Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Національна академія наук України
Інститут молекулярної біології та генетики
НЕМАЗАНИЙ ІВАН ОЛЕКСІЙОВИЧ
УДК 577.218
577.217
Клонування ГЕНА та характеристика білка-партнера протеїнкінази рибосомного білка S6 коензим А-синтази
03.00.03 - молекулярна бiологiя
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
КИЇВ –
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Окремі дослідження проведено в лабораторії клітинної регуляції Інституту ракових досліджень Людвіга (м.Лондон, Велика Британія).
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
Філоненко Валерій Вікторович,
Інститут молекулярної біології та генетики
НАН України,
в.о.завідувача відділу структури та функцій нуклеїнових кислот.
Інститут молекулярної біології та генетики
НАН України,
зав. лабораторії біосинтезу білка
відділy механізмів трансляції генетичної інформації;
доктор біологічних наук, професор
Матишевська Ольга Павлівна,
Київcький національний університет
імені Tapaca Шевченкa,
професор кафедри біохімії.
Провідна установа: Інститут біології клітини НАН України, м.Львів.
Захист відбудеться “ 28 ” грудня 2004 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Автореферат розіслано 26 листопада 2004 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Регуляція клітинного росту, проліферації та диференціації є необхідною умовою забезпечення нормального функціонування окремо взятої клітини та організму в цілому. Відповідно, порушення цих процесів призводять до цілої низки важких патологій, у тому числі, і до злоякісної трансформації клітин (Conlon et al., 1999). Сигнальні шляхи клітини відіграють провідну роль у регуляції та координації зазначених клітинних процесів шляхом передачі позаклітинних стимулів до відповідних компартментів клітини. Важливою регуляторною ланкою сигнальних шляхів є родина Ser/Thr протеїнкіназ S6 білка 40S субчастинки рибосом (S6K1 та S6K2), що належать до PI3-кіназа залежного сигнального шляху. Оскільки S6K2 було ідентифіковано відносно недавно (Gout et al., 1998) більш охарактеризованною на сьогодні є S6K1, яку було ідентифіковано наприкінці 80-х років (Jeno et al., 1988). Встановлено, що незважаючи на високий ступінь гомології (85%) первинних структур кіназ впродовж каталітичних доменів і відповідно високу специфічність до спільного субстрату - S6 рибосомного білка існують суттєві відмінності у регуляції та функціонуванні кіназ у клітині. Доведено важливу роль S6K1 у регуляції клітинного циклу, а саме, введення в клітину нейтралізуючих анти-S6K1 антитіл призводило до блокування G1-S переходу клітинного циклу (Jefferies et al., 1997). Встановлено провідну роль S6K1 у регуляції біосинтезу білка індукованого ростовими факторам, гормонами та іншими мітогенними стимулами шляхом фосфорилювання рибосомного білка S6 і, як наслідок, активації ініціації трансляції мРНК, що кодують компоненти апарату біосинтезу білка –рибосомні білки, фактори елонгації білкового синтезу. З використанням трансгенних мишей доведено, що одночасна інактивація генів S6K є несумісною із життєдіяльністю клітини (Pende et al., 1994). На сьогодні ідентифіковано цілий ряд специфічних для S6K субстратів - проапоптичний мітохондріальний білок BAD, фактор транскрипції CREM, фактор ініціації трансляції eIF-4B, однак найбільш дослідженим є S6 рибосомний білок і лише для нього доведено існування опосередкованого S6K1 та S6K2 фосфорилювання in vivo.
Згідно існуючої на сьогоднішній день моделі регуляція активності S6K відбувається за рахунок фосфорилювання/дефосфорилювання множинних сайтів фосфорилювання індукованого позаклітинними мітогенними стимулами. Цілий ряд білкових кіназ та фосфатаз здатні використовувати S6K як субстрат in vitro, однак лише для деяких із них підтверджено існування функціонального зв'язку in vivo і саме тому молекулярні механізми регуляції активності кіназ у клітині лишаються багато в чому незрозумілими.
На сьогодні існують переконливі дані, які вказують на зв'язок РІ3-кіназного сигнального шляху і безпосередньо S6K з канцерогенезом. Дослідження генетичних порушень в аденокарциномах молочної залози виявили ампліфікацію гена S6K1, що розташований в 17q22-24 хромосомній ділянці. Ампліфікація цього гена корелює із зростанням експресії даної форми S6 кінази у цих клітинах як на рiвні мPHK, так i бiлкa. Важливо також зазначити, що ампліфікація генів 17q22-24 хромосомної ділянки є характерною особливістю онкологічних захворювань даного типу (Wu et al., 1999). Крім того, надекспресію S6 кіназ у ракових клітинах виявлено і для інших типів злоякісних пухлин (Лизогубов и др., 2003).
Беручи до уваги вище зазначене, актуальним є дослідження білок-білкових взаємодій S6K у клітині, особливо із використанням методичних підходів, що максимально відповідали б умовам in vivo. Це в свою чергу дало б змогу ідентифікувати нові білки-партнери (субстрати або індуктори) кіназ, або ж підтвердити існування вже виявлених in vitro взаємодій і, таким чином дослідити особливості функціонування кіназ як у нормальних клітинах, так і у випадку різного роду патологічних станів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась за бюджетною темою №2.2.4.10 –“Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації - 0101U000360, 2001-2005рр.), а також у рамках співробітництва з Інститутом ракових досліджень Людвіга (Велика Британія) згідно договору про наукове співробітництво 1999р.
Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було ідентифікувати нові білки-партнери кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної дріжджової системи та проаналізувати функціональний зв'язок виявлених взаємодій у клітині. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:
10. Встановити субклітинну локалізацію S6K1-білкових комплексів.
Об’єкт дослідження –кіназа рибосомного білка S6 (S6К1) та КоА-синтаза.
Предмет дослідження –ідентифікація та характеристика білок-білкових взаємодій S6K1 в клітинах ссавців.
Методи дослідження –дріжджова двогібридна система, клонування кДНК фрагментів у плазмідні конструкції, метод сайтспрямованого мутагенезу, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК конструкціями, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, конфокальна сканувальна мікроскопія, визначення ензиматичної активності S6К1 та КоА-синтази.
Наукова новизна одержаних результатів. Ідентифіковано новий S6K1- зв’язувальний білок – КоА-синтазу. Вперше клоновано кДНК, що кодує КоА-синтазу. Базуючись на аналізі амінокислотної послідовності КоА-синтази передбачено і підтверджено біохімічними методами, що КоА-синтаза є біфункціональним ензимом і має одночасно дефосфоКоА-кіназну (EC 2.7.1.24) та фосфопантотенатаденілтрансферазну (EC 2.7.7.3) активності й відповідно каталізує два останні етапи біосинтезу КоА.
Вперше показано, що КоА-синтаза взаємодіє із S6K1 у клітинах дріжджів і у клітинах ссавців. Встановлено, що С-кінцеві регуляторні ділянки як S6K1, так і КоА-синтази залучені до утворення білок-білкового комплексу. Методами конфокальної мікроскопії клітин та субклітинного фракціонування виявлено мітохондріальну локалізацію КоА-синтази. Доведено, що N-кінцевий гідрофобний домен КоА-синтази відповідає за асоціацію КоА-синтази із зовнішньою мембраною мітохондрій. Вперше встановлено зв'язок сигнальних молекул із ензимами, відповідальними за біосинтез КоА.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дають можливість охарактеризувати низку закономірностей функціонування та механізмів, які лежать в основі передачі регуляторного сигналу через S6 кіназний сигнальний шлях. Ідентифікування нового партнера S6K1 –КоА-синтази дає підстави говорити про місце інтеграції сигнальних шляхів і біогенезом КоА клітини. Це доповнює експериментальні дані, які відкривають перспективу для пошуку і впровадження у практику препаратів для корекції патологічних змін, пов’язаних із порушенням функціонування S6 кіназного сигнального шляху та процесів біосинтезу білка в цілому.
Клонування гена КоА-синтази відкриває також перспективи для детальнішого вивчення цього ензиму із використанням широкого спектра сучасних молекулярно-біологічних методичних підходів, дозволяє отримувати високо очищений препарат КоА-синтази в необмежених кількостях, що може полегшити створення препаратів для лікування хвороб, пов’язаних із порушенням біосинтезу КоА та обміну вітаміну В5 в організмі. Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах з молекулярної біології та біохімії для студентів біологічних факультетів.
Особистий внесок здобувача. Всі дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Обробку та аналіз отриманих результатів виконано особисто пошукачем. Експерименти із використанням дріжджової двогібридної системи було виконано спільно з к.б.н. О.М. Живолупом і Г.Г. Панасюк; метод кількісного визначення Leu+ та LacZ+ фенотипів у дріжджів розроблено спільно з к.б.н. О.М. Живолупом. Клонування, експресію та очистку КоА-синтази із клітин бактерій проводили спільно з к.б.н М.І. Вудмаскою та к.б.н. В.Г. Найдьоновим. Імунізацію кролів, отримання та очистку антитіл проти КоА-синтази проводили спільно з к.б.н. О.П. Кухаренком та Л.О. Савінською. Визначення нуклеотидної послідовності кДНК клону КоА-синтази проводили спільно з Т. Фентоном (м. Лондон, Велика Британія). Отримання лізатів тканин щура та Вестерн-блот аналіз експресії КоА-синтази в різних тканинах щура проводили спільно з к.б.н. Г.В. Овчаренко. Дослідження субклітинної локалізації КоА-синтази з використанням конфокальної мікроскопії виконували спільно з Г.Г.Панасюк. Автор висловлює подяку професорам І. Гуту та П. Шепарду, Х. Ребхолтс та Ф. Вердьер за корисні поради та зауваження під час підготовки експериментів та в обговоренні отриманих результатів. Автор дякує М.Л. Ванг та к.б.н. Т.Й. Вальовці за люб'язно наданий маркер мітохондрій MTRMitotracer. Автор висловлює щиру подяку к.б.н. В.В. Філоненку за керівництво, корисні поради в плануванні експериментів та при обговоренні результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на Міжнародній конференції з генетики і молекулярної біології (м.Київ, 2001), “The Wellcome Trust” Міжнародному симпозіумі (м.Лондон, Велика Британія, 2001), 17-му з’їзді Європейської асоціації ракових досліджень (м. Гранада, Іспанія, 2002), IV Пapнaciвcькiй конференції (м.Вроцлав, Польща, 2002), 8-му Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці, 2002), Форумі для молодих науковців Федерації європейських біохімічних товариств (м. Стамбул, Туреччина, 2002), Спеціальному з’їзді Федерації європейських біохімічних товариств із сигнальних шляхів (м. Брюсель, Бельгія, 2003), Науковому семінарі із сигнальних шляхів (м. Спетсес, Греція, 2003), Науковому семінарі по білках, що контролюють клітинний ріст (м. Мадрид, Іспанія, 2004), 29-му конгресі Федерації європейських біохімічних товариств (м. Варшава, Польща, 2004), а також на засіданнях відділу структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ і загальних зборах Інституту ракових досліджень Людвіга (м. Лондон, Велика Британія) та відділу біохімії і молекулярної біології Лондонського університету.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 праць, з них 3 статті у фахових наукових журналах, та тези 8 доповідей у збірниках матеріалів з’їздів і конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, експериментальної частини, узагальнення одержаних результатів, висновків, списку цитованої літератури, який охоплює 205 найменувань. Дисертацію викладено на 141 сторінці стандартного машинопису, вона містить 35 рисунків та 3 таблицi.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали і методи дослідження. В роботі використано дріжджову двогібридну систему DupLexA фірми OriGene (США). Для створення "байт"-конструкцій було використано фрагменти гена S6K1, що кодує цитоплазматичну форму кінази. Конструювання рекомбінантних плазмід на основі вектора pEG202 було проведено стандартними методами і перевірено рестрикційним аналізом. Перевірку "байт"- конструкцій і великомасштабну трансформацію дріжджових клітин кДНК-бібліотекою 19-денних ембріонів миші проведено згідно з рекомендаціями виробника. Скринування і тестування позитивних клонів методом статевого злиття проведено відповідно до оригінального кількісного методу (Живолуп та ін., 2000).
