Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Ярославская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Учебно - методическая разработка для курсантов цикла тематического усовершенствования «Лабораторные исследования системы гемостаза» (ТУ 7)
продолжительность обучения 72 учебных часа (0,5 месяца)
Кафедра клинической лабораторной диагностики
с курсом ФПДО
Ярославль, 2008 год
Тема занятия:
«Современные представления о системе гемостаза».
Место проведения занятия:
Кафедра «Клинической лабораторной диагностики»
Учебная база: ГУЗ ЯО Клиническая больница №5
Конференц-зал, лаборатория Центра изучения тромбозов и
аутоиммунных заболеваний
Оснащение занятия:
Методическое:
- компьютерная версия презентации занятия;
- данные историй болезней пациентов;
- коагулограммы;
Материальное:
- мультимедийные установки;
- агрегометр с набором индукторов;
- полуавтоматический и автоматический коагулометры с набором реагентов;
- оборудование для иммуноферментного анализа;
- комплекты инструментов для забора крови;
- тесты.
Продолжительность занятия:
Количество часов, отведённых на изучение данной темы - 72 учебных часа.
Лекции -30 часов
Семинары – 10 часов.
Практическая часть – 32 часа.
Актуальность темы:
Исследование системы гемостаза имеет первостепенное значение для диагностики различных видов тромбозов, тромбофилических состояний, тромбоэмболий, геморрагического синдрома, процессов диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, в том числе при критических состояниях. Именно тромбозы той или иной этиологии служат ведущей причиной гибели людей во всех странах мира. Динамический контроль состояния свертывающей системы необходим при проведении антикоагулянтной, фибринолитической, антиагрегантной терапии, являющейся неотъемлемой частью многих современных схем лечения терапевтической, хирургической и акушерской патологии.
Исследование системы свертывания крови базируется на определении показателей первичного (тромбоцитарно-сосудистого), коагуляционного звеньев гемостаза, антикоагулянтной и фибринолитической систем, исследовании активности и количественного содержания многих белков в плазме крови пациента.
На сегодняшний день, учитывая возможность высокой автоматизации исследования, немаловажное значение приобретает соблюдение всех правил преаналитического этапа исследования свертывающей системы.
Целевая установка:
Учебная – обучить слушателей методам исследования свертывающей системы крови, научить проводить клинико-диагностическую трактовку основных изменений полученных данных.
Развивающая – приобретение навыков в выполнении лабораторных методов исследования различных звеньев системы гемостаза. Умение излагать материал последовательно и логично, приводить примеры, пользоваться терминологией, соответствующей теме занятия.
Конкретные задачи:
1. Разобрать технику проведения, особенности преаналитического этапа исследования свертывающей системы.
2. Познакомится с нормативными показателями коагулограммы.
3. Обучиться интерпретировать изменения основных показателей гемостазиограммы в зависимости от патологии.
4. Научиться анализировать полученные данные в целом, с дальнейшей постановкой предполагаемого диагноза патологических состояний, приведших к нарушениям в свертывающей системе крови.
5. Использовать полученные знания в ходе практических заданий.
Обучающийся должен знать:
- основные компоненты системы гемостаза, участвующие в формировании и препятствующие образованию тромба;
- последовательность физиологических реакций тромбоцитарно-сосудистого и коагуляционного звеньев гемостаза;
- влияние системы физиологических ингибиторов свертывания на формирование тромба;
- механизмы, приводящие к растворению тромба, участие фибринолитической системы в развитии геморрагического и гиперкоагуляционного синдромов;
- факторы риска тромбозов и геморрагий, патологические состояния, проявляющиеся нарушениями в системе гемостаза;
- варианты геморрагического синдрома, клинику тромбоза сосудов различной локализации и тромбоэмболии легочной артерии;
- распространенность тромбофилий, особенности условий возникновения и локализации тромбоза сосудов в зависимости от инициирующих его причин;
- основные показатели, определяемые для изучения состояния первичного гемостаза;
- основные показатели, определяемые для изучения состояния коагуляционного гемостаза и контроля терапии;
- основные показатели антикоагулянтной и фибринолитической систем;
- скринининговые тесты гемостазиограммы, последовательность назначения тестов для выявления причин нарушения в системе свертывания крови.
- методику подготовки пациента, забора и подготовки крови на исследование;
- нормальные значения основных показателей гемостазиограммы;
- наиболее значимые изменения в указанных показателях.
Обучающийся должен уметь:
- провести забор и подготовку крови на исследование;
- провести инструментальное исследование свертывающей системы крови;
- трактовать основные изменения показателей обозначенных методов исследования;
- строить логические заключения, делать выводы из полученных данных лабораторных анализов;
- активно участвовать в ходе занятия, аргументировать свои рассуждения.
Тип занятия:
Комбинированное занятие – семинар с элементами проблемного обучения, с последующим закреплением знаний практическими навыками.
|
Пропедевтика внутренних болезней Инфекционные болезни Гематология Терапия Хирургия |
Межпредметные связи
|
Биология Гистология Общая химия Органическая химия Неорганическая химия Анатомия человека Патологическая анатомия Нормальная физиология Патологическая физиология |
«Современные
лабораторные
методы исследования системы гемостаза»
→
Внутрипредметные связи
|
«Система гемостаза в норме и патологии» «Тромбофилии» «Тромбоцитопении и тромбоцитопатии» «Гемофилии» «Венозный тромбоэмболизм» «ДВС-синдром» «Болезнь фон Виллебранда» «Фармакологические препараты в гемостазиологии» |
|
Забор биологического материала для лабораторного анализа Микроскопия мазка Агрегатометрия («Biola LA-230») Проведение коагулограммы на коагулометре («Sysmex CA50», «Sysmex CA 560») |
«Современные
лабораторные
методы
исследования
системы гемостаза
→
Вопросы для повторения:
План самостоятельной работы курсанта на практическом занятии:
Вопросы для самоконтроля:
Литература, рекомендуемая для самоподготовки
1. В.В.Долгов, П.В.Свирин «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза». М.: Триада, 2005г.
2. А.П.Момот «Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы лабораторной диагностики». С-Пб.: ФормаТ, 2006г.
3. Баркаган З.С., Момот А.П. «Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза». М.: Ньюдиамед, 2001г.
4. «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза в клинической практике». Методическое пособие для студентов медицинских ВУЗов. Ярославль, 2002г.
5. Бокарев И.Н. «Кровоточивость, или геморрагический синдром. Дифференциальная диагностика и лечение» М.; 2002г.
6. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Венозный тромбоэмболизм и тромбоэмболия легочной артерии. М.: «МИА»; 2005г.
7. Василенко В.Х., Гребенев АЛ. «Пропедевтика внутренних болезней» М.: Медицина, 1982г.
8. Гребенев АЛ. «Пропедевтика внутренних болезней» М.:Медицина, 1995г.
9. «Практикум по клиническим лабораторным методам исследования». Под ред.
проф. Н.П.Шилкиной. Ярославль, 1999г.
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Ярославская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Учебно - методическая разработка для преподавателей цикла тематического усовершенствования «Лабораторные исследования системы гемостаза» (ТУ 7)
продолжительность обучения 72 учебных часа (0,5 месяца)
Кафедра клинической лабораторной диагностики
с курсом ФПДО
Ярославль, 2008 год
Тема занятия:
«Современные представления о системе гемостаза».
Место проведения занятия:
Кафедра «Клинической лабораторной диагностики»
Учебная база: ГУЗ ЯО Клиническая больница №5
Конференц-зал, лаборатория Центра изучения тромбозов и
аутоиммунных заболеваний
Оснащение занятия:
Методическое:
- компьютерная версия презентации занятия;
- данные историй болезней пациентов;
- коагулограммы;
Материальное:
- мультимедийные установки;
- агрегометр с набором индукторов;
- полуавтоматический и автоматический коагулометры с набором реагентов;
- оборудование для иммуноферментного анализа;
- комплекты инструментов для забора крови;
- тесты.
Продолжительность занятия:
Количество часов, отведённых на изучение данной темы - 72 учебных часа.
Лекции -30 часов
Семинары – 10 часов.
Практическая часть – 32 часа.
Актуальность темы:
Исследование системы гемостаза имеет первостепенное значение для диагностики различных видов тромбозов, тромбофилических состояний, тромбоэмболий, геморрагического синдрома, процессов диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, в том числе при критических состояниях. Именно тромбозы той или иной этиологии служат ведущей причиной гибели людей во всех странах мира. Динамический контроль состояния свертывающей системы необходим при проведении антикоагулянтной, фибринолитической, антиагрегантной терапии, являющейся неотъемлемой частью многих современных схем лечения терапевтической, хирургической и акушерской патологии.
Исследование системы свертывания крови базируется на определении показателей первичного (тромбоцитарно-сосудистого), коагуляционного звеньев гемостаза, антикоагулянтной и фибринолитической систем, исследовании активности и количественного содержания многих белков в плазме крови пациента.
На сегодняшний день, учитывая возможность высокой автоматизации исследования, немаловажное значение приобретает соблюдение всех правил преаналитического этапа исследования свертывающей системы.
Целевая установка:
Учебная – обучить слушателей методам исследования свертывающей системы крови, научить проводить клинико-диагностическую трактовку основных изменений полученных данных.
Развивающая – приобретение навыков в выполнении лабораторных методов исследования различных звеньев системы гемостаза. Умение излагать материал последовательно и логично, приводить примеры, пользоваться терминологией, соответствующей теме занятия.
Воспитательная – в процессе проведения занятия следует стремиться выработать у курсантов интерес к изучаемым методам исследования.
Конкретные задачи:
1. Разобрать технику проведения, особенности преаналитического этапа исследования свертывающей системы.
2. Познакомится с нормативными показателями коагулограммы.
3. Обучиться интерпретировать изменения основных показателей гемостазиограммы в зависимости от патологии.
4. Научиться анализировать полученные данные в целом, с дальнейшей постановкой предполагаемого диагноза патологических состояний, приведших к нарушениям в свертывающей системе крови.
5. Использовать полученные знания в ходе практических заданий.
Обучающийся должен знать:
- основные компоненты системы гемостаза, участвующие в формировании и препятствующие образованию тромба;
- последовательность физиологических реакций тромбоцитарно-сосудистого и коагуляционного звеньев гемостаза;
- влияние системы физиологических ингибиторов свертывания на формирование тромба;
- механизмы, приводящие к растворению тромба, участие фибринолитической системы в развитии геморрагического и гиперкоагуляционного синдромов;
- факторы риска тромбозов и геморрагий, патологические состояния, проявляющиеся нарушениями в системе гемостаза;
- варианты геморрагического синдрома, клинику тромбоза сосудов различной локализации и тромбоэмболии легочной артерии;
- распространенность тромбофилий, особенности условий возникновения и локализации тромбоза сосудов в зависимости от инициирующих его причин;
- основные показатели, определяемые для изучения состояния первичного гемостаза;
- основные показатели, определяемые для изучения состояния коагуляционного гемостаза и контроля терапии;
- основные показатели антикоагулянтной и фибринолитической систем;
- скринининговые тесты гемостазиограммы, последовательность назначения тестов для выявления причин нарушения в системе свертывания крови.
- методику подготовки пациента, забора и подготовки крови на исследование;
- нормальные значения основных показателей гемостазиограммы;
- наиболее значимые изменения в указанных показателях.
Обучающийся должен уметь:
- провести забор и подготовку крови на исследование;
- провести инструментальное исследование свертывающей системы крови;
- трактовать основные изменения показателей обозначенных методов исследования;
- строить логические заключения, делать выводы из полученных данных лабораторных анализов;
- активно участвовать в ходе занятия, аргументировать свои рассуждения.
Тип занятия:
Комбинированное занятие – семинар с элементами проблемного обучения, с последующим закреплением знаний практическими навыками.
|
Пропедевтика внутренних болезней Инфекционные болезни Гематология Терапия Хирургия |
Межпредметные связи
|
Биология Гистология Общая химия Органическая химия Неорганическая химия Анатомия человека Патологическая анатомия Нормальная физиология Патологическая физиология |
«Современные
лабораторные
методы исследования системы гемостаза»
→
Внутрипредметные связи
|
«Система гемостаза в норме и патологии» «Тромбофилии» «Тромбоцитопении и тромбоцитопатии» «Гемофилии» «Венозный тромбоэмболизм» «ДВС-синдром» «Болезнь фон Виллебранда» «Фармакологические препараты в гемостазиологии» |
|
Забор биологического материала для лабораторного анализа Микроскопия мазка Агрегатометрия («Biola LA-230») Проведение коагулограммы на коагулометре («Sysmex CA50», «Sysmex CA 560») |
«Современные
лабораторные
методы
исследования
системы гемостаза
→
Вопросы для повторения:
План самостоятельной работы курсанта на практическом занятии:
Вопросы для самоконтроля:
Литература, рекомендуемая для самоподготовки
1. В.В.Долгов, П.В.Свирин «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза». М.: Триада, 2005г.
2. А.П.Момот «Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы лабораторной диагностики». С-Пб.: ФормаТ, 2006г.
3. Баркаган З.С., Момот А.П. «Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза». М.: Ньюдиамед, 2001г.
4. «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза в клинической практике». Методическое пособие для студентов медицинских ВУЗов. Ярославль, 2002г.
5. Бокарев И.Н. «Кровоточивость, или геморрагический синдром. Дифференциальная диагностика и лечение» М.; 2002г.
6. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Венозный тромбоэмболизм и тромбоэмболия легочной артерии. М.: «МИА»; 2005г.
7. Василенко В.Х., Гребенев АЛ. «Пропедевтика внутренних болезней» М.: Медицина, 1982г.
8. Гребенев АЛ. «Пропедевтика внутренних болезней» М.:Медицина, 1995г.
9. «Практикум по клиническим лабораторным методам исследования». Под ред.
проф. Н.П.Шилкиной. Ярославль, 1999г.
План - хронокарта занятия
|
N |
Этапы занятия |
Вре-мя |
Действия преподавателя |
Действия учащихся |
Оснащение |
Формы и методы работы |
|
1 |
Организа- ционный |
1час 25 мин. |
Определение темы. |
Внимательно слушать преподавателя. |
Компьютерная версия презентации занятия. |
Вводная форма (установочная) |
|
2 |
Контроль исходного уровня знаний. |
15 мин. |
Фронтальный опрос. |
Давать ответы на поставленные вопросы. |
Компьютерная версия презентации занятия. |
Активный метод |
|
3 |
Педагоги- ческий показ |
1 час 30 мин. |
Проведение агрегатометрии тромбоцитов, коагулограммы на полуавтоматическом и автоматическом коагулометрах, объяснение принципа ИФА, латекс-тест на D-димер |
Наблюдать за действиями преподавателя, запоминать, при необходимости записывать, задавать вопросы. |
Агрегометр, коагулометры, спектрофотометр (микропланшетный ридер), промывочная станция для ИФА, набор для определения D-димера (латекс-аглютинация) |
Объясни-тельно – иллюстра-тивный метод |
|
4 |
Само- стоятель-ная работа. |
60 мин. |
Под контролем преподавателя выполнение практических методик по исследованию показателей гемостаза |
Выполнять основные практические методики по исследованию мокроты, транссудата, экссудата; желудочного и дуоденального содержимого, копрограммы. |
Агрегометр, коагулометры, спектрофотометр (микропланшетный ридер), промывочная станция для ИФА, набор для определения D-димера (латекс-аглютинация) |
Репродуктив-ный метод. |
|
5 |
Контроль конечного уровня знаний. |
25 мин. |
Раздача тестов и контроль за выполнением задания. |
Индивидуальное решение тестовых заданий. |
Тесты. |
Репродуктив-ный метод. |
|
6 |
Взаимо- проверка |
15 мин. |
Наблюдение и контроль за рассуждениями студентов. |
Студенты проверяют друг друга, обсуждают, дополняют. |
Агрегометр, коагулометры, спектрофотометр (микропланшетный ридер), промывочная станция для ИФА, набор для определения D-димера (латекс-аглютинация) |
Активный метод. |
|
7 |
Подведение итогов и задание на дом. |
5 мин. |
Сообщается оценка деятельности каждого студента. Даётся домашнее задание. |
Сделать выводы. Записать задание на дом. |
|
|
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Кафедра лабораторной диагностики с курсом ФПДО
Лекционный материал
для курсантов ФПДО по теме:
ГЕМОСТАЗ:
современные представления
и методы исследования
Ярославль, 2008
ВВЕДЕНИЕ
Исследование системы гемостаза имеет первостепенное значение для диагностики различных видов тромбозов, тромбофилических состояний, тромбоэмболий, геморрагического синдрома, процессов диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, в том числе при критических состояниях. Именно тромбозы той или иной этиологии служат ведущей причиной гибели людей во всех странах мира. Динамический контроль состояния свертывающей системы необходим при проведении антикоагулянтной, фибринолитической, антиагрегантной терапии, являющейся неотъемлемой частью многих современных схем лечения терапевтической, хирургической и акушерской патологии.
Таким образом, проблема изучения гемостаза и коррекция его нарушений является одной из наиболее актуальных проблем медицины. Очевидно, что в современных условиях не могут считаться сколько-нибудь полноценными обследование и лечение больных без контроля состояния системы свертывания крови.
Вместе с тем, оценка системы гемокоагуляции является одной из самых сложных задач лабораторного исследования. Адекватная лабораторная диагностика нарушений в системе гемостаза невозможна без понимания общих биологических закономерностей функционирования многокомпонентных систем организма, патофизиологических механизмов нарушений процесса свертывания крови, строения и функции отдельных структур и компонентов системы гемостаза, методических подходов к его изучению. Ключевыми в правильной диагностике патологии свертывания крови являются вопросы стандартизации, контроля качества проводимых исследований, приборного обеспечения диагностического поиска.
ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ СВЁРТЫВАНИЯ КРОВИ
Система гемостаза – биологическая система, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение жидкого состояния циркулирующей крови, а с другой, - предупреждение и купирование кровотечений. Это двуединство противоположных функций предопределяет сопряженное участие в механизмах гемостаза различных морфологических структур и биохимических процессов, многоступенчатость их взаимодействия, функционирование на всех этапах механизмов самоускорения и самоторможения, активации и инактивации.
Простыми словами, совершенный гемостаз – это отсутствие кровотечений и отсутствие тромбозов.
Основные компоненты системы гемостаза представлены в таблице 1.
|
Таблица 1. Основные компоненты гемостаза |
|
Сосудистая стенка (особенно эндотелий и субэндотелий) Тромбоциты и другие клетки крови Плазменные факторы свертывания Антикоагулянты Факторы фибринолиза и их ингибиторы Другие протеины плазмы (фактор фон Виллебранда, белки острой фазы, иммуноглобулины и др.) Ионы кальция Органические низкомолекулярные субстанции (фосфолипиды, простагландины и др.) Цитокины, гормоны |
Взаимодействие этих компонентов очень хорошо организовано серией механизмов прямого и обратного взаимодействия и обеспечивает несвертываемость крови и циркуляцию ее в сосудах в течение всей жизни человека. При патологии, сопровождаемой повреждением сосудов, а также при патологических состояниях (атеросклероз, злокачественные новообразования, аутоиммунная патология) происходит активация системы гемостаза с доминированием компонентов, непосредственно связанных с повреждающим агентом. При этом в системе кровотока появляются маркеры активации, которые генерируются при активации факторов свертывания, высвобождаются из активированных тромбоцитов или синтезируются эндотелием. Эти продукты регистрируются лабораторными методами, их изменение и соотношение используется для диагностики различных патологических процессов в системе гемостаза.
Этапы активации системы гемостаза
Процесс активации системы гемостаза можно разделить на несколько этапов, которые протекают параллельно и дополняют друг друга. Как правило, выделяют:
Первичный гемостаз - в нем участвуют сосуды и тромбоциты, его же часто обозначают как сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. Он представляет собой серию реакций на повреждение сосудистой стенки, включая немедленный сосудистый спазм, адгезию тромбоцитов к месту повреждения, их активацию с изменением формы (секунды), агрегацию тромбоцитов, секрецию тромбоцитарных факторов, формирование тромбоцитарной пробки (минуты).
Вторичный (коагуляционный) гемостаз - в нем участвуют плазменные факторы свертывания. Этот этап включает активацию плазменных факторов и образование фибрина, скрепляющего тромбоцитарную пробку (окончательный тромб). Эта фаза длится 5-10 мин.
Фибринолиз, длительностью 48-72 ч. При этом наблюдается активация компонентов фибринолиза (минуты) и растворение (лизис) тромба (часы).
Эндотелий
Тромбообразование – это конечный этап сложного процесса взаимодействия компонентов сосудистой стенки, тромбоцитов, белков свертывающей и противосвертывающей систем крови. В норме сосудистая стенка резистентна к тромбообразованию за счет следующих факторов:
отрицательного поверхностного заряда эндотелиальных клеток и тромбоцитов, способствующего их взаимному отталкиванию;
синтеза простациклина (PgI2) и оксида азота (NO)
активности фермента АДФ-азы.
.Целостность эндотелиального покрова является основой нормального функционирования кровеносных сосудов. Площадь поверхности эндотелиального покрова в сосудах взрослого человека сопоставима с площадью футбольного поля. Сосудистая стенка имеет очень активную поверхность, покрытую с внутренней стороны эндотелиальными клетками. Клеточная мембрана эндотелиоцитов обладает высокой текучестью, что является основным условием антитромбогенных свойств сосудистой стенки. Высокая текучесть обеспечивает гладкую внутреннюю поверхность эндотелия, который функционирует как целостный пласт.
При контакте с поверхностью с высокой текучестью клетки крови, плазменные факторы и другие компоненты гемостаза не активируются.
На мембране эндотелиальных клеток находится гликопротеид тромбомодулин, который связывает тромбин, локализующийся на внутренней поверхности сосудистой стенки. Комплекс тромбомодулин–тромбин стимулирует активацию протеина С, являющегося сильным антикоагулянтом.
Антитромбоцитарные свойства сосудов обусловлены простациклином и оксидом азота (NO), которые постоянно синтезируются в эндотелии и препятствуют адгезии и агрегации тромбоцитов на нормальной сосудистой стенке.
Эндотелий синтезирует и постоянно высвобождает в плазму ингибитор внешнего пути (ИВП, TFPI – tissue factor pathway inhibitor). Образующиеся комплексы TFPI + активный фактор Xa соединяются с фактором VIIa, связанным с тканевым фактором, формируя четырехкомпонентный комплекс (фактор VIIa + тканевой фактор + TFPI + фактор Xa). Тем самым инактивируются факторы внешнего каскада коагуляции.
Сосудистому эндотелию принадлежит ведущая роль в регуляции сосудистого тонуса. Эндотелий является структурным организатором, вырабатывающим несколько активных метаболитов, контролирующих сосудистый тонус. Это эндотелин, оксид азота (NO) и простациклин (ПГI2).
Доказано, что дисбаланс эндотелий-зависимой сократимости и релаксации сосудов при артериальной гипертензии может способствовать повышению общего периферического сопротивления сосудов и появлению сердечно-сосудистых осложнений. Наиболее высокий уровень эндотелина отмечен при атеросклерозе, неспецифическом аортоартериите, облитерирующем тромбангиите, то есть при заболеваниях, протекающих с повреждением эндотелия. Поскольку эндотелин действует преимущественно местно, естественно предположить, что повышенное образование и поступление его в кровь может быть причиной возникновения и усугубления тяжести течения ИБС.
Прокоагулянтная функция эндотелиальных клеток связана с синтезом тканевого фактора (тромбопластина) – индуктора внешнего пути свертывания крови. Тканевой тромбопластин высвобождается из эндотелиальных клеток только при их повреждении, поэтому в норме антикоагулянтная активность эндотелия преобладает над прокоагулянтной.
Повреждение эндотелия обусловливает взаимодействие сосудистой стенки с клетками крови, в первую очередь тромбоцитами. В месте повреждения начинается образование тромба, вначале тромбоцитарного (рис.1).
Тромбоциты
Тромбоциты – клетки крови, которые продуцируются в органах кроветворения мегакариоцитами, продолжительность жизни тромбоцитов человека составляет 7-10 дней. Срок жизни снижается при повреждении сосудов, при действии чужеродных поверхностей (например, искусственных клапанов сердца), внутрисосудистой активации, изменении поверхностных структур тромбоцитов.
Сохранение жидкого состояния крови и непрерывного кровообращения требует, чтобы тромбоцитарные гемостатические реакции были ограничены во времени, степени и протяженности строго в соответствии с биологической целесообразностью.
Выделяют несколько этапов образования тромбоцитарного тромба. Традиционно они представляются в следующей последовательности:
- адгезия тромбоцитов к субэндотелию
- активация тромбоцитов
- секреция содержимого тромбоцитарных гранул
- агрегация тромбоцитов
У здорового человека количество тромбоцитов может меняться в течение суток. При ручном подсчете число тромбоцитов 180-320109/л принято за норму. Применение автоматических анализаторов способствовало внедрению более широких границ нормального содержания тромбоцитов (PLT) - 150-450109/л. С помощью автоматических анализаторов можно измерить средний объем тромбоцита (MPV) и дисперсию распределения тромбоцитов по объему (PDW).
Структурная организация тромбоцитов. Тромбоциты окружены бислойной фосфолипидной мембраной с асимметрично расположенными фосфолипидами. Фосфолипиды тромбоцитов, также известные как фактор 3 тромбоцитов (ф3, PF3) или тромбоцитарный тромбопластин, играют критическую роль в образовании активных комплексов из факторов свертывания крови и формировании тромбина, объединяя тромбоциты и плазменные факторы в едином процессе свертывания крови.
Органеллы тромбоцитов. Зона органелл тромбоцитов состоит из беспорядочно расположенных по цитоплазме митохондрий, пероксисом (содержат каталазу) и гранул хранения. В тромбоцитах выделяют 3 вида органелл хранения: -гранулы, электронноплотные тельца (-гранулы) и лизосомы (-гранулы) (рис.5).
Активация тромбоцитов. Неактивный тромбоцит имеет дискоидную форму. Активация сопровождается изменением формы тромбоцитов, агрегацией или адгезией и освобождением содержимого тромбоцитарных гранул (секреция).
Таким образом, тромбоцитарный тромб – это соединенные между собой с помощью молекулы фибриногена активированные тромбоциты, прикрепленные с помощью фактора Виллебранда к субэндотелиальным структурам в месте повреждения эндотелия сосудистой стенки. Тромбоцитарный тромб, образующийся в месте повреждения эндотелия или субэндотелиального слоя, способен остановить кровотечение в мелких капиллярах и венулах. Прочность этого тромба недостаточна, чтобы противостоять внутрисосудистому давлению, и он нуждается в укреплении фибрином, который образуется в процессе вторичного (коагуляционного) гемостаза.
