Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Тема 10. ДНК - молекулы наследственности. История изучения
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
. Открытие ДНК и нуклеопротеидная теория наследственности
. Доказательства роли ДНК как материального носителя наследственной информации
. Изучение химического состава и структуры ДНК
. Современное представление о структуре ДНК
Список литературы
ВВЕДЕНИЕ
Вопросы наследственности, передачи отдельных признаков от родителей потомству, самовоспроизводства живых организмов на Земле издавна волновали человечество. В разные эпохи различными учеными выдвигалось множество теорий, своеобразно объясняющих подобные процессы. Наиболее древняя из них датирована VI-V вв. до н. э. Это так называемое энцефаломиелоидное учение древнегреческого врача и натурфилософа Алкмеона из Кротона (Гайсинович А. Е., 1988).
Но истинные ответы на эти вопросы человечество смогло найти лишь спустя несколько тысяч лет, с появлением и развитием генетики - науки о наследственности и изменчивости организмов. Официальной датой рождения генетики считают 1900 г., когда трое ученых - голландец Х. де Фриз, немец К. Коренс и австриец Э. Чермак - независимо друг от друга переоткрыли законы Грегора Менделя о наследовании генетических признаков.
С развитием точных наук и техники менялись методы и уровни изучения живой материи. Наряду с классической генетикой, появились такие важные направления, как цитогенетика, генетика человека, генетика микроорганизмов, биохимическая, эволюционная генетика, космическая генетика, молекулярная генетика и многое др.
Именно с молекулярной генетикой связана история изучения структуры и значения ДНК в понимании наследственности.
. ОТКРЫТИЕ ДНК И НУКЛЕОПРОТЕИДНАЯ ТЕОРИЯ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
В настоящее время в сознании многих людей такие термины, как ДНК и генетика, неразделимы. Однако так было не всегда.
В 1868 г. швейцарский химик Ф. Мишер обнаружил в клеточных ядрах, изолированных из гноя, а позже из спермиев лосося вещество, которое он назвал «нуклеином» (от лат. nucleus - ядро). Впоследствии Р. Альтманн (1889 г.) сообщил, что выделенный Ф. Мишером «нуклеин» состоит из двух фракций - белковой и нуклеиновых кислот (Гайсинович А. Е., 1988).
Достаточно длительное время считали, что функцию передачи наследственной информации выполняют белки, т. к. нуклеиновые кислоты относительно просты по химической структуре и проявляют «поразительное единообразие» у разных видов растений и животных. Этому заблуждению способствовало предположение Э. Вильсона (сделанное им в 1925 г.) о том, что функциональную роль в хроматине играют белки, а не нуклеиновые кислоты. В 1928 г. крупнейший советский биолог Н. К. Кольцов (1872-1940) разрабатывает гипотезу молекулярного строения и матричной репродукции хромосом, которая легла в основу главнейших принципов и положений современной молекулярной биологии и генетики. Тем не менее он считает, что хромосома - это гигантская биологическая молекула, обладающая свойством самоудвоения, и что все признаки и свойства организма предопределены строением белка и взаимодействием его молекул, а не ДНК (Гуляев Г. В., 1971).
Иначе говоря, в конце XIX - начале XX вв. в генетике распространилось ошибочное мнение о том, что материальным носителем генетической информации являются белки. О значении нуклеиновых кислот в данных процессах, а равно и о функциях этих химических соединений в организме ничего не было известно. Поэтому этот период в истории изучения ДНК можно смело назвать нуклеопротеидным.
. ДОКАЗАТЕЛЬСТВА РОЛИ ДНК КАК МАТЕРИАЛЬНОГО НОСИТЕЛЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ
Решающим поворотом в генетике было открытие в 1944 г. трансформирующей функции ДНК. Группа американских бактериологов - О. Эвери, Ч. Мак-Леод и М. Мак-Карти - проводила исследования вирулентности возбудителя пневмонии бактерии Diplococcus pneumoniae (Гуляев Г. В., 1971). Их опыты повторил английский бактериолог Ф. Гриффитс. В его опытах использовались два штамма пневмококков с противоположными признаками: с наличием и отсутствием капсул. Клетки капсульного штамма S были вирулентными, а бескапсульного - R - безвредными.