При виконанні роботи використовували клітини ембріональної нирки людини лінії НЕК293, фібробластів миші NIH3T3 та лінії клітин аденокарциноми молочної залози людини MCF7. Клітини культивували в середовищі DMEM, яке містило 10% телячої ембріональної сироватки, 2 мМ L-глутаміну, 10 мкг/мл пеніциліну і 0,25 мкг/мл стрептоміцину.
Для створення рекомбінантних повнорозмірної та делетованих мутантних форм КоА-синтази, кДНК послідовності ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних олігонуклеотидів із відповідними сайтами розпізнавання ендонуклеаз рестрикції. Ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали відповідними ендонуклеазами рестрикції. Очищені фрагменти ДНК лігували, використовуючи ДНК лігазу (“Promega”, США) згідно з протоколом компанії.
Для одержання мутантної форми КоА-синтази, що мала точкову мутацію, використовували набір для мутагенезу “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” фірми ”Stratagene”, США. Нуклеотидну послідовність кДНК отриманих мутантних форм КоА-синтази перевіряли за допомогою автоматичного секвенатора ABI 377 (“Applied Biosystem”, США).
Трансфекцію клітин НЕК293 плазмідними ДНК здійснювали, використовуючи реагент Рolyfect (“Qiagen”, Велика Британія) згідно з протоколом компанії. Через 20 годин після трансфекції середовище замінювали на безсироваткове і після 24 годин голодування здійснювали стимуляцію додаванням ембріональної сироватки телят до кінцевої концентрації 10%. В експериментах із використанням інгібіторів кіназ клітини інкубували у присутності зазначених концентрацій рапаміцину чи LY2942002 протягом 15 хв перед стимуляцією сироваткою.
Імунопреципітацію рекомбінантних форм кіназ, злитих із ЕЕ-таг епітопом та рекомбінантних форм КоА-синтази злитих з Мус-таг епітопом здійснювали, інкубуючи лізати клітин із анти-ЕЕ-таг та анти-Мус-таг моноклональними антитілами і білок-G-сефарозою (“Amersham”, Велика Британія). Аналіз імунопреципітатів проводили методом Вестерн-блот аналізу.
Активність S6К1 в імунопреципітатах визначали, використовуючи як субстрат 40S рибосоми, очищені з гомогенату печінки щура (Thomas et al., 1978). Продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом у 12,5%-му поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6 білка визначали за допомогою PhosphorImager („BioRad”, Велика Британія).
Ферментативну активність КоА-синтази визначали з використанням Р-АТФ і дефосфо КоА або фосфопантотенату як субстратів. Продукти реакції розділяли за домомогою низхідної паперовою хроматографії, а кількість утвореного КоА визначали за допомогою PhosphorImager („BioRad”, Велика Британія).
Для імунофлуоресцентних досліджень використовували клітини лінії NIH 3T3, що були трансфіковані відповідними плазмідами. Клітини фіксували 4%-им параформальдегідом та обробляли відповідними антитілами. Флуоресцентно мічені клітини вивчали за допомогою конфокального лазерного сканувального мікроскопа Zeiss LSM510, а зображення аналізували за допомогою програми LSM510.
Збагачені фракції мітохондрій одержували за допомогою диференційного центрифугування у градієнті іодоксонолу („OptiPrep”, США), як рекомендовано виробником.
Результати досліджень та обговорення.