Коагуляционный гемостаз
Итак, первичная тромбоцитарная пробка, образующаяся в месте нарушения целостности сосудистой стенки, не является достаточно прочной, и после восстановления кровотока и повышения давления крови она может быть разрушена, кровотечение может возобновиться. Для предотвращения этого тромбоцитарные агрегаты должны быть укреплены фибрином, являющимся конечным продуктом каскада активации плазменных факторов коагуляции (таблица 6)
Образование фибрина является конечным этапом свертывания крови в результате серии последовательных протеазных реакций. Этому предшествует активация фактора Х и протромбина.
Таблица 6. Плазменные факторы коагуляции
|
Фактор |
Синоним |
Содержание в плазме, мкгмл |
|
I |
Фибриноген |
1700-4500 |
|
II |
Протромбин |
100 |
|
III |
Тканевой тромбопластин |
0 |
|
IV |
Ионы Са++ |
0,8 – 1,32 ммольл |
|
V |
Проакцелерин (АС-глобулин) |
10 |
|
VI |
Акцелерин (сывороточный АС-глобулин) |
|
|
VII |
Проконвертин (конвертин) |
0,5 |
|
VIII |
Антигемофильный глобулин (плазменный тромбопластический фактор А; VIII:С) |
0,1 |
|
IX |
Кристмас-фактор (антигемофильный глобулин В; плазменный тромбопластиновый комплекс - PTC) |
5 |
|
X |
Фактор Стюарта-Прауэра |
8 |
|
XI |
Плазменный предшественник тромбопластина (PTA-фактор) |
5 |
|
XII |
Фактор Хагемана (фактор контакта) |
30 |
|
XIII |
Фибринстабилизи-рующий фактор |
10 |
|
Фактор Флетчера |
Плазменный прекалликреин |
|
|
Фактор Фитцжеральда (Фитцжеральда-Фложе) |
Высокомлекулярный кининоген плазмы, ВМ-кининоген) |
|
|
Витамин «К» - зависимые факторы: II, VII, IX, X |
||
|
Чувствительные к тромбину факторы: I, V, VIII, XIII |
||
|
Факторы контакта: XII, XI, ВМ-кининоген, прекалликреин |
||
|
Факторы-сериновые протеазы: XII, XI, X, IX, VII, II, Плазмин |
Фактор Х является кардинальным в механизме свертывания крови. В зависимости от механизма его активации условно различают 2 пути коагуляции – внутренний (контактный) и внешний.
Все необходимые факторы внутреннего пути присутствуют в крови, и активация свертывающей системы начинается при контакте крови с отрицательно заряженной поверхностью. Такой поверхностью могут быть стекло или пластик, обеспечивающие взаимодействие некоторых белков, которым необходимы отрицательно заряженные поверхности для их конформационных изменений и активации. Отрицательно заряженными биологическими поверхностями также могут служить коллаген и компоненты клеточных мембран, такие как сульфатиды.
Процесс свертывания по внутреннему пути инициируется за счет формирования комплекса, состоящего из 2 факторов свертывания (XII и XI), высокомолекулярного кининогена (ВМК, HMWK) и прекалликреина (ПК). В результате фактор XII превращается в активированный фактор XIIа.
Контактная фаза развивается по механизму положительной обратной связи: в присутствии ВМК прекалликреин превращается в активированный калликреин, стимулирующий переход фактора XII в XIIа, который в свою очередь активирует ВМК. Полагают, что в большинстве случаев внутренний путь менее важен по сравнению с внешним путем свертывания крови, а контактная активация свертывания крови выполняет ряд других важных функций, включая активацию фибринолиза и регуляцию артериального давления через систему ренин-ангиотензиноген и кинины.
Внешний путь активации фактора Х быстро включается после повреждения ткани и осуществляется совместно фактором VIIа и тканевым фактором (ТФ, TF). Предшественник фактора VIIа – фактор VII – синтезируется в печени и может активироваться тромбином или фактором Ха. Фактор VII обладает довольно высокой эндогенной активностью, небольшое его количество (около 1% от общего количества фактора VII) постоянно находится в плазме в активированном состоянии.
Только в присутствии ТФ фактор VII расщепляет (то есть активирует) факторы Х и IХ. Расположенный на поверхности клеток ТФ активирует фактор VII, и этот комплекс катализирует образование небольших количеств фактора Ха, который активизирует VII фактор по принципу положительной обратной связи. Далее высокоактивный комплекс ТФ–VIIa ускоряет реакции активации факторов Х и IХ.
Тромбин играет ключевую роль в процессе свертывания крови. Как только концентрация его достигает уровня, достаточного для преодоления действия антитромбинов, он быстро превращает растворимый фибриноген в фибрин-мономер. Длинные нерастворимые мономеры фибрина спонтанно скручиваются в зигзагообразные структуры, конечным этапом этого процесса является образование нерастворимого полимерного фибринового сгустка. Тромбин также активирует фактор XIII, под действием которого происходит полимеризация фибрина. Тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов и стимулирует секрецию эндотелиального релаксирующего фактора эндотелиальными клетками.
Ингибиторы свертывания крови
Важнейшими ингибиторами прокоагулянтной системы являются антитромбин III, протеин S, протеин C, гепарин - кофактор II, ингибитор тканевого пути свёртывания (TFPI), 2-макроглобулин, 1-антитрипсин, гепарин, тромбомодулин, протеин Z.
Естественные механизмы ограничения тромбообразования включают две системы ингибиторов, контролирующих активацию свертывания крови:
ингибиторы сериновых протеаз – ингибируют активированные факторы свертывания крови
система протеина С – инактивирует активированные кофакторы
Антитромбин III (АТ III) – один из наиболее изученных и важных антикоагулянтов плазмы крови, который ингибирует тромбин, факторы Ха и IХа. От 70 до 90% ингибирующей активности сывороточных протеаз обусловлены активностью AT III. АТ III, связывая гепариноподобные протеогликаны на поверхности эндотелиоцитов, способствует инактивации тромбина.
Наряду с АТ III и TFPI важным компонентом противосвертывающей системы является протеин С – витамин К–зависимый белок протромбиназного комплекса.
Механизм антикоагулянтного действия системы протеина С заключается в следующем. Тромбин, вымываемый током крови из места образования (места повреждения эндотелия), контактирует с неповрежденным эндотелием, где возможна его инактивация АТ III, либо связывание с тромбомодулином. На поверхности эндотелиальных клеток экспрессируются рецепторы протеина С, которые, связывая активированный протеин С, в комплексе с тромбин-тромбомодулином, ускоряют активацию последнего. Образованный активированный протеин короткое время остается связанным с эндотелиальными рецепторами протеина С. При диссоциации комплекса активированный протеин С:рецептор активированный белок С связывает протеин S. Образующийся комплекс инактивирует факторы Vа и VIIIа на поверхности активированных тромбоцитов, эндотелиальных клеток и других клеток крови.
Резистентность к активированному протеину С обозначает устойчивость фактора Vа к инактивации под действием активированного протеина С. При этом состоянии не отмечается удлинения времени свертывания плазмы после добавления к плазме активированного протеина С. Наследственная форма резистентности к активированному протеину С может быть связана с мутацией в V факторе (так называемая мутация V Leiden), что приводит к развитию нечувствительности фактора V к активированному протеину С и сопровождается повышением уровня этого фактора в плазме и, соответственно, усилением образования тромбина.
Причины резистентности к активированному протеину С могут быть и приобретенными. Приобретенная резистентность возможна при беременности или любом воспалении, что, вероятно, связано с увеличением уровня С4b-связывающего белка и функциональным дефицитом протеина S. Повышение уровня VIII фактора свертывания – спонтанное или при воспалении – также может быть причиной резистентности к активированному протеину С.
Система фибринолиза
В норме система фибринолиза обеспечивает восстановление нормального кровотока после повреждения ткани и тромбирования сосудов. Действие антитромбина III и активация протеина С направлены на ограничение роста фибринового тромба. Такую же функцию выполняет фибринолитическая система, которая не только ограничивает рост, но и обеспечивает растворение тромба. Фибринолитическая система имеет некоторое сходство с системой свертывания крови. Так же как и в свертывающей системе, кофакторы играют важную роль в процессе фибринолиза.
Подобно свертыванию крови условно выделяют два пути фибринолиза – плазминзависимый и плазминнезависимый
Снижение активности фибринолиза зачастую связано с развитием тромбоэмболических осложнений.
Таким образом, в регуляции свёртывания крови участвует множество факторов, нарушение баланса между которыми может приводить как к развитию тромбозов, так и кровоточивости.
ДИАГНОСТИКА НАРУШЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
Геморрагический синдром, интенсивность которого может варьировать от петехий и небольших поверхностных кровоизлияний до профузных кровотечений и кровоизлияний в жизненно важные органы, в 80% случаев обусловлен патологией первичного гемостаза, нарушениями со стороны плазменного компонента гемостаза - в 18-20% случаев, дефектом сосудистой стенки - в 1-2%.
Для дефекта тромбоцитарно - сосудистого гемостаза в большей степени характерны кожные и слизистые петехии и пурпура, небольшие и поверхностные спонтанные гематомы, меноррагии, желудочно-кишечные кровотечения.
При нарушении плазменного компонента гемостаза более типичны обширные и глубокие (обычно изолированные) гематомы, кровоизлияния в суставы и мышцы. На приобретенный характер патологии указывают: небольшой срок заболевания, совпадение с приёмом аспирина, вазодилятаторов, антидепрессантов, антибиотиков, наличие заболеваний системы крови, эндокринная патология, болезни соединительной ткани, почек, печени, а также воздействие факторов внешней среды (ионизирующее облучение, бензол, свинец, пестициды и т.д.).
Тромбозы могут быть венозными и артериальными, как правило они имеют мультифакторное происхождение, врожденный, приобретенный или комбинированный характер, непосредственной их причиной служит нарушение соотношения анти- и прокоагулянтных факторов и регуляторных систем.
Диагностика факторов риска тромбообразования является трудоемкой и дорогостоящей, включает много скрининговых и подтверждающих, уточняющих тестов, но она абсолютно необходима для предотвращения сосудистых катастроф.
Патогенез венозного тромбоза впервые был описан Р.Вирховым в 1856г., он включает 3 фактора (триада Вирхова): повреждение сосудистой стенки, повышенная склонность крови к свертыванию, замедление скорости кровотока. Врожденными причинами могут быть дефицит, аномалии естественных антикоагулянтов (антитромбина III, протеина С, протеина S), факторов свертывания или фибринолитических протеинов (мутация фактора V Leiden, протромбина 20210А, плазминогена; дисфибриногенемия).
К приобретенным причинам венозных тромбозов относятся антифосфолипидный синдром (АФС), злокачественные новообразования, миелопролиферативные заболевания, беременность, прием оральных контрацептивов, травма, длительная иммобилизация, операции и др. Наиболее частой локализацией венозных тромбов являются вены нижних конечностей.
В отличие от венозного, артериальный тромб формируется преимущественно тромбоцитами, возникает при адгезии тромбоцитов к месту повреждения сосуда («белый тромб»). Самой частой причиной его развития является атеросклероз. Тромбоз коронарных, мозговых, мезентериальных артерий (следствиями которых будут инфаркт миокарда, ишемический инсульт, инфаркт кишечника) – катастрофа, зачастую приводящая к гибели больного или его тяжелой инвалидизации.
Еще раз необходимо остановиться на таком важном понятии как «тромбофилия». Тромбофилия – это повышенная склонность организма человека к образованию тромбов.
Наличие тромбофилий можно заподозрить уже при тщательном сборе анамнеза. Важными признаками являются тромботическая наследственность (наличие тромбозов у ближайших родственников), повторные тромбозы без видимых причин, тромбозы, возникающие во время ситуаций, обычно легко переносимых здоровыми людьми (длительные поездки, прием противозачаточных средств, беременность), тромбозы, возникающие в молодом возрасте (у лиц моложе 50 лет), сочетание артериальных и венозных тромбозов, повторные выкидыши, тромбозы необычных локализаций (вен мозга, мезентериальных вен), тромбозы поверхностных вен.
Большинство форм тромбофилий являются наследственными и передаются по аутосомно-доминантному механизму.
Наиболее частыми из них являются:
Фактор V Лейден
Мутация протромбина 20210А
Антитромбин III
Дефект протеина С
Дефект протеина S
Гипергомоцистеинемия
Наличие антифосфолипидных антител
Общие подходы
Зачастую наличие нарушений гемостаза может быть определено с более чем 90% достоверностью на основании тщательного изучения истории болезни, жизни больного, а также данных физикального обследования. Это позволяет выбрать направление диагностического поиска, определить лабораторные тесты для обследования больного вместо хаотичного использования множества необязательных лабораторных показателей.
Лабораторные тесты общего назначения могут указать на заболевания печени или почек, которые имеют значение для синтеза и катаболизма факторов гемостаза. Опухоль с метастазами может быть причиной тромбоза. Лекарственные препараты могут быть причиной кровотечений, а в некоторых случаях передозировка прямых и непрямых антикоагулянтов, наоборот, может приводить к тромбофилии.
Важную информацию о причинах развивающихся тромбозов и кровотечений могут дать такие общелабораторные исследования, как общий анализ крови, определение гомоцистеина, витаминов, гормонов, наличия аутоантител.