Ф. Гриффитс вводил суспензию данных микроорганизмов белым мышам в различных комбинациях. Животные, зараженные вирулентным штаммом S, погибали. При введении бескапсульных бактерий (R) и клеток S-штамма, убитых нагреванием, мыши выживали. Казалось бы, полученные результаты были закономерны, а их причины - очевидны. Но совершенно обескураживающие результаты были получены у последней группы белых мышей. Этим животным вводили суспензию, содержащую живые клетки бескапсульного штамма и убитые вирулентные бактерии. Через некоторое время у мышей обнаруживались клинические признаки пневмококковой инфекции и животные погибали. Проведенный бактериологический анализ показал, что в тканях погибших мышей содержатся клетки пневмококка, окруженные капсулой. Следовательно, невирулентный бескапсульный штамм пневмококков под воздействием убитых бактерий S-штамма получал новый признак - капсулу - и приобретал вирулентные свойства. Такое явление Гриффитс назвал трансформацией.
Однако природу трансформирующего агента в то время установить не удалось. Было известно, что это вещество небелкового происхождения, т. к. все белки при нагревании подвергались денатурации.
Явление трансформации наблюдалось также и в пробирке (in vitro), где смешивали живые клетки бескапсульного и мертвые бактерии вирулентного штаммов Diplococcus pneumoniаe. Через определенное время часть бескапсульных бактерий приобрели капсулу и вирулентность. Эксперименты in vitro полностью исключали участие в феномене трансформации каких-либо систем макроорганизмов.
Задача О. Эвери с сотрудниками состояла в том, чтобы выяснить, какое именно вещество способствует трансформации. Методика определения была выбрана относительно простая. Лизированные клетки капсульного штамма разделялись на различные химические составляющие. Каждый компонент испытывался на наличие трансформирующих свойств. Путем такого отбора удалось получить вещество, обладающее высокой трансформирующей активностью. Это была дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК.
Однако выводы группы О. Эвери о том, что посредством ДНК клетки-реципиенты получали от клеток-доноров новый генетический признак, долгое время многие ученые-генетики подвергали сомнению.
Например, существенные сомнения вызывал уровень очистки ДНК в экспериментах О. Эвери. Предполагалось, что присутствующие в препаратах нуклеиновых кислот белковые примеси и были причиной передачи нового генетического признака, что абсолютно не противоречило нуклеопротеидной теории. Стремясь проверить правильность выводов О. Эвери, Хочкисс добился такой степени очистки ДНК, что доля балластных веществ, в т. ч. и белков, в препарате составляла всего 0,02 %. Полученная таким образом чистая ДНК, тем не менее, обладала трансформирующими свойствами.
Другое возражение против генетической роли ДНК сводилось к тому, что ДНК как химическое соединение каким-то образом препятствовало биосинтезу основного вещества капсулы - полисахарида. То есть ДНК приписывалось физиологическое, а не генетическое воздействие. Чтобы опровергнуть это возражение, Гарриет Тейлор в 1949 г. получила новые данные о пневмококковой трансформации: она использовала два штамма, полностью лишенных капсул. Первый R-штамм был типичной бескапсульной бактерией, образующей шероховатые колонии. Второй, названный ей eхtremely R (ER), отличался ярко выраженными характеристиками и образовывал сильно шероховатые колонии. Выделенная из штамма R ДНК вносилась на среду с клетками ER. Через определенное время большая часть ER-бактерий превращалась в R-формы. Таким образом было показано, что наличие или отсутствие капсулы не отражается на трансформирующей роли ДНК.
В 1949 г. Хочкисс провел ряд экспериментов, которые подтвердили, что определенной зависимости между ДНК и синтезом бактериальными клетками капсулы на уровне метаболизма не существует. В его опытах трансформации подвергались бактериальные признаки, которые не имеют никакого отношения к капсулообразованию, - устойчивость микробов определенного штамма к пенициллину и стрептомицину передавалась к другому штамму бактерий.