Скринування кДНК бібліотеки ембріонів миші за допомогою pEG202/S6K1 "байт"-конструкцій. Для пошуку білків-партнерів S6K1 було використано дріжджову двогібридну систему, що є загальновизнаним у світі методом для пошуку білок-білкових взаємодій. На підготовчому етапі двогібридного скринування було створено "байт"-конструкцій S6K1 для подальшого використання в скринуванні кДНК бібліотеки. Для цього кДНК послідовності повнорозмірної форми S6K1, N- та C- кінцевих доменів, було клоновано як LexA-злиті білки у вектор pEG 202 (повнорозмірну S6K1 та N- кінцевий домен) та pNLexA (С-кінцевий домен) (рис.1). Проведений аналіз показав, що з усіх 3-х конструкцій лише повнорозмірна форма S6K1 мала допустимий рівень самоактивації репортерних генів LacZ та Leu2, відповідно лише цю конструкцію використовували для скринування кДНК бібліотеки. Для скринування кДНК бібліотеки 19-денних ембріонів миші (OriGene Inc, США) використовували штами дріжджів із мінімальною (EGY188), середньою (EGY194) та максимальною (EGY48) чутливістю до активації репортерного гена Leu2 та максимально чутливу до активації репортерного гена плазміду (pSH18-34) з 8 операторами LexA перед геном LacZ. Трансформацію клітин дріжджів плазмідною ДНК бібліотеки та “байт”-плазмідами, а також відбір позитивних клонів проводили згідно протоколу виробника.
Лише серед максимально і середньочутливих штамів трансформованих дріжджових клітин по швидкості росту на селективному (+ галактоза) середовищі було відібрано 382 позитивних клони. З огляду на значний рівень самоактивації системи для подальшої перевірки відібраних клонів було розроблено і використано метод кількісного аналізу залежності LacZ+ та Leu+ фенотипів клонів від індукції галактозою, що дозволило підтвердити галактозозалежність LacZ+ та Leu+ фенотипів для 16 клонів штаму EGY48 і 12 клонів штаму EGY194. Рестрикційний аналіз кДНК вставок та аналіз специфічності позитивних клонів методом статевого злиття (рис. 2) дозволив підтвердити специфічність 11 позитивних клонів, які, як з’ясувалось, містили ідентичні за розміром кДНК вставки. Аналіз первинної структури кДНК вставок позитивних клонів встановив їхню повну ідентичність, а тому для подальшого аналізу використовували кДНК одного з 11 позитивних клонів –клону №2.
Біоінформаційний аналіз нуклеотидної послідовності кДНК вставки клону №2 з використанням бази послідовностей GenBank. Для ідентифікації кДНК клону №2 було проведено пошук за базою даних (GenBank) гомологічних нуклеотидних послідовностей з використанням стандартної програми BLAST. Пошук виявив, що центральна частина кДНК вставки має високий ступінь гомології з фрагментами генів фосфопантатеїл трансфераз, які належать до суперсімейства цитидилтрансфераз прокаріотів та нижчих еукаріотів. C-кінцева ділянка мала натомість високу гомологію до каталітичного домену дефосфоКоА-кіназ прокаріотів. Подальший біоінформаційний аналіз виявив гомологічні кДНК клону №2 гени та мРНК у еукаріотів, що одночасно кодували гомологічні фосфопантатеніладенілтрансферазний та дефосфоКоА-кіназний домени (рис. 3). Жоден із продуктів цих генів не було біохімічно охарактеризовано та ідентифіковано. Біохімічно було охарактеризовано лише ензим із печінки свині, що мав фосфопантатеїладенілтрансферазну та дефосфоКоА-кіназну активності одночасно (Warral et al., 1982). Однак амінокислотну послідовність відповідного ферменту ніколи не визначали, і не було ідентифіковано відповідний ген ензиму, а тому гіпотезу про біфункціональний білок, що каталізує останні етапи біосинтезу КоА, не було остаточно підтверджено. Беручи до уваги вище наведене, було зроблено припущення, що кДНК вставка клону №2 кодує білок, який може бути задіяним у біосинтезі КоА і який одночасно каталізує два останні етапи біосинтезу КоА –синтез дефосфо КоА та власне синтез КоА.
Перевірка та підтвердження прогнозованих активностей КоА-синтази. Для перевірки висунутого припущення фрагмент кДНК клону №2, що кодує гіпотетичний дефосфоКоА-кіназний домен (dPКoAK) було клоновано у вектор для бактеріальної експресії pET24a в рамці з C-кінцевою полігістидиновою послідовністю (His-dPКoAK). Рекомбінантний білок експресували у клітинах E.coli та очищали методом афінної хроматографії.
Перевірка ензиматичної активності рекомбінантного dPКoAK із використанням як субстратів дефосфоКоА або 4-фосфопантотенату та радіоактивно міченої АТФ встановила утворення радіоактивно міченого КоА лише в разі використання дефосфоКоА (рис 4, доріжки 10, 11). Тим самим було підтверджено, що dPКoAK має дефосфоКоА-кіназну активність. Для визначення активності повнорозмірної форми КоА-синтази відповідну кДНК було клоновано в рамці з нуклеотидною послідовністю Myc-таг епітопу в вектор pcDNA3.1+ та експресовано у клітинах НЕК293. Активність рекомбінантної КоА-синтази визначали в імунопреципітатах анти-Myc-таг антитіл із використанням як субстратів дефосфоКоА або 4-фосфопантотенату. Як видно з рис. 4 (доріжки 4, 5), КоА-синтаза здатна використовувати обидва субстрати та каталізувати утворення КоА і відповідно виявляє прогнозовані активності.
Визначення рівня експресії КоА-синтази в різних тканинах ссавців на рівні мРНК. Визначення нуклеотидної послідовності кДНК, що кодує КоА-синтазу, дало змогу проаналізувати експресію КоА-синтази в різних тканинах ссавців. Рівні експресії КоА-синтази в тканинах на рівні мРНК визначали за допомогою Нозерн-блот аналізу. мРНК гібридизували з радіоактивно міченим фрагментом кДНК КоА-синтази (120-150 п.н.). Було виявлено мажорний транскрипт розміром 2300 п.н. та два мінорні транскрипти розміром 1700 п.н. і 2000 п.н. Найвищий рівень експресії детектовано у нирках і печінці, на відміну від товстої кишки, легенів, кишечнику,та селезінки, де було встановлено нижчий рівень експресії транскриптів.