Преаналитический этап
Взятие крови. Существенное значение имеет, какая кровь используется для выполнения того или иного теста - цельная стабилизированная капиллярная кровь или плазма венозной крови.
Капиллярная кровь как диагностический материал, имеет ограниченное значение. Взятие венозной крови – критическая процедура для тестов на коагулограмму. Взятие крови должно быть приурочено ко времени исследования, чтобы свести до минимума время хранения проб. Исследование следует проводить у пациентов, отдохнувших не менее 15 мин после незначительной физической нагрузки. Важным моментом является длительность наложения манжеты (жгута), так как стаз вызывает освобождение белков из сосудистой стенки (в том числе тканевого активатора плазминогена и vWF) и активацию тромбоцитов. Во время венепункции длительность венозного стаза рекомендуется должна быть не более 1 мин, а сила сжатия — ниже диастолического давления крови.
Центрифугирование для получения плазмы должно проводиться при ускорении 1500 - 2000 g в течение 10 минут, при этом получается плазма, бедная тромбоцитами.
Общий алгоритм диагностики нарушений свёртывания крови
На первом этапе лабораторной диагностики нарушений свёртывания крови выполняют тесты минимально необходимые для первичной диагностики, позволяющие ориентировочно оценить уровень нарушений и состояние того или иного звена системы гемостаза. С этой целью выполняют следующие скрининговые тесты:
определение протромбинового времени;
определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени;
определение количества тромбоцитов;
определение концентрации фибриногена;
определение тромбинового времени;
определение времени кровотечения
определение спонтаннной фибринолитической активности
манжеточная проба Румпеля-Лееде-Кончаловского.
Перечисленными тестами можно получить достаточно общее представление о свёртывающем и противосвёртывающем потенциале крови пациента. Эти тесты не являются трудоемкими и достоверно указывают на нарушения в плазменном и тромбоцитарно-сосудистом компонентах гемостаза.
Однако и диагностические тесты начального этапа возможно дополнить поиском гемокоагуляционных маркёров (1 – 2 метода), специфичных для определённой категории пациентов. В этом случае полученная информация (особенно в амбулаторных условиях) может оказаться достаточной для назначения терапии.
Тесты для оценки первичного гемостаза
Время кровотечения – это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения кровотечения. Оно характеризует функциональную активность тромбоцитов и используется для выявления тромбоцитопатии различного генеза и некоторых нарушений сосудистой стенки, при которых нарушен первичный гемостаз. Этот метод не стандартизуется, зависит от температуры, обладает низкой специфичностью и чувствительностью.
Наиболее распространённым методом определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях венозного стаза, затрудняющего сосудистые реакции. Веностаз достигается наложением на плечо обследуемого манжеты тонометра под давлением 40 мм рт.ст. В тесте Borchgrevink и Waaler на внутренней поверхности предплечья делают два разреза по 13 мм длиной и 1 мм глубиной. В норме длительность кровотечения из такой ранки менее 9 минут 37сек. и менее 12 минут 4 сек. у мужчин и женщин соответственно.
Число тромбоцитов. В норме количество тромбоцитов составляет в среднем 250 х 109 л. Их количество может варьировать в пределах от 140 х 109 л. до 440 х 109 л. Общепринятое нормальное содержание составляет 180 – 320 х 109 л. По мнению З.С.Баркагана, тромбоцитопения - это снижение количества тромбоцитов ниже 150 х 109 л., а по мнению R.L.Bick, для выполнения своих функций достаточным количеством тромбоцитов является 100 х 109 л.
Метод подсчёта тромбоцитов в счётной камере должен сочетаться с оценкой морфологии пластинок в мазке крови. Так, в частности, можно отметить увеличение размера тромбоцитов при болезни Бернара-Сулье, появление крупных агранулированных («серых») пластинок при синдроме Вискотта-Олдрича, почти полное отсутствие агрегатов тромбоцитов и отростков в пластинках при тромбастении Гланцмана.
Средний объем тромбоцита (MPV). У здоровых людей MРV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. Такое соотношение определяет постоянство тромбоцитарной массы в циркулирующей крови. MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что у мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.
Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцита от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) — не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.
Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом
Агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов исследуют на агрегометре с использованием индукторов агрегации. Требования к пробам критично. Исследование агрегации проводят на плазме, богатой тромбоцитами (ПБТ, английская аббревиатура PRP). Желательно использовать ПБТ, содержащую примерно 200 клеток/нл. Существенным ограничением для этого требования является тяжелая тромбоцитопения.
Пробы помещаются в кювету агрегометра, который представляет собой оптический прибор с регистрацией проходящего света. Проба в кювете постоянно перемешивается специальной мешалкой. При формировании агрегатов увеличивается поток проходящего через кювету света
Вид агрегатограммы зависит от типа и концентрации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в нескольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как процесс агрегации в определенной степени зависит от скорости и характера перемешивания, температуры, способа регистрации и некоторых других факторов.
Тромбоэластография (ТЭГ) – метод, который может быть использован для исследования цельной крови, цельной крови с антикоагулянтами, ПБТ, плазмы, бедной тромбоцитами с цитратом в качестве антикоагулянта. ТЭГ позволяет оценить в целом процесс свертывания крови
Тромбоэластография, как метод оценки гемостаза, была предложена еще в 1948 г Гартертом (Hartert) и до настоящего времени остается единственным методом, который качественно и полуколичественно позволяет охарактеризовать процесс образования сгустка, его физиологическую плотность, стабильность и процесс фибринолиза
Наиболее важной информацией, которую можно извлечь из кривой ТЭГ, является:
Время до начала образования фибрина (r-время)
Время формирования сгустка (k-время)
Максимальная амплитуда (зависит от концентрации фибриногена, количества и качества тромбоцитов, взаимодействия фибрина и тромбоцитов в сгустке)
Время лизиса тромба
Молекулярно-биологические методы оценки клеток крови.
Высокоинформативным методом, сочетающим иммунохимические технологии с исследованием клеточных популяций, является проточная цитометрия. Проточная цитометрия позволяет охарактеризовать клеточные популяции, их размеры, стадию дифференцировки. Этим методом определяют наличие или отсутствие на клеточной поверхности специфических рецепторов или продуктов клеточной активации, субпопуляции тромбоцитов и даже циркулирующие эндотелиальные клетки. Метод возможен при наличии проточного цитометра и специфических реактивов, в первую очередь моноклональных антител, меченных определенным флюорохромом. Основным достоинством этой технологии является возможность получить представление о качественном и количественном составе клеточных популяций.
Тем не менее, использование данной технологии для оценки гемостаза используется крайне редко, так как технология дорогая и требуется высококвалифицированный персонал, подготовленный в области проточной цитометрии и гемостазиологии.
Методические основы лабораторной оценки плазменного гемостаза
Коагуляционные методы. Данная группа методов основана на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образования сгустка (выпадения фибрина). При постановке коагуляционных тестов необходимо перемешать плазму с реактивом до гомогенной суспензии и поддерживать стабильной температуру реакции. Коагуляционные тесты в настоящее время - наиболее распространенный методический подход в клинико-диагностических лабораториях для оценки плазменного гемостаза. Необходимо подчеркнуть, что коагуляционные методы являются скриннинговыми, тем не менее, на основе их сконструирован ряд методов для оценки активности факторов плазмы.
Ручные методы обнаружения момента выпадения сгустка проводятся на водяной бане. Автоматическая регуляция температуры воды только частично решает проблему поддержания постоянной температуры. Частое вынимание пробирки во время исследования для наблюдения за появляющимся сгустком является причиной того, что температура реакции не соответствует температуре водяной бани. При этом способе оценки наиболее трудно установить момент появления сгустка, что в большой степени зависит от навыков наблюдателя и является главной причиной плохой повторяемости результатов. Однако следует помнить, что в ситуациях, в которых подводят автоматические методы (присутствие очень слабо выраженного сгустка), метод может иметь обоснованное применение. Точность определения времени зависит от исследователя. Удовлетворительной следует считать точность определения времени до 0,5 сек. К недостаткам этого метода можно отнести длительность его выполнения и необходимость максимального внимания во время проведения исследования.
Автоматизированные коагулометры существенно улучшили коагуляционные тесты, уменьшили влияние человеческого фактора. В настоящее время появляются биохимические анализаторы, в которых предлагаются программы для регистрации коагуляционных тестов методом турбидиметрии по резкому изменению светопропускания в момент свертывания плазмы. Это значительно расширило возможности оценки гемостаза в клинико-диагностических лабораториях. В то же время это требует качественного улучшения преаналитического этапа, жестких требований к пробоподготовке.
В последние несколько лет в аналитическом подходе к оценке гемостаза, в том числе и из-за внедрения автоматизации, существенно повышены требования к стандартизации. Стандартизация рассматривается как уровень исследования гемостаза, обеспечивающий за счет применения разовых систем взятия крови, аттестованных методов, реактивов, приборной базы, международных калибраторов воспроизводимые в разных лабораториях результаты.
Наиболее ярким примером такого подхода является переход от определения нестандартизованного протромбинового индекса к определению международного нормализованного отношения (МНО) при использовании аттестованного по международным стандартам тромбопластина (см. ниже).
Однако многие коагуляционные методы плохо поддаются стандартизации, в том числе такой широко распространенный тест как активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).
Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов. Применение синтетических хромогенных субстратов явилось прорывом при исследовании отдельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными тестами или очень трудны для стандартизации. Во многих случаях хромогенные субстраты являются специфичными и позволяют определить протеолитическую активность отдельных компонентов плазменного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому легко автоматизируются и могут выполняться на биохимических анализаторах как в клинико-диагностических, так и научных лабораториях.
С помощью хромогенных субстратов возможно достичь высокой чувствительностьи и специфичностьи диагностики нарушений отдельных факторов гемостаза. Чувствительность обусловлена использованием рNA или АМК, которые обладают фотометрическими характеристиками, позволяющими использовать кинетические методы измерения. Специфичность определяется использованием определенной аминокислотной последовательности короткоцепочечного пептида, в котором участок из 3 аминокислот является селективным звеном, который гидролизует фермент сериновая протеаза. Для каждой отдельной сериновой протеазы системы гемостаза известна структура участка гидролиза, этот участок и представлен в короткоцепочечном пептиде хромогенного субстрата, поэтому для каждой индикаторной реакции подбирается свой специфический хромогенный субстрат. При синтезе хромогенных субстратов для повышения специфичности используются L- или D-стереоизомеры аминокислот, а также различные блокирующие группировки, чтобы предупредить деградацию их неспецифическими аминопептидазами.
Иммунохимические методы. Иммунохимические методы активно начали внедряться в клинико-диагностических лабораториях с целью исследования гемостаза в последнее десятилетие. Иммунохимические методы позволяют определять с высокой специфичностью компоненты свертывающей системы количественно, что отличает их от коагуляционных методов и методов с хромогенными субстратами, в которых определяется функциональная активность компонентов свертывающей системы, а не их концентрация.
В последнее время предлагается все больше тест-систем для определения концентрации активных компонентов свертывания, их кофакторов, активаторов, ингибиторов, продуктов протеолитического гидролиза, а также сформировавшихся субстрат-ферментных комплексов. Эти тесты основаны на использовании специфических антител.
В современных клинико-диагностических лабораториях доступными стали иммунохимические методы для ручного и автоматизированного использования, основанные на латекс-агглютинации и методе иммуно-ферментного анализа (ИФА, ЕLISA - Еnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Латекс агглютинация выявляется визуально или на автоматизированных нефелометрах (рис. 12). Существенной трудностью этого подхода является нелинейность оптического сигнала при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации.
Метод ИФА для выявления концентрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип сэндвича. На стенки микроплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза), с которыми в реакции антиген-антитело взаимодействует фактор свертывания в тестируемой пламе. Плашка промывается и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же антигеном, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгируются с ферментом, радиоактивной меткой (РИА), люминисцентной меткой (ЛИА). В тесте ИФА после отмывки несвязавшихся антител добавляется субстрат ферментативной реакции и хромоген, изменение цвета которого пропорционально количеству связанного антигена. Метод ИФА позволяет определять концентрацию факторов гемостаза в концентрации < 1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертывающей системы.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) начинает внедряться в лаборатории, занимающиеся гемостазом, в первую очередь наследственными нарушениями свертывания крови.
Обширные молекулярно-генетические исследования проводятся при диагностике гемофилии А и В, а также болезни Виллебранда. ПЦР используется для выявления мутаций фактора V Leiden, протромбин 20210GA, полиморфизма фактора XIII, дефицита АТ, протеинов С и S и в других случаях.
ПЦР и другие методы молекулярной и генной диагностики используются для выявления наследственных заболеваний, при которых нарушения гемостаза являются сочетанной формой патологии.
Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза
Тесты, оценивающие состояние плазменного звена гемостаза, входят как основной компонент в понятие коагулограммы. Обычно в качестве основных скрининговых методов используют определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ) и количества фибриногена.