Более наглядно роль ДНК в передаче наследственной информации была установлена в 1952 г. американскими вирусологами А. Д. Херши и М. Чейзом при изучении разложения фага Т2 (вируса бактерий). Опыт состоял в том, что белки, входящие в протеиновую оболочку вириона, были помечены радиоизотопной меткой - S 35 (сера), а ДНК - радиоактивным фосфором - Р32. В дальнейшем вирус культивировался в клетках бактерий. После этого дочерние вирионы - потомство фага - подвергались радиометрическому анализу на распределение радиоактивных меток. Исследования показали, что новое поколение фаговых частиц содержало только фосфор - Р32. Исследователи сделали справедливый вывод о том, что именно ДНК, а не белок передается от родителей к потомству.
О роли ДНК в передаче наследственной информации свидетельствует также открытие в 1952 г. Зайндером и Ледербергом явления трансдукции, заключающееся в переносе генетического материала фагами от одних бактерий к другим. Ученые при этом показали, что в процессе трансдукции активное участие принимает ДНК (Лехов А. П., 1973).
Кроме прямых доказательств об участии ДНК в процессах наследования признаков, наукой был накоплен обширный фактический материал, косвенно подтверждающий высказанные ранее предположения. В частности, об этом говорят данные относительно возникновения вызываемых химическими веществами и радиацией генетических изменений - мутаций.
Значительный вклад в изучение мутагенеза внесли отечественные ученые. Впервые в 1925 г. сотрудники Ленинградского радиевого института Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов воспроизвели мутацию у дрожжевых грибков под влиянием лучей радия (Гулиев Г. В., 1971). В 1932 г. В. В. Сахаров получил мутацию у дрозофилы под воздействием раствора йодистого калия, в 1933 г. М. Е. Лобашев открыл мутагенное действие аммиака (Беляев Д. К., Иванов В. И., 1980). Несколько позже было показано, что мишенью для действия мутагенов является ДНК. Следовательно, изменение в структуре ДНК способствовало изменению генетической информации.
Открытия, сделанные в конце 40 - начале 50 гг. ХХ в. в области молекулярной генетики, предопределили современное направление исследований не только в изучении наследственности, но и биологии в целом. Важнейшее значение открытия явлений трансформации и трансдукции, а также расшифровки действия мутационных факторов заключается прежде всего в доказательстве генетической роли ДНК. Теперь генетики могли с уверенностью констатировать: ДНК является материальным носителем наследственности. Именно эта молекула ответственна за передачу важнейших признаков от родительских особей потомству.
. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И СТРУКТУРЫ ДНК
Если основная функция ДНК для многих ученых была понятна, то химическое строение и, в особенности, трехмерная структура нуклеиновых кислот представлялась еще недостаточно ясной.
С момента открытия Миллером в 1868 г. «нуклеина» прошло немало времени. Основные сведения по химическому составу были изложены А. Косселем, биохимиком, работавшим на рубеже XIX-XX вв. (Стент Г., 1974). Он установил, что нуклеиновая кислота состоит из четырех азотистых оснований, сахара и фосфорной кислоты. Азотистые основания были представлены двумя пуриновыми (аденин, гуанин) и двумя пиримидиновыми (цитозин и урацил) соединениями.
В 20-х гг. минувшего столетия П. Левеном и У. Джонсом в эту схему были внесены важные уточнения. Ими было обнаружено, что нуклеиновые кислоты имеют две разновидности: РНК и ДНК, различные по химическому строению. РНК, или рибонуклеиновая кислота, содержит пятиуглеродный сахар рибозу, а в ДНК присутствует дезоксирибоза. Наконец, ДНК не содержит урацила, как это полагал А. Коссель, вместо него имеется тимин. Кроме того, установлено, что азотистое основание, сахар и остатки фосфорной кислоты образуют соединение, названное нуклеотидом. В свою очередь, нуклеотиды образуют с помощью фосфодиэфирных связей некое подобие цепочки.