Отримання поліклональних антитіл проти КоА-синтази та визначення експресії КоА-синтази в різних тканинах ссавців на рівні білка. Для отримання поліклональних антитіл проти КоА-синтази як антиген для імунізації кролів використовували His-dPКoAK.
Для аналізу експресії КоА-синтази в тканинах ссавців було використано лізати тканин щура. В імуноблотингу антитіла розпізнавали мажорну смугу на рівні 60 кДа. Всі лізати аналізували в однаковій кількості (40 мкг білка). Експресія КоА-синтази була найвищою в нирках, печінці та мозку, на відміну від яєчників і легенів, що експресують низький рівень білка (рис. 5). З одержаних даних можна зробити висновок, що КоА-синтаза є широко розповсюдженим ферментом, високі рівні експресії якого спостерігаються у тканинах з високим енергетичним метаболізмом. Крім того, рівень експресії КоА-синтази на рівні білка значною мірою збігається з експресією на рівні мРНК.
Підтвердження взаємодії S6K1 і КоА-синтази у клітинах ссавців. Оскільки взаємодію КоА-синтази з S6K1 було ідентифіковано у клітинах дріжджів, необхідно було підтвердити існування цієї взаємодії in vivo у клітинах ссавців. Було проведено імунопреципітацію з лізатів клітин НЕК 293, що одночасно тимчасово експресували ЕЕ-S6К та КoA-Мус-синтазу, гіпотетичного комплексу S6K1/КоА-синтаза за допомогою анти-ЕЕ антитіл. Як видно з рис. 6А (доріжка 1), рекомбінантна S6К1, яка преципітується за допомогою анти- ЕЕ антитіл, одночасно зв’язується з рекомбінантною КоА-синтазою, що детектується за допомогою анти-Мус антитіл. При цьому в імунопреципітатах з клітин, що не експресували рекомбінантну ЕЕ-S6К, КoA-Мус синтази не виявлено (рис. 6А, доріжка 2). З цього можна зробити висновок про взаємодію рекомбінантних КоА-синтази та S6K1, експресованих у клітинах ссавців.
Для підтвердження взаємодії між ендогенними S6K1 і КоА-синтазою імунопреципітацію білкових комплексів проводили з використанням поліклональних антитіл (анти-dPКоАК) та лізатів клітин MCF7. Детектування S6K1 в імунних комплексах проводили за її активністю, використовуючи як субстрат S6 білок (рис.6Б). Разом із тим було також перевірено вплив на активність преципітованої S6K1 голодування клітин, стимуляції клітин сироваткою та застосування відомих інгібіторів S6K1 –LY 294002 і рапаміцину. Для контролю замість поліклональних антитіл використовували преімунну сироватку кроля. КоА-синтазу імунопреципітували з лізатів клітин MCF7, що голодували, протягом 24 годин і безпосередньо перед отриманням лізатів до клітин додавали ембріональну сироватку або ж перед цим обробляли інгібіторами S6K1 рапаміцином та LY 294002. Наведені результати свідчать, що в імунопреципітатах анти-dPКоАК антитіл виявлено активність S6K1. Крім того, встановлено, що активність чутлива до голодування та стимуляції клітин ембріональною сироваткою, а також інгібується класичними інгібіторами S6K1. Таким чином, підтверджено існування в клітині взаємодії між ендогенними ензимами.
Ідентифікація в послідовностях S6K1 та КоА-синтази послідовностей, які залучені до утворення білок-білкового комплексу. Для підтвердження специфічності взаємодії S6K1 та КоА-синтази та подальшого дослідження її функціональних особливостей дуже важливим є встановити структурні елементи в амінокислотних послідовностях S6K1 та КоА-синтази, які відповідають за утворення комплексу. Для цього було перевірено можливість утворення білкового комплексу між мутантними формами КоА-синтази та S6K1. Було створено такі мутантні форми КоА-синтази: делетовану з N-кінця КоА-синтазу, що не містила перших 175 амінокислот (N КоА-синтаза); делетовану з С-кінця КоА-синтазу, що не містила останніх 214 амінокислот (С КоА-синтаза). Кожну із форм було експресовано з Мус-таг епітопом. Утворення білкових комплексів у клітинах, що одночасно експресували рекомбінантну S6K1 та одну з мутантних форм КоА-синтази визначали як і раніше шляхом імунопреципітації і подальшого імуноблот аналізу преципітатів. Як свідчать результати, подані на рис. 7А, С КоА-синтаза на відміну від N КоА-синтази не здатна утворювати комплекс із S6K1. Отже, у взаємодії S6K і КоА-синтази задіяний С-кінцевий фрагмент КоА-синтази.
Для визначення ділянок S6K1, які залучені до утворення білкового комплексу, використовували конструкції, що кодують делетовані з N- та С-кінця форми S6K1. Було створено конструкції pcDNA3.1/CS6K1-ЕЕ та pcDNA3.1/NS6K1-ЕЕ. Імунопреципітацію з лізатів клітин, що одночасно експресували N КоА-синтазу-Myc та одну з мутантних форм S6K1 проводили анти-ЕЕ антитілами, а імуноблотинг –із використаням анти-Myc антитіл. Як видно з рис. 7Б, лише делетована з N-кінця S6K1 взаємодіє з N КоА-синтазою (доріжка 3), в той час як делетована з С-кінця S6K1 втрачає цю здатність (доріжка 2). Таким чином, у формуванні S6K1-КоА-синтаза комплексу беруть участь С-кінцеві послідовності як S6K1 (420-525 а.к.), так і КоА-синтази (449-563 а.к.).