Скрининговые тесты на состояние внутреннего и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны факторов-субстратов, кофакторов, ингибиторов каскада свертывания, а также действие некоторых лекарственных препаратов или аутоантител. Основным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АЧТВ, на состояние внешнего каскада - ПВ. Их диагностическое значение представлено в таблице 11.
|
Таблица 11. Клинико-диагностическое значение АЧТВ и ПВ |
|
|
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) или АПТВ |
Протромбиновое время (ПВ) |
|
Оценка внутреннего пути, который определяется высокомолекулярным кининогеном, прекалликреином, факторами XII, XI, IX, VIII, X, V, протромбином, фибриногеном |
Оценка внешнего пути, который определяется факторами VII, X, V, протромбином, фибриногеном |
|
Контроль за лечением гепарином |
Контроль за лечением непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К) |
|
Определение волчаночных антикоагулянтов |
Несмотря на то, что в тестах АЧТВ и ПВ участвуют большинство плазменных факторов, тем не менее, далеко не во всех случаях при патологии того или иного звена или действии лекарственных препаратов эти показатели изменяются (таблица 12).
Коагулограмма – это комплексный анализ по многим тестам, совокупность которых может позволить определить конкретную причину нарушения свертывания крови.
|
Таблица 12. Изменение АЧТВ и ПВ при патологии отдельных компонентов плазменного звена гемостаза и влиянии некоторых лекарственных средств |
|||
|
Дефицит фактора/терапия |
ПВ |
АЧТВ |
Комментарий |
|
Дефицит фактора XII, ВМК или ПреК |
Норма |
Удлинено |
При использова-нии некоторых реактивов АЧТВ не меняется |
|
Дефицит факторов XI, VIII или IX |
Норма |
Удлинено |
Степень удлине-ния АЧТВ зависит от реактивов |
|
Дефицит факторов X, V или II |
Удлинено |
Удлинено |
ПВ более чувствительно |
|
Дефицит фактора VII |
Удлинено |
Норма |
Подтип фактор VII Padova опреде-ляется только с тромбопластином из мозга кролика |
|
Дефицит фибриногена, дисфибриногенемия |
Норма/ удлинено |
Норма/ удлинено |
Зависит от реа-гентов и использо-ванного прибора, при фибриногене > 1г/л обычно норма |
|
Гепарин в терапевтических концентрациях |
Норма/ удлине-но (за-висит от реак-тивов) |
Удлинено /не определяется |
Влияние гепарина на АЧТВ зависит от использован-ных реактивов |
|
Низкомолекулярный гепарин |
Норма/гранич-ные из-менения |
Норма/ удлине-но |
Изменения АЧТВ зависят от использованных реактивов |
|
Лечение непрямыми антикоагулянтами |
Удлине-но |
Тенденция к удлине-нию |
АЧТВ менее чувс-твительный пока-затель, чем ПВ |
|
Гирудин в терапевтических дозах |
Удлинено |
Удлинено |
АЧТВ более чувст вительный пока-затель, чем ПВ |
|
ДВС-синдром |
Удлинено /норма |
Удлинено /норма |
Зависит от тяжести и стадии ДВС |
|
Волчаночный антикоагулянт |
Норма / (удлинение) |
Измене-но/нор-ма |
При наличии вол-чаночного антико-агулянта ПВ, как правило, нормаль-но. Удлинение АЧТВ зависит от реактива |
|
Тяжелая патология печени |
Удлинено |
Удлинено |
Зависит от реакти-вов и приборов |
|
Дефицит фактора XIII |
Норма |
Норма |
Не влияет на АЧТВ и ПВ |
Протромбиновое время (ПВ) - широко используемый скриннинговый тест для оценки внешнего каскада свертывания плазмы. ПВ обычно используется для контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами и при предоперационном скриннинге.
ПВ удлиняется при:
дефиците факторов VII, X, V, протромбина и фибриногена,
тяжелых заболеваниях печени
иногда в присутствии люпус-антикоагулянта и аутоантител против факторов свертывания.
Чувствительность к недостатку протромбина и фибриногена меньше, чем к недостатку других факторов. Несколько типов реагентов для постановки ПВ используется в КДЛ:
Рекомбинантные ПВ реактивы
Рекомбинантный тканевой фактор, Са2+, фосфолипиды, буфер, стабилизаторы.
Тканевые тромбопластины
Экстракты тканей, богатые тканевым тромбопластином (печень, мозг кролика, быка, свиньи, плацента человека).
Комбинированные тромбопластины
Тканевой тромбопластин, разведенный в растворе фибриногена быка, его целесообразно использовать при контроле за лечением непрямыми антикоагулянтами.
Реактивы могут отличаться по нескольким показателям: чувствительности, реактивности к гепарину, межсерийным колебаниям, разной активностью по свертыванию контрольной плазмы. Свертывание в тесте ПВ не должно быть < 10 с, особенно в тех случаях, когда определение проводится в относительных единицах или процентах. На результат ПВ-теста могут влиять патологические ингибиторы фосфолипид-зависимых реакций и ингибиторы полимеризации фибрина - продукты его деградации, или миеломные белки.
Для представления результатов ПВ в разное время предлагалось использовать:
1) время свертывания в секундах;
2) протромбиновый индекс (ПТИ), который определяется как
ПТИ = %;
3) протромбиновое отношение (ПО), которое определяется как
ПО = ;
4) ПТ по Квику - % от нормы, которое определяется по калибровочному графику;
5) международное нормализованное отношение (МНО), которое представляет собой ПО, возведенное в степень Международного индекса чувствительности (МИЧ):
Первые три выражения, хотя и представляются в виде цифр, но из-за отсутствия калибровки, являются, по сути, качественными показателями с неопределенным масштабом. Кроме того, существенным недостатком определения протромбинового времени в секундах является низкая воспроизводимость из-за использования нестандартизованного тромбопластина, поэтому нельзя сопоставлять результаты у одного пациента, полученные в разных лабораториях, на разных приборах или с тест-наборами разных серий. Выражение ПТИ в процентах не несет смысловой нагрузки и путает врачей, так как между количеством факторов и измерением ПВ в секундах нет прямой пропорциональной зависимости. Два последних выражения являются взаимодополняющими.
Протромбиновое время, выраженное через Международное нормализованное отношение (МНО).
Современные коагулометры программируются на вычисление МНО.
Стандартизованный протромбиновый тест был разработан Международным комитетом по стандартизации в гематологии и Международным комитетом по тромбозу и гемостазу и принят ВОЗ в 1983 г. В его основе лежит наличие линейной зависимости между логарифмами протромбинового времени, определенными с разными тромбопластинами. На практике это означает, что значения ПО, определенные с использованием разных тромбопластинов, могут быть приведены путем возведения в степень, представляющую собой МИЧ используемого тромбопластина, к величине, которая была бы получена при определении факторов протромбинового комплекса с первичным стандартом тромбопластина. Эту величину было предложено называть МНО - международным нормализованным отношением (INR - английская аббревиатура). По рекомендации ВОЗ определение МИЧ ( ISI английская аббревиатура) является обязанностью производителей тромбопластина, которые должны определять относительную чувствительность каждой серии выпускаемых ими тромбопластинов, сравнивая ее с эталоном тромбопластина, чувствительность которого принята за единицу.
МНО рассчитывают по формуле:
Использование МНО позволяет оценивать степень гипокоагуляции при терапии непрямыми антикоагулянтами независимо от используемого тромбопластина, сравнивать результаты, полученные разными лабораториями. Для контроля за терапией непрямыми антикоагулянтами рекомендуется использовать тромбопластины со значениями МИЧ ниже 2 (лучше 1,0– 1,2).
Интерпретация результатов. ПВ удлинено (ПИ снижен, ПО и МНО повышены) — врожденный дефицит (менее 40% от нормы) факторов II, V, VII, X, хронические заболевания печени с нарушением ее функции, дефицит витамина К (холестаз, мальабсорбция, дисбактериоз), лечение антикоагулянтами непрямого действия, гипофибриногенемия (менее 0,5 г/л), дисфибриногенемия и нарушение полимеризации фибрина, ДВС-синдром; присутствие ингибиторов свертывания (гепарин, ПДФ);
ПВ укорочено (ПИ увеличен, ПО и МНО снижены) — состояния гиперкоагуляции, массивное поступление тканевого тромбопластина в кровоток (травма, некроз), повышенная свертываемость во время беременности и после родов.
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)
В названии АЧТВ (иногда его обозначают как активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ) слово «частичное» или «парциальное» указывает на то, что в тесте используются реагенты, содержащие фосфолипиды, а не тканевые факторы (в этом отличие от ПВ, где используется тканевой тромбопластин).
АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. АЧТВ более значимый тест для первичного выявления патологии, чем ПВ , так как выявляет относительно часто встречающиеся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX, соответственно).
Нормальные значения теста АЧТВ строго зависят от использованных реактивов и приборов. Большое значение играет преаналитическая стадия: принимаемые пациентом лекарственные препараты, правильность взятия крови, использованный антикоагулянт, условия хранения и транспортировки пробы и т.д. Охлаждение пробы ведет к активации контактной фазы in vitro. Стабильность пробы зависит от применяемых пробирок. Поэтому каждая лаборатория должна нарабатывать собственные нормы. До настоящего времени практически нет системы межлабораторной стандартизации теста АЧТВ, приборная и реагентная база этого теста пока не поддаются стандартизации. Рекомендуется корректировать нормы для каждой серии реактивов. Опытным путем следует удостовериться в качестве АЧТВ-реактивов, которые должны отвечать следующим критериям:
Иметь одинаковые диапазоны нормальных значений для разных серий реактивов от одного производителя
Должны выявлять клинически значимое снижение факторов свертывания удлинением времени образования сгустка (т.е. результаты должны соответствовать клиническим проявлениям гипокоагуляции)
Быть чувствительными к антикоагулянтному эффекту гепарина, при этом не проявлять слишком высокой чувствительности при использовании гепарина в терапевтической концентрации
Выявлять наличие волчаночного антикоагулянта, для этого рекомендуется использовать, в частности, 2 набора с разной чувствительностью к волчаночному антикоагулянту
Предпочтительно использовать готовые к использованию реактивы, что уменьшает ошибку оператора
Укорочение АЧТВ иногда определяется у больных с тромбофилией. Это может быть связано с резистентностью фактора V к активному протеину С, повышенным уровнем фактора VIII или активированных факторов свертывания. Однако чаще всего укорочение АЧТВ объясняется нарушениями работы с кровью на преаналитическом этапе.
Удлинение АЧТВ происходит при:
Врожденном или приобретенном дефиците факторов II, V, VIII, IX, X,XI, XII, прекалликреина, ВМК;
Дефиците фактора Виллебранда (vWF), который часто приводит к снижению активности фактора VIIIС (врожденная или приобретенная болезнь Виллебранда);
Лечении гепарином, гирудином или апротинином (ингибитор контактной фазы коагуляции);
Присутствии в крови ПДФ, волчаночного антикоагулянта;
Нарушении функции печени;
Коагулопатии потребления (ДВС-синдром);
Тяжелой дисфибриногенемии или афибриногенемии.
Важно подчеркнуть (обычно это не учитывается), что при хранении снижается стабильность пробы, особенно от больных, которым вводился гепарин. В результате резко увеличивается вариация данных АЧТВ, регистрируемых подряд из одной пробы.
Реактивы, используемые для постановки АЧТВ, не стандартизуются. Поэтому свойства реактивов должны быть известными, лучше пользоваться реактивами от одного производителя. Набор реактивов для АЧТВ содержит активатор контактной фазы и фосфолипиды. СаCl2 добавляется в пробу отдельно как стартовый реактив. Контактный активатор – это высокодисперсионная суспензия отрицательно заряженных частиц каолина (белая глина) или эллагиковая кислота, полифенол или сульфатиды (отрицательно заряженные сульфатированные липиды) в смеси с каолином. Фосфолипиды используют или синтетические или выделенные из тканей животных (мозг кролика) или из сои. Лучшие результаты достигаются при использовании смеси разных фосфолипидов, включая отрицательно заряженный фосфатидилсерин. Вид и концентрация фосфолипидов – более важный компонент для характеристики набора АЧТВ, чем компоненты контактной фазы активации. Стабилизация реактива обеспечивается в первую очередь ионной силой раствора и свойствами буферной системы, это во многом обеспечивает коагуляционные свойства АЧТВ-реактива.
Чувствительность теста АЧТВ в значительной мере связана со свойствами используемых в тесте реактивов. Большинство тест-наборов АЧТВ (но не все) показывает удлинение АЧТВ при менее чем 25-35 % остатке факторов VIII или IX. К дефициту других факторов чувствительность теста значительно варьирует, однако при остатке фактора < 10 % нормы АЧТВ во всех случаях удлиняется.
Фактор VIII является острофазным белком, повышается при воспалительных реакциях, травмах. Этот факт необходимо учитывать при интерпретации укорочения АЧТВ в этих случаях. АЧТВ менее чувствительный тест на выявление патологии на общем этапе коагуляции и недостаточности фибриногена, чем ПВ.
АЧТВ используется для выявления дефицита отдельных факторов плазменного гемостаза, для этого применяются заменные пробы с контрольными плазмами, дефицитными по конкретному фактору.
Например при гемофилии А (дефицит фактора VIII) тест АЧТВ с плазмой больного пациента будет соответственно удлинен. При добавлении к такой плазме контрольной плазмы, истощенной по фактору VIII, восстановления времени коагуляции в тесте АЧТВ не произойдет. Это доказывает, что в плазме больного и в контрольной, истощенной по фактору VIII, отсутствует один и тот же компонент. Если же к плазме больного гемофилией А добавить плазму, истощенную по другому фактору (например IX), то время свертывания в тесте АЧТВ восстановится до нормальных значений, так как в этой плазме присутствует фактор VIII, с недостатком которого было связано удлинение АЧТВ плазмы больного гемофилией А.
