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции а. Зависимости вероятностей нахождения канала в открытом состоянии от времени, полученные из численных экспериментов и из точного решения уравнений Колмогорова. б. Временные зависимости нахождения канала в закрытом и инактивированном состоянии, полученные из уравнений (3.11). Интенсивности электронных переходов при t>0: EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 мс-1, EMBED Equation.DSMT4 , EMBED Equation.DSMT4 . EMBED Equation.DSMT4 .
а.
EMBED Origin50.Graph
б.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.23. Зависимости вероятности EMBED Equation.3 пребывания канала в открытом состоянии при ступенчатом изменении cis[Ca] от времени. а. Результаты численного эксперимента. б. Эксперимен-тальные данные, адаптированные из [25].
а. б.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.22. Зависимость вероятности нахождения канала в открытом состоянии от времени после резкого понижения cis[Ca] и решение уравнения (3.19) при EMBED Equation.DSMT4 и EMBED Equation.DSMT4 .
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.21. Зависимость среднего времени закрытия одиночного RyR-канала от интенсивности переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от активных частей канала в отсутствии туннельных переходов и при EMBED Equation.DSMT4 .
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.20. Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии от времени в отсутствии туннелирования (а) и при учете туннелирования (б) после резкого понижения уровня cis[Ca] (в).
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.19. Зависимость времени активации одиночного RyR-канала от интенсивности активации (электронных переходов EMBED Equation.DSMT4 ).
EMBED Origin50.Graph
б.
а.
Рис. 3.18. Вероятность пребывания канала в открытом состоянии в ансамбле после резкого повышения концентрации Са2+ в cis-части. а. Зависимость вероятности EMBED Equation.DSMT4 от времени. б. Зависимость концентрации Са2+ в cis-части от времени.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.17. Зависимости интенсивностей электронных переходов от уровня цитозольного Са2+.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.16. Зависимость интенсивностей электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-части при различных значениях числа секторов на активных центрах (а.) и при различных значениях максимального уровня концентрации EMBED Equation.DSMT4 (б.).
а. б.
EMBED Origin50.Graph EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.15. Зависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии от интенсивности электронных переходов в открытое состояние EMBED Equation.DSMT4 при различных интенсивностях электронных переходов в инактивационное состояние EMBED Equation.DSMT4 .
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.14. Гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в закрытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных переходов EMBED Equation.DSMT4 . EMBED Equation.DSMT4 мс-1.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.13. Зависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии от интенсивности электронных переходов в закрытое состояние EMBED Equation.DSMT4 при различных интенсивностях туннельных переходов.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.12. Гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в открытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных переходов EMBED Equation.DSMT4 . EMBED Equation.DSMT4 0.001 мс-1, EMBED Equation.DSMT4 0.025 мс-1
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.11. Зависи-мость активности RyR-канала от времени, интервалы пребывания канала в открытом и закрытом состояниях.
Рис. 3.10. Схема динамики RyR-канала в модифицированной электронно-конформационной теории с
Рис. 3.9. Зависимость времени релаксации канала в точку локального минимума конформационного поте-нциала от параметра электронно-конформаци-онного взаимодействия а.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.8. Конформационный потенциал RyR-канала при четырех различных значениях параметра электронно-конформационного взаимодействия а.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.7. Зависимость времени релаксации канала в точку локального минимума конформационного потенциала от коэффициента упругости канала К.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.6. Зависимость конформационной координаты Q от времени при различных значениях константы упругости RyR-канала К.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.5. Конформационный потенциал RyR-канала при различных значениях коэффициента упругости К. Параметры потенциала: а=5,
р=-1.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.4 Зависимости конформационной координаты Q от времени при различных значениях параметра эффективного трения Г. Параметры КП: K=12, p=-0.86, a=5. а. Колебательное движение вблизи минимума КП. б. Режим отсутствия колебаний системы.
а. б.
EMBED Origin50.Graph EMBED Origin50.Graph
б.
Рис 3.3. Результаты исследования временного ряда Q(t) методом Херста при различных значениях параметра эффективного трения (а); при различных значениях параметра упругости канала K (б).
а.
K=12
Г=2
Рис. 3.2. Зависимости конформационной координаты RyR-канала от времени, результаты численных экспериментов; а. при различных значениях коэффициента упругости К; б. при различных значениях коэффициента эффективного трения Г; в. при различных значениях концентрации цитозольного кальция cis[Са2+].