Субклітинна локалізація КоА-синтази. Для подальшої функціональної характеристики взаємодії між S6K1 та КоА-синтазою було вирішено перевірити субклітинну локалізацію КоА-синтази порівняно з локалізацією S6K1. В літературі не існує переконливих даних щодо локалізації КоА-синтази в клітині.
Згідно з літературними даними активність КоА-синтази детектується як у цитозолі, так і у мітохондріях. Для аналізу субклітинної локалізації КоА-синтази було вирішено використати імунофлуоресцентну мікроскопію. Такий підхід дає змогу одержати наочні дані про локалізацію білків. Клітини NIH3T3 трансфікували плазмідою pсDNA3.1/КоАсин-Myc. Після фіксації клітини обробляли анти-Myc антитілами та відповідними вторинними антитілами, міченими FITC, та детектували флуоресцентний сигнал, використовуючи скануючий флуоресцентний мікроскоп. Виявилось, що флуоресцентний сигнал майже повністю локалізувався у структурах цитоплазми, що нагадували мітохондрії (рис. 8). Для підтвердження гіпотези про мітохондріальну локалізацію КоА-синтази було використано комерційний барвник
MitoTracer, що специфічно акумулюється у нативних мітохондріях і не вимивається
під час фіксації клітин. Як видно з рис. 8, сигнал флуоресценції MitoTracker вказує на локалізацію мітохондрій у цитоплазмі. Комп’ютерне поєднання зображення, що відповідає локалізації КоА-синтази та сигналу, що відповідає локалізації мітохондрій, дало забарвлення (рис.8В), яке вказує на місця колокалізації КоА-синтази та мітохондрій. Аналізуючи одержані дані, можна зробити висновок, що майже вся КоА-синтаза в клітині колокалізується з мітохондріями.
N-кінцева послідовність КоА-синтази відповідає за її мітохондріальну локалізацію. Аналіз амінокислотної послідовності КоА-синтази з використанням програми Tempred (http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html) виявив гідрофобну ділянку, що розташована на N-кінці (7-29 амінокислота) молекули КоА-синтази. Наявність цієї ділянки свідчить про те, що N-кінцева послідовність КоА-синтази може бути задіяна в асоціації ферменту з мембранними структурами клітини. Для перевірки цього припущення було вирішено використати вже наявні мутанти КоА-синтази. Тимчасова експресія N КоА-синтази у клітинах NIH3T3 і подальший аналіз субклітинної локалізації делетованої форми синтази чітко показує, що ця делеція призводить до того, що білок втрачає мітохондріальну локалізацію. Базуючись на цих даних, а також на результатах прогнозування, було створено мутант, у якого не вистачає перших 29 амінокислот, що утворюють консервативну гідрофобну ділянку. Експресія цього мутанта у клітинах NIH3T3 показала, що він також втрачає мітохондріальну локалізацію.
N-кінцеву послідовність КоА-синтази, що кодує перші 29 амінокислот, було клоновано в рамці з GFP - зеленим флуоресцентним білком у вектор pEGFP-N1. Дослідження із застосуванням імунофлуоресцентної мікроскопії показали, що в клітинах, трансфікованих контрольною плазмідою pEGFP-N1, сигнал зеленої флуоресценції розподілявся по всій клітині (рис.9А), однак у клітинах, трансфікованих pEGFP-N-КоА-синтаза, сигнал зеленої флуоресценції детектувався у структурах, що нагадують мітохондрії (рис.9Г). Використання MitoTracker підтвердило локалізацію GFP-N-КоА-синтази на мітохондріях (рис.9 Д, Е). Таким чином, можна зробити висновок, що N-кінцева гідрофобна ділянка КоА-синтази (1–амінокислота) відповідає за мітохондріальну локалізацію КоА-синтази.
КоА-синтаза асоційована з мітохондріями. Для підтвердження мітохондріальної локалізації КоА-синтази було проведено фракціонування лізатів клітин MCF-7 у градієнті іодоксонолу (10%-30%). Одержані фракції аналізували імуноблотингом з антитілами проти КоА-синтази (рис. 10, А) та антитілами проти VDAC1, що є специфічним маркером зовнішньої мембрани мітохондрій (рис. 10, Б). Як видно з наведених результатів, КоА-синтаза кофракціонується разом з мітохондріями (рис.10).
Для з’ясування субмітохондріальної локалізації КоА-синтази очищені мітохондрії досліджували із використанням обмеженого протеолізу протеїназою К, що дає змогу виявити експоновані назовні або зв’язані із зовнішньою мембраної білки. Одержані результати свідчать, що КоА-синтаза є мембраноасоційованим білком, оскільки деградує в присутності протеїнази К, в той час як інші мітохондріальні білки, а саме трансмембранний білок VDAC та білок мітохондріального матриксу SOD лишаються майже неушкодженими. КоА-синтаза може бути асоційованою із зовнішньою мембраною мітохондрій за допомогою N-кінцевої гідрофобної ділянки, експонуючи обидва каталітичні домени в цитозоль. Слід зауважити, що додаткові білок-білкові взаємодії можуть бути задіяні також у стабілізуванні асоціації КоА-синтази з мембраною.