АЧТВ используется для выявления волчаночного антикоагулянта. Если при добавлении к плазме больного с удлинением АЧТВ контрольной плазмы, содержащей все факторы, АЧТВ восстанавливается, то в плазме больного был дефицит фактора. Если АЧТВ не восстанавливается в полной мере, то в плазме больного присутствует ингибитор, в частности им может быть волчаночный антикоагулянт, который блокирует фосфолипидную матрицу. Чувствительность к волчаночному антикоагулянту проявляют отрицательно заряженные фосфолипиды, поэтому тест зависит от реактивов. В некоторых лабораториях применяются 2 набора реактивов для теста АЧТВ, по-разному чувствительные к волчаночному антикоагулянту. В то же время присутствие волчаночного антикоагулянта отличается у пациентов, склонных к тромбозам, поэтому удлинение АЧТВ при наличии тромбоза сразу настораживает на присутствие волчаночного антикоагулянта.
Трудность вызывает ситуация с транзиторным повышением волчаночного антикоагулянта при инфекции или лечении некоторыми препаратами, при которых нет клинических проявлений тромбоза. Например, гепарин оказывает синергичный эффект с волчаночным антикоагулянтом, вызывая слишком сильное удлинение времени свертывания. В этом случае изменение АЧТВ будет указывать на передозировку гепарина. В то же время использование реактивов, нечувствительных к волчаночному антикоагулянту, покажет относительно адекватное изменение АЧТВ на вводимую дозу гепарина. Поэтому еще раз рекомендуем использовать для постановки АЧТВ реактивы с разной чувствительностью к волчаночному антикоагулянту.
Использование АЧТВ для контроля гепаринотерапии. Лечение гепарином контролируется тестом АЧТВ. Однако процедура не стандартизована. Это связано с тем, что реактивы по разному чувствительны к гепарину и ингибитору внешнего пути (ИВП, TFPI), который повышается в пробах пациентов, получающих гепарин. Кроме того, сам гепарин имеет разные свойства, варьирует по размеру, степени очистки, активности in vivo и in vitro. У пациентов во время инфузии гепарин представлен нативной молекулой, а через некоторое время гепариноподобный эффект оказывают его дериваты, но уже с другой антикоагулянтной активностью. Продукты метаболизма гепарина по-разному влияют на нейтрализацию фактора 4 тромбоцитов (освобождается из тромбоцитов in vivo и in vitro, особенно при нарушениях преаналитического этапа, что может существенно изменять показатели гемостаза), а также на антитромбиновую и анти-Ха активность. Поэтому не имеет большого смысла тестировать реактивы на чувствительность к гепарину, эти результаты дают сугубо ориентировочную информацию.
Некоторые АЧТВ-реагенты очень чувствительны к присутствию гепарина, вплоть до того, что вообще не регистрируют свертывание при концентрации гепарина даже в терапевтической концентрации. Кроме того, коммерческие гепарины разные. Гепарин – это глюкозаминогликан, получаемый путем экстракции в основном из тканей легких крупного рогатого скота или свиньи или из слизистой оболочки кишечника быков – это нефракционированный гепарин. Нефракционированный гепарин имеет М.м. от 5000 до 30000 дальтон, в основном ингибирует тромбин и фактор Ха. С недавнего времени стали широко использовать низкомолекулярные гепарины, которые получают из нефракционированного путем энзиматической и химической деградации.
Контроль за лечением низкомолекулярным фракционированным гепарином рекомендуется на основе теста анти-Ха (единица измерения - анти-Ха МЕ/мл), ставить который следует перед очередным введением препарата. Тест анти-Ха заключается в измерении оставшегося Ха с использованием специфического хромогенного субстрата
Тромбиновое время (ТВ) - скрининговый тест на полимеризацию фибриногена/фибрина и на антикоагулянтную активность в плазме.
ТВ регистрируется по свертыванию плазмы при добавлении к ней низкой или средней концентрации тромбина (бычьего или человеческого). ТВ определяется в основном количеством и качеством фибриногена и присутствием антикоагулянтов в плазме.
К удлинению ТВ приводят:
снижение концентрации фибриногена менее 0,5 г/л (врожденная или приобретенная гипо-/афибриногенемия);
качественные изменения молекулы фибриногена (дисфибриногенемия);
присутствие физиологических (гепарин) и патологических (ПДФ, моноклональные белки) ингибиторов тромбина и фибринообразования;
наличие парапротеинемии, уремии, в некоторых случаях волчаночных антикоагулянтов.
Рептилазное время (Батроксобиновое время). Батроксобин (или Рептилаза) – тромбиноподобная протеаза из яда щитомордника обыкновенного, которая способна вызывать переход фибриногена в фибрин. Рептилаза отщепляет от фибриногена только фибринопептид А, что отличает ее от действия тромбина, который кроме фибринопептида А отщепляет от фибриногена еще и фибринопептид В и активирует факторы V, VIII, XIII. Рептилаза не подавляется антитромбином и высокомолекулярным и низкомолекулярными гепаринами. Поэтому этот тест может использоваться для оценки полимеризации мономеров фибрина в присутствии гепарина. Рептилазное время часто определяют одновременно с ТВ
Определение фибриногена. Данный тест – один из рутинных тестов коагулограммы.
Определение фибриногена по Клауссу считается наиболее адекватным тестом, он основан на определении времени свертывания при добавлении избытка тромбина. В этих условиях критическим для свертывания становится концентрация фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена. Если время свертывания очень короткое (< 5 сек), то тест проводится на разведенной плазме. Гепарин не оказывает влияния на результаты определения фибриногена. Продукты распада фибриногена/фибрина (ПДФ) влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров, поэтому могут при определении фибриногена по Клауссу быть причиной ложно низких результатов.
Турбидиметрический метод определения фибриногена по изменению мутности плазмы с использованием батроксобина широко используется для определения фибриногена на автоматических коагулометрах и клинических анализаторах. В ручном исполнении он мало пригоден, так как изменение мутности нелинейное, необходимо кинетическое измерение пропускания.
Фибриноген – острофазный белок. Концентрация его может превышать 10 г/л при тяжелых бактериальных инфекциях, при травме и тромбозе. Повышение уровня фибриногена в острой фазе воспаления, как правило, имеет транзиторный характер. У курящих людей значения несколько выше, чем у некурящих. К значительному росту фибриногена приводят заболевания почек (пиелонефрит, гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром), коллагенозы (ревматоидный артрит, узелковый периартериит), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, новообразования (рак легкого).
При атеросклерозе наблюдается устойчивое увеличение фибриногена, трудно корригируемое лекарственными препаратами. В результате риск сердечно-сосудистых заболеваний увеличивается с повышением исходного уровня фибриногена в интервале 1,8 – 4,5 г/л. Обнаружено, что повышение уровня фибриногена в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями предшествует развитию инфаркта миокарда и инсульта. Корреляция между уровнем фибриногена и развитием этих осложнений особенно четко прослеживается у пациентов молодого и среднего возраста. Определение уровня фибриногена – наиболее чувствительный тест для выявления бессимптомных стадий заболевания периферических артериальных сосудов.
Дисфибриногенемия – относительно часто встречающееся заболевание, причем это состояние может определяться несколькими мутациями, некоторые из которых не сопровождаются, другие сопровождаются кровотечениями, а при некоторых развиваются тромбозы.
Снижение концентрации фибриногена в плазме наблюдается при врожденном дефиците фибриногена, печеночно-клеточной недостаточности, ДВС-синдроме, острых фибринолитических состояниях, поражениях костного мозга (лейкоз, опухолевые метастазы), при инфекционном мононуклеозе. Гипофибриногенемию могут вызвать такие лекарственные препараты, как вальпроат натрия, фибраты, фенобарбитал, стрептокиназа, урокиназа, L-аспарагиназа. Физическая перегрузка снижает фибриноген. Лекарственную дефибринизацию плазмы можно достичь, используя ферменты змеиного яда (Reptilase или анкрод), которые применяются для улучшения реологии крови за счет снижения вязкости.
Отдельные факторы гемостаза
В случае обнаружений патологических измененийАЧТВ и/или ПВ необходимо проводить дополнительные исследования с целью выяснения причины этих отклонений.
Несмотря на то, что за последнее время для определения отдельных факторов гемостаза были разработаны методы с использованием хромогенных субстратов (амидолитические методы), многие лаборатории продолжают пользоваться коагуляционными технологиями с использованием контрольных плазм, обедненных по определенному фактору
Удлинение АЧТВ и/или ПВ может быть вызвано дефицитом факторов свертывания или присутствием ингибиторов, в частности аутоантител, волчаночного антикоагулянта и др.
Для дифференцирования истинного дефицита факторов свертывания от присутствия специфического ингибитора или волчаночного антикоагулянта необходимо провести скриннинговое исследование (количество тромбоцитов, АЧТВ, ПВ), исследование коррекции активности факторов или скриннинговых тестов при смешивании тестируемой плазмы с нормальной (контрольной) плазмой и тест разведения.
Соотношения компонентов могут быть различными. Чаще применяется смешивание 1:1 (1 часть исследуемой плазмы / 1 часть контрольной), которое обладает неплохой чувствительностью и удобно для подсчета.
При низкой активности ингибитора можно использовать соотношение: 2 части исследуемой плазмы / 1 часть контрольной.
При высокой активности ингибитора можно использовать соотношение 1:4 и более, и по степени коррекции косвенно судить об активности ингибитора.
После смешивания необходимо проводить тесты немедленно и через 1 час инкубации, что позволяет определить характер ингибитора (таблица 17).
Для более точной дифференциальной диагностики между истинным и вторичным дефицитом можно провести пробу с разведением, по крайней мере до 3 разных концентраций. Пробы с дефицитом показывают при разведении одинаковый расчетный процент фактора в цельной плазме, тогда как пробы, в которых присутствует ингибитор, при разведении показывают относительное увеличение фактора, что связано с диссоциацией комплекса фактор-ингибитор и освобождением фактора из блокированного состояния.
Определение фактора Виллебранда (vWF)
Определение vWF проводится для:
диагностики и последующего мониторинга врожденной или приобретенной болезни Виллебранда;
диагностики тромбофилий;
дифференциальной диагностики тромбофилии А.
Один из алгоритмов диагностики болезни Виллебранда представлен в таблице 18.
Таблица 18. Тесты диагностики болезни Виллебранда
|
Основные методы диагностики |
|
Время кровотечения Число тромбоцитов АЧТВ Активность фактора VIII |
|
Подтверждающие тесты |
|
Ристоцетин-кофакторная активность vWF Антиген фактора Виллебранда (vWF:Ag) Ристоцетин-индуцированная агрегация тромбоцитов |
|
Специальные тесты |
|
Коллаген-связывающая активность фактора Виллебранда Исследование мультимерного состава фактора Виллебранда Определение тромбоцитарного фактора Виллебранда Молекулярно-генетическая диагностика мутаций гена фактора Виллебранда методом ПЦР |
Концентрация vWF определяется методами иммунотурбодиметрии, ИФА.
Связывающая способность фактора Виллебранда с коллагеном определяется в микроплашках, покрытых коллагеном, методом ИФА.
Состав субъединиц определяется электрофорезом в геле агарозы или иммуноблоттингом.
Функциональная активность определяется методом агглютинации фиксированных или отмытых тромбоцитов или агрегации в богатой тромбоцитами плазме при индукции агрегации ристомицином (Ристоцетином)
Определение дефицита антитромбина III
Лабораторная диагностика дефицита антитромбина III основана на сочетании функциональных (клоттинговых) или амидолитических методов с использованием хромогенных субстратов, или иммунологических методов основанных на использовании прямых антител к АТ III. Механизмы возможного дефицита AT III следующие: дефект синтеза; усиленное потребление; при некоторых заболеваниях почек (протеинурия) и увеличении разрушения (катаболизма) белков. Использование оральных контрацептивов дозозависимо снижает уровень AT III. Уменьшение концентрации АТ III отмечается у больных с хроническими заболеваниями печени, активными инфекционными заболеваниями, при АФС. Глюкокортикоидная терапия может увеличивать уровень AT III у пациентов с его дефицитом за счет стимуляции его синтеза стероидами.
Определение протеина C и S
Лабораторная диагностика дефицита протеина С также основана на совокупности функциональных и иммунологических тестов. Для оценки функциональной активности протеина C используются клоттинговые тесты и или тесты с хромогенными субстратами. Метод ИФА для изучения протеина C характеризуется высокой надёжностью и точностью, но не определяет активированный протеин C, связанный со своим ингибитором. При изучении протеина S необходимо определять как свободную его форму, так и связанную. Нормальное соотношение между этими двумя формами составляет 2 : 3. Снижение уровня свободного протеина S сопровождается повышением тромбогенного риска. Приобретенный дефицит протеина С и S возникает у пациентов с ДВС-синдромом, вследствие его избыточного потребления при освобождении тромбина и тромбомодулина, тяжелых заболеваниях печени,. Снижение активности протеина С может быть обусловлено также образованием антифосфолипидных аутоантител к протеину С, его кофактору - протеину S. Однако кроме потребления снижение концентрации протеина S также происходит вследствие его разрушения под воздействием фибринолитической системы. Уровень протеина S уменьшается при эстрогеновой терапии.
Определение протеина С клоттинговым методом. Протеин С активируется в присутствии специфического активатора. Активированный протеин С ингибирует факторы V и VIII, что удлиняет АЧТВ. Исследование проводится на коагулометре с использованием протеин С–дефицитной плазмы и протеин С активатора. Уровень протеина С представляется в процентах от его активности в нормальной плазме.