В 1924 г. немецкий химик Р. Фельген предложил гистохимический способ окраски ДНК животных, растений и бактерий. Основу методики составлял реактив Шиффа, который окрашивал ДНК в красно-фиолетовый цвет. С помощью реакции Фельгена ученые установили, что ДНК содержится преимущественно в ядре клетки, а РНК - в цитоплазме.
До 1950 г. среди генетиков и биохимиков господствовала тетрануклеотидная теория Ф. А. Левина. Согласно этой теории, все нуклеиновые кислоты - это монотонные макромолекулы, представляющие собою единообразное повторение четырех азотистых оснований - тетрануклеотидов. При этом полярные соотношения аденина, гуанина, цитозина и тимина представлялись как приблизительно равные. Ошибочность этой теории заключалась в том, что структуру ДНК понимали как элементарное химическое соединение, придавая ему линейный характер. Наличие вторичных и третичных структур у ДНК не учитывалось. Это привело к тому, что долгое время ученые считали, что ДНК не способна выполнить функцию носителя информации.
Эту теорию опроверг Э. Чаргафф. В 1948 г. Эрвин Чаргафф и Хочкисс применили для количественной оценки компонентов нуклеиновой кислоты тогда еще новый метод хроматографии на бумаге. Анализируя таким образом различные образцы ДНК от животных, растений и человека, ученые обнаружили, что точного количественного соответствия азотистых оснований ни в одном из случаев не наблюдалось. Напротив, в зависимости от биологического происхождения ДНК, состав молекулы будет различен. Следовательно, обнаружилось, что ДНК отнюдь не монотонная макромолекула. Обобщая данные своих исследований, Э. Чаргафф в 1949 г. сформулировал правило эквивалентности, которое вошло в историю генетики как правило Чаргаффа. Оно гласит: количественные отношения гуанина всегда равны содержанию цитозина, а содержание аденина соответствует содержание тимина. Математически это можно записать так:
А + Г = ц + Т А + Г = Ц + Т
В 1952 г. на основании работ Э. Чаргаффа и Хочкисса была сформулирована теория, объясняющая, каким образом ДНК содержит в себе генетическую информацию. Основное положение этой теории звучит так: «Генетическая информация определяется специфической последовательностью четырех нуклеотидных оснований в полинуклеотидной цепи.
Следует отметить, что установленные опытным путем количественные соотношения азотистых оснований в молекуле ДНК, выраженные в правиле Чаргаффа, не случайны. Отечественные генетики А. С. Спирин и А. Н. Белозерский пришли к выводу, что зависимость содержания гуанин-цитозиновых пар определяется филогенетическими (т. е. сложившимися в процессе эволюции) связями между организациями различной видовой принадлежности.
В 1912 г. отец и сын Брегги изобрели метод рентгеновской кристаллографии, основанный на том, что пучок параллельных рентгеновских лучей, падающих на регулярное скопление атомов, образует так называемую дифракционную картину. Дифракционная картина зависит главным образом от атомной массы атомов и их пространственного расположения. В 40-х гг. Астбюри использовал данный метод для определения пространственной структуры ДНК. На основании полученных рентгенограмм автор предположил, что биополимер ДНК представляет собой стопку из уложенных один над другим нуклеотидов. При этом нуклеотиды представлялись им в виде плоских дисков.
Астбюри оставил работу по дальнейшему изучению структуры ДНК. Исследования в начале 50-х гг. по структуре ДНК продолжили три группы ученых. Первую группу возглавил известный в то время своими работами по расшифровке вторичной структуры белков Лайнус Полинг. Вторая группа работала под руководством английского биофизика, члена Лондонского королевского общества Мориса Уилкинса, и, наконец, третью группу представляли Джеймс Уотсон и Френсис Крик.
Первыми представила свою модель в 1953 г. группа Л. Полинга. Однако она не получила всеобщего признания.