Надекспресія S6K1 не впливає на активність КоА-синтази. Оскільки декількома методичними підходами було доведено існування комплексу КоА-синтаза/S6К1 для розуміння фізіологічного змісту такої взаємодії було перевірено вплив утворення комплексу на ензиматичні активності кожного із компонентів комплексу. В амінокислотній послідовності КоА-синтази потенційних сайтів фосфорилювання для S6К1 ідентифіковано не було. Однак не можна виключати можливості того, що вплив S6К1 на активність КоА-синтази опосередкований іншими молекулами.
Для перевірки цього було перевірено активність КоА-синтази в клітинах НЕК293, що надекспресують як S6К1, так і КоА-синтазу, або лише КоА-синтазу. Клітини культивували за умов голодування, стимуляції сироваткою та в присутності інгібітора S6К1 - LY 294002. У жодному із випадків не виявлено впливу надекспресії S6K1 на активність КоА-синтази.
Надекспресія КоА-синтази не впливає на активність S6K в реакції фосфорилювання S6 білка. Було також перевірено вплив надекспресії КоА-синтази на активність S6K1. Для цього КоА-синтазу надекспресували у клітинах НЕК 293 та визначали ступінь фосфорилювання S6 білка з використанням специфічних анти-фосфо-Сер236 антитіл у лізатах клітин, що голодували, були стимульовані сироваткою або знаходились під дією інгібіторів S6K1 LY 294002 та рапаміцину. Як видно з рис. 11, надекспресія КоА-синтази не впливає на рівень фосфорилювання S6 білка ні в умовах голодування клітин та стимуляції сироваткою, ні під час дії інгібіторів.
Висновки
У дисертаційній роботі методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано та досліджено S6K зв’язувальний білок –КоА-синтазу. Вперше виявлено зв’язок ензимів сигнальних шляхів клітини з ензимами біогенезу КоА.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Особистий внесок здобувача –проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як “байт”, розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.
Особистий внесок здобувача –автором клоновано кДНК КоА-синтази в бактеріальні та еукаріотичні експресійні вектори, проведено біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, проведено Нозерн- та Вестерн-блот аналіз рівня експресії мРНК КоА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті кДНК двох активностей.
Особистий внесок здобувача –отримано рекомбінантні плазміди для вивчення субклітинної локалізації КоА-синтази, проведено імунофлуоресцентний аналіз субклітинної локалізації КоА-синтази, проведено субклітинне фракціонування та аналіз фракцій лізатів клітин.
Особистий внесок здобувача –виконано двогібридне скринування з використанням S6K1 як “байту”.
Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування з використанням S6K1 як “байту”, виявлено наявність у кДНК дефосфоКоА-кіназної та фосфопантотенатаденілтрансферазної активностей у отриманого позитивного клону.
Особистий внесок здобувача - розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів на селективних середовищах, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.
Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки з використанням S6K1 як “байту”.
Особистий внесок здобувача –біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, Нозерн-блот аналіз експресії мРНК КоА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті кДНК дефосфоКоА-кіназної та фосфопантотенат трансферазної активностей.
Особистий внесок здобувача –встановлено мітохондріальну локалізацію КоА-синтази методами конфокальної сканувальної мікроскопії та ультрацентрифугування.
Особистий внесок здобувача –з використанням методу імунопреципітації встановлено, що КоА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців.
Особистий внесок здобувача - встановлено, що КоА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців in vivo. Встановлено, що ферменти не впливають на активність одне одного.
АНОТАЦІЯ
Немазаний І.О. Клонування гена та характеристика білка-партнера протеїнкінази рибосомного білка S6 коензим А-синтази. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 –молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2004.
Роботу присвячено пошуку та характеристиці білків партнерів кінази S6 рибосомального білка (S6K1) методом дріжджової двогібридної системи. В результаті проведеного скринування кДНК бібліотеки ембріонів миші ідентифіковано кДНК нового S6K1-зв’язувального білка –КоА-синтази. Вперше клоновано кДНК ген, що кодує КоА-синтазу. Доведено, що КоА-синтаза має дефосфоКоА-кіназну та фосфопантотенатаденілтрансферазну активності та каталізує два останні етапи біосинтезу КоА.
Вперше показано, що КоА-синтаза взаємодіє з S6K1 у клітинах дріжджів та у клітинах ссавців. Встановлено, що С-кінцеві ділянки S6K1 та КоА-синтази залучені до утворення білкового комплексу.
Продемонстровано мітохондріальну локалізацію КоА-синтази методами конфокальної мікроскопії та субклітинного фракціонування з використанням специфічних антитіл. Виявлено, що КоА-синтаза не є субстратом для S6K1 та, що обидва ферменти не впливають на активність одне одного. Запропоновано, що ця взаємодія має структурну роль і дає можливість S6K1 наблизитися до мітохондрії з метою фосфорилювання її мітохондріальних субстратів.
Ключові слова: кіназа рибосомного білка S6, КоА, біосинтез КоА, КоА-синтаза, дріжджова двогібридна система.
АННОТАЦИЯ
Немазаный И.А. Клонирование гена и характеристика белка-партнера протеинкинази рибосомного белка S6 коензим А-синтази. -Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 –молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2004.