Определение резистентности к активированному протеину С
Принцип состоит в том, что резистентность к активированному протеину С (РАПС) проявляется укорочением АЧТВ при отсутствии других тромбогенных причин. В данном методе, в результате добавления активатора протеина С к смеси нормальной и дефицитной по фактору V плазмы, происходит удлинение времени свёртывания. При резистентности фактора Va к действию протеина С (в смеси плазмы больного и дефицитной по фактору V плазмы) удлинение времени свёртывания выражено в меньшей степени.
Определение возможно как на коагулометре, так и мануальным методом в условиях термостатирования при 37С. Оценка результата производится путём расчёта нормализованного отношения (НО). НО в норме превышает 0,8. Все значения НО ниже 0,8 свидетельствуют о резистентности фактора Va к действию протеина С.
Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома (АФС): волчаночного антикоагулянта (люпус-антикоагулянта, ЛАК) и антифосфолипидных антител (АФА)
Симптомокомплекс, характеризующийся рецидивирующими венозными и/или артериальными тромбозами и потерей плода, а также тромбоцитопенией, развивающийся на фоне гиперпродукции антифосфолипидных антител (аФЛ), называется антифосфолипидный синдром. Антифосфолипидные антитела, основными типами которых являются волчаночный антикоагулянт (ВА) и антитела к кардиолипину (аКЛ) – это гетерогенная популяция аутоантител, реагирующих с широким спектром антигенных детерминант фосфолипидов или фосфолипид-связывающих бедков (бета2 гликопротеин I и др). Поскольку в основе сосудистой патологии при АФС лежит невоспалительная тромботическая васкулопатия, затрагивающая сосуды любого калибра и локализации, от капилляров до крупных сосудов (включая аорту), спектр клинических проявлений чрезвычайно разнообразен. В рамках АФС описано поражение ЦНС, сердечно-сосудистой системы, нарушение функции почек, печени, эндокринных органов, ЖКТ, акушерская патология и др.
АФС считается самой частой причиной приобретенной тромбофилии у человека и одной из ведущих причин невынашивания беременности. Характерной особенностью АФС является более высокий риск рецидивирования тромбозов, чем в общей популяции пациентов с тромботическими нарушениями. Тромбозы развиваются примерно у трети пациентов с аФЛ (частота первого тромбоза 1%) и рецидивируют при отсутствии приема антикоагулянтов. (в 10%-30% случаев)
Надежная диагностика обеспечивается только комплексным использованием группы тестов.
Коагулометрические методы.
В плазме крови in vitro АФА связываются с фосфолипидными мембранами и тормозят активацию и взаимодействие между собой плазменных факторов. Наиболее четко эти нарушения выявляются на бедной тромбоцитами плазме в тестах, основанных на применении низких концентраций активаторов свертывания.
Выявление волчаночных антикоагулянтов проводят последовательно: сначала в скринyинговых методах, а затем в подтверждающих.
Мы приводим алгоритм диагностики ЛАК (рис. 13), используемый в клинике Мэйо – одной из ведущих клиник в изучении системы гемостаза и АФС в частности.
Рисунок 13. Алгоритм диагностики волчаночного антикоагулянта
dRVVT (тест с ядом гадюки Рассела) – тест на основе АЧТВ, но модифицированный путем добавления потенциального активатора фактора X - яда гадюки Рассела. В набор входит и растворенный фосфолипид для потенцирования эффекта ЛАК.
Удлиненное DRVVT, которое не корректируется при 1:1-миксе с контрольной плазмой, говорит о присутствии ЛАК. Так как в этой реакции активируется фактор X в присутствии фосфолипида, то тест будет нормальным с недостатком факторов VII, VIII, IX, XI и XII. Однако, специфические ингибиторы факторов II, V, X и фибриногена могут давать ложно положительный результат в отношении ЛАК.
Если у пациента удлинено ПВ, эти ингибиторы должны быть исключены до окончательной диагностики ЛАК.
Гепарин даст аномальные результаты dRVVT, поэтому надо проводить исследование тромбинового времени (ТВ) для исключения эффекта гепарина. В присутствии гепарина ТВ будет пролонгировано, но нормальным в присутствии ЛАК.
Тесты смешивания. ПВ и АЧТВ не определяют надежно дефицит одного какого-то фактора свертывания, пока его уровень не будет ниже 40%.
Если добавление контрольной плазмы к исследуемой (1:1, 50%) не приводит к продлению АЧТВ – это значит, что в плазме пациента присутствует специфичный или неспецифичный ингибитор. Удлинение ПВ или АЧТВ более чем на 2-3 секунды в тесте смешивания по сравнению с исходным подтверждает присутствие ингибитора, по действию сравнимое с дефицитом одного фактора.
Чаще действие ингибиторов отражается на АЧТВ, чем ПВ
Используются смешивание плазмы пациента с нормальной плазмой в соотношении 0:1, 1:0, 4:1, 1:1, 1:4
Если АЧТВ корректируется при 1:1-миксе – предполагается дефицит фактора (факторов), надо проводить определение конкретных факторов свертывания.
Если АЧТВ не корректируется при 1:1-миксе – предполагается присутствие ЛАК или парапротеинемия или специфический ингибитор (чаще – фактора VIII) в исследуемой плазме.
Однако иногда ингибиторы в низком титре могут быть просто разведены контрольной плазмой. В таком случае будет определяться ложная коррекция. Поэтому, для повышения чувствительности теста на ингибитор (ЛАК или специфичный ингибитор определенного фактора) используется еще и смешивание 4 частей исследуемой плазмы с 1 частью контрольной. Ингибиторы в низком титре в таком случае пролонгируют АЧТВ.
Если АЧТВ не корректируется тестом смешивания, то для установления более точной причины такого нарушения, помимо вышеозначенных диагностических приемов, необходимо провести определение изменения АЧТВ со временем
Так, наиболее частые ингибиторы фактора VIII или IX прогрессивно нейтрализуют факторы свертывания нормальной плазмы со временем. Поэтому миксы 4:1, 1:1, 1:4 инкубируются от 30 до 60 минут при 370С, после чего вновь определяется АЧТВ. Если определяется его удлинение по сравнению с исходным уровнем – в плазме присутствует специфический ингибитор, если АЧТВ не изменяется со временем – неспецифический ингибитор - ЛАК.
Более редкие ингибиторы (антифактор V или антипротромбин) могут не приводить к удлинению АЧТВ со временем. С другой стороны, в 25 – 20% случаев ЛАК обусловливает продление АЧТВ после инкубации, а в 15-20% дает пограничные значения. В таком случае важны клинические корреляции – специфические ингибиторы факторов чаще приводят к развитиию геморрагического синдрома, ЛАК – тромбозов.
Тесты смешивания должны проводиться на свежей плазме. Присутствие остаточных тромбоцитов в центрифугированной плазме может обусловить укорочение АЧТВ из-за наличия продуктов лизиса тромбоцитов при заморозке-разморозке образца плазмы.
Если же необходимым является исследование именно замороженной плазмы, то перед заморозкой ее надо профильтровать или отцентрифугировать на 15000g 10 минут.
Микс-тесты чувствительны, но неспецифичны, поэтому используются именно как скриннинг-тест.
Подтверждающие тесты с фосфолипидами тромбоцитарных мембран, гексагональными фосфолипидами (PNP, platelets neutralization procedure). Принцип метода заключается в том, что добавление большого количества фосфолипида тромбоцитов (или фосфолипида специфичного конформационного комплекса) будет нейтрализовывать (или «обходить») активность ЛАК
Для проведения теста используется лизат тромбоцитов (заморозка-разморозка с последующим диализом) или коммерческий замороженный, лиофилизированный лизат тромбоцитов (описаны методы с использованием концентрата предварительно отмытых тромбоцитов, но их достоверность ниже).
В равных объемах (100мкл) смешиваются АЧТВ-реагент, бедная тромбоцитами плазма пациента или контрольная плазма и фосфолипиды (или суспензия приготовленных тромбоцитов), проводится инкубирование при 370С в течение 5 минут. Затем добавляется CaCl2 (рекальцификация) и определяется АЧТВ.
Параллельно проводится контроль с физраствором
Таким образом, запускается 3 теста с плазмой пациента (или контрольной плазмой) (рис. 14):
Рисунок 14. Подтверждающий тест на ЛАК с фосфолипидами
АЧТВ PNP АЧТВ АЧТВ с физраствором
Плазма пациента Плазма пациента Плазма пациента
100 мкл 100 мкл 100 мкл
+ + +
АЧТВ-реагент АЧТВ-реагент АЧТВ-реагент
100 мкл 100 мкл 100 мкл
+ +
Суспензия тромбоцитов 0 ,15М NaCl
100 мкл 100 мкл
Рекальцификация, CaCl2 25mM
Регистрация времени свертывания
АЧТВ PNP АЧТВ АЧТВ с физраствором
Секунды Секунды Секунды
АЧТВ с физраствором служит контрольным тестом, позволяющим оценить эффект дилюции суспензии тромбоцитов (то есть простое разбавление ингибитора, присутствующего в плазме)
В присутствии ЛАК укорочение АЧТВ в PNP-образце будет на 10 и более секунд быстрее, чем укорочение АЧТВ в образце (пробирке) с физраствором.
Укорочение PNP АЧТВ в плазме с ингибитором всегда больше укорочения в той же плазме с физраствором.
Но тест трудно интерпретировать, если изначально АЧТВ было незначительно удлинено по сравнению с нормой.
PNP не укорачивается в присутствии специфического ингибитора фактора V, VIII или IX (рис.15).
Определение антифосфолипидных антител (АФА)
АФА, выявляемые твердофазным ИФА, представляют собой различные комбинации иммуноглобулинов, принадлежащих к классам IgG и IgM, реже IgА. Определяют аутоантитела против кардиолипина, фосфатидилсерина, 2-гликопротеина I.
Специфичность диагностики по антителам различна: антитела против 2-гликопротеина I демонстрируют большую специфичность, чем антитела к кардиолипину или другим фосфолипидам.
Лабораторный диагноз антифосфолипидного синдрома можнет быть поставлен только в том случае, если содержание диагностических аутоантител в сыворотке крови, выявленные иммуноферментным методом, подтверждают патологию повторно с интервалом, по крайней мере, в 12 недель.
Результаты определения АФА могут считаться положительными лишь при их повышении в 2 и более раза по сравнению с верхней границей нормы. Кроме того, необходимо иметь в виду, что АФА присутствуют всегда в сыворотке здоровых людей, но, с одной стороны, они заблокированы гистонами, с другой стороны, их титр достаточно низкий.
Тесты для исследования фибринолитической системы
Основным функциональным ферментом фибринолиза является плазмин. При лизисе фибринового сгустка плазмин и его активаторы фиксируются на фибрине, где идет активное расщепление субстрата, тогда как в плазме фибринолиз слабо выражен, плазмин блокирован 2-антиплазмином
Спонтанный эуглобулиновый лизис - традиционный метод оценки фибринолиза. В кислой среде при низкой температуре происходит осаждение эуглобулиновой фракции белков плазмы, содержащей фибриноген, факторы свертывания, плазминоген и его активаторы. Ингибиторы фибринолиза выпадают в осадок в незначительном количестве (около 2%). После растворения эуглобулиновой фракции и образования фибринового сгустка определяют время его растворения (лизиса), что отражает фибринолитическую активность плазмы.
Укорочение времени лизиса эуглобулинов (активация фибринолиза) отмечается при:
уменьшении концентрации фибриногена — гипо- / дисфибриногенемия;
увеличении содержания плазминогена и его активаторов — панкреатит, панкреонекроз, метастазирующий рак предстательной железы, легкого, яичников, метастазы меланомы, операции на легких, предстательной, поджелудочной железе, гиперкатехоламинемия (стресс, тиреотоксикоз, гипертонический криз, введение адреналина), шок, патология беременности, терминальные и другие состояния, сопровождающиеся развитием ДВС-синдрома, цирроз, рак, метастатическое поражение печени (снижение антиплазминовой и антиактиваторной функции).
Увеличение времени лизиса эуглобулинов (угнетение фибринолиза) отмечается при:
гиперфибриногенемии;
врожденной а-, гипо- или дисплазминогенемия;
дефиците плазминогена и его активаторов — рецидивирующие венозные тромбозы, системные васкулиты, сепсис, нефротический синдром, гипокоагуляционная стадия ДВС-синдрома, цирроз печени (нарушение синтеза плазминогена).
Тест может применяться при фибринолитической терапии для контроля эффективности лечения.
Метод требует учета исходного содержания в плазме фибриногена, так как при снижении фибриногена время лизиса укорачивается, что трактуется ошибочно как гиперфибринолиз. При гиперфибриногенемии время лизиса удлиняется. Поэтому при отклонениях содержания фибриногена в плазме, а также неполноценной полимеризации фибрина и гепаринемии возможно получение ошибочных результатов. В связи с ориентировочным характером и недостаточной специфичностью в последнее время вместо теста спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка начали использовать определение отдельных факторов фибринолиза.