в.
б.
а.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 3.1. Схема динамики одиночного RyR-канала.
Рис. 2.1. Представление RyR-канала в электронно-конформационной модели. 1 – конформационная, 2 – электронная степени свободы. Слева: канал открыт электронно и конформационно. Справа: канал закрыт электронно и конформационно.
а. б.
Рис. 2.2 Конформационный потенциал RyR-канала, стрелками обозначены электронные (сплошные) и конформационные (штрихованные) переходы. Параметры потенциала: а=5, K=12, p=-0.86. а. Общий вид конформационного потенциала, общий случай (адиабатический режим). б. Частный случай конформационного потенциала при EMBED Equation.DSMT4 (диабатический режим).
а.
б.
Рис 2.3 Влияние люменального Са2+ на конформационный потенциал канала. а. График зависимости значения параметра эффективного давления p от уровня trans[Ca]. (Kca=200 мкМ, n=6) б. Форма конформационного потенциала при различных значениях параметра p. Левый минимум соответствует закрытому, правый – открытому состоянию RyR-канала. Параметры потенциала: а=5, K=12, p=-0.86.
Схема 1. Связывание ионов Са2+ с активационной частью. Открытие канала.
Схема 2. Отсоединение ионов Са2+ от активационной части. Закрытие канала.
Рис. 2.3 Схемы процессов открытия и закрытия канала. Взаимодействие ионов Са2+ с активационной частью канала в ЭК модели.
Рис. 2.4. Две ветви диабатического конформационного потенциала и инактивационное состояние. а. Схема процессов открытия и инактивации канала в ЭК-модели, предложенная в данной работе. б. Энергетические уровни, соответствующие закрытому, открытому и инативированному состояниям канала.
а.
б.
Рис. 2.5. Обозначения вероятностей электронных переходов
1 Pa b
2 Pa u
3 Pi b
4 Pi u
Рис. 2.6. Примитивная модель «качели со сдвинутой осью» описывает конкурирующие процессы активации / инактивации, зависящие от количества ионов, связанных с активационной (слева) и инактивационной (справа) частями канала.
Рис.2.7. Модель «качели» и процессы активации/инактивации RyR-канала. Стрелками обозначены различные электронные переходы канала.
1 Pa b
2 Pa u
3, 4 Pi b, Pi u
|
Ca2+ |
|
|
Ca2+ |
|
|
|
Ca2+ |
|
Ca2+ |
|
|
|
|
|
|
Ca2+ |
Ca2+ |
|
|
|
|
|||||
|
|
Ca2+ |
|
|
Ca2+ |
|
|
|
|
|
Рис. 2.8. Схема заполнения k ионами Са2+ (k=8) активных центров RyR-канала, состоящих из z активных мест связывания (z=36).
Рис.2.9. Квантование энергетических уровней конформационного потенциала.
Рис. 2.10. Туннельный переход между двумя электронно-конформационными оО и сС состояниями. Справа показана зона разрешенного туннелирования.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 2.11. Зависимость проницаемости RyR-канала от конформационной координаты Q.
Q
E(Q)
сC
оO
1
2
3
оC
сO
Рис. 2.12. Простейшая схема динамики RyR-канала в ЭК-модели.
Рис. 2.13. Зависимость вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в диадном пространстве при EMBED Equation.DSMT4 =0.01, α = 1.2·10-6 М, EMBED Equation.DSMT4 =1.5·10-6 М.
EMBED Origin50.Graph
Рис. 2.14 Схема кальциевых токов между компонентами Са2+-«часов».
EMBED Equation.3
EMBED Equation.3
EMBED Equation.3
EMBED Equation.3
1
2
3
Рис. 2.15. Схема случайных переходов из текущего состояния. Стрелки: 1 – электронная активация, 2 – туннелирование, 3 – электронная инактивация.
Рис. 2.16. Скриншот программного комплекса ReleaseUnit.exe, разработанного для проведения численных экспериментов в рамках ЭК-модели и модели ВЕ.
Рис. 2.17. Общий вид среды Mathematica 8.0. В левом окне продемонстрирована аппроксимация результатов численных экспериментов по исследованию активности изолированных RyR-каналов точным решением уравнения Колмогорова. Справа – расчет интенсивностей электронных переходов в ЭК-модели.