Сотрудникам Уилкинса удалось получить очень четкие рентгенограммы ДНК, на которых отчетливо было видно, что молекула нуклеиновой кислоты состоит из двух нитей, и, в частности, подтвердилась гипотеза Астбюри о межнуклеотидном расстоянии, равном 0, 34 нм
Одну из таких рентгенограмм ДНК, полученной в лаборатории М. Уилкинса, опубликовал журнал Nаture. На эту публикацию обратили внимание Д. Уотсон и Ф. Крик. Анализируя опубликованную рентгенограмму, они дополнили свои предположения и в апреле 1953 г. опубликовали собственную модель пространственной структуры ДНК, названную впоследствии их именами. Основные положения вторичной структуры ДНК, по Уотсону и Крику, сводятся к следующему:
) Молекула ДНК представляет собой двойную спираль диаметром 2 нм.
) Вдоль оси молекулы соседние пары оснований располагаются на расстоянии 0, 34 нм одна от другой. Полный оборот спирали приходится на 3, 4 нм, т. е. на 10 пар оснований.
Придавая молекуле ДНК форму спирали, Уотсон и Крик исходили из того, что последовательность нуклеотидов в цепи отражает генетическую информацию. Из этого следует, что любая произвольная последовательность оснований вдоль полинуклеотидных цепей ДНК должна соответствовать ее молекулярной структуре. Определенные трудности представляло то обстоятельство, что размеры пуринового кольца были больше, чем пиримидинового. Поэтому, чтобы спираль на всем протяжении имела постоянный диаметр, пуриновое кольцо в одной цепи должно быть расположено строго напротив пиримидинового в другой цепи. Так родился постулат о взаимной комплементарности нуклеотидов. Из этого постулата следует, что аденин (А) образует комплементарные связи только с тимином (Т), а гуанин (Г) - только с цитозином (Ц).
Правило комплементарности нуклеотидов взаимосвязано и подтверждается правилами Чаргаффа о эквивалентности. Однако основное значение открытия комплементарного спаривания заключается в признании ДНК самокоплементарной молекулой, т. е. генетическая информация записана в полинуклеотидной цепи в виде определенной последовательности четырех азотистых оснований, тогда каждая молекула ДНК несет два полных набора такой информации. Из этого следует, что обе полинуклеотидные цепочки антипараллельны друг другу.
В пользу спиральной формы ДНК говорит и то обстоятельство, что длина линейной молекулы ДНК, выделенной из бактериальной клетки, равна 1,4 мм, т. е. примерно в 1000 раз превышает длину самой бактерии.
В настоящее время модель ДНК Уотсона и Крика получила всеобщее признание мирового сообщества ученых. В 1962 г. Френсису Крику, Джеймсу Уотсону и Морису Уилкинсу за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их роли в передаче генетической информации в живой материи присуждена Нобелевская премия по генетике.
Однако этим исследования ДНК не ограничились. Вскоре выяснилось, что образуемые между двумя полинуклеотидными цепочками водородные связи можно разорвать при помощи нагревания. В результате повышения температуры до 94 град. в структуре ДНК наблюдался переход от спиральной формы к клубку. Такое явление было названо денатурацией ДНК.
В 1960 г. был открыт обратный процесс - восстановления разрушенных водородных связей и реставрации двойной спирали. Данное явление было названо ренатурацией.
Эти открытия полностью подтвердили высказанную еще в 1953 г. Уотсоном и Криком гипотезу о механизме самоудвоения (репликации) ДНК. По их мнению, репликация ДНК происходит путем разрыва водородных связей между двумя полинуклеотидными цепочками.
Разделение и разматывание молекулы начинается с одного конца спирали и продолжается по направлению к другому. Одновременно с разрывом цепочек происходит процесс синтеза новых полинуклеотидов. Результатом этой гипотезы стал сформулированный авторами постулат полуконсервативного характера репликации ДНК. То есть прежняя полинуклеотидная цепочка является как бы шаблоном для синтеза новой.