Определение плазминогена. Дефицит плазминогена – один из потенциальных факторов риска тромбоза. При добавлении стрептокиназы (бактериальный препарат, который используется как тромболитик) к разведенному образцу исследуемой плазмы образуется плазминоген-стрептокиназный комплекс, который обладает ферментативной активностью и способен расщеплять хромогенный субстрат. Ферментативная активность комплекса плазминоген-стрептокиназа не подавляется 2-макроглобулином и 2-антиплазмином. Тесты, в которых сначала переводили плазминоген в плазмин, а затем пытались определить активность плазмина, не получились надежными, так как свободный плазмин мгновенно инактивируется 2-антиплазмином, присутствующим в пробе.
Определение 2-антиплазмина. Многие ингибиторы плазмы способны инактивировать плазмин. 2-Антиплазмин – самый быстрый «реактивный» ингибитор плазмина, он не позволяет присутствовать плазмину в крови в свободном виде. Помимо плазмина 2-антиплазмин ингибирует активаторы плазминогена – урокиназу (u-PA) и тканевой активатор плазминогена (t-PA).
Определение ингибитора тканевого активатора плазминогена тип I (РAI-I). В качестве основного ингибитора урокиназы (u-PA) и тканевого активатора (t-PA) РAI-I играет центральную роль в контроле за активностью фибринолиза. Определение РAI-I часто включается как один из тестов профиля (панели) оценки тромбофилии. У больных с кровотечениями невыясненного генеза с нормальными скрининговыми тестами может быть причиной патологии дефицит РAI-I. Истинный дефицит выявляется относительно редко, но сопровождается тяжелыми кровотечениями.
Повышение РAI-I встречается достаточно часто, так как РAI-I – белок острой фазы, и это имеет клиническое значение, так как является причиной рецидивирующего венозного тромбоза и отмечается часто у мужчин в преклонном возрасте. РAI-I повышается при:
инфекционных и воспалительных процессах;
послеоперационном периоде;
злокачественных опухолях;
ожирении; гипертриглицеридемии;
лечении дексаметазоном.
У больных с инфарктом миокарда персистирующий подъем РAI-I рассматривается как неблагоприятный прогностический признак.
Определение РAI-I технически достаточно комплексная процедура. На первом этапе необходимо инактивировать ингибиторы плазмина - 2-антиплазмин и 2-макроглобулин, затем используется общий принцип определения остаточной активности добавленного в избытке фактора, который должен подавляться исследуемым ингибитором. При использовании u-PA метод в техническом исполнении несколько проще, чем при использовании избытка t-PA, и может быть автоматизирован на современных анализаторах.
Содержание РAI-I в системе циркуляции подвержено суточным ритмам, поэтому пробы при системном анализе необходимо брать в одно время, лучше по утрам.
Кроме того РAI-I – один из самых неустойчивых белков плазмы, поэтому определение необходимо проводить сразу после взятия крови, транспортировка может привести к потере активности РAI-I в пробе. Строгое выполнение преаналитических процедур при выполнении исследования РAI-I диктуется неустойчивостью аналита.
Из интерферирующих факторов самым выраженным может быть РAI-2, этот ингибитор повышается при беременности, что может дать ложные результаты определения РAI-I в этом случае. В последнее время активно используется определение РAI-I методом ИФА или комбинацией иммунохимических и функциональных методов.
Определение тканевого активатора плазминогена (t-РA). Тканевой активатор плазминогена (t-PA) освобождается в кровоток из эндотелиальных клеток сосудистой стенки, где он синтезируется. Поэтому диагностика дефицита t-PA основывается не только на определении концентрации t-PA в крови, но и на способности освобождаться из сосудистой стенки при стрессовых воздействиях, в частности при манжеточной пробе (дозированном пережатии вен).
Сначала определяется базовый уровень t-PA, потом на 10 – 15 минут на предплечье накладывают жгут или раздувают манжетку, вызывающую венозный стаз, затем берут вторую порцию крови, в которой повторно определяют t-PA. Сравнивают результаты обеих проб. Из-за быстрой t-PA инактивации РAI-I и другими ингибиторами, пробы крови необходимо немедленно закислить, чтобы предупредить инактивацию t-PA in vitro. В настоящее время выпускаются специальные пробирки с кислым антикоагулянтом. t-PA имеет суточный ритм, поэтому его необходимо определять также как РAI-I.
Определение t-PA проводится у больных с тромбофилией как часть панели тестов на выявление ее причины, особенно при нагрузочных манжеточных пробах. Повышение t-PA после инфаркта миокарда рассматривается как неблагоприятный фактор. Нарушение освобождения t-PA после венозного стаза описано у больных с тромбозами и с патологией почек.
Тесты активации свертывания крови
Определение D-димера. D-димеры – это специфические продукты деградации фибрина, входившего в состав тромба. Они образуются в процессе лизиса сгустка крови под влиянием плазмина и некоторых неспецифических фибринолитиков. Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Этот тест позволяет судить об интенсивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков.
Определение D-димеров проводится иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, иммунодиффузии, методом турбидимитрии, латекс-агглютинации
На определение D-димера практически не оказывает влияния техника взятия крови, примесь тромбоцитов, не требуется использования ингибиторов для подавления других факторов.
Повышение уровня D-димеров в крови определяется при возникновении венозных тромбозов, атеротромбозе, тромбоэмболии легочной артерии, ДВС-синдроме, после операций, особенно при большом операционном поле, после травм, при онкологических заболеваниях и других состояниях с повышенным образованием фибрина.
D-димеры достаточно долго циркулируют в крови, время их полувыведения составляет более 24 часов, повышение D-димеров может персистировать в течение нескольких недель после острого тромбоза.
На уровень D-димеров влияют величина тромба, время от начала тромбообразования до назначения антикоагулянтной терапии, прием антикоагулянтов (варфарина), на фоне которых уровень D-димеров постоянно снижается. Поэтому более важной для исключения диагноза тромбоза является отрицательная диагностическая значимость теста.
Продукты деградации фибрина/фибриногена (ПДФ). Продукты деградации фибрина/фибриногена определяются традиционно в общей группе с использованием поликлональных антител. При этом антитела могут взаимодействовать с эпитопами фибриногена, поэтому требуется не только использование сыворотки, но и полное удаление фибриногена с добавлением к крови тромбина или змеиного яда с тромбиноподобным эффектом.
Достаточно трудно отдифференцировать ПДФ, образующиеся при деградации фибрина из тромба, от ПДФ, сформировавшихся при деградации фибриногена, особенно при использовании активаторов фибринолиза.
Для определения ПДФ широко используется, помимо ИФА, метод латекс-агглютинации. Этот метод легко автоматизируется на турбидиметрах, но характеризуется относительно низкой специфичностью.
Положительная проба – содержание ПДФ в плазме/сыворотке свыше 0,5 мкг/мл – указывает на ДВС-синдром, тромбоз глубоких вен, ТЭЛА, метастазы в легкие, рак яичников, фибринолитическую терапию.
Тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ) – новый тест в диагностике ДВС-синдрома, он активно внедряется в практику. Клиренс ТАТ из системы циркуляции достаточно быстрый, он удаляется в течение нескольких минут. Поэтому присутствие ТАТ в плазме свидетельствует об образовании тромбина in vivo непосредственно в момент взятия крови и о возможности истощения антикоагулянтов.
По информативности в острой ситуации определение ТАТ схоже с определением фибринопептида А (ФПА), однако для ТАТ менее критичными являются требования к процедуре взятия крови.
Фрагменты протромбина F1+2. Это также новый тест, он отражает активность превращения протромбина в тромбин с участием протромбиназного комплекса (фактор Ха, фактор Vа, фосфолипиды и Са2+), который формируется при активации системы плазменного гемостаза.
Определение F1+2, так же как и ТАТ, проводится с целью диагностики состояния гиперкоагуляции, которое может быть значимым при остром и хроническом ДВС, тромбозе глубоких вен бедра, ТЭЛА, злокачественных опухолях и острых миелодных лейкозах (протекающих с активацией системы свертывания), наличии факторов риска тромбоэмболий, остром инфаркте миокарда и последующей тромболитической терапии. Исследование F1+2 полезно использовать при мониторинге лекарственной коррекции состояния гиперкоагуляции, в частности при лечении гепарином и концентратами антитромбина.
Определение ТАТ и F1+2 хараутеризуется высокой аналитической чувствительностью, поэтому их увеличение можно зарегистрировать до появления клинических признаков ДВС-синдрома.
F1+2, в отличие от ТАТ, имеет относительно продолжительный период циркуляции в системе кровотока.
Состояние же гипокоагуляции можно определить только по уменьшению F1+2, но не ТАТ. Поэтому исследование F1+2 проводится иногда с целью мониторинга антикоагулянтов непрямого действия, эффективности профилактического подкожного или внутривенного введения гепарина.
Определение F1+2 можно использовать для решения вопроса о назначении /неназначении терапевтических вмешательств у пациентов с дефицитом антикоагулянтов и при беременности в случае риска возникновения тромбозов.
Фибринопептид А (ФПА, FPA). ФПА отщепляется от молекулы фибриногена тромбином, поэтому при тромбинемии количество ФПА в плазме увеличивается. В современных лабораториях используется метод ИФА для его определения. ФПА – очень чувствительный тест на потребление фибриногена, его концентрация повышается при различных заболеваниях, сопровождающихся тромбоэмболией.
Результаты теста в большой мере зависят от процедуры взятия крови, даже небольшие отступления от предписанной схемы могут вызвать значительные сдвиги в уровне ФПА в пробе.
Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). При ряде форм патологии, характеризующейся активацией свертывания крови (ДВС, тромбозы, тромбофилии), происходит расширение пула фибриногена. В норме в крови из пула фибриногена присутствует практически только сам фибриноген в количестве 1,8 – 3,5 г/л. Все остальные продукты находятся в минимальном количестве, которое практически не определяется лабораторными тестами.
При ДВС-синдроме за счет свободного тромбина происходит постоянный процесс трансформации фибриногена в фибрин с появлением в крови фибринопептидов А и В, накоплением мономеров фибрина.
Активация фибринолиза сопровождается повышенным образованием ПДФ. ПДФ взаимодействуют с фибрин-мономерами, увеличивая количество растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). РФМК – это фибрин-мономеры и олигомеры, а также их комплексы с ПДФ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог, можно констатировать важность исследования гемостазиологических показателей в клинической практике. Имеющийся арсенал методов изучения гемостаза позволяет определить непосредственную причину нарушения свёртывания крови и контролировать все этапы лечения пациентов с патологией гемостаза.
Нам представляется очень важной задачей донести до будущего врача или врача, только начинающего нелегкий путь знакомства с гемостазиологией, понимание того, насколько важен комплексный и вместе с тем дифференцированный подход к исследованию свертывания крови. Алгоритм «От скриннингового теста к высокоспецифичному», иными словами «От простого к сложному», на 100% правомочен в области исследования гемостаза, будь то научное исследование или практическая диагностика заболеваний.
В этой связи огромное значение приобретает качество проведения гемостазиологических тестов, глубокое знание врачом методики постановки исследований, начиная от момента забора крови у пациента. Только строгий внутренний контроль качества диагностики, неотступное следование инструкции по проведению тестов обеспечат достоверность получаемых результатов. Любое превосходное знание теории гемостаза может стать бесполезным при отступлении от правил качественного проведения исследования.
Безусловно, из года в год появляется все больше новых методов диагностики, новых информативных гемостазиологических показателей, которые по-настоящему украшают диагностический процесс и имеют только один минус – высокую стоимость оборудования и реактивов для их постановки. Для крупных лабораторий и центров изучения гемостаза даже этот факт не является проблемой, но еще ни одна лаборатория и ни один центр не отказались от скриннинговых тестов исследования гемостаза. Более того, зачастую предпочтение отдается «рутинным» методам исследования с использованием высококачественных и высокочувствительных реактивов, нежели «высокотехнологичному» показателю, который является лишь подтверждающим в схеме диагностики патологии свертывания крови. Примером может служить тест АЧТВ с использованием высокочувствительных реагентов, который имеет огромное диагностическое значение в определении люпус-антикоагулянта, ингибиторов факторов свертывания крови, контроле антикоагулянтной терапии и др.
Знание алгоритма диагностики той или иной патологии системы гемостаза в определенной мере облегчает работу врача. Умение хорошо собрать анамнез, провести физикальное обследование больного, грамотно оценить результаты ориентировочных тестов, определить дополнительные исследования, назначить терапию и контролировать ее – вот залог успеха врача в борьбе с тромбозами, кровотечениями или риском их возникновения.
Литература
1. В.В.Долгов, П.В.Свирин «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза». М.: Триада, 2005г.
2. А.П.Момот «Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы лабораторной диагностики». С-Пб.: ФормаТ, 2006г.
3. Баркаган З.С., Момот А.П. «Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза». М.: Ньюдиамед, 2001г.
4. «Лабораторная диагностика нарушений гемостаза в клинической практике». Методическое пособие для студентов медицинских ВУЗов. Ярославль, 2002г.
5. Бокарев И.Н. «Кровоточивость, или геморрагический синдром. Дифференциальная диагностика и лечение» М.; 2002г.
6. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Венозный тромбоэмболизм и тромбоэмболия легочной артерии. М.: «МИА»; 2005г.
Удлинение АЧТВ или dRVVT
Тесты смешивания
Коррекция (дефицит факторов)
Нет коррекции (присутствие ингибитора)
Определение активности отдельных факторов
Подтверждающие тесты люпус-антикоагулянта
(с гексагональными фосфолипидами, мембранами тромбоцитов)
Коррекция АЧТВ
ЛАК
Нет коррекции АЧТВ
Специфичный ингибитор фактора (-ов)
ТВ
В
Рептилазное время