Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
50.Методы секвенирования ДНК.
Методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот в отечественной литературе принято называть методами секвенирования (от англ. sequence - последовательность).
Немного истории... Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды. Данный способ секвенирования получил название "плюс-минус" метод. В 1977 г. автор "плюс-минус" метода предложил еще один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца.
В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных.
Наиболее успешным секвенатором начала 90-х стал ABI 373 производства компании Applied Biosystems. Затем выпускается ABI 310, который стал пионером капиллярной технологии в секвенировании. На сегодняшний день компания имеет в своем арсенале целую линейку автоматических генетических анализаторов/сиквенаторов, рассчитанных на лаборатории с различным потоком исследований (от одного до 96-ти капиллярного). В этих моделях используется одновременная детекция пяти красителей (TAMRA, FAM, ROX, JOE, NED), возбуждаемых излучением аргонового лазера. Лазер генерирует непрерывное излучение в сине-зеленой области спектра в диапазоне 488-514 нм. Разделение фрагментов проводится в геле толщиной 0.4 мм. Возбуждение флуорофора и следующая за этим эмиссия флуоресценции происходят при прохождении меченным фрагментом ДНК зоны сканирования. Результаты выводятся на компьютер.
Наука не стоит на месте и на сегодняшний день активно воплощаются в жизнь другие методы автоматического секвенирования - пиросеквенирование и секвенирование с помощью чип-гибридизации. К сожалению, эти методы имеют довольно серьезные ограничения, а их аппаратное воплощение еще очень далеко от совершенства, поэтому пока они широкого распространения не получили.