Значительный вклад в понимание механизмов самоудвоения молекулы ДНК внес Артур Корнберг. Он открыл фермент, который катализирует синтез полинуклеотидной цепочки. Этот фермент Корнберг назвал ДНК-полимеразой. В 1956 г. Корнберг сообщил, что ему удалось синтезировать в пробирке in vitro молекулу ДНК.
Эксперимент Корнберга показал, что ДНК используется непосредственно в качестве матрицы, без синтеза каких-либо других посредников, что полностью согласовывалось с предположениями Уотсона и Крика о репликации ДНК.
В 1969 г. удалось синтезировать ген комплементарной последовательности транспортной РНК.
. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О СТРУКТУРЕ ДНК
Работы М. Уилкинса, Д. Уотсона и Ф. Крика, Э. Чаргаффа и многих других ученых заложили фундамент в понимание процессов наследственности, а именно - структуры и биологической роли ДНК в передаче генетической информации.
Наука не стоит на месте, и в настоящее время внесены значительные дополнения и коррективы в представления о строении ДНК, разработанные в середине ХХ в. Уотсоном и Криком. Без изменения этих данных история изучения ДНК была бы неполной и незаконченной.
Прежде всего установлено, что ДНК обладает полиморфизмом, т. е. способностью молекулы принимать различные конфигурации. На данный момент описано шесть таких форм. В-форма имеет стандартную структуру, соответствующую модели Уотсона-Крика. Это основной тип ДНК. А-форма представляет собой структуру, схожую для РНК-ДНК дуплексов. Она обнаружена в среде с высокой концентрацией ионов К и Nа и низким содержанием влаги. С-форма менее спирализованная, чем В-форма, т. е. имеет меньше нуклеотидов на один оборот спирали, чем остальные разновидности. Д- и Е-формы - крайние варианты С-формы имеют наименьшее число пар оснований на виток - 8 или 7,5. Они обнаружены только в молекулах ДНК, не содержащих гуанина. Z-форма представляет собой спираль с чередованием лево- и правозакрученности. В ДНК человека имеются участки, которые потенциально способны переходить в Z-форму. В 1993 г. установили, что в организме человека существуют условия, которые стабилизируют Z-форму. Установлено, что некоторые из конфигураций ДНК могут переходить друг в друга: А - В; Z - В.
Ученые полагают, что взаимные переходы А- и В-форм регулируют работу генов.
Исследования, направленные на поиск материального носителя наследственности, определили собой рождение новой науки - молекулярной генетики.
История изучения одной молекулы перевернула прежние представления о наследственности и передаче генетических признаков из поколения в поколение.
Методом проб и ошибок была установлена важнейшая роль ДНК в переносе наследственной информации. Отброшены ошибочные теории о том, что генетическую роль в организме выполняют белки, отвергнута бесперспективная и упрощенная тетрануклеотидная схема строения нуклеиновых кислот.
В начале 50-х гг. Д. Уотсоном и Ф. Криком разработана модель строения молекулы ДНК, разъясняющая, как происходит копирование генетического материала. Вскрыты механизмы этого процесса.
Значительные достижения молекулярной генетики обеспечили прочную основу для таких перспективных направлений, как генная инженерная и биотехнология, планирование генов и многоклеточных организмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
. Беляев Д. К., Иванов В. И. Выдающиеся советские генетики (сборник биографических очерков). М.: Наука, 1980. С. 147.
. Гайсинович А. Е. Зарождение и развитие генетики. М.: Наука, 1988. С. 422.
. Гуляев Г. В. Генетика. М.: Колос, 1971, С. 345.
. Приходченко Н. Н., Шкурат Т. П. Основы генетики человека. Ростов-на-Дону: Феликс, 1997. С. 360.
. Пехов А. П. Введение в молекулярную генетику. М.: Медицина, 1973. С. 265.
. Рейвин А. Эволюция генетики. М.: Мир. 1967.
. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биографии. М.: Мир, 1991. С. 110.
. Стент Г. Молекулярная генетика. М.: Мир, 1974. С. 532.