Работа посвящена поиску и характеристике белков-партнеров киназы рибосомального белка S6 (S6K1) методом дрожжевой двугибридной системы. В результате проведенного скринирования кДНК библиотеки мыши идентифицировано кДНК нового S6K1-связывающего белка –КоА-синтазы. Впервые клонировано кДНК гена КоА-синтазы. Доказано, что КоА-синтаза имеет дефосфоКоА-киназную и фосфопантотенатаденилтрансферазную активности и катализирует два последних этапа биосинтеза КоА.
Впервые показано, что КоА-синтаза взаимодействует с S6K1 в клетках дрожжей и клетках млекопитающих. Установлено, что С-концевые районы S6K1 и КоА-синтазы задействованы в формировании белкового комплекса.
Продемонстрировано митохондриальную локализацию КоА-синтазы методами конфокальной микроскопии и субклеточного фракционирования. Установлено, что КоА-синтаза не является субстратом для S6K1 и что оба фермента не влияют на активности друг друга. Предложено, что установленное взаимодействие имеет структурную роль и дает возможность S6K1 находиться в близости к митохондриальным субстратам.
Ключевые слова: киназа рибосомного белка S6, КоА, биосинтез КоА, КоА-синтаза, дрожжевая двугибридная система.
SUMMARY
Nemazanyy I.О. Gene cloning and characterization of CoA synthase a novel binding partner of ribosomal S6 kinase. - Manuscript.
Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 –molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.
The ribosomal protein S6 kinase (S6K) belongs to theAGC family of Ser/Thr protein kinases which includes the proteinkinase C's, protein kinase B's, SGKs, and 90-kDa ribosomalS6 kinases. S6K is involved in signalling pathways, which regulate cell growth, size and energy metabolism. Two forms of S6K have been identified (S6K1 and S6K2). Each form possesses nuclear and cytoplasmic isoforms that differs only by presence of short N-terminal extention in the structure of nuclear isoform that carry a nuclear localization signal. Both kinases are activated in response to mitogenic stimuli and nutrients via PI3-K and mTOR signaling pathways respectively. The activity of S6K is regulated by phosphorylation and dephosphorylation events in cellular responses to various extracellular stimuli. The treatment of cells with growth factors, cytokines, and hormones leads to a rapid activation of S6K, while growth inhibitory agents, such as steroids and transforming growth factor ß, suppress kinase activity It is believed that conformational changes induced by multiple S/T phosphorylations open the structure of S6K1, making both N- and C-terminal regulatory domains available for protein-protein interactions. So far, only a small number of S6K-binding partners have been identified, including PKC, PDK1, protein phosphatase PP2A, cytoskeletal protein neurabin and small GTP-binding proteins Rac and Cdc42.
Genetic studies in flies and mice strongly indicate that S6K is involved in the regulation of cell growth. The induction of cellular biosynthetic pathways in response to mitogenic stimuli and nutrients is a prerequisite for the accumulation of cellular mass. S6K has been implicated in the augmentation of ribosomal biogenesis and the initiation of protein synthesis. These events are at least partly regulated via the phosphorylation of ribosomal protein S6 with following activation of translation of specific mRNA subset that carry a specific oligopyrimidine tract at 5’ untranslated region and encoded for components of translational machinery –ribosomal proteins and elongation factors. Several additional substratezs of S6K had been identified recently, among them proapoptotic protein BAD and translation initiation factor 4B.
The main aim of this research was the identification of novel binding partners of S6K1 with the use of yeast two hybrid system. For screening of mouse embryo cDNA library the full length S6K1 was used as a bait. 28 primary positives were subjected for maiting assay. One clone was further confirmed as true-positive and identified by DNA sequencing. It has an open reading frame of 563 aa and encodes a protein of approximately 60 kDa. Sequence alignments suggested that the protein possesses both phosphopantetheine adenylyltransferase and dephospho-CoA kinase domains and can catalyze last two steps of CoA biothinthesis. Enzymatic activities responsible for each step of CoA biosynthesis have been purified from various mammalian sources and characterized.However, these studies have not been extended into protein sequenceanalysis and cDNA cloning of enzymes involved in the pathway ofCoA biogenesis.
Biochemical assays using wild type recombinant protein, dePCoA, 4’phosphopantenate and P32 γATP confirmed that the gene product indeed contained both these enzymatic activities. The presence of intrinsic phosphopantetheine adenylyltransferase activity was further confirmed by site-directed mutagenesis. These results confirm that the novel protein is a mammalian CoA synthase (CoASy) - a bifunctional enzyme containing the last two components of CoA biosynthesis.
The association between S6K1 CoASy was further confirmed between native and transiently overexpressed recombinant proteins in HEK293 and MCF7 mammalian cells using immunoprecipitation experiments. With use of transiently overexpresed deletion mutants of CoASy (ΔCCoASy) and S6K1 (ΔCS6K1) in HEK293 cell with subsequent immunoprecipitation of protein complex the region of interaction was mapped to the C-terminal parts of both CoA synthase (dephospho-CoA kinase domain) and S6K1 regulatory (autoinhibitory region).
Transient expression studies and confocal microscopy allowed us to demonstrate for the first time that full-length CoASy is associated with the mitochondria, whereas the removal of the N-terminal region relocates the enzyme to the cytosol. In addition, we showed that the N-terminal sequence of CoA synthase (amino acids 1-29) exhibits a hydrophobic profile and targets green fluorescent protein exclusively to mitochondria. Further analysis, involving subcellular fractionation and limited proteolysis with proteinase K, indicated that CoA synthase is localized on the mitochondrial outer membrane. These data provide the evidence that the final stages of CoA biosynthesis take
place on mitochondria.